CN115192569B

CN115192569B - Sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN115192569B
Application number: CN202210960681.0A
Authority: CN
Inventors: 沈涛; 杨康; 王小宁
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-08-10
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2042-08-10
Also published as: CN115192569A

Abstract

本发明公开了在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用。所述sphaeropsidin A的化学式为：Sphaeropsidin A是一种强效NF‑κB信号通路和NLRP3炎症小体抑制剂，其能够抑制NF‑κB信号通路转录和激活，抑制其转位入核，下调炎症蛋白iNOS和COX‑2的表达；还是NLRP3炎症小体的广谱抑制剂，能够降低炎症因子IL‑1β和Caspase‑1的蛋白水平和mRNA水平；同时，其在体内能够有效抑制炎症反应，进而减缓肺部炎症发病进程；还可以干预体内炎症，是治疗炎症反应相关疾病的有效化合物，为治疗炎症相关疾病创新药物的研发提供了先导化合物或候选药物。

Description

Sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及异海松烷类二萜化合物的应用，具体涉及sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)目前在全球引发大流行，对人类健康产生了重大威胁。临床资料显示，COVID-19引起的免疫反应和严重的 “细胞因子风暴”，出现无法控制的炎症反应，释放过量炎症因子。另外随着社会的快速发展，环境污染特别是空气污染日益加剧，据统计2017年患有肺炎疾病的人数较1990年增加了40%，死亡率增加20.0%，所以肺部炎症疾病受到了全世界重视。当多种外源性污染物进入机体后，会激活巨噬细胞和中性粒细胞诱导炎症核因子 (Nuclear factor，NF) -κB和NLRP3 (NOD-like receptor 3)炎症小体活化，引起下游炎症因子TNF-α、Caspase-1和 IL-1β 大量产生，导致DNA损伤和细胞焦亡，从而诱发一系列严重疾病，如肺部炎症疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化疾病或肿瘤疾病等。

NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路均为炎症反应相关的关键通路，是研发干预肺部炎症疾病的优良药物靶点。当细胞受到NLRP3激动剂损伤物刺激时，会使NLRP3炎症小体自组装，使Pro-caspase-1自切割并产生活化的Caspase-1。活化的Caspase-1一方面会促进生成一系列IL-1β、IL-18炎症因子，另一方面导致细胞发生焦亡——近年来发现的一种新的程序性细胞死亡方式，伴随着Caspase-1、4、11炎症因子和GSDMD炎症蛋白的产生，与动脉粥样硬化性疾病、神经系统相关疾病和一些感染性疾病的发生息息相关，抑制细胞发生焦亡也是临床防治和新药物发现的新思路。IκB结合并沉默NF-κB稳定存在细胞质中，当细胞受到外部刺激时，会致IκB蛋白磷酸化， NF-κB转位入胞核中诱导下游炎症蛋白一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶(COX-2)的生成。NF-κB是调节细胞炎症反应的重要转录因子，通过与κB序列结合，调控炎症相关基因的表达。因此，抑制NF-κB和NLRP3炎症小体调控的炎症反应，是治疗炎症反应相关疾病的有效策略。

天然产物是新药先导分子和创新药物的主要来源，据统计在过去40年世界范围内获批的新药中，约50%与天然产物相关。天然药物在自然界含量比较低，但是具有结构新颖，类型多样，机制独特，活性显著的优点。二萜是一类具有重要生物活性的天然产物，例如银杏内酯、紫杉醇、雷公藤素等。其中海松烷型二萜因其独特的结构、显著的抗炎、抗菌、抗病毒等药理功能，备受关注。Sphaeropsidin A是海松烷型二萜中的一种，目前文献已报道的sphaeropsidin A生物活性仅有抗癌，抗菌，抗细胞耐药性等，并未有文献在炎症方面进行报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物或化妆品中的应用。本发明研究发现了sphaeropsidin A 通过调控NF-κB和NLRP3炎症小体，抑制肺部炎症的作用机制，建立了小鼠脂多糖（LPS）雾化给药的肺炎模型并用其首次确证了sphaeropsidin A干预肺炎的有效性，sphaeropsidin A具有成为用于治疗肺部炎症先导药物的潜力，有望应用于制备预防和治疗肺部炎症疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化疾病或肿瘤疾病。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

本公开的第一方面，提供Sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用，所述sphaeropsidin A的化学结构为：

