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CN115011480B - 一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途 - Google Patents

一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物分离技术领域，尤其涉及一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途。本方法先利用环己酰亚胺去除动物组织中的真核细胞，然后在不同离心力的作用下从动物组织中分离微生物。利用本方法能够在不破坏微生物的前提下有效地分离动物血液和组织中的微生物，同时去除动物血液和组织中的其它细胞，分离获得的体内微生物可用于进一步纯化、培养、鉴定、代谢、移植等研究和应用。本方法简便易行、分离效果好，在血液和组织微生物纯化方面有着广阔的应用前景。

Description

一种从动物组织中分离微生物的方法及其用途
技术领域
本发明属于微生物分离技术领域，尤其涉及一种通过环己酰亚胺(放线菌酮，CHX)在不同离心力的作用下从动物组织中分离微生物的方法及其用途。
背景技术
现代医学研究表明，在人体肠道中存在着大量微生物(Qin,J.,et al.,A HumanGut Microbial Gene Catalogue Established by Metagenomic Sequencing.Nature,2010.464(7285):p.59-65.)，肠道微生物种类丰富、数量巨大，在体内参与着多种代谢调节活动，例如，肠道微生物及其次级代谢物直接或间接参与机体的物质代谢吸收及能量的转化(Geva-Zatorsky,N.,et al.,Mining the Human Gut Microbiota forImmunomodulatory Organisms.Cell,2017.168(5):p.928-943.e11.)。
另外，在正常人身体的表面(如皮肤、毛发等)和与外部连通的腔道中(如鼻腔、口腔等)都存在着不同的微生物群落(Weese and J.Scott,The canine and feline skinmicrobiome in health and disease.Veterinary Dermatology,2013.24(1):p.137-e31.)，除此之外，在身体其他器官中也存在着大量微生物，并且这些微生物可能与特定疾病的发生发展密切相关，例如，在人的乳腺以及子宫中都存在微生物(Chu,D.M.,et al.,Maturation of the infant microbiome community structure and function acrossmultiple body sites and in relation to mode of delivery.Nature Medicine,2017.23(3):p.314-326.)，又例如，Marsland发现改变婴儿呼吸道微生物的定殖结构，会使婴儿以后患过敏反应和反复喘息的机会大增，发生的机制可能是：当病原微生物侵入肺部时，它们会刺激肺部感染，产生细胞因子和趋化因子，导致肺泡巨噬细胞不受控制的活化，最终导致呼吸窘迫(Marsland B J,Gollwitzer E S.Host-microorganism interactionsin lung diseases.Nature Reviews Immunology,2014,14(12):827.)。
在一项新的研究中，研究人员用L型结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)疫苗注入母体后，在新生儿体内也发现L型结核分枝杆菌，并且发现在母体及婴儿体内的L型菌是无细胞壁结构的无害L型菌，但是可以转变为有细胞壁结构的菌型。2018年罗莎琳达·罗伯茨(Rosalinda Roberts)等人通过电子显微镜在大脑切片中捕捉到细菌似乎正在钻入轴突内部的照片(Roberts,R.,Do gut bacteria make a second homein our brains？2018.)，这一发现受到了很多关注，同时这与我们在大鼠肿瘤组织以及小鼠胎盘组织中发现的微生物形态及大小非常相似。
然而，目前尚没有理想的方法对动物组织以及血液中的微生物进行分离提取，从而给后续的微生物纯化、培养、鉴定、代谢研究、移植等工作造成了很大的困难。
发明内容
为了解决从动物组织和血液中分离提取微生物的问题，本发明提供了一种解决方案。本发明方法利用环己酰亚胺(放线菌酮，CHX，是由链霉菌产生的戊二酰亚胺类抗生素，具有选择性抑制酵母和真菌的作用)去除真核细胞，然后在不同离心力的作用下从动物组织中分离提取微生物，通过本发明方法可以在不破坏微生物的前提下有效地分离动物组织中的微生物。
本发明提供了一种从动物组织中分离微生物的方法，本方法先利用环己酰亚胺去除动物组织中的真核细胞，然后在不同离心力的作用下从动物组织中分离微生物。
具体而言，本发明方法包括下述步骤：
(1)处理材料：将动物组织切成大小为2毫米的组织块，用生理盐水洗净；
(2)酶解：取(1)步所得的动物组织块200μg，向其中加入600μl胰蛋白酶-EDTA消化液，保持溶液pH在7.8-8.0之间，混合均匀后在4℃条件下放置过夜使动物细胞分散，得到动物细胞溶液；
(3)向(2)步所得动物细胞溶液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为200μg/ml，并保持溶液pH＜7.0，将溶液在4℃条件下静置30min；
(4)将(3)步所得溶液放入离心机中，在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀1；
(5)将(4)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀，弃去上清液，得到沉淀2；
(6)向(5)步所得沉淀2中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清；再向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清得到沉淀3；
(7)向(6)步所得沉淀3中再次加入400μl生理盐水复溶，即得到游离微生物的菌液；
(8)向(4)步所得沉淀1中加入600μl细胞裂解液进行温和裂解，得到细胞裂解溶液；
(9)将(8)步所得细胞裂解溶液在4℃条件下800-1000rpm/min离心3-5min，取上清液；
(10)将(9)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清，向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，即得到内在微生物的菌液。
进一步地，本发明从动物组织中分离微生物的方法中当提取材料为动物血液时，直接量取200μl新鲜、冷冻或加入抗凝剂的动物血液作为提取材料。
进一步地，上述方法第(2)步酶解中所加入的胰蛋白酶-EDTA消化液中含有胰蛋白酶或胰蛋白酶和胶原酶按照1︰1的重量比组成的混合酶，所述胰蛋白酶-EDTA消化液中胰蛋白酶的重量百分比含量为0.25％。
此外，本发明还涉及上述从动物组织中分离微生物的方法在微生物药物制剂开发中的用途。
以及，上述从动物组织中分离微生物的方法在体内微生物示踪技术中的用途。
综上，本发明提供了一种从动物血液和组织中分离微生物的方法，利用本方法能够在不破坏微生物的前提下有效地分离动物血液和组织中的微生物，同时去除动物血液和组织中的其它细胞，分离获得的体内微生物可用于进一步纯化、培养、鉴定、代谢、移植等研究和应用。本方法简便易行、分离效果好，在血液和组织微生物纯化方面有着广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面对本发明实施例中需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下述附图仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实验小鼠血液微生物属水平热图(其中：G1、G2为实验组小鼠血液样本，S-1G、S2-G为实验组小鼠皮肤样本)。
图2为实验小鼠血液微生物属柱状图(其中：G1、G2为实验组小鼠血液样本，S-1G、S2-G为实验组小鼠皮肤样本)。
图3为实验小鼠血液样品经CHX处理前后光学显微镜照片(A：经过胰蛋白酶处理未经CHX处理的血液样品；B：经过胰蛋白酶处理且经CHX处理的血液样品；根据比例尺测算分离出来的微生物直径大约在0.5～1nm之间)。
图4为乳酸菌样品经CHX处理前后光学显微镜照片(A：未经CHX处理的乳酸菌样品；B：经CHX处理的乳酸菌样品)。
图5为肿瘤组织及子宫中微生物电子显微镜照片(A：大鼠肿瘤组织中的微生物电子显微镜照片；B：小鼠子宫中的微生物电子显微镜照片)。
图6为本发明方法处理前含有目的菌的小鼠血液荧光显微镜观察图。
图7为本发明方法处理后含有目的菌的小鼠血液荧光显微镜观察图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例及相应的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
同时，应理解，本发明的保护范围并不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，若无特别说明，所有的仪器和试剂均可从商业途径得到或是本行业常用的。下述实施例中的实验方法和操作，如无特别说明，均为本领域的常规实验方法和操作。
本发明方法中的操作均在无菌环境中进行。
实施例1
对小鼠的血液、胎盘以及大鼠的肿瘤进行微生物检测，发现均存在一定的微生物。在实验小鼠的血液中我们发现伊氏菌属(Ileibacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae NK4A136 group)、Turicibacter等微生物(参见图1、图2)。用本发明方法处理后的血液进行感染实验，得到了显著的效果。
(一)实验方法
(1)处理材料：取200μl小鼠新鲜血液；
(2)酶解：向(1)步所得的小鼠新鲜血液中加入600μl胰蛋白酶-EDTA消化液(含胰蛋白酶0.25％，EDTA0.35 mM，已过滤灭菌)，保持溶液pH在7.8-8.0之间，混合均匀后在4℃条件下放置过夜使动物细胞分散，得到动物细胞溶液；(若样品为含结缔组织较丰富的组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，单独使用胰蛋白酶可能对其消化的效果不佳，此时可加入胰蛋白酶和胶原酶按照1︰1的重量比组成的混合酶，能显著改善胰蛋白酶对组织的分离作用)；
(3)向(2)步所得动物细胞溶液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为200μg/ml，并保持溶液pH＜7.0，将溶液在4℃条件下静置30min；
(4)将(3)步所得溶液放入离心机中，在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀1；
(5)将(4)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀，弃去上清液，得到沉淀2；
(6)向(5)步所得沉淀2中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清；再向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清得到沉淀3；
(7)向(6)步所得沉淀3中再次加入400μl生理盐水复溶，即得到游离微生物的菌液；
(8)向(4)步所得沉淀1中加入600μl细胞裂解液进行温和裂解，得到细胞裂解溶液；
(9)将(8)步所得细胞裂解溶液在4℃条件下800rpm/min离心5min，取上清液；
(10)将(9)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清，向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，即得到内在微生物的菌液。
