Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN115210266B - 多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法 - Google Patents

多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115210266B
CN115210266B CN202180017984.2A CN202180017984A CN115210266B CN 115210266 B CN115210266 B CN 115210266B CN 202180017984 A CN202180017984 A CN 202180017984A CN 115210266 B CN115210266 B CN 115210266B
Authority
CN
China
Prior art keywords
salt
chondroitin sulfate
molecular weight
polysaccharide
polymer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202180017984.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115210266A (zh
Inventor
P·巴扎
D·比安基
A·R·塔利亚尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lesaffre et Cie SA
Original Assignee
Lesaffre et Cie SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lesaffre et Cie SA filed Critical Lesaffre et Cie SA
Publication of CN115210266A publication Critical patent/CN115210266A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115210266B publication Critical patent/CN115210266B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一种使用生态上可接受的溶剂直接硫酸化未保护的糖、特别是多糖的新方法。

Description

多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法
发明领域
本发明涉及一种新的硫酸化方法，特别是使用生态上可接受的溶剂的糖的硫酸化方法；所述方法也适用于多糖，并允许制备硫酸化糖胺聚糖，如硫酸软骨素。这类反应通常在具有较高环境影响的有毒溶剂中进行，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等。一个先前未知的发现是，硫酸化反应可以在乙酸(一种生态上可接受的溶剂)中进行，从而产生良好的转化率、良好的硫酸化程度控制和良好的化学选择性。此外，所述的方法不需要羟基保护/脱保护步骤，可直接应用于未保护的糖。它也适用于分子量范围较宽的多糖。特别是，它可应用于糖胺聚糖，并可用于制备肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素。
发明背景
糖胺聚糖(GAG或粘多糖)是由单糖和氨基糖交替的双糖直链形成的多糖家族；一个或多个硫酸基团可存在于双糖上的不同位置。它们存在于许多动物组织中，在结缔组织中尤其丰富，通常如皮肤、软骨和软组织。GAG包括肝素和硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸；后者是唯一不含硫酸盐基团的。糖胺聚糖能够具有不同的硫酸化特征和不同的分子量，这取决于动物物种和其来源的器官或组织。
硫酸软骨素是一种由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的糖胺聚糖，存在于二糖上不同位置的硫酸盐基团中，通常存在于各种动物组织中；它是人类中含量最丰富的GAG，特别见于软骨中。目前，它被用作注射药物和营养产品，用于治疗骨关节炎和其他炎性关节疾病，尤其是膝关节和手关节疾病，供人用和兽用。