。

本公开通过研究发现sphaeropsidin A能够抑制RAW 264.7巨噬细胞中NO的产生；在J774A.1巨噬细胞中抑制了由NLRP3激动剂和LPS共同诱导的IL-1β和Caspase-1的过量生成，降低炎症因子的分泌和mRNA水平；能够抑制NF-κB基因转录和入核，进而降低下游iNOS和COX-2的蛋白和mRNA水平，下调细胞炎性反应。所以，sphaeropsidin A具有开发成为以NLRP3炎症小体和NF-κB为靶点通路抑制炎症的潜力。Sphaeropsidin A能够降低J774A.1巨噬细胞中焦孔素蛋白D (GSDMD)的蛋白水平，控制乳酸脱氢酶(LDH)的释放，同时剂量依赖抑制GSDMD、Caspase-4和11的mRNA水平，能够保护细胞形态的改变以及提高细胞生存的数量。小鼠肺部LPS雾化给药诱发小鼠肺部炎症模型表明sphaeropsidin A可以减缓小鼠肺部炎症的病理变化，降低小鼠血液中炎症细胞的百分比，具有体内有效性。

由此，得出结论，本发明涉及的sphaeropsidin A能对抗炎症反应，具有预防或治疗肺部炎症疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化疾病或肿瘤疾病的潜力。

本公开的第二方面，提供Sphaeropsidin A在化妆品中的应用，所述sphaeropsidinA的化学式为：

；

所述化妆品为面膜、护肤霜、护肤膏、护肤水、护肤粉或护肤凝胶。

本公开的第三方面，提供一种药物组合物，其特征是，所述药物组合物包括sphaeropsidin A和/或其药学上可接受的盐。

优选的，所述药学上可接受的盐为硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或为复合物的形式。

本公开的第四方面，提供一种药剂，所述药剂包括sphaeropsidin A或第二方面所述的药物组合物及药学上可接受的辅料。

优选的，所述药剂为胶囊剂、片剂、凝胶剂、散剂、颗粒剂、注射剂、口服液、酒剂、丸剂、合剂或酊剂。

优选的，所述片剂的辅料包括淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠及硬脂酸镁。

优选的，所述凝胶剂的辅料包括卡波姆及聚山梨醇。

本公开的第五方面，提供第三方面所述药物组合物或第四方面所述药剂在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用。

优选的，所述炎症诱发疾病为肺部炎症疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化疾病或肿瘤疾病。

本公开的第六方面，提供一种化妆品，所述化妆品包括sphaeropsidin A及化妆品原料。

优选的，所述化妆品为面膜、护肤霜、护肤膏、护肤水、护肤粉或护肤凝胶。

本发明的有益效果为：

本发明研究提供了Sphaeropsidin A的抗炎活性，并且具体提供了该化合物的抗炎机制，为该化合物制备成为相应的药物提供了宝贵的依据。Sphaeropsidin A 通过调控NF-κB、NLRP3炎症小体，抑制肺部炎症的作用机制，建立了小鼠脂多糖（LPS）雾化给药的肺炎模型并用其首次确证了sphaeropsidin A干预肺炎的有效性，sphaeropsidin A具有成为用于治疗肺部炎症先导药物的潜力，有望应用于制备预防和治疗肺部炎症疾病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化疾病或肿瘤疾病。

本公开研究发现sphaeropsidin A能够抑制RAW 264.7巨噬细胞中NO的产生；在J774A.1巨噬细胞中抑制了由NLRP3激动剂和LPS共同诱导的IL-1β和Caspase-1的过量生成，降低炎症因子的分泌和mRNA水平；能够抑制NF-κB基因转录和入核，进而降低下游iNOS和COX-2的蛋白和mRNA水平，下调细胞炎性反应。所以，sphaeropsidin A具有开发成为以NLRP3炎症小体和NF-κB为靶点通路抑制炎症的潜力。Sphaeropsidin A能够降低J774A.1巨噬细胞中GSDMD的蛋白水平，控制LDH的释放，同时剂量依赖抑制GSDMD、Caspase-4和11的mRNA水平，能够保护细胞形态的改变以及提高细胞生存的数量。小鼠肺部LPS雾化给药诱发小鼠肺部炎症模型表明sphaeropsidin A可以减缓小鼠肺部炎症的病理变化，降低小鼠血液中炎症细胞的百分比，具有体内有效性。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：为NO生成抑制试验的柱状图，表明sphaeropsidin A能够呈剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中NO的生成，LPS浓度为1 μg/ml，Didox 50μM为阳性对照；

