CN115227738B - 紫苏叶提取物在制备抗病毒药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种紫苏叶提取物在制备抗病毒药物中的用途。其中，该药物组合物包含紫苏叶提取物。本发明的紫苏叶提取物表现出低细胞毒性，在无细胞毒性浓度下，对呼吸道病毒(包括甲型流感病毒、人冠状病毒)和肠道病毒具有明显抑制作用，能够改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率，有效抑制病毒复制，同时表现出较好的量效关系，具有明显抗病毒作用。
Description
本申请是申请日为2021年09月23日，申请号为CN202111116895.1，发明名称为抗病毒药 物组合物及抑制体外病毒活性的方法和用途的分案申请。
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及抗病毒药物组合物及抑制体外病毒活性的方法和用途。
背景技术
呼吸道病毒和肠道病毒能够引发病毒感染性疾病，一些病毒还会引起临床上的急性发病， 如急性肺损伤、惊厥、强直性痉挛、脑膜刺激症、感染性休克及多脏器衰竭等重症，重症和 危重症死亡率高达35％～60％。由于较高传染性和破坏性，带来了巨大的医疗危机。由于病 毒具有严格的寄生性，对抗生素具有抵抗作用，因此基于抗生素治疗病毒感染一般无效或疗效甚微。而中医药在中国经历了数千年的发展，其在抗病毒中具有不可取代的作用。
由于中药采取的是个体化的治疗，对病情更具有针对性。正是由于这种治疗过程中中药 有效成分的多元化，病毒难以对其产生抗药性，使得中药在治疗病毒感染性疾病方面具有明 显的优势，临床使用前景广阔。
中国专利申请CN113181303A公开了一种治疗或预防流感病毒感染的中药组合物及其 应用，该中药组合物的制备原料包括荆芥、防风、银花、连翘、柴胡、黄芩、芦根、白茅根、 苏叶和薄荷十种中药进行配伍，以用于治疗或预防流感病毒感染。
中国专利申请CN111450166A公开了一种柴银制剂在抗肠道病毒中的新用途。该柴银 制剂含有柴胡、金银花、黄芩、葛根、荆芥、青蒿、连翘等中药材，制备得到的制剂具有一定的抗肠道病毒作用。然而，目前仍亟需一种抗病毒作用针对性强、适用范围广、安全性高、作用全面和制备工艺简单的抗病毒药物组合物。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明人通过深入研究发现，含有紫苏叶提取 物的药物组合物能够有效地防治呼吸道和肠道病毒。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种抗病毒药物组合物，其包括紫苏叶提取物。
根据本发明的某些实施方案，其中，所述抗病毒药物组合物中的所述提取物为水提物。
根据本发明所述的抗病毒药物组合物，其中，所述水提物通过下述方法制备得到：按每 克紫苏叶6-14mL水的比例，将紫苏叶与水混合，加热回流煎煮，提取1-3小时，提取2-3次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶水提取物。优选地，按每克紫苏叶8-12mL水的比例，将紫苏叶与水混合。
根据本发明的某些实施方案，其中，所述的抗病毒药物组合物中的所述提取物为醇提取 物。
根据本发明所述的抗病毒药物组合物，优选地，所述醇提取物通过下述方法制备得到： 按每克紫苏叶6-10mL醇溶剂的比例，将紫苏叶与醇溶剂混合，加热回流提取1.5-2.5小时，提取2-3次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶提取物。还优选地，按每克 紫苏叶7-9mL醇溶剂的比例，将紫苏叶与醇溶剂混合，
根据本发明所述的抗病毒药物组合物，优选地，所述醇溶剂为醇水混合溶剂，其中醇的 体积浓度为60％-80％。还优选地，所述醇溶剂为60％-80％的乙醇水溶液。
根据本发明所述的抗病毒药物组合物，优选地，所述病毒选自呼吸道病毒和肠道病毒。
根据本发明所述的抗病毒药物组合物，优选地，所述病毒包括甲型流感病毒、人冠状病 毒HCoV-229E和柯萨奇病毒。
本发明的第二方面，提供一种用于抑制体外病毒活性的方法，其包括向病毒施用紫苏叶 提取物的步骤。
根据第二方面所述的用于抑制体外病毒活性的方法，优选地，所述病毒为细胞内的病 毒。体外细胞包括但不限于：人胚肺成纤维细胞(MRC-5)、人肺癌细胞(A549)、犬肾细胞 (MDCK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)。
优选地，所述病毒包括甲型流感病毒、人冠状病毒HCoV-229E和柯萨奇病毒。还优选 地，所述甲型流感病毒的病毒株包括甲型流感病毒H1N1 FM1株、甲型流感病毒H1N1 PR8株和甲型流感病毒H3N2株中的至少一种；所述冠状病毒包括：人冠状病毒HCoV-229E株。
本发明的第三方面，提供紫苏叶提取物在制备抗病毒药物中的用途。可以理解的是，本 领域技术人员可以根据实际需要将本申请的紫苏叶提取物或含有紫苏叶提取物的组合物与 其他具有抗病毒活性成分的提取物/组合物联合使用以达到进一步的抗病毒效果。
本发明的紫苏叶提取物不仅表现出低细胞毒性，而且对呼吸道病毒具有显著抑制作用。 本发明中，受试药物在无细胞毒性浓度下，对甲型流感病毒H1N1有显著抑制作用，对甲型 流感病毒H3N2、人冠状病毒HCoV-229E有明显抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率，有效抑制病毒复制，同时表现出较好的量效关系。
此外，本发明的紫苏叶提取物对肠道病毒具有抑制作用。本发明中，受试药物在无细胞 毒性浓度下，对柯萨奇病毒有显著的抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主 细胞存活率，同时表现出较好的量效关系。因此，本发明的紫苏叶提取物具有明显抗病毒作用。
附图说明
图1为紫苏叶醇提物对体外培养细胞的毒性作用(×20)。
图2为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞病变的影响。
图3为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)。
图4为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1病毒载量的影响。
图5为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8致A549细胞病变的影响。
图6为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)。
图7为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8病毒载量的影响。