CS作为食品工业的副产品获得，特别是从饲养动物(如牛和猪)或渔业(特别是鲨鱼)中获得。根据组织和来源物种，硫酸软骨素具有不同的特性，特别是具有不同的硫酸化特性和不同的分子量；后者也能够受到所用制备方法的影响。CS可根据其组成的双糖序列进行分类；硫酸基团可以存在于双糖和两种糖上的不同位置(主要在2、4和6位置)；软骨素A和C只有一个硫酸盐基团，而B、E和D有两个硫酸盐基团。也可能存在非硫酸化和三硫酸化软骨素。
市场上存在的动物源性CS的组成根据来源的物种和组织而不同；分子量也不同，通常在海洋来源的产品中较高，而从陆地动物获得的产品中较低。此外，动物来源的CS在聚合物分子量方面呈现出非常异质的混合物，它由短链(几kDa)、中链和长链(大于100kDa)多糖组成。为了描述CS的特性，除了平均MW值外，还指示了CS的多分散性(MW值在均值上下的分散程度)。在WO2012/159655第2-3页表1中可以找到按产品来源的组成的描述。
也可以通过多糖的受控裂解随意愿降低CS(或其他糖胺聚糖)的平均原始分子量；在具有低平均分子量(LMW-CS)的动物来源的CS中，多分散性值通常更高，因为多糖链在酸水解和自由基水解中随机断裂。
除了产品的标准化较差外，CS来源于动物这一事实显然还涉及其他风险，例如与源自动物的疾病有关的风险，这些疾病可传播给人类或宠物。
为了克服源自动物的缺点，最近开发了通过半合成获得的硫酸软骨素的生产；通过发酵产生称为K4的非硫酸化前体，随后转化为硫酸软骨素。K4是一种多糖，具有与软骨素相同的线性结构，但也携带果糖残基，不含硫酸基团；如WO2001/02597A1所述，它可以通过发酵生产，例如从大肠杆菌O5：K4：H4中生产。K4可以通过化学水解容易地去果糖基化，产生称为K4d的线性聚合物，相应于非硫酸软骨素的结构，由此获得CS。
或者，如WO2012/004063所述，K4d多糖也可以使用合适的重组微生物菌株通过发酵直接生产。
K4d多糖的后续硫酸化可在受控条件下进行，以根据硫酸基的引入位置调节硫酸化程度(每个二糖单元的硫酸基团数量)，通常在4位或6位。分子量也可以例如通过使高分子量聚合物经受酸水解或自由基水解来调节；对K4d多糖和硫酸软骨素的水解可以在硫酸化之前或之后进行。该方法及其变体产生了具有所需硫酸化特性的硫酸软骨素，具有极好的可靠性，并且没有动物源性产品特有的缺点(US2019/231810)。
K4d聚合物的硫酸化反应迄今为止已使用各种硫酸化剂进行，但始终使用无水有机溶剂，特别是二甲基甲酰胺(DMF)；这不是一个低生态毒理学影响的方法。
DMF是一种需要特殊预防措施的溶剂，因为它不仅易燃，而且对人类和环境有害；它对皮肤、眼睛、呼吸系统和生殖系统有毒。DMF也特别危险，因为如果皮肤接触或吸入是有害的。鉴于其毒性特征，环境成本显然也很高；含有DMF的废水的回收和处理费用昂贵。二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮可作为DMF的替代品用于硫酸化反应，但它们存在类似的生态毒理学问题。
DMF也是硫酸化剂的良好溶剂；例如，在Chopin等人的BioMed ResearchInternational 2015，Article ID508656(生物医学研究国际2015，ID508656)中，使用离子化液体作为反应溶剂对糖胺聚糖进行硫酸化，但DMF仍用于溶解硫酸基团供体(与各种有机碱的SO3复合物)。此外，DMF与SO3形成复合物，构成可能的硫酸化剂。
作为DMF的替代品，乙腈可用作微波辐射反应中的溶剂；例如，见de Paz Carrera等人，WO2012/035188。Desai等人，Tetrahedron 662907-18(2010)的综述中对包括多糖在内的有机分子的硫酸化反应进行了一般描述。
定义
K4：果糖基非硫酸化糖胺聚糖多糖，具有以下结构式：
K4d：不含果糖残基的非硫酸化糖胺聚糖，具有以下结构式：
硫酸软骨素：硫酸化的糖胺聚糖多糖，具有以下结构式：
R4、R6＝H或SO3Na
发明详述
本发明的硫酸化方法允许使用乙酸，一种生态上可接受的溶剂，同时在反应进程(即硫酸化程度)和引入硫酸基团的位置(即其选择性)两方面保持对反应的良好控制。此外，该方法不需要保护和脱保护步骤，从而节省原材料并降低废水产量。该方法涉及分子量(MW)的增加，其仅涉及引入新的硫酸盐基团，但不影响聚合物长度，或仅以受控方式影响聚合物长度，特别是不产生裂解；如果需要LMW-CS，则可通过组合合成过程(硫酸软骨素硫酸化前后K4d多糖的受控裂解)和分离过程(沉淀或超滤分离)随意愿调节最终产物的分子量。因此，该新方法产生具有所需硫酸化特性、分子量和多分散性的CS，其适用于营养和制药领域。
