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CN115161246B - 一株高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌菌株及其应用 - Google Patents

一株高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。本发明通过常温常压等离子诱变筛选得到了高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌A22，其糖化酶活力为1372.85U/g±55.54U/g，液化酶活力为1.53U/g±0.09U/g，相比原始菌株，糖化酶活力提升了29％，液化酶活力提升了47％。本发明中利用高产酶的诱变菌株A22制备的接种生麦曲，是对传统生麦曲的一种强化，可以用于生产白酒、黄酒、米酒、料酒、酱油、醋等各类曲法制得的酿造食品，在曲法酿造的食品中具有广泛的应用前景。

Description

一株高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株高产糖化酶和液化酶的玫瑰糖多孢菌菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
生麦曲是我国传统酿造食品中最常见的糖化剂之一，不仅起到提供糖化酶与液化酶的作用，对发酵物(一般是酒类)的风味特征也有显著影响。生麦曲为发酵食品提供各种酶类，主要是淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，促使原料所含的淀粉、蛋白质、脂肪等高分子物质的液化、分解，同时在制曲过程中形成的各种代谢物，以及由这些代谢产物相互作用产生的色泽、香味等物质，赋予酿造食品独特的风格。生麦曲中的淀粉酶对酿造食品中原料的利用起着至关重要的作用，而水解淀粉的两个关键酶是糖化酶和液化酶，因此生麦曲中的糖化酶和液化酶也是表征麦曲质量的关键指标。
宏基因组测序证实糖多孢菌是黄酒麦曲和发酵过程中的核心微生物，尤其麦曲中的披发糖多孢菌、霍氏糖多孢菌、玫瑰糖多孢菌和江西糖多孢菌在放线菌属中占有主要的丰度。功能预测也表明糖多孢菌属与食品发酵过程中的风味物质联系紧密，主要与氨基酸(天冬氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸)脂肪酸的来源(辛酸、癸酸、月桂酸)，和醇类、酯类物质合成有关。因此提高麦曲中糖多孢菌属的丰度对于改善发酵食品的风味和质量具有重要的意义。
目前，现有生麦曲的生产主要利用环境种的微生物，属于开放培养，曲中优良菌种少，酶活力较低，导致酿造时用曲量大，增加企业生产成本，另外，生产中麦曲用量过大，容易导致酿造食品风味变差，色泽偏暗，进而影响酿造食品品质。实验室前期筛选了一株可以进行生麦曲制作的玫瑰糖多孢菌，但是它存在水解淀粉酶活低，原料利用率低等缺点。
同时，采用现有工艺酿造的黄酒高级醇的含量较高(560mg/L-620mg/L)，会导致饮后头晕，恶心等不良反应，因此在黄酒发酵过程中要控制高级醇的含量。此外，现有工艺酿造的黄酒由于添加了熟麦曲，熟麦曲具有较高的蛋白酶，可以水解原料产生大量的氨基酸，包括一些苦味氨基酸(2.5g/L-3g/L)，这也是导致黄酒苦涩重的主要原因。目前黄酒企业酿造的黄酒酒精度普遍在17％vol-18％vol之间，要开发一种新型麦曲去替代传统麦曲，首先酒精度要接近原有工厂的酒精度。
因此，针对上述目前黄酒企业存在的问题，选育出高产淀粉酶，遗传稳定性好的菌株，并将其接种到生麦曲中，对改善黄酒的风味，以及提高其他酿造食品原料的利用率上具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一株玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)A22，已于2022年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221039。
所述玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)A22是对玫瑰糖多孢菌原始菌株进行复合诱变并筛选得到的诱变菌株，该菌株能稳定传代，相比原始菌株，能够明显提高糖化酶和液化酶的生产水平。
本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有上述玫瑰糖多孢菌A22或其发酵液，或含有上述玫瑰糖多孢菌A22细胞裂解液。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，玫瑰糖多孢菌A22的含量至少为1.0×106spore/mL。
本发明还提供了一种生麦曲，所述生麦曲为，将小麦粉碎，将上述玫瑰糖多孢菌A22菌悬液按照一定的添加量加到粉碎的小麦中，搅拌均匀，在曲房发酵6-7d，制备得到生麦曲。