图8为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞病变的影响。
图9为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞存活率的影响(n＝6)。
图10为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2病毒载量的影响。
图11为紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞病变的影响。
图12为紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞存活率的影响(n＝6)。
图13为紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E病毒载量的影响。
图14为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞病变的影响。
图15为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞存活率的影响(n＝6)。
图16为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B4致Vero细胞病变的影响。
图17为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B4致Vero细胞存活率的影响(n＝6)。
图18为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B3致Vero细胞病变的影响。
图19为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B3致Vero细胞存活率的影响(n＝6)。
图20为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒A16致Vero细胞病变的影响。
图21为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒A16致Vero细胞存活率的影响(n＝6)。
图22为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞病变的影响。
图23为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)。
图24为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞病变的影响。
图25为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞存活率的影响(n＝6)。
图26为紫苏叶水提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞病变的影响。
图27为紫苏叶水提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞存活率的影响(n＝6)。
图28为紫苏叶水提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞病变的影响。
图29为紫苏叶水提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞存活率的影响(n＝6)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而 应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外， 对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中 间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在 范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人 员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测 试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在本发明提取方法，还可包含其 他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。例如，提取方法中可进一步 包括将紫苏叶与水/醇混合物进行多次加热回流的步骤。
实施例1
本实施例为紫苏叶醇提物体外抗呼吸道、肠道病毒药效学试验研究，根据各病毒株致病 特点并结合中药特性，基于体外细胞病毒感染模型，设计了相应体外抗病毒药效学试验。紫 苏叶醇提物设计100、10、1、0.1mg/mL四个剂量，观察其对11种呼吸道病毒、6种肠道病 毒致细胞病变(CPE)，细胞存活率，抑制病毒复制作用，评价其抗病毒药效作用具体如下：
一、提取
称取适量紫苏叶，按1g：8mL的比例，将紫苏叶与体积浓度为70％的乙醇水溶液混合，加热回流提取2小时，提取2次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶提 取物。
二、紫苏叶醇提取物防治呼吸道、肠道病毒的有效性研究
1.试验材料
1.1细胞
1.2病毒株
1.3试剂
1.4仪器
1.5受试药物：紫苏叶70％乙醇提取物。储存条件：常温干燥处。
1.6阳性对照药：瑞德西韦，购自美国Targetmol公司，生产批号：144250；CAS：1809249- 37-3；分子量：602.58；分子式：C27H35N6O8P；规格：5mg/管；性状：白色粉末；储存条 件：-20℃保存。药理作用：一种核苷类似物，具有抗病毒活性，在HAE细胞上，SARS-CoV及MERS-CoV的EC50是74μM。
磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，意大利Delpharm Milano S.r.l.生产，上海罗氏制药有限公司 分装；生产批号：M1066；分装批号：SH0089；规格：75mg/粒，10粒/盒；性状：灰色和淡黄色胶囊，内容物为白色至黄白色粉末；储存条件：25℃以下保存；生产日期：2019.06.05， 有效期至：2024.06.04。适应症：抗病毒药，用于预防和治疗流行性感冒。用法用量：口服， 成人每次1粒，每日2次。
利巴韦林颗粒，四川百利药业有限公司生产；生产批号：191205；规格：50mg/袋，18袋/盒；性状：白色或类白色可溶颗粒；储存条件：密封，干燥处保存；生产日期：2019.12.05，有效期至：2021.11。适应症：呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎，皮肤疱疹感染。
2.实验方法
2.1剂量设计
紫苏叶醇提物：根据前期实验结果，体外设100、10、1、0.1μg/mL四个剂量，试验时将药粉稀释成相应浓度。
达菲：在本实验涉及的细胞上确定其不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒浓度 (TC0)，以TC0及其后2-3个浓度为阳性对照孔的药物浓度。本实验中达菲在A549、MDCK细胞上TC0均为78.125μg/mL。
利巴韦林：在本实验涉及的细胞上确定其不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒浓 度(TC0)，以TC0及其后2-3个浓度为阳性对照孔的药物浓度。本实验中利巴韦林在Hep-2、 Hela、Vero细胞上TC0均为312.5μg/mL,在RD细胞上TC0为156.25μg/mL。
瑞德西韦：药品说明书提示，其在HAE细胞上，SARS-CoV及MERS-CoV的EC50是 74nM。本实验中瑞德西韦体外设296、148、74nmol/L三个剂量，试验时将药粉稀释成相应 浓度。
2.2细胞病变判断标准
细胞病变按6级标准判断：
-：细胞生长正常，无病变出现；
±：细胞病变少于整个单层的10％；
+：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；
++：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；
+++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；
++++：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。
2.3统计学分析
使用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析。计量资料以表示，组间差异采用t检 验，P<0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果
3.1紫苏叶醇提物对体外培养细胞的毒性试验
将受试药物(原始浓度50mg/mL)用培养液做1:2-1:512倍比稀释后，加到已长成单层的 A549、Vero、MDCK、MRC-5、Hep-2、Hela及RD细胞培养板(96孔)中，100μL/孔，每个 稀释度药液做6个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃，5％CO2培养箱中培养， 每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数为最大无毒 浓度(TC0)，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度(TC50)。图1为紫苏叶醇提物对体外 培养细胞的毒性作用(×20)。
结果显示：紫苏叶醇提物对A549细胞(72h)的TC0为195.31μg/mL，TC50为472.03μg/mL； 对Vero细胞(48h)的TC0为195.31μg/mL，TC50为472.03μg/mLμg/mL；对MDCK细胞(72h)的TC0为390.63μg/mL，TC50为931.04μg/mL；对MRC-5细胞(72h)的TC0为97.66μg/mL， TC50为262.41μg/mL；对Hep-2细胞(48h)的TC0为390.63μg/mL，TC50为561.01μg/mL；对 Hela细胞(72h)的TC0为390.63μg/mL，TC50为931.04μg/mL；对RD细胞(72h)的TC0为 195.31μg/mL，TC50为523.56μg/mL。
3.2呼吸道病毒实验结果
3.2.1紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的MDCK细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种100TCID50甲型流感病毒H1N1 FM1病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔， 置37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药 液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、达菲对照。置37℃5％CO2培养箱中继续 培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，吸取细胞上清液检测病毒载量，具体结果见表1及图2所示。
表1-紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞病变的影响(CPE法)
图2中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL；E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G达菲(39.06μg/mL)。
表1和图2结果显示：甲型流感病毒H1N1 FM1感染MDCK细胞72h后，细胞出现圆 缩，坏死脱落等病变。紫苏叶醇提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，以100、 10μg/mL剂量药效最佳，100、10、1、0.1μg/mL四个剂量表现出良好的量效关系。
图3为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)，其 中，与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：甲型流感病毒H1N1 FM1感染MDCK细胞72h后，细胞出现明显病变，甚至坏死，活细胞数量减少。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率升高，100、10、0.1μg/mL三个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异 (p<0.01或p<0.05)。
图4为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 FM1病毒载量的影响，其中，n＝4，每个样 本重复1次；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：MDCK细胞感染甲 型流感病毒H1N1 FM1后，上清液中病毒载量显著增加，与正常对照组比较有显著性差异 (p<0.01)。紫苏叶醇提物干预72h后，100、10μg/mL剂量组细胞上清液中病毒载量显著降 低，与模型对照组比较均有统计学差异(p<0.05或p<0.01)，病毒抑制率分别为80.86％、20.58％，达菲组病毒抑制率为93.16％。