本发明的方法由于使用无污染溶剂和较低的废水产生而具有较低的生态影响。在该方法的优选实施方案中，所得产物为低分子量硫酸软骨素钠盐。
在一个可能的实施方案中，K4d聚合物盐、优选四烷基铵盐、更优选吡啶盐或四甲基、四乙基或四丁基铵盐被硫酸化。在替代实施方案中，使用酸形式的K4d多糖。
在一个实施方案中，将SO3与有机碱(如SO3Py或SO3NEt3、DMF等)的复合物用作硫酸化剂。在替代实施方案中，氯磺酸用作硫酸化剂。
在一个实施方案中，使用乙酸作为溶剂进行硫酸化反应。
本发明的方法包括：
a)将多糖如糖胺聚糖或其盐溶解或悬浮在乙酸中，
b)加入硫酸化剂，
c)在受控温度条件下进行反应，例如通过将反应混合物保持在乙酸或其与待硫酸化多糖的混合物的冷冻温度和70℃之间、更优选10-50℃、甚至更优选10-20℃，
d)例如通过直接过滤、在有机溶剂中沉淀或色谱法从反应溶剂中分离产物，
e)任选地例如通过透析从糖胺聚糖硫酸盐溶液中除去有机或无机盐和其他杂质，
f)任选地，回收分离所需产物后可获得的反应溶剂，并将其再用于a)中所述的反应。
由此以足够纯净的形式获得所需产品的溶液，用于营养领域；如果希望获得固体形式的产品，可以冷冻干燥、喷雾干燥或通过其他合适的方法干燥溶液。
如果要获得质量适合注射使用的反应产物，建议从上述溶液中除去任何热原，例如通过用碳去热原，然后在干燥前进行灭菌过滤。
整个过程从生产荚膜多糖K4开始，通过WO2001/02597A1中公开的野生型大肠杆菌菌株O5：K4：H4发酵获得。分离生物质后，在受控条件下对上清液进行水解，以去除果糖残留物；获得K4d多糖的水溶液，其对应于非硫酸化软骨素。所述产物可进一步纯化以获得钠盐形式的脱果糖基化高分子量多糖水溶液。然后在酸性条件下对该产品进行受控裂解，类似于Cho等人在Biol Pharm Bull 27，(1)，47-51中描述的方法。或者，可以采用自由基裂解方法，使用IT 1224260中披露的过氧化氢和硫酸铁，或使用US 4977250中披露的次氯酸钠。通常通过HPLC-SEC监测反应以控制产物的分子量；当达到所需的平均分子量时，例如在5-30kDa，通过添加氢氧化钠、碳酸钠或其他碱来猝灭反应，直到达到中性pH值，并将混合物冷却至室温。
低分子量K4d聚合物的水溶液用聚砜膜进行超滤，截止值在500-5000道尔顿；无机盐(主要是氯化钠和硫酸钠)和分子量非常低的糖在渗透液中被去除。这样，聚合物的分子量在窄范围内选择；还可以组合两种超滤，一种具有较高截止值，另一种具有较低截止值，以进一步缩小分子量分布(低多分散性)。
膜收集的高分子量聚合物部分可在下一批中回收。
为了获得钠盐形式的K4d多糖，可以通过超滤或薄膜蒸发浓缩溶液，然后喷雾干燥；或者，可以通过冷冻干燥分离产品。获得具有所需分子量的基本上纯的K4d多糖(非硫酸软骨素)；残余水含量小于5％，通常小于2％(卡尔费休滴定)。
使用与上述程序非常类似的程序，可通过使用适当的透析溶液或树脂洗脱溶液(例如，使用KCl溶液代替NaCl)获得钾、铵或其他盐。
为了获得酸形式或季铵盐形式的K4d聚合物，可以如上所述操作，但为了降低成本，优选使用阳离子交换树脂，优选强酸树脂，并且优选磺酸树脂。所述树脂可以基于天然聚合物如琼脂糖或合成聚合物如聚丙烯酸酯或聚苯乙烯；它可以是刚性的或凝胶形式；必须用例如磺酸基或磷酸基的强酸基团官能化。该过程可以在柱中或分批模式下进行，使用的树脂量取决于其官能化程度(每升树脂的官能团数)。
K4d聚合物的水溶液在装有机械搅拌器的反应器中通过连续一部分一部分地添加树脂(酸形式)进行处理，直到溶液的pH值小于2；然后通过过滤分离树脂。获得未离解酸形式的K4d多糖溶液，未观察到聚合物碎片；该产品也可以通过冷冻干燥或喷雾干燥溶液以固体形式获得。
如果产品是以季铵盐的形式获得的，则将适量的碱(吡啶、四丁基氢氧化铵等)加至上述酸溶液中以达到中性pH；固体产物通过如上所述的喷雾干燥或冷冻干燥获得。
吡啶鎓盐、四甲基铵盐、四乙基铵盐和四丁基铵盐均以白色或淡黄色固体的形式获得，残余水分小于5％，基本上不含钠(小于0.1％)。
然后将酸或成盐形式的K4d聚合物用于下述硫酸化反应，以获得硫酸软骨素；透析和浓缩后，将CS溶液喷雾干燥以获得CS钠盐。反应的良好控制使得能够调节聚合物的位置选择性和硫酸化程度。通过这种方式，可以制备具有类似于动物源性硫酸软骨素特性的产品，例如具有类似于从鲨鱼或其他动物物种获得的CS的硫酸化特性的产品。
如上所述，还可以通过在硫酸化之前裂解K4d聚合物或裂解硫酸化之后获得的硫酸软骨素，来选择最终产物的平均分子量及其在平均值周围的分布；在这两种情况下，裂解可以通过酸机制或自由基机制获得，如所引用的文献中所述。