在本发明的一种实施方式中，所述玫瑰糖多孢菌A22菌悬液的浓度为104～108CFU/mL，将玫瑰糖多孢菌A22菌悬液按照20％～26％(v/m)的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀后进行发酵。
本发明还提供了一种利用所述瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)A22发酵生产接种生麦曲的方法，所述方法为：将活化的玫瑰糖多孢菌A22种子液与拌曲的清水混合，调整菌浓度为104～108CFU/mL，得到菌悬液，将上述菌悬液按照20％～26％(v/m)的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团块，防止后续产生坏曲。
将拌好的麦曲放到曲筐(长：宽：高＝60*42*26cm)进行发酵6-7d，曲房温度45℃，湿度95％。
在本发明的一种实施方式中，所述生麦曲的制备方法为，将活化的玫瑰糖多孢菌A22种子液与拌曲的清水混合，调整菌浓度为104～108CFU/mL，得到菌悬液，将上述菌悬液按照20％～26％(v/m)的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀后，将上述拌好的散曲进行块曲的制作。
在本发明的一种实施方式中，所述块曲的制备方法为：将搅拌均匀后的散曲采用机械制曲机压制特定形状的曲块，曲块长为25(±1)cm，宽为15(±1)cm，高为6(±1)cm。将压制好的曲块静30～40min，将曲块按照丁字形摆放，保证相邻曲块间空气流动，然后将块曲运送到曲房中，在45℃，95％的湿度条件下发酵120～122h，最后获得成品块曲。
在本发明的一种实施方式中，采用上述技术方案，一种用于酿造食品的接种生麦曲制作过程中，最高温度达到52～54℃，有助于抑制不耐高温的杂菌生长，此温度下，耐高温的玫瑰糖多孢菌大量繁殖，产酶较强，糖化酶与液化酶较高，麦曲内部呈白色，产生大量的孢子，曲香味正常。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为：45℃，95％的湿度下培养6～7d，待麦曲里面长满白色的菌丝后，出曲房，烘干备用。
本发明还提供了上述玫瑰糖多孢菌A22或其代谢物在发酵领域提高糖化酶和液化酶酶活方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述代谢物包括但不限于所述玫瑰糖多孢菌A22发酵后去除了菌体细胞的上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵领域包括制备酿造食品、发酵食品、酒精饮品或调味品。
本发明还提供了所述玫瑰糖多孢菌A22制备接种生麦曲的应用。
本发明还提供了制备的接种生麦曲可以应用在黄酒、白酒、红曲黄酒、料酒、醋、酱油等各类曲法制得的酿造食品及其对应曲的制作过程中。
本发明还提供了上述生麦曲在制备酿造食品、酒精饮品或调味品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述酿造食品包括但不限于：黄酒、白酒、清酒或米酒、酱油、食醋、甜米酿或料酒。
在本发明的一种实施方式中，所述酒精饮品包括但不限于：黄酒、白酒、清酒或米酒。
在本发明的一种实施方式中，所述调味品包括但不限于：料酒、酱油、食醋。
本发明还提供了上述玫瑰糖多孢菌A22或上述微生物菌剂或上述生麦曲在制备发酵食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括但不限于酒精饮料、豆制品、发酵蔬菜、调味品。
本发明还提供了上述玫瑰糖多孢菌A22或上述微生物菌剂在提高生麦曲的糖化力和液化力中的应用。
本发明还提供了上述玫瑰糖多孢菌A22或上述微生物菌剂或上述生麦曲在提高黄酒酒精度、或在降低黄酒中高级醇含量、或在降低黄酒中苦味氨基酸含量中的应用。
本发明还提供了一种酒的酿造方法，所述方法为：
将上述生麦曲代替工厂传统的生麦曲+熟麦曲的配方，将上述生麦曲直接添加至含有酒母的原料中进行发酵制备得到；所述酒包括但不限于黄酒、白酒、清酒和米酒。
有益效果
(1)本发明以实验室现有玫瑰糖多孢菌为出发菌，经过复合诱变筛选得到诱变菌株玫瑰糖多孢菌(CCTCC NO:M 20221039)，诱变菌株具有高的糖化酶和液化酶。
(2)本发明提供了一种玫瑰糖多孢菌诱变菌株A22，该菌株在固态发酵制备麦曲发酵剂中糖化酶活力1200～1400U/g，液化酶活力为1.3～1.6U/g，较出发菌株(玫瑰糖多孢菌F2014)糖化酶活力提高了29％，液化酶活力提升了49％。
(3)该诱变菌株玫瑰糖多孢菌A22在斜面培养传代至6代以后，菌株具有较好的遗传稳定性。