图2：为不同浓度sphaeropsidin A的免疫印迹分析图，表明sphaeropsidin A能够显著降低 Caspase-1和IL-1β的蛋白水平，图中的sphaeropsidin A浓度单位为μM，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM；

图3：为不同浓度sphaeropsidin A的免疫印迹分析图，表明sphaeropsidin A是NLRP3炎症小体的广谱抑制剂，图中的sphaeropsidin A浓度单位为μM，LPS浓度为1 μg/ml，ATP浓度为3 mM，MSU浓度为200 µg/mL；

图4：为酶联免疫法结果的柱状图，表明sphaeropsidin A能够抑制炎症因子水平升高，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM，ATP浓度为3 mM，MSU浓度为200 µg/mL；

图5：为qRT-PCR结果的柱状图，表明sphaeropsidin A能够阻断LPS和尼日利亚菌素刺激促炎介质mRNA水平的增加，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM；

图6：为双荧光素报告基因实验的柱状图，表明sphaeropsidin A能以剂量依赖性方式抑制NF-κB基因的转录，LPS浓度为1 μg/ml；

图7：为不同浓度sphaeropsidin A的免疫印迹分析图，表明sphaeropsidin A能够上调NF-κB抑制蛋白IκBα的表达，降低NF-κB亚基p65和其下游炎症相关蛋白iNOS, COX-2蛋白水平，图中的sphaeropsidin A浓度单位为μM，LPS浓度为1 μg/ml，Didox 100 μM为阳性对照；

图 8：为细胞免疫的荧光显微照片，表明sphaeropsidin A能够抑制LPS诱导的NF-κB亚基p65转位入核。sphaeropsidin A浓度为2 μM；LPS浓度为1 μg/ml；

图 9：为qRT-PCR结果的柱状图，表明sphaeropsidin A能够呈剂量依赖性地降低下游iNOS、COX-2和MMP-9 的mRNA水平，LPS浓度为1 μg/ml；

图 10：为不同浓度sphaeropsidin A的免疫印迹分析图，表明sphaeropsidin A有效降低J774A.1细胞内的GSDMD蛋白水平，图中的sphaeropsidin A浓度单位为μM，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM；

图 11：为细胞上清液中LDH含量的柱状图，表明sphaeropsidin A显著下调细胞培养上清液中LDH的水平，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM；

图 12：为qRT-PCR结果的柱状图，表明sphaeropsidin A能够剂量依赖性地降低Caspase-11，Caspase-4和GSDMD的mRNA水平；

图 13：为PI-Hoechst染色照片，表明sphaeropsidin A能够提高细胞生存数量，sphaeropsidin A浓度为2 μM，LPS浓度为1 μg/ml，尼日利亚菌素浓度为4 µM；

图 14：为小鼠肺组织HE染色照片，表明sphaeropsidin A 能够减轻LPS诱导的小鼠肺组织病理变化，阳性对照药Dex浓度为1 mg/kg，tBHQ 40 mg/kg，sphaeropsidin A的浓度分别为2和4 mg/kg，LPS浓度为10 mg/kg；

图 15：为酶联免疫法结果的柱状图，表明sphaeropsidin A可抑制LPS所诱导小鼠肺泡灌洗液中促炎介质的增加，阳性对照药Dex浓度为1 mg/kg，tBHQ 40 mg/kg，sphaeropsidin A的浓度分别为2和4 mg/kg，LPS浓度为10 mg/kg；

图 16：为小鼠血液中血常规的柱状图，表明sphaeropsidin A能够降低小鼠血液中炎症细胞的数量，阳性对照药Dex浓度为1 mg/kg，tBHQ 40 mg/kg，sphaeropsidin A的浓度分别为2和4 mg/kg，LPS浓度为10 mg/kg。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有文献中存在对sphaeropsidin A生物活性研究较少，并未有文献对sphaeropsidin A的抗炎生物活性进行评价，为了解决如上的技术问题，本申请提出了sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物或化妆品中的应用。

本发明的一种典型实施方式，sphaeropsidin A在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用，所述sphaeropsidin A的化学式为：