下面的实施例更详细地说明了本发明。
实施例1：K4d聚合物钠盐制备的一般程序
K4d多糖是通过大肠杆菌发酵生产荚膜多糖K4获得的，如Manzoni等人的Biotechnol Lett 18383-6(1996)所述；分离生物质后，在受控条件下对上清液进行水解，以去除果糖残留物；如Rodriguez等人.，Eur J Biochem 177，117-124(1988)中所述，通过色谱法进一步纯化K4d多糖的所得水溶液，以获得去果糖化高分子量多糖的水溶液。
然后在受控条件下进行酸解聚，通过添加HCl将溶液的pH值调节至1-4，并加热至60-80℃。通过HPLC-SEC监测反应以检查产物的分子量；当达到5-30kDa的所需平均分子量时，通过添加氢氧化钠使反应淬灭，直到达到pH 7，并冷却至20-25℃。
低分子量K4d聚合物的水溶液用截流为2.5kDa的聚砜膜进行超滤，用水透析并浓缩。在工业规模上，产品通过喷雾干燥分离，而在实验室规模上，则通过冷冻干燥获得。K4d多糖(非硫酸软骨素)钠盐以细白色粉末的形式获得；残余水含量小于2％(卡尔费休滴定法)。
实施例2：K4d聚合物季铵盐制备的一般步骤
K4d多糖通过如实施例1中所述的操作获得，直到获得具有所需分子量的纯钠盐水溶液，而无需分离固体形式的产物。
将所述溶液置于装有机械搅拌器的反应器中，然后连续添加Amberlite IRA1200H树脂(酸形式)，直到pH值低于2；然后通过过滤分离树脂。获得未离解酸形式的K4d多糖溶液，未观察到聚合物碎片；该产品也可以通过冷冻干燥或喷雾干燥溶液以固体形式获得。
可以使用类似的树脂代替Amberlite IRA1200H，例如具有聚丙烯酸或聚乙烯结构的强阳离子树脂，并且将获得类似的结果。
将碱(吡啶或四丁基、四甲基或四乙基氢氧化铵)加至所述酸溶液中，使pH值大于7。通过喷雾干燥或冷冻干燥获得固体产物。
获得吡啶鎓盐、四甲基铵盐、四乙基铵盐或四丁基铵盐，均为白色或淡黄色固体形式，残余水分小于5％，基本上不含钠(小于0.1％)。
实施例3：制备K4d聚合物的替代程序
作为实施例1中所述方法的替代方法，K4d多糖可使用产生脱果糖基化多糖的菌株DSM23644通过发酵直接获得。如WO2012/004063所述纯化产物，并如Cho等人所述进行酸或自由基解聚以获得所需分子量。
所得产物与根据实施例1获得的产物相同；可通过如实施例2中所述的操作获得季铵盐。
实施例4(对比实施例)：在DMF溶剂中制备硫酸软骨素
反应如WO2012/159655实施例4所述进行，不同之处在于所用K4d多糖的分子量较低，小于10kDa。
向反应器中加入72ml无水二甲基甲酰胺和如实施例2中所述获得的1.20g K4d多糖四丁基铵盐。加入3当量的SO3-DMF复合物，并将温度控制在+10℃左右。反应完成后，用碳酸氢钠猝灭反应并透析，通过冷冻干燥分离产物；获得了具有分子量＜10kDa和WO2012/159655第16页表2中报告的硫酸化特性的硫酸软骨素钠。
实施例5：在乙酸中制备硫酸化混合物
在氮气流下向玻璃反应器中加入134ml无水DMF，并冷却至5±5℃；滴入67g氯磺酸，保持温度＜30℃。在添加过程中形成白色沉淀；将混合物再搅拌20分钟，将温度调节至5±5℃。固体在氮气下通过烧结玻璃布氏漏斗过滤，除去DMF。在磁力搅拌下将固体试剂溶解在乙酸(73.46g)中。在使用之前，将生成的硫酸化溶液保持在4℃的氮气下，防潮。
实施例6：在乙酸溶剂中制备低分子量硫酸软骨素
在氮气流下向玻璃反应器中加入200ml无水乙酸和20g K4d多糖四丁基铵盐(如实施例2所述)。在搅拌下将所得悬浮液冷却至约13℃，用按实施例5制备的硫酸化溶液(40.22g)处理，并在相同温度下搅拌24小时。用30％NaOH(382ml)和冰淬灭反应，保持温度＜30℃；用HCl将悬浮液调节至pH 7.9，并通过布氏漏斗过滤，然后弃去固体(乙酸钠)。母液通过超滤膜(截止值2.5kDa)超滤，用水透析。通过真空蒸发浓缩残余物，用脱色炭脱色并冷冻干燥，得到10.5g硫酸软骨素。
实施例7：在乙酸溶剂中制备低分子量硫酸软骨素
在氮气流下向玻璃反应器中加入200ml无水乙酸和20g K4d多糖四丁基铵盐(如实施例2中所述获得)；将悬浮液冷却至约13℃，并加入实施例5中所述的硫酸化溶液(40.0g)。24小时后，用水和冰淬灭反应，保持温度＜30℃；然后进行超滤并用水透析，将残余物的pH值校正到5.5-7.5。浓缩残余物，用炭脱色并冷冻干燥；获得11.5g硫酸软骨素。
实施例8：在乙酸溶剂中制备低分子量硫酸软骨素