(4)利用该菌株玫瑰糖多孢菌A22制备的接种生麦曲发酵的黄酒酒精度(18％vol)高于机械化黄酒(生麦曲+熟麦曲发酵)的酒精度(17.8％vol)，同时，与机械黄酒相比，采用本发明的方法能够使黄酒中的总高级醇含量降低12.7％，苦味氨基酸的含量降低了28％，在不改变黄酒整体风味的基础上，可改善黄酒的饮用舒适性。同时，采用玫瑰糖多孢菌A22制备的接种生麦曲发酵的黄酒苦味氨基酸含量也降低了。
(5)采用本发明的菌株制备得到的新型玫瑰糖多孢菌接种生麦曲，是对普通生麦曲的一种功能微生物强化，具有比普通生麦曲更高的糖化酶和液化酶。本发明工艺是对传统制曲工艺的一种创新，改变工厂熟麦曲和生麦曲搭配使用传统机械化生产黄酒的工艺，完全用强化生麦曲生产黄酒，可使手工黄酒生产用曲量从16～17％减少到12～13％，并且理化指标满足黄酒的国标要求。由于麦曲用量的减少，所酿黄酒的风味及外观得到改善和提高，色泽黄亮透明，风味优雅细腻，节约酿酒生产成本，提高企业经济效益。
(6)本发明所获得诱变的菌株玫瑰糖多孢菌A22，不仅可用于散曲的制作，还可应用于块曲的生产，减少块曲的发酵时间，不受季节限制，可常年生产，提高生产效率。
(7)本发明所生产的生麦曲，不仅可以应用到黄酒，还可以应用到用于白酒、酱油、醋、米酒、料酒、红曲黄酒等曲法酿造食品的生产中，具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
一株玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)A22，分类学命名为玫瑰糖多孢菌A22 Saccharopolyspora rosea A22，已于2022年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221039，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：ARTP诱变的致死率曲线(A)和正突变率曲线(B)。
图2：玫瑰糖多孢菌接种生麦曲中在黄酒酿造过程中的基本理化指标变化；其中，A酒精度；B还原糖；C可滴定酸；D氨基酸态氮。
图3：诱变菌株制备接种生麦曲的糖化酶(A)和液化酶活力(B)。
图4：玫瑰糖多孢菌接种生麦曲中在黄酒酿造过程中的基本理化指标变化；其中，A总酸；B氨基酸态氮；C酒精度；D还原糖。
图5：诱变菌株与出发菌株糖化酶(A)和液化酶(B)的比较。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的红皮或黄皮软质小麦购买自无锡汇聚通粮贸、酵母菌保藏于江南大学传统酿造食品研究中心。
本发明所述“液化酶”主要是指淀粉酶的酶活。
下述实施例中所涉及的诱变出发菌株为玫瑰糖多孢菌F2014，为玫瑰糖多孢菌CCTCC NO：M 2020952，记载于公开号为CN113249268A的申请文本中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
放线菌液体培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，pH值7.2～7.4(25℃)。
放线菌培养基：硝酸钾1.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2～7.4(25℃)。
YPD培养基：10g/L酵母浸粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，加水至1000mL，2％琼脂，115℃高压灭菌20min，冷却后备用。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
酶活力检测：
采用国标GB1886.174-2016对自升温麦曲中的α-淀粉酶、糖化酶进行检测。
水分测定采用国标GB5009.3-2016进行测定，温度、湿度采用温湿度计进行测定。
黄酒理化指标检测：
酒精度按照国标GB13662-2018进行测定，还原糖测定采用3,5-二硝基水杨酸法测定，黄酒中的有机酸、游离氨基酸采用高效液相色谱仪器进行检测，黄酒中的风味物质采用气质联用仪器进行检测。
实施例1：玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)诱变菌株制备
1、玫瑰糖多孢菌诱变菌株的制备
将实验室原有的出发菌株玫瑰糖多孢菌F2014(CCTCC NO：M 2020952)进行等常压室温等离子体。
(1)玫瑰糖多孢菌孢子悬液的制备
菌种活化：将4℃冰箱保藏的斜面菌种F2014转接到新鲜的斜面上，37℃生培养8～10天，直至斜面上长满白色的孢子停止培养。
孢子悬浮液的制备：将活化的斜面菌种用含有0.05％吐温的无菌生理盐水洗下，转移至装有30mL无菌水的三角瓶中，三角瓶底加入直径5mm的玻璃珠10粒～15粒与孢子混合，封口后在37℃的摇床中180r/min震荡30min，充分打散孢子，然后用单层灭菌棉纱布过滤以除去菌丝，用离心机分离沉淀孢子，去上清液。再加入40mL洗脱液，重复离心操作3次。制成浓度为(0.8～1.2)×106spores/mL的霉菌孢子悬液。
