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CN115108931B - 一种托灭酸类衍生物及其制备与应用 - Google Patents

一种托灭酸类衍生物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种托灭酸类衍生物及其制备与应用。本发明托灭酸类衍生物以化合物对氟苯胺或对羟基苯胺为起始原料，经过基团保护、亲核取代或亲电取代、硝基氢化、缩合、脱除保护基五步反应合成得到。本发明所制备的托灭酸类衍生物具有拓扑酶Ⅰ和环氧化酶‑2(COX‑2)抑制作用，通过线粒体介导的凋亡途径促进细胞凋亡，诱导活性氧爆发和线粒体膜电位增加，阻滞细胞周期在G1/G0期，同时通过抑制NF‑κB/IκB通路影响炎症微环境从而抑制肿瘤的生长，具有良好的抗结肠癌活性。该类化合物在动物水平上具有良好的药代动力学特征和抗肿瘤作用，可应用于制备结肠癌治疗药物。

Description

一种托灭酸类衍生物及其制备与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种托灭酸类衍生物及其制备方法；本发明同时还涉及托灭酸类衍生物在抗结肠癌药物药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)作为一种肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。根据全球癌症观察组织GLOBOCAN 2020的数据，在2020年，结直肠癌是世界上发病率第三高的癌症，仅次于乳腺癌和肺癌，估计有190多万新病例，在死亡率方面排名第二，共有935173人死亡。而在我国近年来结肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，因此结肠癌的治疗是目前亟待解决的问题。外科手术切除仍是当前结肠癌的主要治疗手段，可行手术切除病例约占70%，根治术后33%病例会出现复发，近半数病例死于转移。因此化学药物治疗在大肠癌的治疗中占有十分重要的地位，既是以手术为主的综合治疗中的重要组成部分，也是不能手术切除的Dukes D期及术后复发、转移病例的主要治疗手段。目前对于结肠癌的化学治疗首选的化疗药物是5-氟尿嘧啶(5-Fu)及其与其他药物的联用。但5-Fu常见的化疗毒副作用的是中性粒细胞的减少、胃肠道反应和手-足感觉障碍等，同时易被产生耐药性,因此开发新型的结肠癌治疗药物具有重要的临床意义。
拓扑异构酶I（Topo I）是一类能够催化DNA链的断裂和结合的酶，已被广泛应用为抗癌的经典靶点。Topo I抑制剂可通过抑制Topo I 从而阻碍DNA合成，使DNA断裂，阻断DNA合成，干扰细胞分裂周期以及使染色体DNA断裂、降解等反应，在机体多种调控蛋白协同作用下，最终导致肿瘤细胞的死亡。已有研究表明相较于正常的结直肠组织，Topo I在结直肠癌变组织中高表达，且Topo I 抑制剂伊立替康已被应用为临床作为局部进展期和转移结直肠癌用药。而COX-2作为在结直肠癌种高表达的另一类酶，大约 40% ～50%的结肠腺瘤和80% ～ 90% 的结肠癌组织中出现COX-2 的高表达，COX-2 的表达不仅是结肠息肉恶变的典型相关危险因素，在结肠癌进展中也发挥着重要的作用：①通过分泌PGE2，增加促血管生成因子VEGF等刺激内皮细胞的迁移和诱导血管的生成②通过抑制促凋亡的蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax的表达和活化，促进抑制凋亡的Bcl-2蛋白的表达从而抑制癌症细胞的表达③通过增加基质金属蛋白酶MMP-2,MMP-9的含量以增强肿瘤的浸润和转移。已有实验表明COX-2抑制剂对早期结直肠癌的发生具有一定的预防作用，且与部分可诱导癌细胞凋亡的药物合用可增强其细胞毒作用。因此COX-2抑制剂具有治疗结直肠癌的较大潜力。综上，同时靶向Topo I和COX-2是设计结肠癌治疗药物的较好出发点。
基于前期研究，我们实验室目前已经发展了一类具有Topo I 和COX-2双重抑制作用的N-芳基邻氨基苯甲酸类骨架，其中化合物I-1拥有其中最好的的双靶点抑制作用和抗增殖活性，但其靶点抑制活性较差，与其细胞增殖抑制活性不符，可能存在其他的靶点。并且该分子具有较差的水溶性和一定脑分布的特点。综上I-1不适合直接作为结肠癌治疗药。因此我们需要对其进行靶点活性和水溶性改善，以期发展一种具有结肠癌治疗潜力的化合物。在观察I-1与以上两个靶点蛋白的分子对接结果后，我们尝试在其甲氧基部分直接引入常用于改善水溶性的乙二醇结构及其类似物，分子对接结果显示：乙二醇末端的羟基结构有利于分子与靶点蛋白的氢键作用，有利于增加其靶点活性。综上我们合成了一系列该类分子，并进行其靶点抑制活性和结肠癌细胞增殖抑制活性测试，以期找到能有效治疗结肠癌新型COX-2和Topo Ⅰ双靶点抑制剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种托灭酸类衍生物及其制备方法；
本发明的另一个目的是提供托灭酸类衍生物在制备抗结肠癌药物中的应用。
本发明一种托灭酸类衍生物，其结构式如下：
其中，R为4-（2-羟基乙氧基）苯胺，4-（2-甲氧基乙氧基）苯胺，4-（2-羟基乙酸酯基）苯胺，4-（2-甲氧基乙酸酯基）苯胺，4-（2-羟基乙氨基）苯胺，4-（2-氨基乙氧基）苯胺，4-（4-吗啉）苯胺，4-（1-哌嗪）苯胺，4-（4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪）苯胺，4-（4-甲基-1-哌嗪）苯胺， 4-（4-乙基-1-哌嗪）苯胺，4-（4-丙基-1-哌嗪）苯胺，4-（4-异丙基-1-哌嗪）苯胺，4-（4-丁基-1-哌嗪）苯胺，4-（4-苯基-1-哌嗪）苯胺，4-（4甲磺酰基-1-哌嗪）苯胺，4-（4乙酰基-1-哌嗪）苯胺，4-吗啉基，1-4-甲氧基哌啶，4-磺胺或4-氨基苯甲酰氨。
本发明一种托灭酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以硝基化合物和溴乙烷衍生物、乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物为原料，以碳酸钾为碱，以N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜为溶剂，在氩气保护下，25℃~120 ℃下反应6h~12h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去溶剂，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；所述硝基化合物为对硝基苯酚或对氟硝基苯，其中对硝基苯酚与溴乙烷衍生物反应，对氟硝基苯与乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物反应；所述溴乙烷衍生物为2-溴乙醇，2-溴乙基甲基醚或N-叔丁氧羰基溴乙胺；所述哌嗪衍生物为1-叔丁氧羰基哌嗪，1-甲基哌嗪，1-乙基哌嗪，1-丙基-哌嗪，1-异丙基哌嗪，1-丁基哌嗪，1-苯基哌嗪，1-甲磺酰基哌嗪或1-乙酰基哌嗪；
化合物2的结构式为：，R2为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-羟基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基，4-甲基-1-哌嗪基，4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基， 4-丁基-1-哌嗪基， 4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基，4-乙酰基-1-哌嗪基中的一种；
K2CO3的用量是硝基化合物摩尔量的3~10倍；溴乙烷衍生物、乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物的用量为硝基化合物摩尔量的1~3倍。
（2）以甲氧基乙酸和对硝基苯酚为原料，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应10~18h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为：；
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为对硝基苯酚的1~1.5倍；甲氧基乙酸与对硝基苯酚的摩尔比为1:1~1:2；4-二甲氨基吡啶的用量为对硝基苯酚摩尔量的0.2~0.3倍。
（3）以二碳酸二叔丁酯和步骤（1）得到的化合物2中的2-（4-硝基苯）乙醇胺为原料，以4-二甲氨基吡啶为碱，以乙腈为溶剂，在氩气保护的条件下，于20~30℃反应1.5~2.5h，将反应液旋干，柱层析分离得到化合物4；
化合物4的结构式为：；
二碳酸二叔丁酯的用量为2-（4-硝基苯）乙醇胺摩尔量的4~6倍；4-二甲氨基吡啶的用量为2-（4-硝基苯）乙醇胺摩尔量的2~3倍。
（4）以化合物2、化合物3或化合物4为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，20~30℃反应8h~24h，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物5；
化合物5的结构式为，R3为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-甲氧基乙酸酯基，2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基， 4-甲基-1-哌嗪基， 4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基， 4-丁基-1-哌嗪基，4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基或4-乙酰基-1-哌嗪基；
钯碳的用量为化合物2、化合物3或化合物4摩尔量的0.1~0.3倍。
（5）将托灭酸作为反应原料，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应25~35min，随后加入另一反应物化合物5，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，三乙胺为碱，继续在室温下反应8h~12h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物8；
化合物8的结构式为：，R3为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基，2-甲氧基乙酸酯基，2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基， 4-甲基-1-哌嗪基， 4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基， 4-丁基-1-哌嗪基， 4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基，4-乙酰基-1-哌嗪基；其中R3为2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基、2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基取代的两种化合物为中间产物（包括实施例中的8-1、8-2），其余为目标化合物（包括实施例中的W1、W2、W4、W13~W21）；