在氮气流下向玻璃反应器中加入800ml无水乙酸和80g K4d多糖四丁基铵盐(如实施例2所述获得)。在搅拌下将所得悬浮液加热至约50℃，用根据实施例5制备的硫酸化溶液(161.32g)处理，并在相同温度下搅拌1小时。将部分悬浮液(～200ml)倒入水和冰(2.5kg)中进行淬灭，保持温度＜30℃；所得溶液通过超滤膜(截止值2.5KDa)超滤，用水透析至透析液的电导率＜500μS，并将残余物的pH值调节至5.5-7.5。通过蒸发、冷冻和冷冻干燥浓缩残余物，以获得8.6g硫酸软骨素。
实施例9：在乙酸溶剂中用氯磺酸制备低分子量硫酸软骨素
在氮气流下向玻璃反应器中加入200ml无水乙酸和如实施例2中所述获得的20gK4d多糖四丁基铵盐；将悬浮液冷却至约13℃并添加氯磺酸(8.95g)，保持温度24小时。然后将悬浮液倒入水和冰中，如实施例7所述进行超滤和透析。通过冷冻干燥获得12.7g硫酸软骨素。
实施例10：在乙酸溶剂中用氯磺酸制备低分子量硫酸软骨素
在氮气流下向装有机械搅拌器、温度计和滴管的玻璃反应器中加入600ml无水乙酸和如实施例2所述的60g K4d多糖四丁基铵盐。在搅拌下将所得悬浮液加热至约50℃，并用氯磺酸(28.8g)处理，并在相同温度下搅拌10分钟。将部分悬浮液(～200ml)倒入水中和冰(2.5kg)中，使其淬灭，保持温度＜30℃；所得溶液通过超滤膜超滤，用水透析，使渗透液的电导率＜500并将残余物的pH值调节至5.5-7.5。通过蒸发、冷冻和冷冻干燥浓缩残余物，获得8.64g硫酸软骨素。
实施例11：在乙酸溶剂中用氯磺酸制备低分子量硫酸软骨素
与前述实施例同样方法，使用200mL无水乙酸、20g K4d多糖盐TBA和10.54g氯磺酸进行，在10-15℃下反应24小时。反应完成后，悬浮液通过布氏漏斗过滤，滤饼用乙酸洗涤，并用Na2CO3(q.s.)溶解在pH 7.3的水中。如上所述对所得溶液进行超滤和透析，并冷冻干燥残余物以获得8.58g硫酸软骨素。
实施例12：通过在乙醇和水中沉淀纯化乙酸中的低分子量硫酸软骨素
如实施例6所述进行合成，并在反应结束时通过过滤除去乙酸钠。在剧烈搅拌下将溶液滴入无水乙醇中；通过布氏漏斗过滤得到的悬浮液，以获得27.1g玻璃状固体形式的粗硫酸软骨素。将所得固体(2.5g)的等分试样溶解在0.2M NaCl(7.5ml)中，然后在剧烈搅拌下将溶液滴入EtOH(50ml)中；纯硫酸软骨素以无定形固体(2.16g)的形式沉淀。
实施例13：在乙酸中合成和纯化高分子量硫酸软骨素
如实施例1所述进行反应，以获得水溶液中的高分子量(去果糖基化)K4d多糖；然而，不进行解聚。如实施例2所述，用离子交换树脂获得相应的四丁基铵盐。
在氮气流下向玻璃反应器中加入91ml无水乙酸和9.1g高分子量K4d多糖TBA盐。将所得悬浮液在搅拌下冷却至10-15℃，用氯磺酸(5.3g)处理，然后在相同温度下搅拌2.5小时。悬浮液通过布氏漏斗过滤，所得滤饼溶解在10％NaHCO3水溶液中；所得溶液通过超滤膜进行超滤和透析。通过冷冻干燥获得5.21g硫酸软骨素。
实施例14：在乙酸中合成和纯化低分子量硫酸软骨素(含DMFSO3粉末)
在氮气流下向玻璃反应器中加入200ml无水乙酸和如实施例2中所述获得的20gK4d多糖TBA盐。在搅拌下将所得悬浮液加热至约50℃，用DMF-SO3复合物(Aldrich，10.95g)处理，并在相同温度下搅拌1小时；然后将反应在冰中淬灭，然后进行超滤和透析，将残余物的pH保持在5.5-7.5。用脱色炭对产物进行脱色并冷冻干燥，得到8.73g硫酸软骨素。

Claims (9)

1.通过使K4d聚合物或其盐与硫酸化剂反应制备硫酸软骨素的方法，其特征在于所述反应在受控温度条件下在乙酸中进行，其中所述硫酸化剂是氯磺酸，或SO3与有机碱的复合物，所述温度条件为反应混合物的凝固点至70℃，所述的方法中的K4d聚合物或其盐不需要羟基保护和脱保护步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中SO3与有机碱的复合物是SO3与二甲基甲酰胺的复合物。
3.根据权利要求1的方法，其中所述有机碱是吡啶或三乙胺。
4.根据权利要求1的方法，其中所述温度条件为10-50℃。
5.根据权利要求1的方法，其中所述温度条件为10-20℃。
6.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述K4d聚合物为盐形式。
7.根据权利要求6的方法，其中所述盐是四烷基铵或吡啶鎓盐。
8.根据权利要求1至3的任一项的制备硫酸软骨素的方法，其中所述的硫酸软骨素为低分子量硫酸软骨素钠盐。