3.2.2紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的A549细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种100TCID50甲型流感病毒H1N1 PR8病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔， 置37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药 液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、达菲对照。置37℃5％CO2培养箱中继续 培养，72h后检测细胞存活情况(CCK8)，96h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变 结果，吸取细胞上清液检测病毒载量，具体结果参见表2及图5。
表2-紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8致A549细胞病变的影响(CPE法)
图5中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL；E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G达菲(39.06μg/mL)。
表2和图5结果显示：甲型流感病毒H1N1 PR8感染A549细胞96h后，细胞出现圆 缩，坏死脱落等病变，细胞密度降低。紫苏叶醇提物干预后，100、10、1μg/mL三个剂量组 均可以明显抑制病毒所致的细胞病变，且表现出良好的量效关系。
图6为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)，其 中，与模型对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：甲型流感病毒H1N1 PR8感染MDCK细胞72h后，细胞出现坏死，活细胞数量减少。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率升高，100、10、0.1μg/mL三个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01)。
图7为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H1N1 PR8病毒载量的影响。其中，n＝4，每个样 本重复1次；与模型对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：A549细胞感染甲型流感病毒H1N1 PR8后，上清液中病毒载量显著增加，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)。绿原酸干预96h后，100、10、0.1μg/mL三个剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对 照组比较均有显著性差异(p<0.01)，病毒抑制率分别为30.24％、35.28％、23.76％，达菲组病毒抑制率为54.15％。
3.2.3紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的A549细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种100TCID50甲型流感病毒H3N2病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药液， 100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、达菲对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养， 72h后于倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，吸取 细胞上清液检测病毒载量。具体结果参见表3及图8。
表3-紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞病变的影响(CPE法)
图8中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL；E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G达菲(39.06μg/mL)。
表3及图8结果显示：甲型流感病毒H3N2感染A549细胞72h后，细胞出现圆缩，坏 死脱落等病变，细胞密度降低。紫苏叶醇提物干预后，100、10、1μg/mL三个剂量组对病毒 所致细胞病变有一定的抑制作用。
图9为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与 模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：甲型流感病毒H3N2感染A549细胞72h后，细胞出现圆缩，坏死等病变，细胞密度降低。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率明 显升高，100、1μg/mL剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.05)。100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组未表现出较好的量效关系。
图10为紫苏叶醇提物对甲型流感病毒H3N2病毒载量的影响，其中n＝4，每个样本重 复1次；与模型对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：A549细胞感染甲型流感病毒H3N2后，上清液中病毒载量显著增加，与正常对照组比较有显著性差异(p<0.01)。紫苏叶醇提物干预72h后，100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与模型对 照组比较均有显著性差异(p<0.01)，病毒抑制率分别为47.96％、71.80％、58.86％、58.22％。达菲组病毒抑制率为93.92％。
3.2.4紫苏叶醇提物对人冠状病毒致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的MRC-5细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种100TCID50人冠状病毒HCoV-229E病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔， 置37℃5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药 液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、瑞德西韦对照。置37℃5％CO2培养箱中 继续培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)， 吸取细胞上清液检测病毒载量，具体参见表4及图11所示。
表4-紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞病变的影响(CPE法)
图11中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL； E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G瑞德西韦(148μmol/L)。
表4及图11结果显示：人冠状病毒HCoV-229E感染MRC-5细胞72h后，细胞出现圆缩，折光度增强，成片脱落、坏死等病变。紫苏叶醇提物干预后，可以抑制病毒导致的细胞病变，其中100、10、1μg/mL三个剂量在体外对HCoV-229E具有较明显的抑制作用。
图12为紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞存活率的影响(n＝6)，其 中与模型组比较，*P<0.05。图中结果显示：HCoV-229E感染MRC-5细胞72h后，细胞出 现明显病变、坏死，活细胞数量减少。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率仅100μg/mL剂量组与病毒对照组比较有明显改善(p<0.05)，10、1μg/mL两个剂量组与病毒对照组比较细胞存 活率有升高趋势，与病毒对照组比较无统计学差异(p>0.05)。
图13为紫苏叶醇提物对人冠状病毒HCoV-229E病毒载量的影响，其中，n＝4，每个样 本重复1次；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：MRC-5细胞感染人冠状病毒HCoV-229E后，上清液中病毒载量显著增加，与正常对照组比较有显著性差异 (p<0.01)。紫苏叶醇提物干预72h后，100μg/mL剂量组细胞上清液中病毒载量显著降低，与 模型对照组比较有统计学差异(p<0.05)，病毒抑制率分别为34.91％。
3.3肠道病毒实验结果
3.3.1紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B5株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的Vero细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接 种100TCID50柯萨奇病毒B5(Cox B5)病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃ 5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药液，100μL/ 孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养，48h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8),结果如表5及图14所示。
表5-紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞病变的影响(CPE法)
图14中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL； E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G利巴韦林(156.25μg/mL)。
表5及图14结果显示：柯萨奇病毒B5感染Vero细胞48h后，细胞出现圆缩，坏死脱落等病变，底层未见正常形态的活细胞。紫苏叶醇提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，100、10μg/mL剂量组可见成片分布的形态正常活细胞，1μg/mL剂量组可见少量散状分布的形态正常活细胞。100、10、1、0.1μg/mL四个剂量表现出良好的量效关系。
图15为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型 对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：柯萨奇病毒B5感染Vero细胞48h后，细胞出现严 重病变，仅有少量活细胞。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率显著升高，100、10、0.1μg/mL 三个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01或p<0.05)。
3.3.2紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B4株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的Vero细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接 种100TCID50柯萨奇病毒B4(Cox B4)病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃ 5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药液，100μL/ 孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养，48h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8),具体结果参见表6及图16。
表6-紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B4致Vero细胞病变的影响(CPE法)
图16中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL； E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G利巴韦林(156.25μg/mL)。
表6及图16结果显示：柯萨奇病毒B4感染Vero细胞48h后，细胞出现圆缩，坏死脱落等病变，底层未见正常形态的活细胞。紫苏叶醇提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，100、10μg/mL剂量组可见成团分布的形态正常活细胞。
图17为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B4致Vero细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型 对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：柯萨奇病毒B4感染Vero细胞48h后，细胞出现严重病变，仅有少量活细胞。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率升高，100、10、 0.1μg/mL三个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01或p<0.05)，其中100μg/mL 剂量组药效尤为显著。
3.3.3紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B3株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的Vero细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接 种100TCID50柯萨奇病毒B3(Cox B3)病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃ 5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药液，100μL/ 孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养，48h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，具体参见表7及图18所示。
表7-紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B3致Vero细胞病变的影响(CPE法)
图18中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL； E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G利巴韦林(156.25μg/mL)。
表7及图18结果显示：柯萨奇病毒B3感染Vero细胞48h后，细胞出现圆缩，坏死脱落等病变，底层仅见少量正常形态的活细胞。紫苏叶醇提物干预后，可以抑制病毒所致的细胞病变，100、10μg/mL剂量组底层可见大量分布的形态正常活细胞，1、0.1μg/mL剂量组可见少量散状分布的形态正常活细胞。紫苏叶醇提物四个剂量表现出良好的量效关系。
图19为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒B3致Vero细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型 对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：柯萨奇病毒B3感染Vero细胞48h后，细胞出现严重病变，仅有少量活细胞。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率明显升高，100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01或p<0.05)，且表现出较好的量效关系。
3.3.4紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒A16株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的Vero细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接 种100TCID50柯萨奇病毒A16(Cox A16)病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶醇提物药液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照。置37℃5％CO2培养箱中继续 培养，120h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，具体参见表8及图20。
表8-紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒A16致Vero细胞病变的影响(CPE法)
图20中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶醇提物100μg/mL；D紫苏叶醇提物10μg/mL； E紫苏叶醇提物1μg/mL；F紫苏叶醇提物0.1μg/mL；G利巴韦林(156.25μg/mL)。
表8及图20结果显示：柯萨奇病毒A16感染Vero细胞120h后，细胞出现圆缩，坏死 脱落等病变。紫苏叶醇提物干预后，可以抑制病毒所致的细胞病变，10、1μg/mL两个剂量 组药效较佳。
图21为紫苏叶醇提物对柯萨奇病毒A16致Vero细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型 对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：柯萨奇病毒A16感染Vero细胞120h后，细胞出现病变，坏死，细胞密度降低。紫苏叶醇提物干预后，细胞存活率明显升高，10、1μg/mL两 个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01)。
4.结论
紫苏叶醇提物在A549、Vero、MDCK、MRC-5、Hep-2、Hela及RD细胞上均表现出低 细胞毒性，TC0在97.66-390.63μg/mL之间，TC50在262.41～931.04μg/mL之间。
紫苏叶醇提物对呼吸道病毒有抑制作用。本受试药物在无细胞毒性浓度下，对甲型流感 病毒H1N1(FM1、PR8株)有显著抑制作用，对甲型流感病毒H3N2、人冠状病毒HCoV-229E 有明显抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率，有效抑制病毒复 制，且100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组表现出较好的量效关系。
本受试药物在无细胞毒性浓度下，对柯萨奇病毒B5、B4株有显著的抑制作用，对柯萨 奇病毒B3、A16株有明显的抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率，且100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组表现出较好的量效关系。
综合本实验结果得出结论：紫苏叶醇提物对甲型流感病毒、人冠状病毒、柯萨奇病毒有 明显抗病毒作用。
实施例2
本实施例为紫苏叶水提物体外抗呼吸道、肠道病毒药效学试验研究，根据各病毒株致病 特点并结合中药特性，基于体外细胞病毒感染模型，设计了相应体外抗病毒药效学试验。紫 苏叶水提物设计100、10、1、0.1mg/mL四个剂量，观察其对11种呼吸道病毒、6种肠道病 毒致细胞病变(CPE)，细胞存活率，评价其抗病毒药效作用。具体如下：
一、提取
称取适量紫苏叶，按1g紫苏叶：10mL水的比例，将紫苏叶与水混合，加热回流煎煮，提取2小时，提取2次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶水提取物。
二、紫苏叶水提取物防治呼吸道、肠道病毒的有效性研究
紫苏叶水提物对甲型流感病毒H1N1 FM1株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的MDCK细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种75TCID50甲型流感病毒H1N1 FM1病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔， 置37℃5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶水提物药 液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、达菲对照。置37℃5％CO2培养箱中继续 培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，具体结果参见表9及图22。
表9-紫苏叶水提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞病变的影响(CPE法)
图22中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶水提物100μg/mL；D紫苏叶水提物10μg/mL； E紫苏叶水提物1μg/mL；F紫苏叶水提物0.1μg/mL；G达菲(39.06μg/mL)。
表9及图22结果显示：甲型流感病毒H1N1 FM1感染MDCK细胞72h后，细胞出现 圆缩，坏死脱落等病变。紫苏叶水提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，以100、 10μg/mL剂量药效最佳，100、10、1、0.1μg/mL四个剂量表现出良好的量效关系。
图23为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H1N1 FM1致MDCK细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：甲型流感病毒H1N1 FM1感染MDCK 细胞72h后，细胞出现明显病变，甚至坏死，活细胞数量减少。紫苏叶水提物干预后，细胞 存活率升高，100、10、0.1μg/mL三个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01)。 1.2紫苏叶水提物对甲型流感病毒H3N2株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的A549细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种75TCID50甲型流感病毒H3N2病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃ 5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶水提物，100μL/孔， 同时设正常细胞对照、病毒对照、达菲对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养，72h后于 倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，具体结果见表10和图24。
表10-紫苏叶水提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞病变的影响(CPE法)
图24中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶水提物100μg/mL；D紫苏叶水提物10μg/mL； E紫苏叶水提物1μg/mL；F紫苏叶水提物0.1μg/mL；G达菲(39.06μg/mL)。
表10及图24结果显示：甲型流感病毒H3N2感染A549细胞72h后，细胞出现圆缩， 坏死脱落等病变，细胞密度降低。紫苏叶水提物干预后，100、10μg/mL两个剂量组对病毒 所致细胞病变有明显的抑制作用。
图25为紫苏叶水提物对甲型流感病毒H3N2致A549细胞存活率的影响(n＝6)，其中， 与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：甲型流感病毒H3N2感染A549细胞72h后，细胞出现大量坏死。紫苏叶水提物干预后，细胞存活率明显升高，100、10μg/mL 剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.05或p<0.01)。
1.3紫苏叶水提物对人冠状病毒致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的MRC-5细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接种100TCID50人冠状病毒HCoV-229E病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔， 置37℃5％CO2培养箱中吸附2h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶水提物药 液，100μL/孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、瑞德西韦对照。置37℃5％CO2培养箱中 继续培养，72h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)， 具体见表11及图26。
表11-紫苏叶水提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞病变的影响(CPE法)
图26中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶水提物100μg/mL；D紫苏叶水提物10μg/mL； E紫苏叶水提物1μg/mL；F紫苏叶水提物0.1μg/mL；G瑞德西韦(148μmol/L)。
表11及图26结果显示：人冠状病毒HCoV-229E感染MRC-5细胞72h后，细胞出现圆缩，折光度增强，成片脱落、坏死等病变。紫苏叶水提物干预后，可以抑制病毒导致的细胞病变，其中100、10、1μg/mL三个剂量在体外对HCoV-229E具有较明显的抑制作用。
图27为紫苏叶水提物对人冠状病毒HCoV-229E致MRC-5细胞存活率的影响(n＝6)，其 中，与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图中结果显示：HCoV-229E感染MRC-5细胞72h后，细胞出现明显病变、坏死，活细胞数量减少。紫苏叶水提物干预后，100、10μg/mL剂 量组细胞存活率与病毒对照组比较有明显改善(p<0.05或p<0.01)，10、1μg/mL两个剂量组 与病毒对照组比较细胞存活率有升高趋势，与病毒对照组比较无统计学差异(p>0.05)。
2.肠道病毒实验结果
紫苏叶水提物对柯萨奇病毒B5株致细胞病变的影响(CPE法)
取已长成单层的Vero细胞培养板，倒掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，接 种100TCID50柯萨奇病毒B5(Cox B5)病毒液，100μL/孔，每个稀释度药液做6个复孔，置37℃ 5％CO2培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，分别加入4个稀释度的紫苏叶水提物药液，100μL/ 孔，同时设正常细胞对照、病毒对照、利巴韦林对照。置37℃5％CO2培养箱中继续培养，48h后倒置显微镜下观察细胞病变情况，记录病变结果，检测细胞存活情况(CCK8)，具体见表12及图28。
表12-紫苏叶水提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞病变的影响(CPE法)
图28中：A正常对照；B模型对照；C紫苏叶水提物100μg/mL；D紫苏叶水提物10μg/mL； E紫苏叶水提物1μg/mL；F紫苏叶水提物0.1μg/mL；G利巴韦林(156.25μg/mL)。
表12及图28结果显示：柯萨奇病毒B5感染Vero细胞48h后，细胞出现圆缩，坏死脱落等病变，底层未见正常形态的活细胞。紫苏叶水提物干预后，可以明显抑制病毒所致的细胞病变，100μg/mL剂量组可见成片分布的形态正常活细胞，10、1μg/mL剂量组可见少量散状分布的形态正常活细胞。
图29为紫苏叶水提物对柯萨奇病毒B5致Vero细胞存活率的影响(n＝6)，其中，与模型 对照组比较，**P<0.01。图中结果显示：柯萨奇病毒B5感染Vero细胞48h后，细胞出现严 重病变，仅有少量活细胞。紫苏叶水提物干预后，细胞存活率显著升高，100、10μg/mL两个剂量组与病毒对照组比较均有统计学差异(p<0.01)。
紫苏叶水提物对呼吸道病毒有抑制作用。受试药物在无细胞毒性浓度下，对甲型流感病 毒H1N1(FM1株)有显著抑制作用，对甲型流感病毒H3N2、人冠状病毒HCoV-229E有明显 抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率。
紫苏叶水提物对肠道病毒有抑制作用。受试药物在无细胞毒性浓度下，对柯萨奇病毒B5株有显著的抑制作用，可以改善细胞病变情况，提高病毒感染宿主细胞存活率。
综合本次实验结果得出结论：紫苏叶水提物对甲型流感病毒、人冠状病毒、柯萨奇病毒 有明显抗病毒作用，以100、10μg/mL剂量组效果尤为显著，100、10、1、0.1μg/mL四个剂量组表现出较好的量效关系。
尽管已经参考示例性实施方案对本发明进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例 性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对示例性实施方案做多种调整或变 化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (4)
1. 紫苏叶提取物在制备抗病毒药物组合物中的用途，其特征在于，所述提取物为醇提取物，所述病毒为人冠状病毒HCoV-229E型，其中，所述醇提取物通过下述方法制备得到：按每克紫苏叶6-10 mL醇溶剂的比例，将紫苏叶与醇溶剂混合，加热回流提取1.5-2.5小时，提取2-3次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶提取物，所述醇溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇的体积浓度为60%-80%。
2.紫苏叶提取物在制备抗病毒药物组合物中的用途，其特征在于，所述紫苏叶提取物为醇提取物，所述病毒为柯萨奇病毒A16和/或柯萨奇病毒B4，其中，醇提取物的溶剂为乙醇和水的混合溶剂，其中乙醇的体积浓度为60%-70%。
3. 一种用于抑制体外病毒活性的方法，其特征在于，包括向人冠状病毒HCoV-229E型、或者柯萨奇病毒A16和/或柯萨奇病毒B4施施用紫苏叶醇提取物的步骤，其中，所述醇提取物通过下述方法制备得到：按每克紫苏叶6-10 mL醇溶剂的比例，将紫苏叶与醇溶剂混合，加热回流提取1.5-2.5小时，提取2-3次，过滤，合并滤液，浓缩成浸膏，真空干燥得紫苏叶提取物；
其中，对于人冠状病毒HCoV-229E型，醇提取物的溶剂为乙醇体积浓度为60%-80%的醇水混合溶剂，对于柯萨奇病毒A16和/或柯萨奇病毒B4，醇提取物的溶剂为乙醇体积浓度为60%-70%的醇水混合溶剂。
4.根据权利要求3所述的用于抑制体外病毒活性的方法，其特征在于，所述病毒为细胞内的病毒，其中，体外细胞包括：人胚肺成纤维细胞、人肺癌细胞、犬肾细胞、非洲绿猴肾细胞。
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