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为托灭酸摩尔量的1~2倍，化合物5的用量为托灭酸摩尔量的1~1.5倍，4-二甲氨基吡啶用量为托灭酸摩尔量的0.2~0.3倍，三乙胺用量为托灭酸摩尔量的2.5~3.5倍。
（6）以化合物8中R3为2-甲氧基乙酸酯基取代的化合物（即实施例中的W4）为反应原料，二氯甲烷作为反应溶剂，在氩气保护的条件下，在-30℃加入三溴化硼，反应1~2h，反应完全后加入冰水淬灭反应，随后使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物化合物W3；所述三溴化硼用量为反应原料摩尔量的1~2倍；
化合物W3结构为。
（7）以化合物8中R3为2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基、2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基或4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基取代的化合物（即实施例中的8-1、8-2或W13）为反应原料，二氯甲烷作为溶剂，在氩气条件下，加入三氟乙酸，室温下反应8~15h，反应完全后直接悬干，加入乙酸乙酯溶解，用氢氧化钠溶液洗涤，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标化合物W5、W8或W7；所述三氟乙酸的用量为反应原料摩尔量的1.5~2.5倍；
化合物W5结构式为：；
化合物W8结构式为：；
化合物W7结构。
本发明托灭酸衍生物的制备方法，将托灭酸作为反应原料，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应25~35min，随后加入胺类化合物，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，三乙胺为碱，室温下继续反应8h~12h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物化合物9（实施例中的W9~W12）；所述胺类化合物为4-甲氧基哌啶、吗啉、磺胺或对氨基苯甲酰胺；所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐用量为托灭酸摩尔量的1~2倍；所述胺类化合物的用量为托灭酸摩尔量的1~1.5倍；4-二甲氨基吡啶用量为托灭酸摩尔量的0.2~0.3倍；三乙胺用量为托灭酸摩尔量的2.5~3.5倍。
化合物9的结构式为：，R5为4-吗啉基，1-4-甲氧基哌啶，4-磺胺或4-氨基苯甲酰氨。
本发明所制备的托灭酸类化合物的合成路线如下：
合成路线中，R1为F或羟基； R2为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-羟基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基， 4-甲基-1-哌嗪基，4-乙基-1-哌嗪基，4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基，4-丁基-1-哌嗪基， 4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基， 4-乙酰基-1-哌嗪基中的一种；R3为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基，2-羟基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基，4-甲基-1-哌嗪基， 4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基，4-丁基-1-哌嗪基，4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基，4-乙酰基-1-哌嗪基中的一种； R4为2-羟基乙氨基，2-氨基乙氧基或4-哌嗪；R5为4-吗啉基，1-4-甲氧基哌啶，4-磺胺或4-氨基苯甲酰氨。
本发明所制备的托灭酸衍生物具备COX-2和Topo Ⅰ的双重抑制效果。可通过线粒体介导的凋亡途径促进细胞凋亡，诱导活性氧爆发和线粒体膜电位增加，阻滞细胞周期在G1/ G0期，同时通过抑制NF-κB/IKB 通路影响炎症微环境从而抑制肿瘤的生长，具有良好的抗结肠癌活性。该类化合物在动物水平上具有良好的药代动力学特征和抗肿瘤作用，可应用于制备结肠癌治疗药物。
本发明所制备的托灭酸衍生物通过COX-2抑制剂筛选实验和Topo I介导的DNA松弛试验显示，具有COX-2和Topo Ⅰ双重抑制作用。
本发明所制备的托灭酸衍生物通过MTT法测定发现在结肠癌细胞（HT-29,RKO,LOVO, HCT116,SW480）上具有较好的增殖抑制活性。
本发明所制备的托灭酸衍生物通过周期试剂盒、凋亡试剂盒、活性氧试剂盒和线粒体膜电位试剂盒发现在HT-29和RKO上影响细胞周期，促进细胞凋亡，促进活性氧爆发，诱导线粒体膜电位降低。
本发明所制备的托灭酸衍生物可以抑制HT-29和RKO的平板克隆增殖。
本发明所制备的托灭酸衍生物通过Western blot 实验发现通过线粒体介导的凋亡途径促进细胞凋亡，也可通过抑制NF-κB/IKB 通路影响炎症微环境从而抑制肿瘤的生长。
本发明所制备的托灭酸衍生物经水溶性测定实验显示具有较好的水溶性，通过大鼠药代动力学实验发现其具有良好的药代动力学参数。
本发明所制备的托灭酸衍生物在HT-29细胞所致的裸鼠异位肿瘤模型中显示较好的抑瘤作用，同时肿瘤的HE切片和Ki67免疫组化显示托灭酸衍生物可诱导肿瘤的凋亡和坏死从而抑制肿瘤的发展。CD31免疫组化切片显示托灭酸衍生物可抑制肿瘤中微血管的生成从而抑制肿瘤的生长。
综上所述，本发明托灭酸类衍生物以化合物对氟苯胺和对羟基苯胺为起始原料，经过上保护、亲核取代或亲电取代、硝基氢化、脱保护、缩合五步反应合成得到。本发明所制备的托灭酸类衍生物具有拓扑酶Ⅰ和环氧化酶-2(COX-2)抑制作用，通过线粒体介导的凋亡途径促进细胞凋亡，诱导活性氧爆发和线粒体膜电位增加，阻滞细胞周期在G1/ G0期，同时通过抑制NF-κB/IKB 通路影响炎症微环境从而抑制肿瘤的生长，具有良好的抗结肠癌活性。该类化合物在动物水平上具有良好的药代动力学特征和抗肿瘤作用，可应用于制备结肠癌治疗药物。
附图说明
图1为母体化合物I-1与合成化合物W1与COX-2和Topo Ⅰ的对接结果；
图2为本发明合成化合物对Topo Ⅰ介导的DNA松弛的的抑制作用；
图3为所选化合物的DNA嵌入/解旋实验；
图4为所选化合物的单细胞凝胶电泳实验；
图5为所选化合物对结肠癌HT-29细胞Hoechst 33342染色情况；
图6为所选化合物对结肠癌HT-29凋亡的影响；
图7为所选化合物对结肠癌RKO凋亡的影响；
图8为所选化合物对结肠癌HT-29细胞周期分布的影响；
图9为所选化合物对结肠癌RKO细胞周期分布的影响；
图10为所选化合物对结肠癌HT-29细胞活性氧爆发的影响；
图11为所选化合物对结肠癌RKO细胞活性氧爆发的影响；
图12为所选化合物对结肠癌HT-29细胞线粒体膜电位的影响；
图13为所选化合物对结肠癌RKO细胞线粒体膜电位的影响；
图14为结肠癌HT-29细胞和RKO细胞在所选化合物处理下的生存曲线；
图15为所选化合物对结肠癌HT-29细胞和RKO细胞克隆群落形成的影响；
图16为所选化合物对结肠癌HT-29细胞和RKO细胞凋亡相关蛋白的影响；
图17为所选化合物对结肠癌HT-29细胞和RKO细胞NF-κB通路相关蛋白的影响；
图18为所选化合物对结肠癌HT-29细胞致瘤的裸鼠异位模型中肿瘤大小的影响；
图19为所选化合物对结肠癌HT-29细胞致瘤的裸鼠异位模型中肿瘤的生长曲线和肿瘤重量的影响；
图20为所选化合物对裸鼠异位移植瘤模型中的肿瘤相关蛋白和肿瘤状态的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
实施例1
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(2-hydroxyethoxy)phenyl)benzamide (化合物W1)
化合物W1的结构式为：
（1）将4-硝基苯酚（7.19 mmol）和碳酸钾（71.9 mmol）加入100 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入24 mL的N,N-二甲基甲酰胺后，将2-溴乙醇（21.57 mmol）滴加到圆底烧瓶中，在80 ℃中反应12 h。经TLC监测反应完成后，停止加热将反应液冷却至室温，加水稀释，使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-(4-nitrophenoxy)ethan-1-ol，产率为60%。
（2）将2-(4-nitrophenoxy)ethan-1-ol（2.73 mmol），10%钯碳(3-5 mol% Pd)加入25 mL圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，置换氢气。25℃反应8h。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物2-(4-aminophenoxy)ethan-1-ol。
（3）将托灭酸（1 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(1.5mmol)，加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气，加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应30min。随后加入2-(4-aminophenoxy)ethan-1-ol（1.2 mmol），4-二甲氨基吡啶（0.25mmol），三乙胺（3 mmol）。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(2-hydroxyethoxy)phenyl)benzamide (化合物W1) ，产率为50%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.16 (s, 1H), 7.96(s, 1H), 7.57 (dd, J = 7.8, 1.1 Hz, 1H), 7.48 – 7.42 (m, 2H), 7.30 – 7.26 (m,2H),7.21 (dd, J = 7.7, 0.9 Hz, 1H), 7.15 – 7.05 (m, 1H), 6.98 (d, J = 8.3 Hz,1H), 6.92 –6.87 (m, 1H), 6.81 – 6.75 (m, 1H),4.08 – 4.03 (m, 2H), 3.98 – 3.92(m, 2H), 2.33 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.99, 155.93, 146.51,141.15, 135.57, 132.74, 131.00, 130.13, 127.61, 126.85, 124.65,122.98,120.80, 117.94, 117.86, 115.54, 115.06, 69.56, 61.50, 15.01.
实施例2
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(2-methoxyethoxy)phenyl)benzamide (化合物W2).
化合物W2的结构式为：
（1）将实施例1步骤（1）中的原料2-溴乙醇替换为2-溴乙基甲基醚，其余步骤同实施例1制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.97 (s, 1H),7.56 (dd,J= 7.9, 1.2 Hz, 1H), 7.44 (dd,J= 9.6, 2.6 Hz, 2H), 7.30 – 7.24 (m,1H), 7.21 (dd,J= 7.7, 1.0 Hz, 1H), 7.14 – 7.04 (m, 2H), 6.99 (d,J= 8.0 Hz,1H), 6.93 – 6.88 (m, 2H), 6.80 – 6.74 (m, 1H),4.09 (dd,J= 5.4, 3.9 Hz, 2H),3.75 (dd,J= 5.4, 3.9 Hz, 2H), 3.45 (s, 3H), 2.33 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.92, 156.01, 146.38, 141.14, 135.50,132.64, 130.80, 129.98, 127.61, 126.80, 124.51, 122.82, 120.64, 117.93,117.91, 115.46,115.03, 71.06, 67.55, 59.26, 14.97.
实施例3
4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl 2-methoxyacetate (化合物W4).
化合物W4的结构式为：
（1）将4-硝基苯酚（7.19 mmol）和甲氧基乙酸（7.19 mmol）加入100 mL圆底烧瓶中，加入16ml二氯甲烷，随后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(7.91mmol)和4-二甲氨基吡啶（1.80mmol），并置换为氩气，在室温下反应18h，经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物4-nitrophenyl 2-methoxyacetate，产率为60%。
（2）将4-nitrophenyl 2-methoxyacetate（2.73 mmol），10%钯碳(3-5 mol% Pd)加入25 mL圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，置换氢气。25℃反应8h。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物4-aminophenyl2-methoxyacetate。
（3）将托灭酸（1 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(1.5mmol)，加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气，加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应30min。随后加入4-aminophenyl 2-methoxyacetate（1.2 mmol）, 4-二甲氨基吡啶（0.25mmol），三乙胺（3 mmol）。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl2-methoxyacetate(化合物W4)，
收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.24 (s, 1H), 8.11 (s, 1H), 7.69 (t,J = 8.9 Hz, 3H), 7.40 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.28 –7.16 (m, 4H),7.09 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.91 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.40 (s,2H), 3.65 (s, 3H), 2.45 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.06, 167.91,146.73, 146.67, 141.03, 135.67, 135.62, 133.00, 130.34, 127.60, 126.91,124.86, 122.04, 121.86, 121.09, 117.97, 117.52, 115.59, 69.83, 59.67, 15.04.
实施例4
4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl 2-hydroxyacetate (化合物W3).
化合物W3的结构式为：
（1）将4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl 2-methoxyacetate（化合物W4，1mmol)作为原料加入50ml圆底烧瓶中并置换氩气，加入10ml干燥的二氯甲烷，在-30℃的温度下，缓慢逐滴滴加BBr3(1.5mmol)，反应1h，经TLC监测反应完成后加入冰水淬灭反应，随后使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl 2-hydroxyacetate(化合物W3)，产率为10%.1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.70 (dd, J = 7.9, 1.1 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.9Hz, 2H), 7.28 – 7.21 (m, 1H), 7.19 – 7.13 (m, 1H), 7.08 (d, J = 8.9 Hz,2H), 7.05 – 7.01 (m, 2H), 6.93 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.80(dd, J = 13.2, 5.8Hz, 1H), 4.37 (s, 2H), 2.26 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 173.03, 170.03,148.05, 146.83, 142.65, 137.48, 136.29, 133.47,130.04, 129.91, 128.01,125.02, 123.29, 122.70, 120.98, 119.98, 119.30, 116.34, 61.05, 14.96.
实施例5
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-morpholinophenyl)benzamide(化合物W6).
化合物W6的结构式为：
（1）将4-氟硝基苯（7.19 mmol）和碳酸钾（71.9 mmol）加入100 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入24 mL的甲基亚砜后，将吗啉（7.19 mmol）滴加到圆底烧瓶中，在120℃中反应12 h。经TLC监测反应完成后，停止加热将反应液冷却至室温，加水稀释，使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物4-(4-nitrophenyl)morpholine，产率为60%。
（2）将4-(4-nitrophenyl)morpholine（2.73 mmol），10%钯碳(3-5 mol% Pd)加入25 mL圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，置换氢气，25℃反应8h。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物4-morpholinoaniline。
（3）将托灭酸（1 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(1.5mmol)，加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气，加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应30min。随后加入4-morpholinoaniline（1.2 mmol）, 4-二甲氨基吡啶（0.25mmol），三乙胺（3mmol）。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-morpholinophenyl)benzamide (化合物W6)，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.20 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.56 (d,J=7.2 Hz, 1H), 7.45 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 7.28 (d,J= 7.5 Hz, 0H), 7.22 (d,J= 7.6Hz, 0H), 7.15 – 7.04 (m, 1H), 7.00 (d,J= 8.3 Hz, 0H), 6.90 (d,J= 8.9 Hz, 1H),6.78 (t,J= 7.4 Hz, 0H), 3.90 – 3.79 (m, 4H), 3.16 – 3.06 (m, 4H), 2.34 (s,3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.88, 148.71, 146.38, 141.17, 135.52,132.60, 130.11, 129.99, 127.58, 126.80, 124.52, 122.53, 120.62, 118.03,117.90, 116.29,115.48, 66.90, 49.64, 14.98.
实施例6
tert-butyl 4-(4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl)piperazine-1-carboxylate(化合物W13).
化合物W13的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为哌嗪-1-羧酸叔丁酯，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.79 (d,J= 5.9 Hz,1H), 7.57 (d,J= 7.0 Hz, 1H), 7.46 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 7.29 (d,J= 8.2 Hz, 1H),7.21 (d,J= 7.7 Hz, 1H), 7.13 (d,J= 7.0 Hz, 1H), 7.08 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 6.98(d,J= 8.4 Hz, 1H), 6.94 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 6.81 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 3.77 –3.55 (m, 4H), 3.25 – 3.03 (m, 4H), 2.34 (s, 3H), 1.49 (s, 9H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.87, 154.85, 148.84, 146.64, 141.22,135.63, 132.74, 130.43, 130.30, 127.51, 126.88, 124.73, 122.48, 120.97,117.97, 117.94,117.40, 115.58, 80.08, 49.88, 28.57, 15.07.
实施例7
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W14).
化合物W14的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为N-甲基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (dd,J=7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.48 – 7.34 (m, 2H), 7.32 – 7.27 (m, 1H),7.22 (dd,J= 7.7,1.2 Hz, 1H), 7.13 (dd,J= 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.08 (d,J= 7.8 Hz, 1H), 6.98 (d,J=7.7 Hz, 1H), 6.96 – 6.92 (m, 2H), 6.83 – 6.77 (m, 1H), 3.33 – 3.06 (m, 4H),2.69 – 2.47 (m, 5H),2.36 (s, 3H), 2.34 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.84, 148.92, 146.65, 141.26, 135.64,132.70, 130.34, 129.85, 127.47, 126.87, 124.73, 122.49, 121.01, 118.07,117.94, 116.79,115.57, 55.20, 49.54, 46.27, 15.08.
实施例8
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-ethylpiperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W15).
化合物W15的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为N-乙基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.44 (d,J= 9.0 Hz, 2H), 7.33 – 7.27 (m, 1H), 7.24 – 7.18(m, 1H), 7.18 – 7.03 (m, 2H), 7.00 – 6.92 (m, 3H),6.87 – 6.76 (m, 1H), 3.31 –3.11 (m, 4H), 2.71 – 2.54 (m, 4H), 2.48 (q,J= 7.2 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.14(t,J= 7.2 Hz, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.84, 148.93, 146.50, 141.23, 135.57,132.61, 130.17, 129.73, 127.51, 126.82, 124.60, 122.51, 120.82, 118.09,117.91, 116.64,115.51, 52.87, 52.45, 49.51, 15.02, 12.10.
实施例9
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-isopropylpiperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W16).
化合物W16的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为N-异丙基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.44 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 7.31 – 7.27 (m, 1H), 7.25 – 7.17(m, 1H), 7.16 – 7.04 (m, 2H), 6.96 (dd,J= 10.5, 8.8 Hz, 3H), 6.80 (dd,J=11.0, 4.1 Hz, 1H), 3.29 – 3.13 (m, 4H), 2.77 – 2.61 (m, 5H), 2.34 (s, 3H),1.10 (d,J= 6.5 Hz, 6H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.84, 149.10, 146.64, 141.27, 135.64,132.68, 130.34, 129.74, 127.47, 126.87, 124.72, 122.48, 121.01, 118.10,117.94, 116.75,115.57, 54.65, 49.95, 48.85, 18.77, 15.08.
实施例10
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-phenylpiperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W17).
化合物W17的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为N-苯基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.19 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.57 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.47 (t,J= 6.1 Hz, 2H), 7.30 (dt,J= 7.1, 6.4 Hz, 3H), 7.25– 7.20 (m, 1H), 7.14 (dd,J= 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.08 (t,J= 7.9 Hz, 1H), 7.03 –6.98 (m, 5H), 6.90 (t,J= 7.3 Hz, 1H), 6.85 – 6.78 (m, 1H), 3.38 – 3.31 (m,8H),2.35 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.86, 151.35, 148.85, 146.66, 141.25,135.65, 132.74, 130.33, 130.20, 129.35, 127.49, 126.89, 124.75, 122.51,121.02, 120.28,117.96, 117.09, 49.88, 49.54, 15.09.
实施例11
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-(methylsulfonyl)piperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W18).
化合物W18的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为1-甲磺酰基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.17 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.57 (dd,J= 7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.50 – 7.45 (m, 2H), 7.31 – 7.27 (m, 1H),7.23 – 7.19 (m,1H), 7.15 – 7.05 (m, 2H), 7.00 – 6.94 (m, 3H), 6.84 – 6.79 (m, 1H), 3.39 (dd,J= 6.1, 3.7 Hz, 4H), 3.27 (dd,J= 6.0, 3.9 Hz, 4H), 2.83 (s, 3H), 2.34 (s,3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.90, 148.13, 146.73, 141.19, 135.67,132.85, 131.04, 130.38, 127.48, 126.91, 124.83, 122.53, 121.08, 117.98,117.84, 117.81,115.64, 49.83, 45.92, 34.60, 15.08.
实施例12
N-(4-(4-acetylpiperazin-1-yl)phenyl)-2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamide (化合物W19).
化合物W19的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为1-乙酰基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.17 (s, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.57 (dd,J=7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.51 – 7.45 (m, 2H), 7.29 (dd,J= 11.4, 4.3 Hz, 1H), 7.24 –7.19 (m, 1H), 7.13 (dd,J= 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.09 (d,J= 7.8 Hz, 1H), 7.02 –6.91 (m, 3H), 6.85 – 6.77 (m, 1H),3.81 – 3.74 (m, 2H), 3.66 – 3.59 (m, 2H),3.19 – 3.08 (m, 4H), 2.34 (s, 3H), 2.14 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.16, 167.89, 148.47, 146.70, 141.22,135.66, 132.80, 130.75, 130.35, 127.51, 126.90, 124.79, 122.51, 121.04,117.96, 117.92,117.50, 115.61, 50.23, 49.84, 46.36, 41.46, 21.49, 15.08.
实施例13
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(4-propylpiperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W20).
化合物W20的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为1-丙基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) 9.18 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (dd,J=7.9, 1.4 Hz, 1H), 7.46 – 7.41 (m, 2H), 7.30 – 7.26 (m, 1H),7.22 (dd,J= 7.7,1.1 Hz, 1H), 7.14 – 7.05 (m, 1H), 6.98 (d,J= 7.9 Hz, 1H), 6.96 – 6.92 (m,1H), 6.83 – 6.78 (m, 1H),3.27 – 3.15 (m, 4H), 2.66 – 2.57 (m, 4H), 2.37 (dd,J= 8.9, 6.7 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.56 (dd,J= 15.4, 7.5 Hz, 2H), 0.93 (t,J=7.4 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.84, 149.04, 146.64, 141.27, 135.64,132.69, 130.34, 129.78, 127.48, 126.87, 124.73,122.48, 121.02, 118.09,117.94, 116.74, 115.57, 60.84, 53.33, 49.58, 20.17, 15.08, 12.11实施例14
N-(4-(4-butylpiperazin-1-yl)phenyl)-2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamide (化合物W21).
化合物W21的结构式为：
将实施例5步骤（1）中的原料吗啉替换为1-丁基哌嗪，其余步骤同实施例5制备而得，收率35%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.72 (s, 1H), 7.56 (dd,J=7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.49 – 7.38 (m, 2H), 7.34 – 7.27 (m, 1H),7.21 (dd,J= 7.7,1.1 Hz, 1H), 7.13 (dd,J= 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.07 (t,J= 7.9 Hz, 1H), 7.01 –6.91 (m, 3H), 6.84 – 6.76 (m, 1H), 3.36 – 3.00 (m, 4H), 2.78 – 2.50 (m, 4H),2.39 (dd,J= 8.9, 6.7 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.57 – 1.45 (m, 2H), 1.35 (dq,J=14.5, 7.3 Hz, 2H), 0.94 (t,J= 7.3 Hz, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.84, 149.04, 146.64, 141.27, 135.64,132.69, 130.35, 129.76, 127.47, 126.87, 124.73, 122.48, 121.02, 118.09,117.94, 116.73,115.57, 58.67, 53.38, 49.59, 29.21, 20.94, 15.08, 14.21.
实施例15
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)benzamide (化合物W7).
化合物W7的结构式为：
化合物W13的合成同实施例6，将2-((2-(1H-indol-3-yl)ethyl)carbamoyl)phenyldiphenylcarbamate (化合物W13，1mmol)作为原料置于50ml圆底烧瓶，置换为氩气，加入10ml干燥的二氯甲烷，随后滴加三氟乙酸（2mmol），在室温下反应8h，经TLC监测反应完成后，直接减压旋干，加入二乙溶解，用1M的NaOH溶液洗涤1次，有机相干燥旋干，柱层析分离得到产物2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)benzamide，产率为20%。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.56 (dd,J= 7.9,1.3 Hz, 1H), 7.49 – 7.43 (m, 2H), 7.31 – 7.27 (m, 1H),7.22 (dd,J= 7.7, 1.1Hz, 1H), 7.13 (dd,J= 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.08 (t,J= 7.9 Hz, 1H), 6.98 (d,J= 8.6Hz, 1H), 6.96 – 6.92 (m, 2H), 6.83 – 6.78 (m, 1H), 3.24 – 3.17 (m, 4H), 3.16– 3.08 (m, 4H),2.34 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.88, 148.82, 146.51,141.19, 135.58, 132.68, 130.38, 130.15, 127.57, 126.84, 124.63,122.51,120.81, 117.99, 117.93, 117.13, 115.52, 49.84, 45.38, 15.04.
实施例16
N-(4-(2-aminoethoxy)phenyl)-2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamide (化合物W8).
化合物W8的结构式为：
（1）将实施例1步骤（1）中的原料2-溴乙醇替换为N-叔丁氧羰基溴乙胺，其余步骤同实施例1制备得到tert-butyl (2-(4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenoxy) ethy l)carbamate（化合物8-2），化合物8-2结构为；
（2）将实施例15中的原料W13换为化合物8-2，其余步骤同实例15得到产物N-(4-(2-aminoethoxy) phenyl) -2- ((3-chloro-2-methylphenyl)amino) benzamide(化合物W8)，产率为15%。1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.74 (dd,J= 7.9, 1.3 Hz, 1H), 7.57 –7.50 (m, 2H), 7.32 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.22 (dd,J= 6.7, 2.5 Hz, 1H), 7.13 –7.09 (m, 2H), 7.00 (dd,J= 9.6, 2.7 Hz, 3H), 6.88 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 4.16 –4.11 (m, 2H), 3.22 (t,J= 5.1 Hz, 2H), 2.32 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO) δ167.51, 154.78, 144.59, 141.54, 134.41, 132.26, 132.09, 129.41,127.50,127.48, 123.31, 122.53, 119.53, 118.93, 118.47, 115.34, 114.54, 67.28, 39.63,14.58.
实施例17
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-((2-hydroxyethyl)amino)phenyl)benzamide (化合物W5).
化合物W5的结构式为：
（1）将4-氟硝基苯（7.19 mmol）和碳酸钾（71.9 mmol）加入100 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气。加入24 mL的甲基亚砜后，将乙醇胺（7.19 mmol）滴加到圆底烧瓶中，在120℃中反应12 h。经TLC监测反应完成后，停止加热将反应液冷却至室温，加水稀释，使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到产物2-(4-nitrophenoxy)ethan-1-amine，产率为55%。
（2）将2-(4-nitrophenoxy)ethan-1-amine（3mmol），二碳酸二叔丁酯（15mmol）和4-二甲氨基吡啶(7.5mmol)置于50ml圆底烧瓶中，置换为氩气，加入15ml干燥的乙腈溶液，于25℃反应2 h，经TLC监测反应完成后，直接减压旋干，柱层析分离得到化合物4 tert-butyl (2-hydroxyethyl)(4-nitrophenyl)carbamate，产率80%。
（3）将tert-butyl (2-hydroxyethyl)(4-nitrophenyl)carbamate（2.73 mmol），10%钯碳(3-5 mol% Pd)加入25 mL圆底烧瓶中，以甲醇为溶剂，置换氢气，25℃反应8h。经TLC监测反应完成后，用砂芯过滤，收集有机相旋干，得到粗产物tert-butyl(4-aminophenyl)(2-hydroxyethyl) carbamate。
（4）将托灭酸（1 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(1.5mmol)，加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气，加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应30min。随后加入tert-butyl (4-aminophenyl)(2-hydroxyethyl)carbamate（1.2 mmol）, 4-二甲氨基吡啶（0.25mmol），三乙胺（3 mmol）。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到tert-butyl (4-(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamido)phenyl)(2-hydroxyethyl)carbamate（化合物8-1），收率15%。化合物8-2的结构为。
（5）将实施例15中的原料W13换为化合物8-1，其余步骤同实例15得到产物2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-((2-hydroxyethyl)amino)phenyl)benzamide，产率为10%.1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.18 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.55 (dd,J= 7.8,0.9 Hz, 1H), 7.32 (d,J= 8.7 Hz, 2H), 7.27 (dd,J= 9.2, 1.9 Hz, 1H), 7.23 –7.19 (m, 1H), 7.14 – 7.04 (m, 2H), 6.99 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 6.78 (t,J= 7.4 Hz,1H), 6.63 (d,J= 8.8 Hz, 2H), 3.80 (t,J= 5.2 Hz, 2H), 3.26 (t,J= 5.2 Hz, 2H),2.33 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 167.91, 146.53, 145.86, 141.28,135.61, 132.62, 130.21, 128.13, 127.50, 126.86, 124.62,123.31, 120.84,118.14, 117.94, 115.54, 113.71, 61.35, 46.47, 15.08.
实施例18
(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)phenyl)(4-methoxypiperidin-1-yl)methanone (化合物W9).
化合物W9的结构式为：
将托灭酸（1 mmol），1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐(1.5 mmol)，加入25 mL圆底烧瓶中，并置换为氩气，加入5 mL干燥的二氯甲烷，室温反应30min。随后加入4-甲氧基哌啶（1.2 mmol）, 4-二甲氨基吡啶（0.25mmol），三乙胺（3 mmol）。经TLC监测反应完成后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物，收率75%。1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.23 – 7.16 (m, 1H), 7.14 (dd, J = 5.8, 3.5 Hz, 0H),7.07 – 7.03 (m, 1H), 7.02 (d, J = 8.1 Hz, 0H), 6.87 – 6.81 (m, 1H),3.87 (s,2H), 3.46 (ddd, J = 10.8, 7.1, 3.4 Hz, 2H), 3.35 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 1.85(s, 2H), 1.63 (s, 2H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.95, 143.20, 141.91, 135.59, 130.55,128.05, 126.93, 123.56, 122.64, 119.28, 118.76, 116.81, 75.30, 55.90, 30.98,14.78.
实施例19
(2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)phenyl)(morpholino)methanone (化合物W10).
化合物W10的结构式为：
将实施例18中的原料4-甲氧基哌啶替换为吗啉，得到目标产物，收率75%。1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.28 (s, 1H), 7.17 (ddd,J= 12.0, 9.4, 5.3 Hz, 3H), 7.07 –7.00 (m, 3H), 6.83 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 3.66 (s, 8H), 2.29 (s, 3H).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169.79, 143.31, 141.57, 135.39, 130.74,128.18, 127.77, 126.79, 123.44, 121.33, 119.07, 118.52, 116.68, 66.85, 14.62.
实施例20
2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)-N-(4-sulfamoylphenyl)benzamide (化合物W11).
化合物W11的结构式为：
将实施例18中的原料4-甲氧基哌啶替换为磺胺，得到目标产物，收率75%。1H NMR(400 MHz, DMSO) δ 10.66 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 7.89 (d,J= 8.9 Hz, 2H), 7.82(dd,J= 11.1, 5.0 Hz, 3H), 7.42 – 7.35 (m, 1H), 7.31 (s, 2H), 7.26 – 7.12 (m,3H), 6.99 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 6.94 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H).13C NMR (101MHz, DMSO) δ 168.10, 144.91, 141.83, 141.37, 138.94, 134.40, 132.76, 129.67,128.02, 127.50, 126.52,123.70, 120.26, 119.67, 119.00, 118.40, 115.42, 14.62.
实施例21
N-(4-carbamoylphenyl)-2-((3-chloro-2-methylphenyl)amino)benzamide (化合物W12).
化合物W12的结构式为：
将实施例18中的原料4-甲氧基哌啶替换为对氨基苯甲酰胺，得到目标产物，收率75%。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.55 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 7.94 – 7.85 (m,3H), 7.80 (t,J= 7.9 Hz, 3H), 7.38 (t,J= 7.6 Hz, 1H), 7.27 (d,J= 20.7 Hz, 1H),7.26 – 7.11 (m, 3H), 6.99 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 6.93 (t,J= 7.5 Hz, 1H), 2.27 (s,3H).
13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.95, 167.41, 144.79, 141.49, 141.43,134.37, 132.57, 129.58,129.35, 128.20, 127.93, 127.47, 123.60, 119.73,119.54, 119.32, 118.40, 115.41, 14.59.
实施例22 分子对接实验
实验方法：
分子对接采用Schrödinger软件(Release 2019-2，Schrödinger, LLC, NewYork, NY, 2019)。 首先,以COX-2(PDBcode: 5IKT)的晶体结构为研究对象，Maestro蛋白制备向导模型制备了COX-2和TopoⅠ的晶体结构， 简单地说，就是第一在蛋白质中加入氢原子，利用OPLS-2005力场将原子、水分和应变最小化。随后利用Epik软件设定电离态pH 7.0+/−2.0。 第二，在LigPrep阶段，在中性条件下将所示化合物的分子结构加入氢原子 ，通过MMFFs力场最小化，生成三维坐标。 COX-2中托灭酸的结合位点(PDB: 5IKT)被选为对接的活性位点，在配体和受体的制备后，配体和受体制备完成后，利用10 Å大小的网格盒在选定的残基上生成受体网格。 最后，使用额外精度(XP)进行分子对接。其他对接参数设置为默认值。以Topo Ⅰ(PDBcode: 1SEU)的晶体结构为研究对象，按照上述步骤，以Topo Ⅰ中Indolocarbazole SA315F的结合位点为对接活性位点，其余步骤一致。结果见图1。
实验结果：相较于化合物I-1，将其甲氧基部分改造为乙二醇结构后的化合物W1由于末端的2-羟基结构与COX-2和Topo Ⅰ形成了氢键结构，对接更加紧密。说明I-1末端引入长度为两个碳的氢键供体和受体有利于化合物与靶点的结合。
实施例23 MTT法测定结肠癌细胞增殖抑制作用
试验方法：
将人结肠癌细胞HT-29,RKO,HCT-116,LOVO,SW480分别用含有10%胎牛血清的DMEM:F12K=1:1混合培养基，MEM培养基，1640培养基，F12K培养基和DMEM培养基在37 ℃、5%CO2条件下放置在细胞培养箱中培养，待细胞处于对数期时，以每孔1х10^5个细胞接种于96孔板中，培养24 h后移去旧培养基，加入含有待测样品的培养基200μL（将20mmol·L-1目标化合物DMSO母液配制成实验浓度30、10、3.33、1.11、0.37、0.12 μmol·L-1），每个实验浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组。待实验细胞与药物作用72 h 后，加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h 后将96 孔板内的上清液吸出，每孔中加入150 μL的DMSO，振荡20 min。在570nm 波长下利用酶标仪测定实验中96 孔板各孔的吸光值（OD 值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，细胞增殖抑制率%=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白OD值），并用SPSS 20.0计算半数抑制浓度IC50值(means ± SD, n=3)，具体数据见表1。（上述平行实验均独立重复三次）
试验结果：
实验结果发现部分化合物对5株结肠癌细胞具有较好的增殖抑制活性，且抑制活性强于市场上常用的结肠癌治疗药物5氟尿嘧啶。
表1.所合成的化合物W1-W21、阳性药对五株结肠癌细胞增殖抑制活性
a采用MTT法检测HT-29、RKO、LoVo、HCT-116和SW480 4个化合物72h的aIC50值(μM)，以母体化合物I-1和结肠癌治疗药物5-FU作为对照药物。bIC50采用SPSS软件计算，以独立实验的平均值±标准差表示，每组3个。
实施例24 COX-2抑制剂筛选实验
试验方法：
使用96孔黑板设置对照孔和样品孔，并按照下表依次加入样品和各溶液。加入待测样品后，混匀，37℃孵育10分钟。
随后各孔加入COX-2 Probe 5微升。各孔快速加入COX-2 Substrate工作液5微升，混匀。 37℃避光孵育5分钟后进行荧光测定。激发波长为545nm，发射波长为590 nm。计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU100%酶活性对照、RFU阳性抑制剂对照和RFU样品。抑制率公式为：抑制率(%) = (RFU100%酶活性对照 - RFU样品)/ (RFU100%酶活性对照 - RFU空白对照) × 100%，并用SPSS 20.0计算半数抑制浓度IC50值(means ± SD, n=3)，具体数据见表2（上述平行实验均独立重复三次）。
实验结果发现部分化合物对以上两种酶具有较好的抑制活性。
表2.所合成化合物W1-W21、阳性药对拓扑异构酶Ⅰ，环氧化酶-2抑制活性
aDNA弛豫法用于Topo I抑制分析。采用bCOX-2抑制剂筛选法进行COX-2抑制分析。CPT和I-1为对照药物。c采用SPSS软件计算IC50，并以独立实验的平均值±标准差表示。dND意味着没有测试。
实施例25 Topo I介导的DNA松弛试验
试验方法：
向0.5mL的离心管中依次加入2μL Topo I 分析缓冲液(350 mM Tris-HCl, (pH8.0), 720 mM KCl, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 50 mM spermidine),2μL 0.1% BSA溶液，1μL 1U/μL的Topo 溶液，0.2μL的待测化合物溶液和0.5μL DNA 溶液（0.25ug）最后加入相应体积的超纯水使得上述体系体积为20μL。将上述体系于37℃孵育45分钟，随后加入10μL苯酚：氯仿=1：1的萃取液萃取以终止反应。离心分离出水相，加入相应体积的6×DNA上样缓冲液，使用0.8%的琼脂糖凝胶和1×的TAE电泳液在110V电压下电泳1h，电泳结束后将凝胶置于0.5μg/mL的溴化乙锭（EB）溶液中30min，随后在302nm波长下拍照记录 ,使用lane 1D软件分析结果，计算抑制率。使用SPSS 20.0计算半数抑制浓度IC50值。图见图2，具体数据见表2。
试验结果：
综合化合物对5株结肠癌细胞增殖抑制活性和其对拓扑异构酶Ⅰ，环氧化酶-2抑制活性，化合物W7在细胞水平和靶点水平均具有较好的活性，故选择W7做进一步的深入研究。
实施例26 DNA嵌入/解旋实验
试验方法：
向0.5mL离心管中加入3μL 1U/μL的Topo I酶溶液，2μL Topo I 分析缓冲液和2μL0.1% BSA溶液以及0.5μL的DNA溶液（0.25μg）,最后加入2.3μL的超纯水。以上的酶反应溶液37℃孵育30分钟，随后加入0.2μL的待测化合物溶液或其溶剂，加入相应体积的超纯水定容至20μL，再于37℃孵育30分钟。孵育完毕后每个离心管中都加入3μL的7mM EDTA溶液来终止反应。加入DNA上样缓冲液后用1%的琼脂糖凝胶和1×的TAE电泳液在20V的电压条件下电泳12h，随后使用0.5μg/mL EB染液染色，在302nm波长下拍照记录。结果见图3，结果显示，W7不是嵌入DNA的Topo Ⅰ抑制剂。
实施例27 单细胞凝胶电泳实验
试验方法：
取对数生长期的RKO细胞消化后，按照10^5个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为control组，喜树碱组（3μM），W7组（9μM，6μM，3μM）。加入待测药品孵育24h后。将细胞消化收集，离心后弃去上清，用预冷的1×PBS清洗细胞一次，以1×10^5个/mL细胞悬浮细胞。将细胞与1%的琼脂糖凝胶以1：10的比例均匀的混匀后迅速滴于玻片上，在4℃的黑暗条件下固化10分钟。轻轻取出玻片，浸入预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1小时，取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗 2 次，每次 2min。将载玻片转移至装有新鲜配制的解旋液的容器中，室温解旋 20min。水平电泳仪中倒入 4℃预冷的电泳液，将载玻片轻柔浸没其中，在电流 300mA 条件下电泳 30min。电泳完毕后，取出载玻片并沥去多余液体，蒸馏水浸洗 2 次，每次 2min。转移载玻片至 70%酒精溶液中，室温放置 5min 后取出沥干，37℃烘干 15min 至胶完全干燥。每孔滴加 40μLPI染色液，室温避光染色 10min，蒸馏水浸洗 2次，每次 2min。在荧光显微镜下观察，并进行图片采集，结果见图4。结果显示，化合物W7不会造成DNA损伤。
实施例28 Hoechst染色
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，按照10^4个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后， 分别用不同浓度的化合物W7孵育24小时。 去除培养基后，PBS冲洗细胞，4%多聚甲醛溶液固定15min。固定完成后，加入Hoechst 33342溶液(10ug/ml)黑暗染色15min,PBS冲洗数次。 在荧光显微镜下观察和记录染色细胞，结果见图5。结果显示，化合物W7对于HT-29和RKO均有较好的诱导凋亡的作用。
实施例29 流式细胞仪分析细胞凋亡
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，按照10^5个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为control组，喜树碱组（HT-29 8μM ）（RKO 9μM），I-1组（HT-29 8μM ）（RKO9μM）W7组(HT-29 8μM,4μM,2μM)（RKO 9μM,6μM,3μM）。加入待测药品孵育24h后，将细胞消化收集，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5×104- 1×105万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中，使用铝箔进行避光。孵育完成后立即使用流式细胞仪对其进行检测。数据见图6和图7。试验结果显示化合物W7对于HT-29和RKO均有较好的诱导凋亡的作用。
实施例30 细胞周期阻滞实验
试验方法：
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，按照10^5个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为control组，喜树碱组（HT-29 8μM ）（RKO 9μM），I-1组（HT-29 8μM ）（RKO9μM）W7组(HT-29 8μM,4μM,2μM)（RKO 9μM,6μM,3μM）。加入待测药品孵育24h后，将细胞消化，收集2×105- 1×106个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次，离心弃上清。加入1 ml DNA Staining solution和10 μl Permeabilizationsolution，涡旋振荡5 - 10秒混匀。室温避光孵育 30分钟。孵育完成后立即使用流式细胞仪对其进行检测。数据见图8和图9。试验结果显示化合物W7对于HT-29和RKO细胞的周期均阻滞于G1/G0期。
实施例31活性氧爆发实验
试验方法：
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，按照10^5个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为control组，喜树碱组（HT-29 8μM ）（RKO 9μM），I-1组（HT-29 8μM ）（RKO9μM）W7组(HT-29 8μM,4μM,2μM)（RKO 9μM,6μM,3μM）。加入待测药品孵育24h后，胰酶消化收集5×104- 1×105细胞，1000g离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次，离心弃上清，用10 μg/mLDCFH-DA无血清培养基的溶液染色30min。随后加入PBS洗涤一次，离心弃上清，用1ml PBS稀释。 最后用流式细胞仪(Beckman, Germany)检测标记的细胞。数据见图10，11。试验结果：化合物W7可诱导HT-29和RKO细胞的活性氧爆发。
实施例32 细胞膜电位测定
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，按照10^5个/mL的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为control组，喜树碱组（HT-29 8μM ）（RKO 9μM），I-1组（HT-29 8μM ）（RKO9μM）W7组(HT-29 8μM,4μM,2μM)（RKO 9μM,6μM,3μM）。加入待测药品孵育24h后，胰酶消化收集5×104- 1×105细胞，1000g离心5分钟，弃上清，用PBS洗涤一次，离心弃上清，用10 μg/mLTMRE无血清培养基的溶液染色30min。随后加入PBS洗涤一次，离心弃上清，用1ml PBS稀释。最后用流式细胞仪(Beckman, Germany)检测标记的细胞。数据见图12，13。试验结果：化合物W7可降低HT-29和RKO细胞的线粒体膜电位。
实施例33 生存曲线
取对数生长期的HT-29和RKO细胞消化后，以每孔1х10^5个细胞接种于96孔板中，培养24 h后移去旧培养基，加入含有待测样品的培养基200μL（将20mmol·L-1目标化合物DMSO母液配制成实验浓度180、90、30、10、3.33、1.11、0.37、0.12 μmol·L-1），每个实验浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组。待细胞与药物作用分别24h、48h、72 h 后，加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h 后将96 孔板内的上清液吸出，每孔中加入150 μL的DMSO，振荡20min。在570 nm 波长下利用酶标仪测定实验中96 孔板各孔的吸光值（OD 值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，细胞增殖抑制率%=（对照孔平均OD值-实验孔平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白OD值），（上述平行实验均独立重复三次）。使用GraphPad Prism8.0.制作生存曲线图，见图14，化合物W7对于HT-29和RKO的增殖抑制作用随着给药浓度和作用时间而变化，具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。
实施例34 平板克隆实验
试验方法：
在6孔板中，HT-29细胞和RKO细胞以1×103cells/孔的密度接种，待细胞贴壁后分为control组，喜树碱组（HT-29 1μM ）（RKO 3μM），I-1组（HT-29 1μM ）（RKO 3μM）W7组(HT-29 1μM,0.5μM,0.25μM)（RKO 3μM,1.5μM,0.75μM），以上药物处理7天。 实验结束时，移去培养液，用4%多聚甲醛溶液固定15分钟，然后用1%结晶紫染色15分钟，用水冲洗。 最后，菌落是根据至少50个细胞不重叠的规则来计数的。 所有实验都重复了三次。 P<0.05为显著性，数据以均数±SD表示。数据见图15。试验结果：化合物W7可显著抑制HT-29和RKO细胞的平板克隆菌落的形成。
实施例35 Western blot 法测定细胞色素C（Cytochrome C）, 活化的半胱氨酸蛋白酶3和9（cleavedcaspase-3,cleaved caspase-9）, B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）, BCL2-Associated X蛋白质(Bax), 核因子-κB(NF-κB p65)，活化的核因子-κB(p-NF-κB p65)，人核因子κB抑制蛋白α（IKBα），活化的人核因子κB抑制蛋白α（p-IKBα）,环氧合酶-2（COX-2）表达。
试验方法
（1）制样： HT-29或RKO细胞接种于6孔板中，37 °C、 5% CO2培养箱中培养过夜后，HT-29用8μM，4μM，2μM的化合物W7，RKO用9μM，6μM，3μM作用24 h，之后用PBS洗细胞2次，使用索莱宝高效RIPA裂解液200μL于冰上裂解30min, 收集样品，并用索莱宝BCA蛋白定量试剂盒定量，样品液加SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(4×)，涡旋混匀后于95 °C 水浴中变性15min，冷却后置于-20 ℃待测。
（2）制胶：用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。
（3）上样：将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。
（4）转印：电泳结束后，剥离凝胶，将0.45μM PVDF 膜于甲醇中活化5 min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的PVDF 膜上。
（5）封闭：待转印结束，将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉的TBST 封闭液中室温封闭1.5h。用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。
（6）一抗孵育：将PVDF 膜置于适当比例稀释的相应一抗中，于4 °C 孵育过夜。
（7）二抗孵育：用TBST 缓冲液洗膜3 次，各10 min。加入适当比例稀释的HRP标记的IgG 二抗，室温摇床孵育1.5 h。
（8）化学发光：抗体孵育结束后，再次用TBST 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ECL化学发光液，采用天能多功能成像仪化学发光模块成像（上述平行实验均独立重复三次）
本发明合成化合物对HT-29细胞和RKO细胞中凋亡相关蛋白的影响见图16，对HT-29细胞和RKO细胞中NF-κB通路相关蛋白的影响结果见图17。化合物W7在HT-29和RKO细胞中均可以通过线粒体途径促进细胞凋亡，表现为促进促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase 3/9,细胞色素C的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。化合物W7也能通过影响NF-κB/IKB途径影响炎癌通路抑制肿瘤的进展。
实施例36体内药代动力学研究
试验方法：
12只8周龄雄性SD大鼠，体重250 ~ 280 g。将大鼠随机分为2组(n = 3)，给药前禁水，禁食一晚。第一组给予化100 mg/kg化合物 W7灌胃，第二组给予30mg/kg化合物 W7腹腔注射。对于口服给药，分别于口服W7后的30 min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、10 h、13h、24 h在大鼠眼眶采集血液样品于肝素钠管中；对于腹腔给药，分别于腹腔注射W7后的2min、5min、10min、15min、25min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h在大鼠眼眶采集血液样品于肝素钠管中；以上血样离心分离(2500 rpm，6 min，4 ℃)血浆，-80℃保存血浆，LC-MS分析。检测时，在每个血清样品中加入5倍甲醇并充分混合。4℃，1600 rpm离心10 min后，经0.22 μm滤膜过滤后进行分析。在液相色谱和质谱条件下，色谱分析采用Eclipse Plus C18柱(4.6×150 mm, 4 μm)。HPLC流动相为水(0.1%甲酸)和甲醇，以0.5 mL/min梯度色谱分离。色谱条件：流动相：0 ~ 7 min，甲醇：H2O = 20：80；7 ~ 16 min MeOH：H2O = 95 : 5，16~25 min，MeOH：H2O=20：80；波长：254 nm；柱温：25℃。柱洗脱液直接引入ES-API。最后，利用PkSolver 2.0对得到的数据进行处理，计算6个独立实验的平均值和参数。结果见下表3。
表3.化合物W7在大鼠体内的药代动力学特性
实验结果：如表3所示，所选化合物W7的口服给药和腹腔注射的药代动力学特性都良好，有进一步用于抗结肠癌药物制备的价值。
实施例37 裸鼠异位移植瘤模型
试验方法：50只雄性BALB/c裸鼠，体重20-25 g，（购自江苏集萃药康生物技术有限公司）。 取处于对数生长期的HT-29细胞，消化处理为8×106/mL的细胞密度，在裸鼠腋窝右侧进行皮下注射。当肿瘤平均体积达到大约100 mm3时，将其随机分为5组(10只)，即：化合物W7组(30 mg/kg/d, bid，ip)、W7组(15 mg/kg/d, bid，ip)、I-1组(30 mg/kg/d, bid，ip)、5-Fu组(15 mg/kg/d, qd，ip),模型组。每两天用游标卡尺测量肿瘤体积一次， 治疗14 d后处死小鼠，称肿瘤重量.肿瘤体积按标准公式(W2× L) / 2计算。W和L分别代表肿瘤的宽度和长度。肿瘤生长抑制率计算公式为[1-(T-T0)/(C- C0)] ×100%， T、C代表治疗组和模型组在实验结束时的平均体积 T0和C0分别代表治疗组和模型组第一次测定的平均肿瘤体积。
实验结果见图18和图19。
实验结果：所选化合物W7在裸鼠异位移植瘤模型中表现出良好的抗肿瘤效果，其活性强于阳性对照要5-Fu，和母体化合物I-1。
实施例38 裸鼠异位移植瘤模型肿瘤切片的HE染色
试验方法：
随机挑选实施例35中每组肿瘤组织各3个，采用HE染色法进行肿瘤切片的组织学研究。HE 染色实验步骤：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ8min-二甲苯Ⅱ8min-无水乙醇Ⅰ6min-无水乙醇Ⅱ6min-95%酒精 6min-85%酒精 6min-75%酒精 5min-流水冲洗。
2、苏木素染细胞核：切片入 Harris 苏木素染 3-8min，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，流水返蓝。
3、伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色 1-3min。
4、脱水封片：将切片依次放入75%酒精 30s-85%酒精 30s- 95%酒精 I 1min -95%酒精 II 2min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ7min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
5、显微镜镜检，图像采集分析。
染色结果如图11所示，图11显示相较于模型组化合物W7可明显诱导肿瘤阻滞的凋亡和坏死其效果强于母体化合物I-1和阳性药5-Fu。
实施例39 裸鼠异位移植瘤模型肿瘤切片的Ki67和CD31免疫组化分析
试验方法：
随机挑选实施例35中每组肿瘤组织各3个，对其组织中Ki67和CD31的表达进行免疫组化分析。免疫组化实验步骤：
1.石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3）。
2.取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3。
3.每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3。
4.除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
5.PBS冲洗3×5。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3。
6.除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5。
7.除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。
8.苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
9.显微镜镜检，图像采集分析。
染色结果如图20所示，图20显示化合物W7可显著抑制肿瘤增殖相关蛋白Ki67和微血管标志蛋白CD31的表达，显示其具有优于母体化合物I-1和阳性对照药5-Fu的对肿瘤增殖和微血管形成的抑制作用。

Claims (10)

1.一种托灭酸衍生物，其结构式如下：
其中，R为4-（2-羟基乙氧基）苯胺基，4-（2-甲氧基乙氧基）苯胺基，4-（2-羟基乙酸酯基）苯胺基，4-（2-甲氧基乙酸酯基）苯胺基，4-（2-羟基乙氨基）苯胺基，4-（2-氨基乙氧基）苯胺基，4-（4-吗啉）苯胺基，4-（1-哌嗪）苯胺基，4-（4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4-甲基-1-哌嗪）苯胺基， 4-（4-乙基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4-丙基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4-异丙基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4-丁基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4-苯基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4甲磺酰基-1-哌嗪）苯胺基，4-（4乙酰基-1-哌嗪）苯胺基，4-吗啉基，1-4-甲氧基哌啶基，4-磺胺基或4-氨基苯甲酰氨基。
2.根据权利要求1所述一种托灭酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以硝基化合物和溴乙烷衍生物、乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物为原料，以碳酸钾为碱，以N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜为溶剂，在氩气保护下，25℃~120 ℃下反应6h~12h，反应完成后，用水和乙酸乙酯萃取洗去溶剂，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物2；所述硝基化合物为对硝基苯酚或对氟硝基苯，其中对硝基苯酚与溴乙烷衍生物反应，对氟硝基苯与乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物反应；所述溴乙烷衍生物为2-溴乙醇，2-溴乙基甲基醚或N-叔丁氧羰基溴乙胺；所述哌嗪衍生物为1-叔丁氧羰基哌嗪，1-甲基哌嗪，1-乙基哌嗪，1-丙基-哌嗪，1-异丙基哌嗪，1-丁基哌嗪，1-苯基哌嗪，1-甲磺酰基哌嗪或1-乙酰基哌嗪；
化合物2的结构式为：，R2为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-羟基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基，4-甲基-1-哌嗪基， 4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基， 4-丁基-1-哌嗪基， 4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基，4-乙酰基-1-哌嗪基中的一种；
（2）以甲氧基乙酸和对硝基苯酚为原料，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应10~18h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物3；
化合物3的结构式为： ；
（3）以二碳酸二叔丁酯和步骤（1）得到的化合物2中的2-（4-硝基苯）乙醇胺为原料，以4-二甲氨基吡啶为碱，以乙腈为溶剂，在氩气保护的条件下，于20~30℃反应1.5~2.5h，将反应液旋干，柱层析分离得到化合物4；
化合物4的结构式为： ；
（4）以化合物2、化合物3或化合物4为原料，以钯碳为催化剂，以甲醇为溶剂，在氢气条件下，20~30℃反应8h~24h，反应完成后，抽滤收集滤液旋干，柱层析分离得到化合物5；
化合物5的结构式为，R3为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-甲氧基乙酸酯基，2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基， 4-甲基-1-哌嗪基， 4-乙基-1-哌嗪基， 4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基，4-丁基-1-哌嗪基， 4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基或4-乙酰基-1-哌嗪基；
（5）将托灭酸作为反应原料， 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应25~35min，随后加入另一反应物化合物5，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，三乙胺为碱，继续在室温下反应8h~12h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到化合物8；
化合物8的结构式为： ，R3为2-羟基乙氧基，2-甲氧基乙氧基， 2-甲氧基乙酸酯基，2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基，2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基，4-吗啉基，4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基，4-甲基-1-哌嗪基，4-乙基-1-哌嗪基，4-丙基-1-哌嗪基，4-异丙基-1-哌嗪基，4-丁基-1-哌嗪基，4-苯基-1-哌嗪基，4-甲磺酰基-1-哌嗪基，4-乙酰基-1-哌嗪基；其中R3为2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基、2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基取代的两种化合物为中间产物，其余为目标化合物。
3.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：以化合物8中R3为2-甲氧基乙酸酯基取代的化合物为反应原料，二氯甲烷作为反应溶剂，在氩气保护的条件下，在-30℃加入三溴化硼，反应1~2h，反应完全后加入冰水淬灭反应，随后使用乙酸乙酯萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物化合物W3；所述三溴化硼用量为反应原料摩尔量的1~2倍；
化合物W3结构为。
4.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：以化合物8中R3为2-羟基-1-叔丁氧羰基乙氨基、2-氨基-N-叔丁氧羰基乙氧基或4-N-叔丁氧羰基-1-哌嗪基取代的化合物为反应原料，二氯甲烷作为溶剂，在氩气条件下，加入三氟乙酸，室温下反应8~15h，反应完全后直接悬干，加入乙酸乙酯溶解，用氢氧化钠溶液洗涤，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标化合物W5、W8或W7；所述三氟乙酸的用量为反应原料摩尔量的1.5~2.5倍；
化合物W5结构式为：；
化合物W8结构式为：；
化合物W7结构。
5.根据权利要求1所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：将托灭酸作为反应原料， 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐为缩合剂，二氯甲烷为反应溶剂，氩气条件下室温反应25~35min，随后加入胺类化合物，以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，三乙胺为碱，室温下继续反应8h~12h，反应完全后，用水和二氯甲烷萃取，收集有机相旋干，柱层析分离得到目标产物化合物9；所述胺类化合物为4-甲氧基哌啶、吗啉、磺胺或对氨基苯甲酰胺；
化合物9的结构式为：，R5为4-吗啉基，1-4-甲氧基哌啶基，4-磺胺基或4-氨基苯甲酰氨基；
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐的用量为托灭酸摩尔量的1~2倍；胺类化合物的用量为托灭酸摩尔量的1~1.5倍；4-二甲氨基吡啶的用量为托灭酸摩尔量的0.2~0.3倍；三乙胺的用量为托灭酸摩尔量的2.5~3.5倍。
6.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，K2CO3的用量是硝基化合物摩尔量的3~10倍；溴乙烷衍生物、乙醇胺、吗啉或哌嗪衍生物的用量为硝基化合物摩尔量的1~3倍。
7.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐用量为对硝基苯酚的1~1.5倍；甲氧基乙酸与对硝基苯酚的摩尔比为1:1~1:2；4-二甲氨基吡啶的用量为对硝基苯酚摩尔量的0.2~0.3倍。
8.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，二碳酸二叔丁酯的用量为2-（4-硝基苯）乙醇胺摩尔量的4~6倍；4-二甲氨基吡啶的用量为2-（4-硝基苯）乙醇胺摩尔量的2~3倍；步骤（4）中，钯碳的用量为化合物2、化合物3或化合物4摩尔量的0.1~0.3倍。
9.根据权利要求2所述一种托灭酸衍生物的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐用量为托灭酸摩尔量的1~2倍，化合物5的用量为托灭酸摩尔量的1~1.5倍，4-二甲氨基吡啶用量为托灭酸摩尔量的0.2~0.3倍，三乙胺用量为托灭酸摩尔量的2.5~3.5倍。
10.根据权利要求1所述一种托灭酸衍生物在制备治疗结肠癌药物中的应用。
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