9.根据权利要求1至3的任一项的方法，其中所述硫酸软骨素通过过滤、通过在有机溶剂中沉淀、或通过色谱法而分离，之后任选通过透析除去有机或无机盐。
CN202180017984.2A 2020-03-04 2021-03-02 多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法 Active CN115210266B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT102020000004564 2020-03-04
IT102020000004564A IT202000004564A1 (it) 2020-03-04 2020-03-04 Processo per la solfatazione diretta di polisaccaridi in solvente ecologicamente accettabile
PCT/IB2021/051714 WO2021176341A1 (en) 2020-03-04 2021-03-02 Process for direct sulfation of polysaccharides in an ecologically acceptable solvent

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115210266A CN115210266A (zh) 2022-10-18
CN115210266B true CN115210266B (zh) 2024-09-17

Family

ID=70804902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180017984.2A Active CN115210266B (zh) 2020-03-04 2021-03-02 多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230090768A1 (zh)
EP (1) EP4114869A1 (zh)
JP (1) JP2023516330A (zh)
KR (1) KR20220149736A (zh)
CN (1) CN115210266B (zh)
AU (1) AU2021229679A1 (zh)
BR (1) BR112022017636A2 (zh)
CA (1) CA3170461A1 (zh)
IT (1) IT202000004564A1 (zh)
MX (1) MX2022010895A (zh)
WO (1) WO2021176341A1 (zh)
ZA (1) ZA202210883B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112279936B (zh) * 2020-11-12 2023-06-30 上海辉文生物技术股份有限公司 一种类肝素的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB773477A (en) * 1954-09-09 1957-04-24 Hoffmann La Roche Process for the manufacture of chitosan derivatives
CN101230109A (zh) * 2007-12-24 2008-07-30 河北科技师范学院 磺化酰化6-羧基壳聚糖及其盐和它们的制备方法
WO2012130753A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Altergon S.A. Process for the preparation of chondroitin sulfated at position 3 of glucuronic acid
CN104877042A (zh) * 2015-06-10 2015-09-02 浙江三门恒康制药有限公司 一种类肝素的制备方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR243540A1 (es) 1986-08-05 1993-08-31 Ajorca Sa Procedimiento quimico para la depolimerizacion controlada de polianiones naturales y productos asi obtenidos, excluidos sus usos farmaceuticos.