(2)等离子诱变处理时间的确定
将上述菌体悬浮液与10％(v/v)甘油按1:1的比例混合，在超净工作台中取孢子悬液10μL均匀涂于载片表面上，无菌风吹干制成菌膜，镊子将加样器放入诱变器。在工作气流量为10L/min、等离子体发射源与样品距离为2mm，操作温度23.0～35.0℃的条件下，设定诱变时间为0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s诱变。诱变后，在EP管中预先加入1mL无菌生理盐水，将处理后的载片转移到EP管中震荡5min，洗脱形成菌悬液。将收集到的菌液适当稀释后，取稀释液100μL涂布高氏一号平板，37℃恒温培养120h，每组三个平行。记录菌落数，计算不同ARTP处理时间下诱变致死率，制致死率曲线。以原始菌株菌落形态为参照，观察平板上长出的菌落，挑取生长较好的菌株到新鲜的高氏一号平板。观察平板上菌落的生长情况以及菌落周围的透明圈大小，挑选具有水解圈的菌株，记录水解圈直径和菌落直径大小，通过酶活指数(Enzymatic activity index，EI)水解圈直径与菌落直径的比值挑选正向突变菌株，绘制致正向突变率曲线。由图1可知，当诱变时间为120s，致死率为85％，超过150s时，致死率高于90％，此外，当诱变时间在120s时，正突变率最高，为了选择较好的诱变菌株，我们选择致死率高于80％，正突变率最高的诱变时间，因此选择120s为最佳的诱变时间。
(3)常温等压等离子诱变后正突变菌株的筛选
平板初筛：根据酶活指数(Enzymatic activity index，EI)水解圈直径与菌落直径的比值,初步筛选了26株EI值大高于出发菌株的诱变菌株进行接种生麦曲的制作和黄酒酿酒实验评价，分别为玫瑰糖多孢菌A21、A22、A23、A31、A36、A37、A42、A44、A45、A46、A47、A48、A49、A51、A52、A54、A55、A56、A58、A59、A60、A61、A68、A69、A73、A74。
2、玫瑰糖多孢菌诱变菌株的筛选
(1)糖多孢菌接种生麦曲的制备
分别将活化的玫瑰糖多孢菌种子液(玫瑰糖多孢菌A21、A22、A23、A31、A36、A37、A42、A44、A45、A46、A47、A48、A49、A51、A52、A54、A55、A56、A58、A59、A60、A61、A68、A69、A73、A74)与拌曲的清水混合，调整菌浓度为104～108CFU/mL，得到菌悬液，将上述菌悬液按照20％～26％(v/m)的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团块，防止后续产生坏曲。将拌好的麦曲放到曲筐(长：宽：高＝60*42*26cm)置于曲房，温度45℃，湿度95％发酵6-7d，分别获得成品曲，即：糖多孢菌接种生麦曲。
(2)黄酒的制备
1)酵母活化培养：
将酿酒酵母接种于YPD培养基中，于28℃，150r/min条件下活化培养24h，制备得到酵母培养液；
2)酒母的制作：
取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g工厂生麦曲，800U/g米饭的糖化酶(购自江苏采薇生物科技有限公司)进行糖化，糖化的温度控制在55～65℃，时间3～4小时，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx后，115℃灭菌15min，灭菌后冷却至24～31℃，将步骤(1)中制备得到的酵母培养液按照5％(v/v)的接种量接入，在培养温度28℃，在150r/min条件下培养时间18～24h，培养成熟后即得酒母。
3)黄酒发酵：
落料表见表1和表2，分别按照表1和表2的原料表进行落料
表1：机械黄酒发酵醪落料表(2L发酵体系)
表2：糖多孢菌接种生麦曲发酵黄酒落料表(2L发酵体系)
结果如图2所示，以机械黄酒为对照，采用不同诱变菌株制备的接种生麦曲所酿造的黄酒理化指标存在差异。按照综合指标，筛选得到玫瑰糖多孢菌诱变菌株A58、A54、A48、A22、A45、A44。
实施例2：玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)诱变菌株A22在提高接种生麦曲糖化酶和液化酶酶活中的应用
具体步骤如下：
(1)玫瑰糖多孢菌菌液的制备
分别将玫瑰糖多孢菌F2014、玫瑰糖多孢菌A22、诱变菌株A58、A54、A48、A45、A44接种到放线菌培养基中，37℃恒温培养96h，然后从平板上挑取菌落接种到放线菌液体培养基中，在37℃，150r/min摇床培养48h，分别制得种子液；
然后分别将种子液按照3％(v/v)的接种量再转接到放线菌液体培养基中，在37℃，150r/min摇床培养96h，获得玫瑰糖多孢菌菌液。
(2)将过筛处理后的当年产的红皮或黄皮软质小麦粉碎，小麦的含水量为13％±1.5％(质量分数)，粉碎时确保每粒小麦粉碎至3～5片，呈梅花形；
(3)将步骤(1)制备得到的玫瑰糖多孢菌菌液按照3％～5％(v/m)的接种量与水进行混合，调整菌液的终浓度为104～106spore/mL，得到菌悬液；
(4)将步骤(3)得到的菌悬液按照20％～26％(v/m)的量加入到步骤(2)得到的粉碎后的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团吸水形成的白心结块，同时以不加菌液的水进行拌曲作为对照组，然后装曲框置于45℃，95％的湿度条件下发酵120-122h，最后获得采用不同的玫瑰糖多孢菌制备得到的成品曲，检测成品曲中的糖化酶和液化酶的酶活。
结果如图3所示，结果显示，实施例1筛选得到玫瑰糖多孢菌诱变菌株A58、A54、A48、A22、A45、A44中，采用玫瑰糖多孢菌A22制备得到的成品曲中的糖化酶和液化酶的活力均高于其他菌株。
(5)将诱变株玫瑰糖多孢菌A22和原始菌株玫瑰糖多孢菌F2014按照步骤(1)～(4)的方法进行成品曲的制备，将得到的成曲中的糖化酶和液化酶的酶活效果进行对比，结果见图5。
结果显示，诱变株玫瑰糖多孢菌A22相比原始菌株玫瑰糖多孢菌F2014，糖化酶提升了29％，液化酶提升了47％，最后诱变玫瑰糖多孢菌A22糖化酶为1372.85U/g±55.54U/g，液化酶为1.53U/g±0.09U/g，可见，相比出发菌株，糖化酶和液化酶都得到了提升。
实施例3：玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea)A22在提高黄酒的酒精度、降低黄酒中的高级醇及苦味氨基酸含量中的应用
分别采用实施例2中制备的糖多孢菌接种生麦曲酿造黄酒，具体步骤如下：
1、黄酒的制备
(1)酵母活化培养：
将酿酒酵母接种于YPD培养基中，于28℃，150r/min条件下活化培养24h，制备得到酵母培养液；
(2)酒母的制作：
取600g蒸熟的米饭，加入1600mL清水，60g工厂生麦曲，800U/g米饭的糖化酶(购自江苏采薇生物科技有限公司)进行糖化，糖化的温度控制在55～65℃，时间3～4小时，糖化结束后外观糖度不低于12°Bx后，115℃灭菌15min，灭菌后冷却至24～31℃，将步骤(1)中制备得到的酵母培养液按照5％(v/v)的接种量接入，在培养温度28℃，在150r/min条件下培养时间18～24h，培养成熟后即得酒母。
(3)黄酒发酵：
落料表见表3和表4，分别按照表3和表4的原料表进行落料
表3：机械黄酒发酵醪落料表(2L发酵体系)
表4：糖多孢菌接种生麦曲发酵黄酒落料表(2L发酵体系)
分别制备得到机械黄酒、采用糖多孢菌接种生麦曲制备得到的黄酒。
2、效果表征
结果显示：
(1)采用玫瑰糖多孢菌A58、A54、A48、A22、A45、A44在后酵结束时，酒精度高于对照机械黄酒组(16％vol)，分别是A58(16.3％vol)，A54(16.6％vol)，A48(16％vol)，A22(17.3％vol)，A45(16.4％vol)，A44(16.1％vol)，同时总酸、还原糖和氨基态含量都在黄酒国标要求GB/T 13662-2018范围内。
(2)采用上述生麦曲进行黄酒发酵实验，各个菌株酿造得到的黄酒的理化指标如图4所示，结果发现总酸control组(采用传统工艺酿造的黄酒)含量最高是6.67±0.13(g/L)，A22的总酸含量为6.07±0.14(g/L)，与对照组有显著差异(P<0.05)。氨基态氮的含量control组最高为1.13±0.03(g/L)，诱变菌株A22、A48、A58和A44并没有显著的差异(P>0.05)，黄酒中氨基态氮的含量在0.81-0.86(g/L)。
(3)酒精度相比较对照机械黄酒组的17.37±0.37(％vol)，诱变菌株A22的酒精度18.63±0.52(％vol)高于对照组(采用传统工艺酿造的黄酒)，诱变菌株A44的酒精度最低为16.16±0.59(％vol)。
(4)还原糖含量对照组9.82±0.97(g/L)，与其他诱变菌株存在显著差异(P<0.05)，其中A44诱变菌株的还原糖含量是6.35±0.25(g/L)，其余诱变菌株接种生麦曲酿造的黄酒还原糖含量均低于5g/L，表明黄酒中的还原糖已基本被微生物消耗完全。
综上，结合黄酒的基本理化指标，诱变菌株A22进行酿酒之后的综合指标最优。
3、突变菌株玫瑰糖多孢菌A22遗传稳定性
将筛选所得的高产淀粉酶突变糖多孢菌在高氏一号平板培养基上传代培养6代，并且每代都需要进行固态发酵120h，检测各代菌株产酶能力，结果如表5所示。
固态发酵如下：将活化的玫瑰糖多孢菌种子液与拌曲的清水混合，调整菌浓度为104～108CFU/mL，得到菌悬液，将上述菌悬液按照20％～26％(v/m)的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团块，防止后续产生坏曲。将拌好的麦曲放到曲筐(长：宽：高＝60*42*26cm)置于曲房，温度45℃，湿度95％发酵6-7d，获得成品曲。
表5：突变菌株A22传代稳定性实验
结果显示，玫瑰糖多孢菌A22传代6次后糖化力和液化力没有显著的变化，糖化酶维持在1286-1372U/g，液化酶活力维持在1.43-1.51U/g，酶活相对稳定，故选择该菌株玫瑰糖多孢菌A22保藏于中国典型培养物保藏中心。
4、采用玫瑰糖多孢菌A22，按照步骤1的方法进行黄酒的制备，同时以传统机械麦曲所酿黄酒作为对照，对发酵后制备得到的黄酒理化指标、挥发性风味物质进行测定，结果如表6所示。
表6：糖多孢菌A22接种麦曲酿造黄酒与传统机械麦曲所酿黄酒的理化指标测定结果
结果显示：
(1)由表6可以看出，玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲与酿酒酵母共酵存在明显差异。酒精度是反映酿酒是否正常进行的一个直观指标，从表6可以看出A22接种生麦曲酿造黄酒的酒精度要显著高于传统黄酒的酒精度(18.35％vol vs 17.41％vol)，表明菌株A22麦曲产生大量的淀粉酶水解淀粉用于酵母生长繁殖和产乙醇。
(2)黄酒的风味是黄酒的灵魂所在。不同菌株由于代谢的差异，产生的风味物质也存在差异。表6中显示了A22麦曲酿造的黄酒与传统黄酒的风味存在差异。
黄酒中高级醇含是构成黄酒的主体风物物质，但是含量过高会导致饮后头晕，恶心等不良反应，因此在黄酒发酵过程中要控制高级醇的含量。表6发现用A22接种生麦曲酿造的黄酒总高级醇含量要低于对照组，相比对照组，高级醇含量降低12.7％，表明用A22接种生麦曲发酵黄酒可以改善黄酒的饮用舒适性。
(3)苦味氨基酸：传统机械化黄酒发酵中由于添加了熟麦曲，产生了大量的苦味氨基酸，包括His,Arg,Val,Phe,Ile,Leu,and Lys，这些苦味氨基酸加重了黄酒的苦涩味，阻碍了黄酒企业的发展。采用A22麦曲酿造的黄酒苦味氨基酸的含量相比传统黄酒降低了28％，改善了机械化黄酒的苦涩味，提高了黄酒的感官体验。
实施例4：玫瑰糖多孢菌接种生麦曲(块曲)的生产工艺
(1)将玫瑰糖多孢菌A22接种到放线菌培养基中，37℃恒温培养96h，然后从平板上挑取菌落接种到放线菌液体培养基中，在37℃，150r/min摇床培养48h，制得种子液；然后将种子液按照3％(v/v)的接种量再转接到放线菌液体培养基中扩大培养，在37℃，150r/min摇床培养96h，获得玫瑰糖多孢菌菌液。
(2)将过筛处理后的当年产的红皮或黄皮软质小麦粉碎，小麦的含水量为13％±1.5％(质量分数)，粉碎时确保每粒小麦粉碎至3～5片，呈梅花形；
(3)将步骤(1)制备得到的玫瑰糖多孢菌菌液按照3％～5％(v/m)的接种量与水进行混合，调整菌液的终浓度为104～106spore/mL，得到菌悬液；
(4)将步骤(3)得到的菌悬液按照20％～26％(v/m)的量加入到步骤(2)得到的粉碎后的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团吸水形成的白心结块，搅拌均匀后的曲采用机械制曲机压制特定形状的曲块，曲块长为25(±1)cm，宽为15(±1)cm，高为6(±1)cm。将压制好的曲块静30-40min，将曲块按照丁字形摆放，保证相邻曲块间空气流动，然后将块曲运送到曲房中，在45℃，95％的湿度条件下发酵120-122h，最后获得成品块曲。
实施例5：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在红曲黄酒上的应用
酵母的活化和酒母的制备方法同实施例3，落料麦见表7，按照表7的原料表进行落料，其中，下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2工艺条件制备得到的。
表7：发酵醪落料表(5L发酵体系)
其中，配料表中所述红曲的制备方法如下：
选取干净大米，浸米48h，然后利用蒸饭柜进行蒸熟，冷却至室温后，将培养好的红曲菌孢子用0.1％无菌吐温水从斜面上洗下来，按照106个孢子/g大米拌入米饭中，当饭粒全部染成微红色时，曲房培养；曲房发酵过程中需要不间断翻曲，保持品温28～35℃，培养5～7d后，米中菌丝已繁殖旺盛，里外透红，将曲移至室外，烘干后即得成品红曲。
落料完成后，进行发酵，前酵在28(±2)℃发酵5天，发酵开始10～12h后开始头耙，头耙后每8h开一次耙；后酵在15(±2)℃发酵15天，后酵开始后每24h开一次耙。发酵结束后的红曲黄酒进行理化指标测定，结果见:8，所酿造的红曲黄酒酒精度为16.72±0.23％vol,洛伐他汀55.65±1.43mg/L。
表8：玫瑰糖多孢菌接种生麦曲酿造红曲黄酒的理化指标
实施例6：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在酱油酿造上的应用
下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2工艺条件制备得到的。
挑选饱满干净的大豆，洗净后加水浸泡5～10h，等豆粒完全吸水膨胀后沥水后加压蒸熟；热豆出锅后，冷却至70～80℃左右，加入面粉30～40％(按照大豆质量计)，搅拌均匀，继续冷却至30～40℃，然后加入2％-5％的玫瑰糖多孢菌接种生麦曲，翻拌均匀，保持品温28～30℃左右进行发酵，发酵中间由于微生物代谢产热，需要不间断翻曲通风降温，经72～96h后获得酱油曲；将制好的酱油曲按照1：1.5(m/v)加入盐水，搅拌均匀进行制醅，发酵3～6个月，每15天翻酱一次；发酵结束后压榨酱油醅，过滤除杂及灭菌就可以得到成品酱油。成品酱油的理化指标见下表。
表9：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲酿造酱油的理化指标
实施例7：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在食醋酿造上的应用
选料处理：选择优质糯米200kg，加水400kg，浸米24-48h，然后淋米至无白浆后沥干，蒸熟后冷却至室温；
拌料入缸：糯米入缸前先拌入酒药3～4kg，低温糖化72～96h；
酒精发酵：糖化结束后加水60kg，加入玫瑰糖多孢菌接种生麦曲(所述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2工艺条件制备得到的)12kg，28℃下发酵168～192h，即得成熟酒醅；
制醅：在发酵池内投入麸皮300kg，摊平，将发酵成熟的酒醅打入池内并搅拌均匀，取稻壳10kg均匀摊于池内上层，再取发酵成熟的醋醅10kg，搅拌均匀，覆盖10kg稻壳，撒匀即完成制醅；
醋酸发酵：每发酵24h后进行翻醅，每次翻醅完都加稻壳进行保温保湿，发酵第11天起不再添加稻壳，翻醅使品温冷却，18～20天后检测酸度不再上升时，加盐8kg，密封30～45天；
淋醋与煎醋：取陈酿结束的醋醅，按比例加入炒米色，浸泡数小时后，采用套淋法循环泡淋，得到的醋汁加入食糖调配，澄清后进行煎醋，等品温降至75～80℃后罐装密封保存。糖多孢菌接种生麦曲酿造食醋的理化指标如:10所示。
表10：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲酿造食醋的理化指标
实施例8：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在清酒酿造上的应用
下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2最优工艺条件制备得到的。
(1)抛光：利用抛光机除去原料米质量的20％～25％。碎米粒要尽量的少，精白米与糙米形状相似，原料米的胚芽和沟完全去除；
(2)浸米：在室温条件下浸米时间为24～48h；
(3)蒸饭：米饭颗粒分明，外硬内软，内无白心，疏松不糊，熟而不烂，均匀一致，糯米出饭率一般在140％～150％左右；
(4)落料：落料时米饭温度冷却到25～30℃，其中米饭、米曲、酒母、水组成如表11所示。
表11：300L清酒发酵体系配料表
(5)发酵：起始发酵温度控制在28～30℃，时间为3天，之后在20℃左右发酵，时间为22天，总发酵时间为25天，发酵结束时对清酒的理化指标进行测定，见表12。
表12：糖多孢菌生麦曲所酿清酒的理化指标
实施例9：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在白酒酿造上的应用
下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2工艺条件制备得到的。
(1)将高粱(45～50％)，小麦(8～10％)，玉米(8～10％)，糯米(8～10％)和大米(20～25％)按照比例称好，热水(55～65℃)浸泡24-48h，稻糠(按照粮食总重量的25～30％)在90～100℃蒸40-50min，摊凉备用；
(2)初蒸：将泡好的玉米、高粱小麦沥干表面水分，进行初蒸，时间为40～60min；
(3)焖水：初蒸结束后，加入40～50℃的温水，水面高出粮面13-15cm以上，闷粮20～30min，之后将水沥干；
(4)复蒸：初蒸完的原粮，加入步骤(1)润好水的大米、糯米，充分拌匀后入蒸粮锅进行复蒸，时间为60～70min；
(5)降温下曲：复蒸糟醅冷却到30～35℃，加入步骤(1)处理后的稻糠和加入20～28％白酒大曲，加入8％～10％的玫瑰糖多孢菌接种生麦曲(按照粮食重量计算)，搅拌均匀进行入窖发酵；
(6)封窖发酵：糟醅入窖池后进行盖糟，盖糟高于地面至少40cm，窖泥封窖，窖泥厚度为15～20cm，发酵45～70d；
(7)出池摘酒：将发酵好的糟醅出窖，利用装甑锅进行蒸馏出酒，流酒速度2.0～2.5kg/min，流酒温度25～30℃。
糖多孢菌接种生麦曲应用上述工艺制备的白酒出酒率30％～35％，优质品率90～93％，总酸含量1.12～1.24g/L，总酯含量15.8～16.3g/L，己酸乙酯5.12～6.33g/L，固形物0.5～0.63g/L；所酿造的白酒无色或微黄透明，酯香、焦糊香突出，入口净爽、甜醹柔润，多粮膨化香氤氲，多香自然融合，酒体较醇厚。
实施例10：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在料酒酿造上的应用
下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2最优工艺条件制备得到的。
将干净的糯米加水浸米24-48h，然后蒸饭，将蒸熟的米饭冷却至30～35℃进行落料，落料时以生米为基准，米饭按照140％～150％，水按照125％，酒母按照11％～12％，加入实例2制备的13％～16％的玫瑰糖多孢菌接种生麦曲。
发前酵28(±2)℃发酵5d，发酵开始10～12h后开始开头耙，头耙后每8h开一次耙；后酵15(±2)℃发酵15d，后酵开始后每48h开一次耙。发酵结束后经压榨、煎酒、陈酿，添加食用盐，添加或不添加植物香辛料加工而成，供烹饪用的液体调味料。
应用糖多孢菌接种生麦曲发酵的料酒具有黄酒特有的醇香或植物香辛料特有香味，诸香协调、和谐，氨基态氮的含量在0.5～0.8g/L，酒精度15％vol～17％vol，总酸4～6g/L，符合酿造料酒的标准。
实施例11：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在在甜米酿的应用
下述玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲为采用实施例2最优工艺条件制备得到的。
将大米在常温下浸泡24-48h左右至充分吸水；将浸泡后的米进行沥干，常压下蒸煮30～40min；米饭蒸熟后冷却至25-30℃左右，转移至发酵罐内，按比例添加0.5％～0.8％玫瑰糖多孢菌接种生麦曲，接种0.8％～1.5％酿酒酵母，搅拌均匀，加入生米质量1～1.5倍的饮用水，在28(±2)℃条件下的恒温发酵48～72h。所得甜米酿酒精度3～5％(v/v)，香气协调、浓郁、质地均匀，口感酸甜适口。
实施例12：玫瑰糖多孢菌A22接种生麦曲在在米酒中的应用
下述玫瑰糖多孢菌接种生麦曲为采用实施例2工艺条件制备得到的。
将大米在常温下浸泡24-48h左右至充分吸水；将浸泡后的米进行沥干，常压下蒸煮30～40min；米饭蒸熟后冷却至25-30℃左右，转移至发酵罐内，按比例添加5％～10％玫瑰糖多孢菌接种生麦曲进行糖化，糖化结束后补加米饭，接种5％～10％接种酿酒酵母，搅拌均匀，加入原米质量1～1.5倍的饮用水，在28～30℃条件下的发酵3～5天，降低温度至10～15℃发酵10～15天，发酵结束后，压榨、过滤得到米酒。米酒酒精度5～10％(v/v)，富含米香果香、香气协调、浓郁、质地均匀。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株玫瑰糖多孢菌(Saccharopolyspora rosea )A22，已于2022年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221039。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的玫瑰糖多孢菌A22或其发酵液。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，玫瑰糖多孢菌A22的含量至少为1.0×106 spore/mL。
4.一种生麦曲，其特征在于，所述生麦曲为，将小麦粉碎，将权利要求1所述玫瑰糖多孢菌A22菌悬液按照一定的添加量加到粉碎的小麦中，搅拌均匀，在曲房发酵6-7 d，制备得到生麦曲。
5.根据权利要求4所述的生麦曲，其特征在于，所述玫瑰糖多孢菌A22菌悬液的浓度为104~108 CFU/mL，将玫瑰糖多孢菌A22菌悬液按照20%~26%的添加量接种到粉碎的小麦中，搅拌均匀后进行发酵。
6.权利要求1所述的玫瑰糖多孢菌A22或权利要求2或3所述的微生物菌剂或权利要求4或5所述的生麦曲在制备发酵食品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵食品为酒精饮料、豆制品、发酵蔬菜或调味品。
8.权利要求1所述的玫瑰糖多孢菌A22或权利要求2所述的微生物菌剂在提高生麦曲的糖化力和液化力中的应用。
9.权利要求1所述的玫瑰糖多孢菌A22或权利要求2所述的微生物菌剂或权利要求4或5所述的生麦曲在提高黄酒酒精度、降低黄酒中高级醇含量、或降低黄酒中苦味氨基酸含量中的应用。
10.一种黄酒的酿造方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的生麦曲直接添加至含有酒母的原料中进行发酵制备得到。
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