(二)实验结果
在实施例1的实验过程中，以小鼠新鲜血液作为生物样品，用环己酰亚胺分离微生物的方法分离血液中的微生物。用本方法处理样品之后染色并用光学显微镜观察，观察到有微生物的存在，而血液中的其它物质(如红细胞等)已经被完全去除(参见图3)。同样的，用环己酰亚胺分离微生物的方法处理乳酸菌作为对照，发现处理前和处理后的乳酸菌并无差别(参见图4)，说明环己酰亚胺处理法并不会对血液和组织中的微生物造成影响。同时，通过电子显微镜拍摄到肿瘤组织以及胎盘中的微生物(均未使用CHX处理)(参见图5)。
实施例2
为了验证本发明方法的有效性，设计如下实验：
(一)实验方法
收集含有荧光蛋白基因标记大肠杆菌的小鼠血液，采用本方法对血液进行处理。
(1)处理材料：取200μl小鼠新鲜血液；
(2)酶解：向(1)步所得的小鼠新鲜血液中加入600μl胰蛋白酶-EDTA消化液(含胰蛋白酶0.25％，EDTA0.35 mM，已过滤灭菌)，保持溶液pH在7.8-8.0之间，混合均匀后在4℃条件下放置过夜使动物细胞分散，得到动物细胞溶液；
(3)向(2)步所得动物细胞溶液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为200μg/ml，并保持溶液pH＜7.0，将溶液在4℃条件下静置30min；
(4)将(3)步所得溶液放入离心机中，在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀1；
(5)将(4)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀，弃去上清液，得到沉淀2；
(6)向(5)步所得沉淀2中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清；再向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清得到沉淀3；
(7)向(6)步所得沉淀3中再次加入400μl生理盐水复溶，即得到游离微生物的菌液；
(8)向(4)步所得沉淀1中加入600μl细胞裂解液进行温和裂解，得到细胞裂解溶液；
(9)将(8)步所得细胞裂解溶液在4℃条件下800rpm/min离心5min，取上清液；
(10)将(9)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清，向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，即得到内在微生物的菌液；
(11)荧光显微镜观察处理所得菌液并拍摄照片。
(二)实验结果
在此实施例中，拍摄本方法处理前及处理后的荧光显微镜照片(参见图6、图7)，通过前后对比，可以看出在处理前及处理后样本中均能够观察到荧光信号，证明本方法能够有效分离血液样本中的微生物，并且，通过明场图像可以观测到微生物存在，但观测不到红细胞等结构物质，从而进一步证实了本方法的有效性，本方法在血液微生物纯化方面有着很好的作用和广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、替换等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (5)

1.一种从动物组织中分离微生物的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
(1)处理材料：将动物组织切成大小为2毫米的组织块，用生理盐水洗净；
(2)酶解：取(1)步所得的动物组织块200μg，向其中加入600μl胰蛋白酶-EDTA消化液，保持溶液pH在7.8-8.0之间，混合均匀后在4℃条件下放置过夜使动物细胞分散，得到动物细胞溶液；
(3)向(2)步所得动物细胞溶液中加入环己酰亚胺，使其终浓度为200μg/ml，并保持溶液pH＜7.0，将溶液在4℃条件下静置30min；
(4)将(3)步所得溶液放入离心机中，在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀1；
(5)将(4)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，分离获得上清液和沉淀，弃去上清液，得到沉淀2；
(6)向(5)步所得沉淀2中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清；再向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，将所得溶液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清得到沉淀3；
(7)向(6)步所得沉淀3中再次加入400μl生理盐水复溶，即得到游离微生物的菌液；
(8)向(4)步所得沉淀1中加入600μl细胞裂解液进行温和裂解，得到细胞裂解溶液；
(9)将(8)步所得细胞裂解溶液在4℃条件下800-1000rpm/min离心3-5min，取上清液；
(10)将(9)步所得上清液在4℃条件下4000rpm/min离心15min，弃去上清，向所得沉淀中加入400μl生理盐水复溶，即得到内在微生物的菌液。
2.根据权利要求1所述的从动物组织中分离微生物的方法，其特征在于，当提取材料为动物血液时，直接量取200μl新鲜、冷冻或加入抗凝剂的动物血液作为提取材料。
3.根据权利要求1所述的从动物组织中分离微生物的方法，其特征在于，第(2)步酶解中所加入的胰蛋白酶-EDTA消化液中含有胰蛋白酶或胰蛋白酶和胶原酶按照1︰1的重量比组成的混合酶，所述胰蛋白酶-EDTA消化液中胰蛋白酶的重量百分比含量为0.25％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的从动物组织中分离微生物的方法在微生物药物制剂开发中的用途。
5.根据权利要求1-3任一项所述的从动物组织中分离微生物的方法在体内微生物示踪技术中的用途。
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