AR243204A1 (es) 1986-11-21 1993-07-30 Ajorca Sa Un metodo para la depolimerizacion quimica de polisacaridos.
ITMI991465A1 (it) 1999-07-02 2001-01-02 Inalco Spa Processo per la preparazione dei polisaccaridi k4 e k5 da escherichiacoli
JP6030056B2 (ja) 2010-07-09 2016-11-24 グノーシス・エツセ・ピ・ア バイオテクノロジーによるコンドロイチンの生産
ES2378676B1 (es) 2010-09-15 2013-02-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Procedimiento de sulfatación de oligosacáridos por calentamiento con microondas.
UA110717C2 (uk) 2011-05-20 2016-02-10 ГНОЗІС С.п.А. Аналог акулячого хондроїтинсульфату і спосіб його одержання
US10632144B2 (en) 2012-05-22 2020-04-28 Gnosis S.P.A. Low polydispersity, low molecular weight biotechnological chondroitin sulfate with anti-inflammatory and antiarthritis activity and use thereof in the prevention of osteoarthritis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB773477A (en) * 1954-09-09 1957-04-24 Hoffmann La Roche Process for the manufacture of chitosan derivatives
CN101230109A (zh) * 2007-12-24 2008-07-30 河北科技师范学院 磺化酰化6-羧基壳聚糖及其盐和它们的制备方法
WO2012130753A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-04 Altergon S.A. Process for the preparation of chondroitin sulfated at position 3 of glucuronic acid
CN104877042A (zh) * 2015-06-10 2015-09-02 浙江三门恒康制药有限公司 一种类肝素的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230090768A1 (en) 2023-03-23
BR112022017636A2 (pt) 2022-11-08
WO2021176341A1 (en) 2021-09-10
CN115210266A (zh) 2022-10-18
EP4114869A1 (en) 2023-01-11
IT202000004564A1 (it) 2021-09-04
KR20220149736A (ko) 2022-11-08
CA3170461A1 (en) 2021-09-10
AU2021229679A1 (en) 2022-10-27
JP2023516330A (ja) 2023-04-19
ZA202210883B (en) 2024-02-28
MX2022010895A (es) 2022-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK168297B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af lavmolekylær heparin ud fra normal heparin
JPS59133201A (ja) 多糖類の解重合およびスルフエ−ト化法
CN115210266B (zh) 多糖在生态可接受溶剂中直接硫酸化的方法
US8513407B2 (en) Process for the preparation of N-acyl-(epi)K5-amine-O-sulfate-derivatives and products thus obtained
JP6205350B2 (ja) 同じ多糖鎖の４位または６位でバイオテクノロジー的に硫酸化されたコンドロイチン硫酸、およびその調整方法
US8664196B2 (en) Shark-like chondroitin sulphate and process for the preparation thereof
CN111154819A (zh) 一种非动物源低分子量肝素及其制备方法与应用
KR101788536B1 (ko) 상어­유사 콘드로이틴 설페이트 및 이의 제조방법
AU2002327578B2 (en) Saccharide sulfation methods
CA2489862C (en) Epimerized derivatives of k5 polysaccharide with a very high degree of sulfation
JP2023529428A (ja) 菌類からのヒアルロン酸の抽出方法、植物由来のヒアルロン酸およびその用途
JP4958368B2 (ja) 架橋ヒアルロン酸
AU2002327578A1 (en) Saccharide sulfation methods
EA046236B1 (ru) Способ прямого сульфатирования полисахаридов в экологически приемлемом растворителе
US20120253029A1 (en) Process for the preparation of highly o-sulfated epimerized derivatives of k5 polysaccharide and intermediates therein
KR20050024339A (ko) 엔-아실-(에피)케이5-아민-오-황산염-유도체 생산방법 및그 생성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant