CN114980929B - 糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂，包含RGMa抑制物质。

Description

糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂

技术领域

本发明涉及包含RGMa抑制物质的糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂。

背景技术

糖尿病性神经障碍是糖尿病所特有的3大并发病之一，在早期发病，且其频率也高。其中，糖尿病性自主神经障碍是因慢性的高血糖而产生的控制全身脏器的自主神经纤维的障碍，是呈现多种征兆、症状的复杂的疾病。心血管系统、消化系统、泌尿·生殖系统、皮肤、瞳孔、肾上腺等的功能发生异常，分别呈现起立性低血压·饮食性低血压、胃排空障碍、膀胱·性功能障碍、出汗异常、瞳孔异常、无意识低血糖(非专利文献1)。

另外，作为糖尿病的3大并发病之一的糖尿病性肾病随着病情的发展，转变为慢性肾衰竭。已知糖尿病性肾病是日本的针对终末期肾衰竭的透析疗法导入原因疾病的第一位，此时，伴有起因于尿毒性和糖尿病性这两者的自主神经障碍(非专利文献2、非专利文献3)。

另一方面，在有糖尿病的肾衰竭患者中，存在缺少蛋白尿的症例。认为这是其它肾疾病、特别是高血压性肾硬化症与糖尿病合并，难以进行与以伴有蛋白尿为前提的糖尿病性肾病的鉴别。因此，在2007年，在美国不将病理检查所见作为诊断的必要条件，将临床上认为糖尿病与其发病、发展有关的慢性肾病(Chronic kidney disease:CKD)定义为糖尿病性肾病(Diabetic Kidney Disease:DKD)(非专利文献4)，在日本也已使用糖尿病性肾病这样的病名。糖尿病性肾病是包含糖尿病性肾病的概念(非专利文献5)。

反映这样的概念的变化，在过去的病期分类中，糖尿病性肾病的进展以伴随尿蛋白为前提，现在，在糖尿病与肾功能不全合并的情况下，不论有无尿蛋白。

RGM(repulsive guidance molecule)是最初被鉴定为视觉系统的轴突诱导分子的膜蛋白(非专利文献6)。已知，RGM家族中包含称为RGMa、RGMb和RGMc的3种成员(非专利文献7)，且至少RGMa和RGMb以相同的信号转导机制发挥作用(非专利文献8)。RGMc在铁代谢中发挥重要的作用。

根据其后的研究，明确了RGM具有诱导爪蟾(XenoPus)和鸡胚胎的轴突和层形成，以及控制小鼠胚胎的头部神经管的闭合等功能(非专利文献9)。在专利文献1中公开了含有抗RGM中和抗体作为有效成分的轴突再生促进剂。

除发育阶段的功能之外，还由于在成年人类和大鼠的中枢神经系统损伤后重新表达，以及在大鼠中，RGMa抑制会使脊髓损伤后的轴突生长亢进、促进功能恢复(非专利文献10)，因此，认为RGMa是中枢神经系统损伤后的轴突再生抑制物质。作为中和RGMa的具体的抗体，记载于例如专利文献2(例如5F9、8D1)、专利文献3(例如AE12－1、AE12－1Y)以及专利文献4(例如r116A3、r70E4、r116A3C、rH116A3)。

如此，对于中枢神经系统损伤，已明确RGMa的作用，但特别是尚未鉴定出RGMa参与糖尿病性自主神经障碍、特别是糖尿病性肾病的治疗，且尚未知晓这样的治疗药。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2005/087268号

专利文献2：国际公开WO2009/106356号

专利文献3：国际公开WO2013/112922号

专利文献4：国际公开WO2016/175236号

非专利文献

非专利文献1：Diabetes Care 26:1553－1579,2003

非专利文献2：透析会志,19(9),905－909,1986

非专利文献3：糖尿病27(6):715－721,1984

非专利文献4：Am J Kidney Dis 2007:49:S12－154

非专利文献5：基于证据的CKD诊疗指南2018,P.104－105

非专利文献6：Neuron 5,735－743(1990)

非专利文献7：Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513-29,2006

非专利文献8：Biochem.Biophys.Res.Commun.382,795－800(2009)

非专利文献9：Curr.Opin.Neurobiol.17,29－34(2007)

非专利文献10：J.Cell Biol.173,47－58(2006)

发明内容

本发明的课题在于提供一种对糖尿病性自主神经障碍有效的药剂。

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现RGMa抑制物质、尤其是抗RGMa中和抗体对糖尿病性自主神经障碍显示改善效果，以至完成了本发明。

即，本发明如下所述。

1.一种糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂，包含RGMa抑制物质。

2.根据项1所述的预防或治疗剂，其中，糖尿病性自主神经障碍是因慢性的高血糖而产生的自主神经障碍或作为肾功能不全的原因的自主神经障碍。

3.根据项1或项2所述的预防或治疗剂，其中，糖尿病性自主神经障碍是作为肾功能不全的原因的自主神经障碍。

4.根据项1～3中任一项所述的预防或治疗剂，其中，糖尿病性自主神经障碍是与肾功能不全有关的肾疾病。

5.根据项4所述的预防或治疗剂，其中，与肾功能不全有关的肾疾病为慢性肾病。

6.根据项1～5中任一项所述的预防或治疗剂，其中，RGMa抑制物质为抗RGMa中和抗体。

7.根据项6所述的预防或治疗剂，其中，抗RGMa中和抗体为人源化抗体。

8.根据项6或项7所述的预防或治疗剂，其中，抗RGMa中和抗体为识别选自序列号16、序列号36、序列号37、序列号38和序列号39中的氨基酸序列的抗体。

9.根据项6～8中任一项所述的预防或治疗剂，其中，抗RGMa中和抗体为选自下述(a)～(l)中的抗体：

(a)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号5中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号6中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号7中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号8中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号9中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号10中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(b)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号11中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号12中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号13中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号14中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号15中记载的氨基酸序列的HCDR2和在氨基酸序列中包含SFG的HCDR3，

(c)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号17中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号18中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号19中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号20中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号21中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号22中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(d)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号23中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号24中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号25中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号26中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号27中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号28中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(e)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号31中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(f)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号35中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(g)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号40中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(h)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号41中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(i)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号42中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(j)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号43中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(k)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号44中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，以及

(l)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号45中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3。

10.一种糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗方法，包括对需要治疗的哺乳动物给予有效量的RGMa抑制物质。

11.根据项10所述的预防或治疗方法，其中，RGMa抑制物质为抗RGMa中和抗体。

12.一种RGMa抑制物质的在制造糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂中的用途。

13.根据项12所述的用途，其中，RGMa抑制物质为抗RGMa中和抗体。

根据本发明，RGMa抑制物质、尤其是抗RGMa中和抗体例如作为糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂是有用的。

附图说明

图1是表示糖尿病病情下的肾脏中的RGMa基因表达变化的图。

图2是表示代表性的染色图像的图(代替附图的照片)。上段左表示非糖尿病、对照抗体给药组的结果，上段右表示非糖尿病、抗RGMa中和抗体给药组的结果，下段左表示糖尿病、对照抗体给药组的结果，下段右表示糖尿病、抗RGMa中和抗体给药组的结果。

图3为表示TH纤维密度的定量数据的图。

图4为表示尿中白蛋白/尿中肌酐比的定量数据的图。

具体实施方式

以下，对本发明中使用的用语进行说明。

[中和]

在本申请中，中和是指与目标靶结合且能够阻碍该靶的任一功能的作用。例如，RGMa抑制物质是指结合于RGMa，结果显示抑制RGMa的生物活性的作用的物质。

[表位]

在本申请中，表位包含能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的多肽决定基。在某个实施方式中，表位包含分子化学活性表面基团(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)，在某个实施方式中，可以具有特定的3维结构特性和/或特定的电荷特性。表位是通过抗体而结合的抗原区域。

[经分离的]

在本申请中，经分离的RGMa抑制物质(例如抗体等)等的“经分离的”是经鉴定且分离的、和/或从自然状态下的成分中回收的含义。自然状态下的杂质是可能妨碍该抗体的诊断或治疗用途的物质，可举出酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。一般而言，对RGMa抑制物质等进行分离时，只要通过至少1个纯化工序进行纯化即可，可以将通过至少1个纯化工序而纯化的RGMa抑制物质称为“经分离的RGMa抑制物质”。

[抗体]

在本申请中，抗体在广义上是指保持免疫球蛋白(Ig)分子的实质上与表位结合的特征的由2条重链(H链)和2条轻链(L链)这4条多肽链构成的Ig分子。

[人类抗体]

在本申请中，人类抗体是指轻链、重链均来自人免疫球蛋白的抗体。人类抗体根据重链的恒定区的不同，包含具有γ链的重链的IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、具有μ链的重链的IgM、具有α链的重链的IgA(包含IgA1、IgA2)、具有δ链的重链的IgD或具有ε链的重链的IgE。另外，原则上轻链包含κ链和λ链中的任一者。

[人源化抗体]

在本申请中，人源化抗体是指由可变区和来自人类抗体的恒定区构成的抗体，该可变区由来自非人类动物的抗体的互补决定区和来自人类抗体的构架区构成。

[嵌合抗体]

在本申请中，嵌合抗体是指轻链、重链或这两者由来自非人类的可变区和来自人类的恒定区构成的抗体。

[单特异性抗体]

在本申请中，单特异性抗体是指具有单一抗原特异性并同时具有单一的独立的抗原识别部位的抗体。在本说明书中，例如将识别RGMa的单特异性抗体称为RGMa单特异性抗体。

[多特异性抗体]

在本申请中，多特异性抗体是指具有2个以上不同的抗原特异性并同时具有2个以上的独立的抗原识别部位的抗体，可举出具有2个抗原特异性的双特异性抗体、具有3个抗原特异性的三特异性抗体等。

[互补决定区(CDR)]

互补决定区(CDR)是指免疫球蛋白分子的可变区中形成抗原结合位点的区域，也称为超可变区，是每个免疫球蛋白分子中氨基酸序列的变化特别大的部分。对于CDR，在轻链和重链中分别具有3个CDR。有时将轻链中所含的3个CDR分别称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且将重链中所含的3个CDR分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，免疫球蛋白分子的CDR可以按照卡巴特(Kabat)的编号系统(Kabat等，1987、Sequences of Proteins ofImmunological Interest、US Department of Health and Human Services、NIH、USA)来决定。

[有效量]

有效量是指足以减轻或改善障碍或其1种以上的症状的严重程度和/或期间，预防障碍恶化，减缓障碍，预防与障碍相关的1种以上的症状的复发、发生、发病或恶化，检测出障碍，或者强化或提高其它治疗(例如预防药或治疗药)的1种以上的预防或治疗效果的预防或治疗剂的量。

[氨基酸序列的百分比(％)同源性]

可变区等的候补多肽序列的氨基酸序列与参考多肽序列的氨基酸序列相关的“百分比(％)同源性”定义为使序列对齐，为了得到最大的％同源性，根据需要导入间隙，且任何的保守取代均不认为是序列同源性的一部分后的与特定的参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候补序列中的氨基酸残基的百分比。用于测定％同源性的目的的比对(alignment)可以通过使用本领域技术人员能力范围内的各种方法、例如使用BLAST、BLAST－2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件这样的可公开获得的计算机软件来实现。只要是本领域技术人员，则能够决定包含为了对比较的序列的全长实现最大比对所必需的任意算法的用于比对序列的适当的参数。但是，为了这里的目的，％同源性值通过在成对比对中使用序列比较计算机程序BLAST而得到。

在氨基酸序列比较中使用BLAST的状况下，所提供的氨基酸序列A与所提供的氨基酸序列B的％同源性如下计算：

分数X/Y的100倍

这里，X为通过序列比对程序BLAST的A和B的程序比对而为相同时则为一致的评分的氨基酸残基数，Y为B的总氨基酸残基数。在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不同的情况下，可以理解为A相对于B的％同源性与B相对于A的％同源性不同。只要没有特别说明，则这里所有的％同源性值如上一段所示使用BLAST计算机程序而得到。

[保守取代]

保守取代是指以实质上未改变肽的活性的方式将氨基酸残基以其它化学上类似的氨基酸残基取代。例如，可举出将某一疏水性残基由其它疏水性残基取代的情况、将某一极性残基由具有相同电荷的其它极性残基取代的情况等。作为能够进行这样的取代的功能上类似的氨基酸的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电荷的(碱性)氨基酸，可举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为带负电荷的(酸性)氨基酸，可举出天冬氨酸、谷氨酸等。

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

本发明提供一种RGMa抑制物质的新颖用途、即、糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂。

另外，本发明提供一种糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗方法，包括对需要治疗的哺乳动物给药包含有效量的RGMa抑制物质的预防或治疗剂。

＜RGMa抑制物质＞

本发明的RGMa抑制物质只要是作用于RGMa本身而抑制或减弱RGMa的活性(以下，在本说明书中有时简称为“RGMa活性”)的物质即可，例如，将具有结合于RGMa而直接抑制(减弱)RGMa活性的活性、或者抑制RGMa与受体的结合而间接地抑制(减弱)RGMa活性的活性的物质(例如后述的化合物或抗体等)称为本发明的RGMa抑制物质。

另外，本发明的RGMa抑制物质也可以为抑制RGMa的表达的物质，例如，抑制RGMa的表达而抑制(减弱)RGMa活性的物质(例如后述的核酸分子等)也包含在本发明的RGMa抑制物质中。

RGMa被鉴定为中枢神经系统中的神经突生长抑制蛋白质，人RGMa蛋白质如序列号1所示，以由450个氨基酸构成的前体蛋白质的形式被生物合成。除去存在于N末端的信号肽Met1～Pro47(是指从N端侧起第1号蛋氨酸残基到第47号脯氨酸残基的肽，以后同样地记载)，切断Asp168与Pro169之间的肽键，生成N末端结构域，进一步从Pro169除去C末侧的片段的C末端肽Ala425～Cys450，并且在成为C末端的Ala424的C末端羧基附加GPI锚定物，生成C末侧结构域。人RGMa蛋白质以通过二硫键将上述N末侧结构域(Cys48～Asp168)与C末侧结构域(Pro169～Ala424)连接而成的成熟蛋白质的形式经由GPI锚定物在细胞膜上表达。

在本发明中，RGMa可以来自任一种动物，但优选为人RGMa。人的RGMa的前体蛋白质由序列表的序列号1所示的氨基酸序列构成。虽然小鼠的RGMa的前体蛋白质由序列表的序列号2所示的氨基酸序列构成，大鼠的RGMa的前体蛋白质由序列表的序列号3所示的氨基酸序列构成，但由于C末端肽被除去，因此作为成熟蛋白质成为相同的氨基酸序列。

作为RGMa基因，可举出例如由序列号4所示的碱基序列构成的人RGMa基因等，但不限于此。来自各种生物的RGM基因的碱基序列可以从公知的数据库(GenBank等)容易地获得。

作为本发明的RGMa抑制物质，具体而言，可举出低分子化合物、抗RGMa中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体或它们的抗原结合片段等，另外，可举出作为RGMa的核酸分子的siRNA(short interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)或反义寡核苷酸等。这些RGMa抑制物质中，优选为抗RGMa中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体和它们的抗原结合片段，更优选为抗RGMa中和抗体或其抗原结合片段，特别优选为抗RGMa中和抗体。

＜抗RGMa中和抗体＞

在本发明中，抗RGMa中和抗体只要是结合于RGMa而中和RGMa活性的抗体即可，可以为多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明中，优选为单克隆抗体。另外，本发明的抗RGMa中和抗体可以为RGMa单特异性抗体，也可以为识别多种RGMa和其它抗原的多特异性抗体，优选为RGMa单特异性抗体。

另外，作为具体的表位，对于人RGMa，优选为序列号16(序列号1的氨基酸序号47－69)、序列号36(序列号1的氨基酸序号298－311)、序列号37(序列号1的氨基酸序号322－335)、序列号38(序列号1的氨基酸序号349－359)、序列号39(序列号1的氨基酸序号367－377)中的1种以上，更优选为序列号36和37的组合，特别优选为序列号36、37和39的组合。

本发明的抗RGMa中和抗体包含以RGMa蛋白质或其部分片段(例如上述的表位片段)作为抗原，并将该抗原对小鼠等哺乳动物进行免疫而得到的多克隆抗体和单克隆抗体，使用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体，以及使用产生人类抗体的转基因动物制造的人类抗体等。在将本发明的抗体作为药物对人类进行给药的情况下，从副作用的观点出发，优选人源化抗体或人类抗体。

作为本发明的抗RGMa中和抗体，具体而言，可举出下述(a)～(l)的抗体，制造方法可以分使用专利文献2－4中记载的方法。

可举出选自(a)～(l)中的抗体：(a)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号36、37和39作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号5中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号6中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号7中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号8中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号9中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号10中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(b)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号36、37和38作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号11中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号12中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号13中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号14中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号15中记载的氨基酸序列的HCDR2和在氨基酸序列中包含SFG的HCDR3，

(c)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号17中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号18中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号19中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号20中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号21中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号22中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(d)包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有包含序列号23中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号24中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号25中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号26中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号27中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号28中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(e)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号31中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(f)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号35中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(g)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号40中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(h)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号41中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(i)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号42中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(j)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号43中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，

(k)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号44中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3，以及

(l)抗RGMa中和抗体(该抗RGMa中和抗体还进一步包含将序列号16作为表位的抗体)，包含轻链可变区以及重链可变区，该轻链可变区含有包含序列号29中记载的氨基酸序列的LCDR1、包含序列号30中记载的氨基酸序列的LCDR2和包含序列号45中记载的氨基酸序列的LCDR3，该重链可变区含有包含序列号32中记载的氨基酸序列的HCDR1、包含序列号33中记载的氨基酸序列的HCDR2和包含序列号34中记载的氨基酸序列的HCDR3。

这些之中，特别优选可举出(a)记载的抗体。

本发明的抗RGMa中和抗体的制造方法可以使用现有的一般使用的制造方法。抗原可以直接用于免疫，也可以制成与载体蛋白的复合物而使用。抗原与载体蛋白的复合物的制备可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等缩合剂。载体蛋白可例示牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、KLH等。

作为进行免疫的哺乳动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猪、山羊、马或牛等，接种方法可举出皮下给药、肌肉给药或腹腔内给药。在给药时，可以与完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂混合而给药，给药通常每2～5周各进行1次。由免疫后的动物的脾脏或淋巴结得到的抗体产生细胞与骨髓瘤(Myeloma)细胞进行细胞融合，以杂交瘤的形式被分离。作为骨髓瘤细胞，可以使用来自哺乳动物、例如来自小鼠、大鼠、人类等的骨髓瘤细胞。

＜多克隆抗体＞

多克隆抗体例如可以通过将如上所述的抗原与根据需要的弗氏佐剂(Freund'sAdjuvant)一起对如上所述的哺乳动物进行免疫，从而从由该免疫敏化动物得到的血清获得。

＜单克隆抗体＞

具体而言，单克隆抗体可以按照下述方式获得。即，将如上所述的抗原作为免疫原，将该免疫原与根据需要的弗氏佐剂(Freund's Adjuvant)一起对如上所述的哺乳动物的皮下、肌肉内、静脉内、足垫内或腹腔内注射1～多次或者进行移植，从而施加免疫敏化。通常，从初次免疫开始每约1～14天进行1～4次免疫，从最终免疫起约1～5天后，从经免疫敏化的该哺乳动物获得抗体产生细胞。

单克隆抗体可以使用本领域技术人员周知的方法得到(例如“Current Protocolsin Molecular Biology”(John Wiley&Sons(1987))、Antibodies:A Laboratory Manual,Ed.Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。

分泌单克隆抗体的“杂交瘤”的制备可按照和Milstein等人的方法(自然(Nature),256,495,1975)和依据其的修饰方法来进行。即，通过使由经免疫敏化的哺乳动物获得的脾脏等中所含的抗体产生细胞与来自哺乳动物、优选小鼠、大鼠或人类的没有自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备。

作为细胞融合中所使用的骨髓瘤细胞，可以使用例如来自小鼠的Myeloma P3/X63－AG8.653(653)、P3/NSI/1－Ag4－1(NS－1)、P3/X63－Ag8.U1(P3U1)、SP2/0－Ag14(Sp2/O、Sp2)、PAI、F0或BW5147，来自大鼠的Myeloma 210RCY3－Ag.2.3.，来自人类的Myeloma U－266AR1、GM1500－6TG－A1－2、UC729－6、CEM－AGR、D1R11或CEM－T15等。

作为融合促进剂，可举出聚乙二醇等，通常可以通过使用20～50％左右浓度的聚乙二醇(平均分子量1000～4000)在20～40℃、优选30～37℃的温度下，抗体产生细胞数与骨髓瘤细胞数的比通常为1：1～10：1左右，反应约1～10分钟左右，从而实施细胞融合。

产生单克隆抗体的杂交瘤克隆的筛选可以通过将杂交瘤在例如微量滴定板中进行培养，通过ELISA等免疫化学的方法测定孔的培养上清液对免疫抗原的反应性而进行。

抗体产生杂交瘤细胞的筛选中，除进行与RGMa蛋白质的结合分析外，还进行该抗体是否阻碍本发明的RGMa活性的评价。通过这些筛选方法，能够选择本发明的抗RGMa中和抗体。

从包含产生目标抗体的杂交瘤的孔中进一步通过极限稀释法进行克隆，能够得到克隆体。杂交瘤的挑选、育种通常添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)，在包含10～20％牛胎儿血清的动物细胞用培养基中进行。

由杂交瘤的单克隆抗体的制造可以通过将杂交瘤在体外培养或者使其在小鼠、大鼠等哺乳动物的腹水中等体内进行增殖，从所得到的培养上清液或哺乳动物的腹水中进行分离而进行。

在体外培养的情况下，可以根据进行培养的细胞种类的特性和培养方法等的各种条件，使杂交瘤增殖、维持和保存，使用适于在培养上清液中产生单克隆抗体的营养培养基。营养培养基可举出公知的营养培养基或由基本培养基制备的营养培养基等。

作为基本培养基，例如可举出Ham’F12培养基、MCDB153培养基或者低钙MEM培养基等低钙培养基以及MCDB104培养基、MEM培养基、D－MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基本培养基可以根据目的含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。

单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述的培养上清液或腹水供给到饱和硫酸铵、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱法(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白质A柱等亲和柱色谱等而进行。具体而言，单克隆抗体的纯化只要使用已知的方法作为免疫球蛋白的纯化法即可，例如，可以通过硫酸铵分级法、PEG分级法、乙醇分级法、利用阴离子交换体、进一步使用RGMa蛋白质的亲和色谱等手段而容易地实现。

单克隆抗体也可以通过噬菌体展示法而获得。在噬菌体展示法中，使用目标免疫原对从任意的噬菌体抗体库所挑选的噬菌体进行筛选，选择对免疫原具有期望的结合性的噬菌体。接下来，对噬菌体中所含的抗体对应序列进行分离或序列决定，基于所分离的序列或所决定的序列信息来构建包含编码抗体或抗原结合结构域的核酸分子的表达载体。然后，通过培养该表达载体经转染的细胞株，能够产生单克隆抗体。通过使用人类抗体库作为噬菌体抗体库，能够生成具有期望的结合性的人类抗体。

＜核酸分子＞

编码本发明的抗RGMa中和抗体或其抗原结合片段的核酸分子例如可以通过以下的方法而得到。首先，使用市售的RNA提取试剂盒，由杂交瘤等的细胞制备全RNA，使用随机引物等，通过逆转录酶合成cDNA。接下来，在已知的人类抗体重链基因、轻链基因的可变区中，通过将分别保存的序列的寡核苷酸用于引物的PCR法使编码抗体的cDNA扩增。对于编码恒定区的序列，可以通过使用PCR法将已知的序列进行扩增而得到。DNA的碱基序列可以通过编入到序列决定用质粒中等并通过常规方法来决定。

或者，通过化学合成可变区或其部分序列并与包含恒定区的序列结合，从而也能够得到编码本发明的单克隆抗体的DNA。

该核酸分子可以为编码所有重链和轻链的恒定区和可变区的核酸分子，也可以为仅编码重链和轻链的可变区的核酸分子。编码所有恒定区和可变区时的重链和轻链的恒定区的碱基序列优选为Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal ofBiological Chemistry vol.257,p1516,1982和Cell vol.22,p197,1980中记载的碱基序列。

＜功能改变抗体＞

抗RGMa中和抗体的功能改变抗体可以通过如下所述的方法来制备。例如，如果使用破坏α1,6－岩藻糖转移酶(FUT8)基因的CHO细胞作为宿主细胞来制造本申请的抗RGMa中和抗体，则可得到糖链的岩藻糖含量降低而提高细胞杀伤功能的抗体，如果将导入有FUT8基因的CHO细胞作为宿主细胞来制造，则可得到低细胞杀伤功能的抗体(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)。另外，通过改变Fc区的氨基酸残基，从而能够调节补体活化功能(美国专利第6737056号、美国专利第7297775号、美国专利第7317091号)。进而，通过使用提高了对作为Fc受体的1种的FcRn的结合的Fc区域的变异体，能够实现血中半衰期的延长(桥口周平等，生物化学，2010、Vol.82(8),p710)。这些功能改变抗体可以采用基因工程来制造。通过使用提高了与作为Fc受体之一的FcRn的结合的Fc区域的变异体，能够实现血中半衰期的延长(桥口周平等，生物化学，2010、Vol.82(8),p710)。这些功能改变抗体可以采用基因工程来制造。

＜偶联抗体＞

作为本发明的抗RGMa中和抗体的改变分子，可举出偶联抗体。作为偶联抗体，可举出以化学或基因工程方式在抗RGMa中和抗体结合聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF－β、NGF、神经营养蛋白等)、白蛋白、酶、其它抗体等本申请的抗RGMa中和抗体以外的功能分子而成的偶联抗体。

在结合PEG作为功能分子的情况下，PEG可以非限定地使用分子量2000至100000Da、更优选10000至50000Da的PEG，可以为直链型，也可以为分支型。PEG例如通过使用NHS活性基团而能够结合于抗RGMa中和抗体的氨基酸的N末端氨基等。

在使用放射性物质作为功能分子的情况下，可使用¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu或²¹¹At等。放射性物质能够通过氯胺T法等而直接结合于抗RGMa中和抗体。

在使用毒素作为功能分子的情况下，可以使用细菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒蛋白)、低分子毒素(例如格尔达霉素)、美登素和卡奇霉素等。

在使用低分子化合物作为功能分子的情况下，可举出道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、丝裂霉素、新抑癌素、长春地辛和FITC等荧光色素等。

在使用酶作为功能分子的情况下，可以使用荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β－半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖－6－磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。

作为将毒素、低分子化合物或酶化学结合时使用的连接子，可举出二价自由基(例如亚烷基、亚芳基、杂亚芳基)、－(CR₂)_nO(CR₂)_n－(R为任意的取代基、n为正整数)表示的连接子、烷氧基的重复单元(例如聚亚乙基氧基、PEG、聚亚甲基氧基等)和烷基氨基(例如聚亚乙基氨基、Jeffamine(商标))、以及二酸酯和酰胺(可举出琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺等)。使功能分子结合的化学修饰方法已经在该领域中建立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.International Ltd,Monoclonal Antibody－Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chari et al.,Cancer Res.,1992 Vol152:127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996 Vol 93:8681)。

＜抗原结合片段＞

在本发明的实施方式中，抗体的“抗原结合片段”是指如上所述的抗体的具有抗原结合性的一部分区域，具体而言，可举出F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv(variable fragment ofantibody)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)以及它们的聚合物等，进而，抗原结合片段包含以化学或基因工程方式结合了聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF－β、NGF、神经营养蛋白等)、白蛋白、酶、其它抗体等本申请的抗RGMa中和抗体以外的功能分子的偶联片段。

“F(ab')₂”和“Fab'”是指通过利用作为蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等对免疫球蛋白进行处理而制造，且在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键前后被消化而生成的抗体片段。例如，如果利用木瓜蛋白酶对IgG进行处理，则在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键的上游被切断，能够制造由VL(轻链可变区)和CL(轻链恒定区)构成的轻链以及由VH(重链可变区)和CHγ1(重链恒定区中的γ1区域)构成的重链片段在C末端区域通过二硫键而结合的相同的2个抗体片段。将这2个相同的抗体片段分别称为Fab。另外，如果利用胃蛋白酶对IgG进行处理，则在存在于铰链区中的2条重链间的二硫键的下游被切断，能够制造比上述2个Fab在铰链区连接的抗体片段稍大的抗体片段。将该抗体片段称为F(ab')₂。

＜嵌合抗体＞

作为本发明的抗RGMa中和抗体的优选的方式，可举出嵌合抗体。作为“嵌合抗体”，可例示可变区为来自非人类动物(小鼠、大鼠、仓鼠、鸡等)的免疫球蛋白的可变区、恒定区为来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体。例如，可以将抗原对小鼠进行免疫，从该小鼠单克隆抗体的基因中切出与抗原结合的可变区，与来自人骨髓的抗体恒定区结合而制作。来自人免疫球蛋白的恒定区根据IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD和IgE等同型而各自具有固有的氨基酸序列，本发明中的重组嵌合抗体的恒定区可以为属于任一同型的人免疫球蛋白的恒定区。优选为人IgG的恒定区。可以使用如此制作的嵌合抗体的基因来制作表达载体。利用该表达载体将宿主细胞进行转化，从而得到嵌合抗体产生转化细胞，通过对该转化细胞进行培养，从而从培养上清液中得到目标嵌合化抗体。

＜人源化抗体＞

作为本发明的抗RGMa中和抗体的其它优选的方式，可举出人源化抗体。本发明中的“人源化抗体”是仅将小鼠等非人类动物抗体的抗原结合位点(CDR、互补决定区)的DNA序列移植(CDR grafting)到人类抗体基因而成的抗体。例如，可以参照日本特表平4－506458号公报和日本专利2912618号说明书等中记载的方法来制作。具体而言，是指一种人源化抗体，其特征在于，其CDR的一部分或全部为来自非人类哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠等)的单克隆抗体的CDR，其可变区的构架区为来自人免疫球蛋白的可变区的构架区，且其恒定区为来自人免疫球蛋白的恒定区。

本发明中的人源化抗体例如可以按照以下方式来制造。然而，当然并不限定于这样的制造方法。

例如，来自小鼠单克隆抗体的重组人源化抗体可以参照日本特表平4－506458号公报和日本特开昭62－296890号公报等，以基因工程方式来制作。即，从产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤分离小鼠重链CDR部分的DNA和小鼠轻链CDR部分的DNA，从人免疫球蛋白基因分离除人重链CDR以外的全部区域的人重链基因和除人轻链CDR以外的全部区域的人轻链基因。

将移植了分离出的小鼠重链CDR部分的DNA的人重链基因以能够表达的方式导入到适当的表达载体中，同样地将移植了小鼠轻链CDR部分的DNA的人轻链基因以能够表达的方式导入到适当的另1个表达载体中。或者也可以将移植了小鼠的CDR的人的重链和轻链基因以能够表达的方式导入到同一表达载体中。利用如此制作的表达载体将宿主细胞进行转化，从而得到人源化抗体产生转化细胞，通过对该转化细胞进行培养而从培养上清液中得到目标人源化抗体。

＜人类抗体＞

作为本发明的抗RGMa中和抗体的其它优选的方式，可举出人类抗体。人类抗体是包含构成免疫球蛋白的重链的可变区和重链的恒定区以及轻链的可变区和轻链的恒定区的全部区域为来自编码人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白的抗体，可以将人类抗体基因导入到小鼠中来制作。具体而言，例如可以至少将人免疫球蛋白基因编入到小鼠等人类以外的哺乳动物的基因座中而制作转基因动物，并利用抗原对该转基因动物进行免疫敏化，从而与上述多克隆抗体或单克隆抗体的制作方法同样地制造。

例如，产生人类抗体的转基因小鼠可以按照Nature Genetics,Vol.7,p.13－21,1994；Nature Genetics,Vol.15,p.146－156,1997；日本特表平4－504365号公报；日本特表平7－509137号公报；国际公开WO94/25585号公报；Nature,Vol.368,p.856－859,1994；以及日本特表平6－500233号公报等中记载的方法来制作。更具体而言，可举出HuMab(注册商标)小鼠(Medarex,Princeton NJ)、KMTM小鼠(Kirin Pharma Company,Japan)、KM(FCγRIIb－KO)小鼠等。

作为本发明的抗RGMa中和抗体，具体而言，可举出在重链可变区具有包含特定的氨基酸序列的CDR且在轻链可变区具有包含特定的氨基酸序列的CDR的抗RGMa中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗RGMa中和抗体)。

应予说明，只要具有与RGMa的结合能力且可维持抑制(中和)RGMa的活性这样的本发明的抗体的特性，则在抗RGMa中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗RGMa中和抗体)的氨基酸序列中也可以取代、缺失、附加或插入1或多个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个，优选1～2个)。这样的取代、缺失、附加可以导入于CDR，但优选导入于CDR以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守取代。

在氨基酸序列中包含取代、缺失等的本发明的抗RGMa中和抗体(优选为上述(a)～(l)的抗RGMa中和抗体)的氨基酸序列例如为如下氨基酸序列：氨基酸序列改变后的重链可变区与改变前的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的％同源性，且氨基酸序列改变后的轻链可变区与改变前的氨基酸序列具有90％以上(更优选为95％、96％、97％、98％、99％以上)的％同源性。

在本发明中，siRNA是指能够抑制靶基因(在本发明中为RGMa基因)的表达的短的双链RNA。只要作为抑制本发明的RGMa活性的siRNA发挥作用，则碱基序列、长度(碱基长度)没有特别限定，优选小于约30个碱基，更优选为约19～27个碱基，进一步优选为约21～25个碱基。

在本发明中，shRNA是指通过在单链RNA中部分包含廻文状的碱基序列而在分子内形成双链结构，由在3'末端具有突出部的短的发夹结构(hairbin)构成的约20个碱基对以上的分子。这样的shRNA在导入到细胞内后，在细胞内分解成约20个碱基(代表性为例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，能够与siRNA同样地抑制靶基因的表达。

在本发明中，上述siRNA和shRNA只要能够抑制RGMa基因的表达，则可以为任何形态。

在本发明中，siRNA或shRNA可以人工进行化学合成。另外，例如可以使用T7RNA聚合酶和T7启动子，由模板DNA在体外合成反义和正义的RNA。反义寡核苷酸只要是与RGMa基因的DNA序列中连续的5至100个碱基序列互补或杂交的核苷酸即可，可以为DNA或RNA中的任一者。另外，只要不影响功能，则也可以进行修饰。反义寡核苷酸可以按照常规方法进行合成，例如，可以利用市售的DNA合成装置而容易地合成。

优选的序列可以使用通常的选择方法来选择，作为本发明中的siRNA或shRNA，可以通过评价功能性RGMa的表达抑制来确认。

＜糖尿病性自主神经障碍＞

本发明中的糖尿病性自主神经障碍是指糖尿病等因慢性的高血糖而产生的自主神经的病变和作为肾功能不全的原因的自主神经的障碍。

在此，所谓糖尿病等因慢性的高血糖而产生的自主神经的障碍，可举出以慢性的高血糖为原因而产生的在全身的脏器中可见的多种征兆、症状，例如，(1)作为心血管系统的自主神经障碍，可举出起立性低血压、心律失常等，(2)作为消化系统的自主神经障碍，可举出由胃轻瘫导致的呕吐、腹泻(糖尿病性腹泻等)等，(3)作为泌尿·生殖系统的自主神经障碍，可举出神经源性膀胱、勃起障碍等，(4)作为代谢系统的自主神经障碍，可举出无意识性低血糖、低血糖相关自主神经不全等，(5)作为末梢血管运动功能涉及的自主神经障碍，可举出由该障碍导致的血压调节机制的破坏、由内分泌系统障碍导致的体液平衡的破坏、贫血等。

另外，肾自主神经通过全身和肾血流的调节、神经体液性因子的分泌、对肾血管的直接作用等而与肾功能紧密相关，因此，肾自主神经的保护被广泛认为有助于慢性肾病的病情中的肾功能的改善(参考文献：Front Med.2018Mar 29；5:82.doi:10.3389/fmed.2018.00082.)。因此，所谓作为肾功能不全的原因的自主神经障碍，例如，可举出慢性肾病(例如，糖尿病性肾病(包含糖尿病性肾病)等)等与肾功能不全有关的肾疾病。

在本发明中，可以期待对由上述的糖尿病性自主神经障碍所带来的不利(疾病或症状)的预防或治疗效果。

本发明中的治疗对象(优选为哺乳动物、特别是人)是以糖尿病性自主神经障碍发病的患者为对象，可以将本发明的糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂对这些患者进行给药。

这里，“治疗”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类的疾病的任意的治疗，包含阻止疾病和症状的恶化，并消除、治愈、减轻或缓和这样的疾病和症状。

另外，“预防”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类防止或抑制上述疾病的发病。进而，本发明中的“预防”是包含对治疗对象、优选为哺乳动物、特别是人类缓解或防止反复复发的上述疾病的复发的“预防复发”。

＜药物组合物＞

本发明中的糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂，通常是全身或局部地以口服或非口服的形式给药。

本发明中的糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂以RGMa抑制物质为有效成分，可以适当地配合药学上允许的载体或添加剂而制剂化。如此制剂化的药物组合物能够以口服或非口服的形式给药。具体而言，可以制成片剂、包衣片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂等口服剂，另外，可以制成注射剂、输液、栓剂、软膏、贴剂等非口服剂。对于载体或添加剂的配合比例，只要基于医药品领域中通常采用的范围适当地设定即可。可以配合的载体或添加剂没有特别限定，可举出例如水、生理盐水、其它水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体、例如赋形剂、粘合剂、pH调节剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。

在RGMa抑制物质为抗RGMa中和抗体、其功能改变抗体、其偶联抗体或它们的抗原结合片段的情况下，优选作为与药学上允许的载体一起制剂化的注射剂或输液以非口服给药途径、例如静脉内、肌肉内、皮肤内、腹腔内、皮下或局部进行给药。

例如，包含抗RGMa中和抗体的注射剂或输液剂可以作为溶液、悬浮液或乳浊液来使用。作为其溶剂，可以使用例如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖溶液和等渗溶液(例如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等的溶液)等。

进而，包含这样的抗RGMa中和抗体的注射剂或输液还可以包含稳定剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、保存剂、防腐剂、pH调节剂等。

作为稳定剂，可以使用例如白蛋白、球蛋白、明胶、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、EDTA钠、柠檬酸钠、二丁基羟基甲苯等。

作为助溶剂，可以使用例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如Polysolvate80(注册商标)、HCO－50等)等。

作为悬浮剂，可以使用例如单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。

作为乳化剂，可以使用例如阿拉伯胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。

作为舒缓剂，可以使用例如苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。

作为缓冲剂，可以使用例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液等。

作为保存剂，可以使用例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苄醇、苯扎氯铵、脱氢乙酸钠、依地酸钠、硼酸、硼砂等。

作为防腐剂，可以使用例如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

作为pH调节剂，可以使用例如盐酸、氢氧化钠、磷酸、乙酸等。

在RGMa抑制物质为核酸(siRNA、shRNA、反义寡核苷酸等)的情况下，可以以非病毒载体或病毒载体的形式进行给药。在非病毒载体形式的情况下，可以利用使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、HVJ－脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法、脂转染胺(Lipofectamine)法等)、微注射法、用基因枪(Gene Gun)将核酸分子与载体(金属颗粒)一起移入到细胞中的方法等。例如，在使用病毒载体将siRNA或shRNA对生物体进行给药的情况下，可以利用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。通过对经无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒、仙台病毒、SV40等DNA病毒或RNA病毒导入表达siRNA或shRNA的DNA，使细胞或组织感染该重组病毒，从而能够将基因导入到细胞或组织内。

如此得到的制剂通过对例如人类或其它哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)给药其有效量，能够预防或治疗糖尿病性自主神经障碍。给药量可以考虑目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、病史、有效成分的种类等而适当地设定。例如在有效成分为抗RGMa中和抗体的情况下，将平均具有约65～70kg的体重的人类作为对象时，优选每1天为0.02mg～4000mg左右，更优选为0.1mg～200mg左右。每1天的总给药量可以为单一给药量，也可以为分批给药量。

＜与其它药剂或治疗的并用＞

在本发明中，糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂以血糖对照为目的，可以以与抗糖尿病药并用的方式进行给药。作为并用的抗糖尿病药，例如，可举出降血糖剂，具体而言，可举出DPP4抑制剂、SGLT抑制剂、GLP－1受体激动剂等。

在本发明中，糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂以血压对照为目的，可以以与高血压治疗药并用的方式进行给药。作为并用的高血压治疗药，例如可举出血管紧张素II受体拮抗剂(ARB)、ACE抑制剂等，在降压效果不充分的情况下，也可以并用Ca拮抗剂、利尿药。

上述其它药剂或治疗可以在本发明的糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂的给药前或给药后进行给药或实施，另外，也可以同时给药或实施。

实施例

以下，举出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限定于这些实施例。

应予说明，作为抗RGMa中和抗体，在各实施例中使用包含本说明书所记载的(a)的氨基酸序列(序列号5～10)的抗RGMa中和抗体。

[实施例1]

使用药物诱导性糖尿病模型小鼠进行糖尿病情下的肾脏中的RGMa mRNA的表达解析，接下来，对抗RGMa中和抗体对于肾自主神经障碍的治疗效果进行组织学研究。

＜糖尿病的诱导＞

将7～8周龄的C57BL/6J雌性小鼠用于实验。对于糖尿病诱导组，将链脲佐菌素(STZ:Sigma－Aldrich)20mg/ml以10ml/kg的用量进行单次腹腔内给药。对于非糖尿病诱导组，将溶剂以10ml/kg的用量进行给药。以现有研究为参考(参考文献1、2)，从糖尿病诱导起1周后进行血糖值测定，将血糖值低于300mg/dl的个体排除。

＜RGMa mRNA表达解析＞

将基于STZ的糖尿病诱导后经过8周的时间点的小鼠(4只)和对照小鼠(4只)充分地麻醉后，在开腹后，从左心室灌流冰冷PBS，进行脱血。迅速地摘除肾脏，回收到包含适量TRIzol溶液(15596026；Thermo Fisher Scientific)和破碎用氧化锆珠(ZB－10；TOMYSEIKO Co,Ltd.)的组织破碎管(TM－625S；TOMY SEIKO Co,Ltd.)中，使用珠式细胞破碎装置(MS－100R；TOMY SEIKO Co,Ltd.)进行破碎。接下来，对RNA进行提取·纯化(使用RNeasyMini Kit(74104；QIAGEN))后，通过逆转录反应制作cDNA，使用Fast SYBR Green Mastermix(4385612,Thermo Fisher Scientific)、QuantStudio 7 Flex Real－Time PCRSystem(Thermo Fisher Scientific)进行反应。根据由本结果测量的Ct值，以将Gapdh作为内源性对照的ΔΔCt法进行相对定量。

＜组织学解析：抗体给药方法、分组＞

将购入的小鼠随机地分为“非糖尿病－抗RGMa中和抗体给药组”、“非糖尿病－同型对照抗体(Palivizumab)给药组”、“糖尿病－抗RGMa中和抗体给药组”和“糖尿病－同型对照抗体(Palivizumab)给药组”这4组，STZ(糖尿病组)或溶剂(柠檬酸缓冲液(pH＝4.5))给药3天后，开始抗RGMa中和抗体或对照抗体的给药。任一抗体均调整为6mg/ml的浓度后，以30mg/kg的用量每周1次进行合计6次尾静脉内给药，在6周后进行采样。

＜组织采样·肾透明化·免疫组织染色＞

在充分麻醉后，在基于4％多聚甲醛(PFA)的灌流固定后，摘除肾脏，后固定后，在30％蔗糖/PBS溶液中在4℃静置2～3天后，按照CUBIC法进行透明化。以先行研究(参考文献3－7)为参考，使用在研究条件的基础上进行了修正的以下的步骤。将30％蔗糖置换后的肾脏进行PBS清洗后，转移到用超纯水稀释为50％的CUBIC－L溶液中，在室温振荡一晩。接下来，转移到100％CUBIC－L溶液中，在37℃振荡5天。在用PBS清洗后，转移到一次抗体液中，在37℃振荡5天，该一次抗体液是使一次抗体溶解在包含0.1％Triton X－100、0.5％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS中而得的。在用PBS－0.5％Triton－X100清洗1天后，转移到二次抗体液中，在37℃振荡5天，该二次抗体液是将二次抗体用包含0.1％Triton X－100、0.1％BSA和0.01％叠氮化钠的PBS稀释而得的。用PBS－0.5％Triton X－100清洗1天后，浸渍在用PB(0.2M)稀释的1％甲醛溶液中3小时，用PBS清洗。浸渍在用超纯水稀释为50％的CUBIC－R中6小时以上，并浸渍于100％CUBIC－R中，从而进行透明化。透明化的组织的观察和摄像使用共聚焦激光显微镜FV－3000(Olympus)。以z间隔1μm的间隔拍摄透明化的肾脏的中央部、从表面到200μm为止的部位，将拍摄图像投影于1张图像后，进行每单位面积的TH阳性交感神经纤维密度的定量。对各组各6个个体进行该操作，进行解析。使用的试剂如下。

·CUBIC－L溶液

Triton X－100(NACALAI TESQUE,INC.,Kyoto,Japan)：10w％N－buthyldiethanolamine(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd,Tokyo,Japan)：10w％

将上述试剂溶解于超纯水。

·CUBIC－R溶液

2,3－dimethyl－1－phenyl－5－pyrazolane/antipyrine(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd,Tokyo,Japan)：45w％nicotinamide(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd,Tokyo,Japan)：30w％

将上述试剂溶解于超纯水。

·一次抗体

抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体(1:100；abcam,Cambridge,UK)

·二次抗体

Alexa Fluor 488donkey anti－sheep IgG(H+L)(1:200；Invitrogen,Waltham,MA,USA)

＜结果＞

通过基因表达解析，在糖尿病病情中可见肾脏中的RGMa的mRNA的表达上升(图1)，表明RGMa参与本病情。接下来，示出将进行的对糖尿病小鼠的抗RGMa抗体和对照给药实验的代表性的染色图像(图2)和TH纤维密度的定量数据(图3)。定量数据中示出的4组结果是以各组n＝6而获得的。非糖尿病组中，不论给药的抗体的种类，TH纤维的密度均没有变化。另一方面，将非糖尿病组与“糖尿病－同型对照抗体给药组”进行比较时，可见TH纤维密度减少的趋势。另一方面，“糖尿病－抗RGMa中和抗体给药组”与“糖尿病－同型对照抗体给药组”相比，可见TH纤维密度的改善趋势。根据以上的结果，认为抗RGM中和抗体缓和了由糖尿病引起的肾自主神经的障碍。

[实施例2]

使用药物诱导性糖尿病模型小鼠，根据尿蛋白量的指标来研究抗RGMa中和抗体对于肾功能不全的治疗效果。

＜糖尿病的诱导＞

将7～8周龄的C57BL/6J雌性小鼠用于实验。对于糖尿病诱导组，将链脲佐菌素(STZ:Sigma－Aldrich)20mg/ml以10ml/kg的用量进行单次腹腔内给药。对于非糖尿病诱导组，将溶剂以10ml/kg的用量进行给药。以先行研究为参考(参考文献1、2)，从糖尿病诱导起3天后进行血糖值测定，将血糖值低于300mg/dl的个体排除。

＜组织学解析：抗体给药方法、分组＞

将购入的小鼠随机地分为“非糖尿病－生理盐水给药组”、“糖尿病－抗RGMa中和抗体给药组”和“糖尿病－同型对照抗体(Palivizumab)给药组”这3组，STZ(糖尿病组)或溶剂(柠檬酸缓冲液(pH＝4.5))给药3天后，开始生理盐水、抗RGMa中和抗体或对照抗体的给药。生理盐水以30mg/kg的用量每周1次进行合计5次尾静脉内给药。另外，任一抗体均调整为6mg/ml的浓度后，以30mg/kg的用量每周1次进行合计5次尾静脉内给药，在5周后进行采样。

＜尿中白蛋白/尿中肌酐比的算出＞

作为由肾障碍导致的蛋白尿的指标，使用尿中白蛋白/尿中肌酐比。在糖尿病诱导后5周的时间点，将各组个体分别放入代谢笼(Tecniplast Japan Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)，在自由行动下进行采尿。样品在至用于测定为止的期间，在－30℃保存。尿中白蛋白使用Levis白蛋白小鼠ELISA试剂盒(FUJIFILM Wako Shibayagi Corporation,Gunmapref.,Japan)进行定量，尿中肌酐使用LabAssay Creatinine(FUJIFILM Wako PureChemical Corporation,Osaka,Japan)进行定量，算出尿中白蛋白/尿中肌酐比(UACR)。

＜结果＞

将尿中白蛋白/尿中肌酐比的定量数据示于图4。定量中示出的3组的结果是以各组n＝6而获得的。对非糖尿病－生理盐水给药组与“糖尿病－同型对照抗体给药组”进行比较时，可见尿中白蛋白/尿中肌酐比的上升趋势，认为反映了肾障碍。另一方面，“糖尿病－抗RGMa中和抗体给药组”与“糖尿病－同型对照抗体给药组”相比，可见尿中白蛋白/尿中肌酐比的改善趋势。因此，认为抗RGMa中和抗体具有缓和由糖尿病引起的肾障碍的效果。根据以上的结果，认为抗RGMa中和抗体缓和由糖尿病引起的肾自主神经的障碍。

综上所述，可以期待RGMa抑制物质、优选抗RGMa中和抗体用作作为肾功能不全的原因的自主神经障碍的预防或治疗剂以及慢性肾病等与肾功能不全有关的肾疾病的预防或治疗剂。

＜参考文献＞

1.Deeds MC,Anderson JM,Armstrong AS,et al.Single dose streptozotocin－induced diabetes:Considerations for study design in islet transplantation models.LabAnim.2011；45(3):131－140.doi:10.1258/la.201 0.010090

2.O’brien PD,Sakowski SA,Feldman EL.Mouse models of diabet icneuropathy.ILAR J.2014；54(3):259－272.doi:10.1093/ilar/ilt052

3.Hasegawa S,Susaki EA,Tanaka T,et al.Comprehensive three－dimensional analysis(CUBIC－kidney)visualizes abnormal renal symp atheticnerves after ischemia/reperfusion injury.Kidney Int.2019；96(1):129－138.doi:10.1016/j.kint.2019.02.011

4.Kubota SI,Takahashi K,Nishida J,et al.Whole－Body Profiling ofCancer Metastasis with Single－Cell Resolution.Cell Rep.2017；20(1):236－250.doi:10.1016/j.celrep.2017.06.010

5.Tainaka K,Murakami TC,Susaki EA,et al.Chemical Landscape for TissueClearing Based on Hydrophilic Reagents.Cell Rep.2018；24(8):2196－2210.e9.doi:10.1016/j.celrep.2018.07.056

6.Richardson DS,Lichtman JW.Clarifying Tissue Clearing.Cell.2015；162(2):246－257.doi:10.1016/j.cell.2015.06.067

7.Yokoyama T,Lee JK,Miwa K,et al.Quantification of sympathe tichyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three－dimensional assessmentof the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts.PLoS One.2017；12(7):1－13.doi:10.1371/journal.pone.0182072

＜序列表的说明＞

序列号1：人RGMa前体蛋白质的氨基酸序列

序列号2：小鼠RGMa前体蛋白质的氨基酸序列

序列号3：大鼠RGMa前体蛋白质的氨基酸序列

序列号4：人RGMa基因的DNA序列

序列号5：抗RGMa中和抗体r116A3的LCDR1的氨基酸序列

序列号6：抗RGMa中和抗体r116A3的LCDR2的氨基酸序列

序列号7：抗RGMa中和抗体r116A3的LCDR3的氨基酸序列

序列号8：抗RGMa中和抗体r116A3的HCDR1的氨基酸序列

序列号9：抗RGMa中和抗体r116A3的HCDR2的氨基酸序列

序列号10：抗RGMa中和抗体r116A3的HCDR3的氨基酸序列

序列号11：抗RGMa中和抗体r70E的LCDR1的氨基酸序列

序列号12：抗RGMa中和抗体r70E的LCDR2的氨基酸序列

序列号13：抗RGMa中和抗体r70E的LCDR3的氨基酸序列

序列号14：抗RGMa中和抗体r70E的HCDR1的氨基酸序列

序列号15：抗RGMa中和抗体r70E的HCDR2的氨基酸序列

序列号16：人RGMa的表位的氨基酸序列

序列号17：抗RGMa中和抗体5F9的LCDR1的氨基酸序列

序列号18：抗RGMa中和抗体5F9的LCDR2的氨基酸序列

序列号19：抗RGMa中和抗体5F9的LCDR3的氨基酸序列

序列号20：抗RGMa中和抗体5F9的HCDR1的氨基酸序列

序列号21：抗RGMa中和抗体5F9的HCDR2的氨基酸序列

序列号22：抗RGMa中和抗体5F9的HCDR3的氨基酸序列

序列号23：抗RGMa中和抗体8D1的LCDR1的氨基酸序列

序列号24：抗RGMa中和抗体8D1的LCDR2的氨基酸序列

序列号25：抗RGMa中和抗体8D1的LCDR3的氨基酸序列

序列号26：抗RGMa中和抗体8D1的HCDR1的氨基酸序列

序列号27：抗RGMa中和抗体8D1的HCDR2的氨基酸序列

序列号28：抗RGMa中和抗体8D1的HCDR3的氨基酸序列

序列号29：抗RGMa中和抗体AE12－1的LCDR1的氨基酸序列

序列号30：抗RGMa中和抗体AE12－1的LCDR2的氨基酸序列

序列号31：抗RGMa中和抗体AE12－1的LCDR3的氨基酸序列

序列号32：抗RGMa中和抗体AE12－1的HCDR1的氨基酸序列

序列号33：抗RGMa中和抗体AE12－1的HCDR2的氨基酸序列

序列号34：抗RGMa中和抗体AE12－1的HCDR3的氨基酸序列

序列号35：抗RGMa中和抗体AE12－1Y的LCDR3的氨基酸序列

序列号36：人RGMa的表位的氨基酸序列

序列号37：人RGMa的表位的氨基酸序列

序列号38：人RGMa的表位的氨基酸序列

序列号39：人RGMa的表位的氨基酸序列

序列号40：抗RGMa中和抗体AE12－1F的LCDR3的氨基酸序列

序列号41：抗RGMa中和抗体AE12－1H的LCDR3的氨基酸序列

序列号42：抗RGMa中和抗体AE12－1L的LCDR3的氨基酸序列

序列号43：抗RGMa中和抗体AE12－1V的LCDR3的氨基酸序列

序列号44：抗RGMa中和抗体AE12－1I的LCDR3的氨基酸序列

序列号45：抗RGMa中和抗体AE12－1K的LCDR3的氨基酸序列产业上的可利用性

本发明的RGMa抑制物质对于糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗是有用的，因此，在医药品产业中具有高利用价值。

序列表

<110> 国立大学法人大阪大学

田边三菱制药株式会社

<120> 糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂

<130> A19097-1688

<150> JP2020-004444

<151> 2020-01-15

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

50 55 60

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

85 90 95

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

100 105 110

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

130 135 140

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145 150 155 160

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

165 170 175

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

180 185 190

Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

195 200 205

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

210 215 220

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225 230 235 240

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

245 250 255

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

260 265 270

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

275 280 285

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

290 295 300

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305 310 315 320

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

325 330 335

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

340 345 350

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

355 360 365

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

370 375 380

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385 390 395 400

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

405 410 415

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

420 425 430

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

435 440 445

Phe Cys

450

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly

50 55 60

Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu

65 70 75 80

Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly

85 90 95

Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser

100 105 110

Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu

130 135 140

Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn

145 150 155 160

Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr

165 170 175

Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp

180 185 190

Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly

195 200 205

Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe

210 215 220

Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu

225 230 235 240

Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly

245 250 255

Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu

260 265 270

Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly

275 280 285

Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala

290 295 300

Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys

305 310 315 320

Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu

325 330 335

Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu

340 345 350

Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro

355 360 365

Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr

370 375 380

Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly

385 390 395 400

Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr

405 410 415

Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr

420 425 430

Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Leu Leu Gly Thr Ile Pro Leu Leu Val

435 440 445

Leu Leu Pro Val Leu Trp

450

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> 褐家鼠

<400> 3

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly

50 55 60

Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu

65 70 75 80

Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly

85 90 95

Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser

100 105 110

Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu

130 135 140

Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn

145 150 155 160

Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr

165 170 175

Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp

180 185 190

Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly

195 200 205

Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe

210 215 220

Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu

225 230 235 240

Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly

245 250 255

Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu

260 265 270

Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly

275 280 285

Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala

290 295 300

Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys

305 310 315 320

Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu

325 330 335

Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu

340 345 350

Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro

355 360 365

Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr

370 375 380

Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly

385 390 395 400

Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr

405 410 415

Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro

420 425 430

Glu Met Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe

435 440 445

Trp

<210> 4

<211> 1353

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atgcagccgc caagggagag gctagtggta acaggccgag ctggatggat gggtatgggg 60

agaggggcag gacgttcagc cctgggattc tggccgaccc tcgccttcct tctctgcagc 120

ttccccgcag ccacctcccc gtgcaagatc ctcaagtgca actctgagtt ctggagcgcc 180

acgtcgggca gccacgcccc agcctcagac gacacccccg agttctgtgc agccttgcgc 240

agctacgccc tgtgcacgcg gcggacggcc cgcacctgcc ggggtgacct ggcctaccac 300

tcggccgtcc atggcataga ggacctcatg agccagcaca actgctccaa ggatggcccc 360

acctcgcagc cacgcctgcg cacgctccca ccggccggag acagccagga gcgctcggac 420

agccccgaga tctgccatta cgagaagagc tttcacaagc actcggccac ccccaactac 480

acgcactgtg gcctcttcgg ggacccacac ctcaggactt tcaccgaccg cttccagacc 540

tgcaaggtgc agggcgcctg gccgctcatc gacaataatt acctgaacgt gcaggtcacc 600

aacacgcctg tgctgcccgg ctcagcggcc actgccacca gcaagctcac catcatcttc 660

aagaacttcc aggagtgtgt ggaccagaag gtgtaccagg ctgagatgga cgagctcccg 720

gccgccttcg tggatggctc taagaacggt ggggacaagc acggggccaa cagcctgaag 780

atcactgaga aggtgtcagg ccagcacgtg gagatccagg ccaagtacat cggcaccacc 840

atcgtggtgc gccaggtggg ccgctacctg acctttgccg tccgcatgcc agaggaagtg 900

gtcaatgctg tggaggactg ggacagccag ggtctctacc tctgcctgcg gggctgcccc 960

ctcaaccagc agatcgactt ccaggccttc cacaccaatg ctgagggcac cggtgcccgc 1020

aggctggcag ccgccagccc tgcacccaca gcccccgaga ccttcccata cgagacagcc 1080

gtggccaagt gcaaggagaa gctgccggtg gaggacctgt actaccaggc ctgcgtcttc 1140

gacctcctca ccacgggcga cgtgaacttc acactggccg cctactacgc gttggaggat 1200

gtcaagatgc tccactccaa caaagacaaa ctgcacctgt atgagaggac tcgggacctg 1260

ccaggcaggg cggctgcggg gctgcccctg gccccccggc ccctcctggg cgccctcgtc 1320

ccgctcctgg ccctgctccc tgtgttctgc tag 1353

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 6

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 7

Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 8

Asp Ala Trp Met Asp

1 5

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 9

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 10

Arg Asp Gly Ala Tyr

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 11

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 12

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 13

Ser Gln Ser Thr His Val Pro

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 14

Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn

1 5

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 16

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser

1 5 10 15

Gly Ser His Ala Pro Ala Ser

20

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 17

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu

1 5 10 15

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 18

Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 19

Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 20

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 21

Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 22

Gly Thr Thr Pro Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 23

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 24

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 25

Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg Thr

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 26

Ser Tyr Val Met His

1 5

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 27

Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 28

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 29

Thr Gly Thr Ser Ser Ser Val Gly Asp Ser Ile Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 30

Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 31

Cys Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 32

Ser His Gly Ile Ser

1 5

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 33

Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 34

Val Gly Ser Gly Pro Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 35

Tyr Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 36

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly

1 5 10

<210> 37

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 40

Phe Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 41

His Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 42

Leu Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 43

Val Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 44

Ile Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成

肽

<400> 45

Lys Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

Claims (4)

1.一种RGMa抑制物质的、在制造糖尿病性自主神经障碍的预防或治疗剂中的用途，所述RGMa抑制物质为抗RGMa中和抗体或其抗原结合片段，所述糖尿病性自主神经障碍为与肾功能不全有关的肾疾病，

抗RGMa中和抗体为下述（a）的抗体：

（a）包含轻链可变区以及重链可变区的抗RGMa中和抗体，该轻链可变区含有：由序列号5中记载的氨基酸序列构成的LCDR1、由序列号6中记载的氨基酸序列构成的LCDR2以及由序列号7中记载的氨基酸序列构成的LCDR3，该重链可变区含有：由序列号8中记载的氨基酸序列构成的HCDR1、由序列号9中记载的氨基酸序列构成的HCDR2和由序列号10中记载的氨基酸序列构成的HCDR3。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，与肾功能不全有关的肾疾病为慢性肾病。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，抗RGMa中和抗体为人源化抗体。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的用途，其中，抗RGMa中和抗体为识别选自序列号36、序列号37和序列号39中的氨基酸序列的抗体。