。

本公开研究发现sphaeropsidin A能够抑制RAW 264.7巨噬细胞中NO的产生；在J774A.1巨噬细胞中抑制了由NLRP3激动剂和LPS共同诱导的IL-1β和Caspase-1的过量生成，降低炎症因子的分泌和mRNA水平；能够抑制NF-κB基因转录和入核，进而降低下游iNOS和COX-2的蛋白和mRNA水平，下调细胞炎性反应。所以，sphaeropsidin A具有开发成为以NLRP3炎症小体和NF-κB为靶点通路抑制炎症的潜力。Sphaeropsidin A能够降低J774A.1巨噬细胞中GSDMD的蛋白水平，控制LDH的释放，同时剂量依赖抑制GSDMD、caspase-4和11的mRNA水平，能够保护细胞形态的改变以及提高细胞生存的数量。小鼠肺部LPS雾化给药诱发小鼠肺部炎症模型表明sphaeropsidin A可以减缓小鼠肺部炎症的病理变化，减轻LPS诱导的肺损伤，具有体内有效性。

下面介绍sphaeropsidin A抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体组装作用以及体内有效性的研究情况：

采用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，评价了sphaeropsidin A对炎症介质NO的生成抑制作用，结果表明sphaeropsidin A能够在无毒剂量下抑制NO活性，即sphaeropsidinA具有抑制炎症介质的作用(图1)。

采用小鼠巨噬J774A.1细胞，评价了sphaeropsidin A对NLRP3炎症小体的作用。蛋白质印迹分析结果表明，sphaeropsidin A能够显著降低 Caspase-1和IL-1β的蛋白水平（图2）。对于不同的NLRP3炎症小体激动剂，sphaeropsidin A同样具有抑制作用，是NLRP3的广谱抑制剂（图3），酶联免疫吸附试验结果表明sphaeropsidin A在体外能够抑制LPS和尼日利亚菌素或MSU或ATP诱导的炎症因子产生（图4）。qRT-PCR结果表明，sphaeropsidin A能够剂量依赖地降低促炎介质mRNA水平（图5）。

采用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系，评价了sphaeropsidin A对NF-κB炎症通路的作用。双荧光素报告基因实验表明，sphaeropsidin A能以剂量依赖性方式抑制NF-κB基因的转录（图6），蛋白质印迹分析结果表明，sphaeropsidin A能够上调NF-κB抑制蛋白IκBα的表达，降低NF-κB亚基p65和其下游炎症相关蛋白iNOS，COX-2 蛋白水平（图7），细胞免疫荧光试验表明，sphaeropsidin A能够抑制LPS诱导的NF-κB亚基p65转位入核（图8）。qRT-PCR试验表明，sphaeropsidin A能够下调LPS诱导的炎症因子iNOS、COX-2和MMP-9 的mRNA水平（图9），降低细胞炎性反应。

采用小鼠巨噬J774A.1细胞系，评价sphaeropsidin A对焦亡的作用。蛋白质印迹分析结果表明，sphaeropsidin A有效降低细胞内的GSDMD蛋白水平（图10），下调细胞培养上清液中LDH的水平（图11）；qRT-PCR试验表明sphaeropsidin A能够剂量依赖性地降低Caspase-11，Caspase-4和 GSDMD的mRNA水平（图12）；PI-Hoechst染色结果表明sphaeropsidin A能够提高细胞生存数量（图13）；即sphaeropsidin A能够抑制焦亡的发生。

采用LPS雾化小鼠肺炎模型，评价sphaeropsidin A的体内有效性。小鼠肺组织HE染色照片，表明sphaeropsidin A 能够减轻LPS诱导的小鼠肺组织病理变化（图14）；小鼠血常规结果表明sphaeropsidin A能够降低小鼠血液中炎症细胞的数量（图15）；即sphaeropsidin A在体内能够有效抑制炎症。

优选的，上述研究情况中，sphaeropsidin A的浓度为1~2μM，该浓度下对细胞产生更好保护作用。进一步优选的， sphaeropsidin A的浓度为2μM，该浓度下对细胞产生最佳保护作用；进一步优选的，sphaeropsidin A的浓度为4μM，该浓度下对小鼠产生最佳保护作用。

本发明的第二种典型实施方式，sphaeropsidin A在化妆品中的应用，所述sphaeropsidin A的化学式为：

；

本发明的第三种典型实施方式，一种药物组合物，所述药物组合物包括sphaeropsidin A和/或其药学上可接受的盐。

该实施方式的一些实施例中，所述药学上可接受的盐为硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或为复合物的形式。

本发明的第四种典型实施方式，一种药剂，所述药剂包括sphaeropsidin A或第二种典型实施方式所述的药物组合物及药学上可接受的辅料。

该实施方式的一些实施例中，所述片剂的辅料包括淀粉、糊精、羧甲基纤维素钠及硬脂酸镁。

优选的，所述片剂的制备方法为：将sphaeropsidin A或第二种典型实施方式所述的药物组合物、淀粉及糊精混合后过筛，再加入羧甲基纤维素钠制粒，然后加入硬脂酸镁混合后压片即得片剂。

进一步优选的，sphaeropsidin A、淀粉及糊精质量比为1~2:2~3:2~3。

该实施方式的一些实施例中，所述凝胶剂的辅料包括卡波姆及聚山梨醇。

优选的，所述凝胶剂的制备方法为：将卡波姆和聚山梨醇加入至水中混合均匀，再加入sphaeropsidin A或权利要求2或3所述的药物组合物，混合均匀即得凝胶剂。

进一步优选的，sphaeropsidin A或权利要求2或3所述的药物组合物、卡波姆和聚山梨醇的质量比为2~3:3~4:1~2。

本发明的第五种典型实施方式，第三种典型实施方式所述的药物组合物或第四种典型实施方式所述的药剂在制备预防或治疗炎症诱发疾病药物中的应用。

本发明的第六种典型实施方式，一种化妆品，所述化妆品包括sphaeropsidin A及化妆品原料。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1：sphaeropsidin A在无毒剂量下，抑制LPS诱导的 RAW264.7 细胞中 NO的生成

（1）小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养

小鼠巨噬细胞RAW264.7购自美国模式培养物集存库（ATCC），采用DMEM培养基，并向其中加入10%胎牛血清(FBS)，5%谷氨酰胺，置于37°C，5% CO2培养箱中培养。

（2）NO生成抑制实验

将RAW264.7细胞接种于96孔版，培养至密度达到70%-80%后，加入LPS（1 μg/mL）与不同浓度的待测化合物共处理细胞18小时，随后，取100μL培养上清，与等体积的Griess试剂（0.1％萘乙二胺和1％磺胺在5％H₃PO₄溶液中）混合。室温下孵育15分钟后，570nm处测量吸光度，并通过NaNO₂标准曲线评估NO含量。

结果：如图1所示，sphaeropsidin A能够呈剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中NO的生成。在10 µM时，sphaeropsidin A对NO生成抑制率达到最大值，约为89.72%，抗炎能力强于阳性对照药Didox。

实施例2：sphaeropsidin A下调Caspase-1和IL-1β蛋白水平

方法：蛋白质印迹分析(Western blot)检测细胞中蛋白水平的变化

（1）小鼠巨噬J774A.1细胞系的培养

小鼠巨噬J774A.1细胞系购自美国模式培养物集存库（ATCC），采用含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基，置于37℃，5% CO₂培养箱中培养。

（2）蛋白质印迹分析试验

将J774A.1细胞接种于D35中，培养至密度达到70%-80%后，用 600 ng/mL LPS刺激J774 A.1细胞4 h，再用不同浓度的sphaeropsidin A预保护0.6 h，4 µM 尼日利亚菌素处理1 h， PBS洗涤2次，加入细胞裂解液（50μg/ml抑肽酶，0.5 mM苯甲基磺酰氟，1 mM正钒酸钠，10 mM氟化钠，10 mMβ-磷酸甘油），收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100μg)上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5%的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h后，分别与各待测蛋白抗体4℃孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h 后, 用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。

结果：如图2所示，细胞经sphaeropsidin A处理后，Caspase-1和IL-1β的蛋白水平上升被显著抑制，证实该化合物能够抑制NLRP3炎症小体的组装。

实施例3：sphaeropsidin A抑制LPS和尼日利亚菌素共诱导的炎症因子表达

方法：酶联免疫法检测炎症因子浓度

将J774A.1细胞接种于24孔板中，培养至密度达到70%-80%后，用 600 ng/mL LPS刺激J774 A.1细胞4 h，再用不同浓度的sphaeropsidin A预保护0.6 h，4 µM 尼日利亚菌素处理1 h，吸取细胞培养液，离心后，取上清液，按照酶联免疫测定试剂盒说明书操作，450nm处测定发光强度。根据标准曲线计算炎症因子浓度。

结果：酶联免疫吸附法结果显示（图4），sphaeropsidin A对IL-18和IL-1β的生成抑制能力呈剂量依赖性增加。

实施例4：sphaeropsidin A抑制LPS和尼日利亚菌素共诱导的炎症因子mRNA水平增加

方法：qRT-PCR法检测炎症因子mRNA水平

将J774A.1细胞接种于D60中，培养至密度达到70%-80%后，用600 ng/mL LPS刺激J774 A.1细胞4 h，用不同浓度的sphaeropsidin A预保护1 h，4 µM 尼日利亚菌素孵育1h，用qRT-PCR检测NLPR3，Caspase-1和IL-1β的mRNA含量。

结果：qRT-PCR结果显示（图5）sphaeropsidin A能够剂量依赖地阻断LPS和尼日利亚菌素刺激的NLRP3，Caspase-1和 IL-1β mRNA水平增加。

实施例5：sphaeropsidin A抑制NF-κB基因转录

方法：双荧光素报告基因实验评价对NF-κB基因表达的影响

RAW 264.7细胞接种于24孔板后，放置于5% CO₂、37℃的细胞培养箱中培养。待细胞密度长至合适密度时，RAW 264.7细胞转染Empty Vector和NF-κB质粒，sphaeropsidin A预处理1 h，1 µg/mL LPS 刺激16 h，上机检测双荧光强度。

结果：如图6所示，LPS的加入能够促进NF-κB基因的转录，而sphaeropsidin A以剂量依赖性方式抑制了转录。

实施例6： sphaeropsidin A上调NF-κB抑制蛋白IκBα水平，下调NF-κB亚基p65蛋白的表达，并能抑制下游炎症相关蛋白iNOS和COX-2的表达

将RAW264.7细胞接种于D35中，培养至密度达到70%-80%后，加入不同浓度的待测化合物sphaeropsidin A处理不同时间，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液（50 μg/ml抑肽酶，0.5 mM苯甲基磺酰氟，1 mM正钒酸钠，10 mM氟化钠，10 mMβ-磷酸甘油），收集蛋白并采用Bradford法测定蛋白浓度。各取样品蛋白(100μg)上样，SDS-PAGE分离蛋白组分并采用电转移法将蛋白条带转移至硝酸纤维素薄膜上。薄膜经TBS配制5%的脱脂奶粉溶液室温封闭1 h后，分别与各待测蛋白抗体4 ℃孵育过夜。经TBS洗涤后分别加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1 h后, 用增强型ECL化学发光进行蛋白分析。

结果：如图7所示，细胞经sphaeropsidin A处理1h后，与LPS共孵育1h，NF-κB抑制蛋白IκBα水平上升，NF-κB亚基p65蛋白表达量下降，细胞经sphaeropsidin A与LPS共处理18h后，NF-κB下游炎症相关蛋白水平呈现剂量依赖性降低，证实sphaeropsidin A能够在蛋白水平上抑制NF-κB信号通路。

实施例7：sphaeropsidin A抑制LPS诱导的NF-κB亚基p65蛋白转位入核

方法：免疫荧光法检测NF-κB亚基p65细胞内位置

将细胞爬片放置于24孔板中，接种RAW264.7细胞，待细胞贴壁后加入sphaeropsidin A处理1小时后，与LPS共孵育1h，PBS洗涤2次，加入甲醇固定4小时，PBS洗涤2次，加入p65抗体孵育1小时，PBS洗涤3次，加入DAPI和荧光二抗孵育50分钟，采用荧光显微镜观察并拍照。

结果：免疫荧光结果显示（图8），细胞正常状态下，NF-κB亚基p65位于细胞质中，LPS诱导状态下p65进入细胞核，加入sphaeropsidin A处理后，p65回到细胞质。

实施例8：sphaeropsidin A抑制GSDMD的蛋白水平

将J774A.1细胞接种于D35中，密度达到75%后，先用不同浓度的sphaeropsidin A预保护0.5 h，再用500 ng/mL LPS刺激J774 A.1细胞3 h，3 µM 尼日利亚菌素孵育2 h。然后用免疫印迹法检测蛋白水平。

结果：如图10所示，GSDMD作为细胞焦亡的关键分子，表明sphaeropsidin A处理可有效降低J774A.1细胞内的GSDMD蛋白水平，并且呈剂量依赖。

实施例9：sphaeropsidin A降低LDH的释放

方法：LDH检测试剂盒测定含量

在D35中接种J774 A.1细胞，待细胞密度达到80%后，加药处理，加入LPS的DMEM完全培养基刺激3 h，不同浓度的药物保护0.5 h，再加入3 µM尼日利亚菌素孵育3 h。收取上清液用LDH试剂盒进行评价。

结果：细胞发生死亡时会释放LDH到培养基中，如图11所示，sphaeropsidin A在0.5μM至2μM浓度范围内能够剂量依赖性地下调细胞培养上清液中LDH的水平。

实施例10：sphaeropsidin A提高细胞生存数量

方法：PI-Hoechst荧光染色进行观察

将J774A.1细胞接种到放入细胞爬片的D35培养皿中，待细胞长至60%密度时，加药处理，加入LPS的opti-DMEM培养基刺激3 h，然后加入2 µM sphaeropsidin A保护0.5 h，最后加入3 µM尼日利亚菌素刺激2 h。按照说明书配制好Hoechst 33342溶液，浓度为1 mg/mL，溶于opti-DMEM培养基加入到D35中，37℃孵育10分钟。吸走培养基，将PI染料溶液溶于0.1%TritionX-100的PBS中，终浓度5 mg/mL，加入到D35中，染色10 min。弃去染色液，用PBS洗涤一次，使用成像系统对荧光信号进行成像。

结果：如图13所示，J774A.1细胞中加入LPS和尼日利亚菌素后，大量细胞核被PI染红，表明有大量细胞发生死亡，加入sphaeropsidin A后，未死亡的细胞数量明显增多。

实施例11：sphaeropsidin A减轻LPS诱导的小鼠肺组织病理变化

方法：H&E染色进行观察

将新鲜摘取的小鼠肺部右下叶全部浸入4%多聚甲醛中，固定24小时，脱水后进行石蜡包埋。将小鼠肺组织切成4μm切片，进行脱蜡处理；二甲苯I (16 min)；二甲苯II (16min)；无水乙醇I (6 min)；无水乙醇II (6 min)；75%酒精(6 min)；水清洗三次。脱蜡处理后，切片进行苏木精-曙红(H&E)染色。

结果：如图14所示，空白组小鼠肺组织形态结构清楚，肺泡排列规则；LPS雾化组小鼠表现出明显的肺部炎症病理变化，包括肺泡壁和肺泡间隔增厚，伴随大量炎性细胞浸润，肺泡壁塌陷。而sphaeropsidin A的加入显著地改善了LPS诱导的病理变化，与阳性对照tBHQ和Dex给药组效果类似。

实施例12：sphaeropsidin A在体内可抑制LPS诱导的促炎介质的产生

方法：酶联免疫法检测炎症因子浓度

颈椎脱臼法处死小鼠后，解剖小鼠使气管暴露，用注射器注入1 mL的PBS到气管中，计时45 s后回收灌洗液，重复3次。以2000 rpm离心10分钟，上清液即为小鼠肺泡灌洗液，-20℃储存。肺泡灌洗液采用酶联免疫法检测。

结果：如图15所示，LPS造模组小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的含量明显升高，sphaeropsidin A的加药处理降低了促炎因子的水平，表明sphaeropsidin A可抑制LPS诱导的促炎因子产生。

实施例13：sphaeropsidin A能够降低小鼠血液中炎症细胞的数量

方法：小鼠血常规进行分析

在处死小鼠之前，收集眼眶血于含EDTA的抗凝管中(血量应大于1 mL)，并采用BC6800全自动血液细胞分析仪进行分析。

结果：如图16所示，LPS造模组小鼠血液中的白细胞数量和中性粒细胞百分占比明显升高，说明LPS引起了小鼠全身性的炎症，sphaeropsidin A加药处理降低了两者的百分占比。因此，sphaeropsidin A能够降低全身性的炎症反应。

实施例14：片剂的制备

sphaeropsidin A 0.25 g，加入淀粉1.5g、糊精1.5g，过筛，加入羧甲基纤维素钠适量，制粒。加入硬脂酸镁适量，混匀，压片，即得。

实施例15：凝胶剂的制备

卡波姆3g、聚山梨酯1g、水100mL混合均匀，加入sphaeropsidin A 0.5 g，充分混匀，并分装，即得。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1. Sphaeropsidin A在制备预防或治疗肺炎疾病药物中的应用，其特征是，所述sphaeropsidin A的化学结构为：

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