CN114829601A - Sbds抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SBDS抑制剂，其用于治疗HBV感染，特别是慢性HBV感染。本发明特别地涉及SBDS抑制剂用于使cccDNA例如HBVcccDNA不稳定的用途。本发明还涉及与SBDS互补并且能够降低SBDSmRNA的水平的核酸分子。本发明中还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗中的用途。

Description

SBDS抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途

技术领域

本发明涉及用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，特别是慢性HBV感染的SBDS抑制剂。本发明特别地涉及SBDS抑制剂用于使cccDNA例如HBV cccDNA不稳定的用途。本发明还涉及与SBDS互补并能够降低SBDS表达的核酸分子，例如包括siRNA、shRNA和反义寡核苷酸的寡核苷酸。本发明还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗和/或预防中的用途。

背景技术

乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病，乙型肝炎病毒是一种小型的嗜肝病毒，其可通过逆转录复制。慢性HBV感染是导致严重肝病(例如肝硬化和肝细胞癌)的关键因素。目前对慢性HBV感染的治疗是基于施用聚乙二醇化的1型干扰素或核苷(核苷酸)类似物的，例如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺，它们可靶向病毒聚合酶(一种多功能逆转录酶)。治疗是否成功通常以乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的损失量来衡量。然而，由于感染后乙型肝炎病毒DNA仍然存在于体内，因此很难完全清除HBsAg。HBV持续性是由附加体形式的HBV基因组介导的，该基因组稳定地存在于细胞核中。这种附加体形式被称为“共价闭合环状DNA”(cccDNA)。cccDNA可作为所有HBV转录本的模板，包括前基因组RNA(pgRNA，一种病毒复制中间体)。少量cccDNA拷贝的存在可能足以再次引发全面的HBV感染。目前对HBV的治疗并不针对cccDNA。然而，慢性HBV感染的治愈需要消除cccDNA(由Nassal,Gut.2015Dec；64(12):1972-84.doi:10.1136/gutjnl-2015-309809综述)。

SBDS(SBDS核糖体成熟因子)是在包括古细菌和真核生物的多种物种中高度保守的蛋白质家族的成员。SBDS蛋白与延伸因子样GTPase-1相互作用，以使真核起始因子6与晚期细胞质pre-60S核糖体亚基分离，从而允许组装80S亚基。SBDS又名SDS、SWDS、CGI-97、SBDS核糖体组装鸟嘌呤核苷酸交换因子、核糖体成熟因子和Shwachman-Bodian-Diamond综合征基因/蛋白质。

SBDS基因的突变被认为是Shwachman-Diamond综合征的主要原因，该综合征是一种罕见的隐性核糖体病，其特征是各种全身性病症，包括造血功能障碍。

多种出版物描述了靶细胞中SBDS的下调。Yamaguchi等人在可能分化为成熟中性粒细胞的细胞系中进行了功能丧失实验。SBDS基因被基于慢病毒的RNAi系统下调。据显示，具有SBDS减少的细胞对凋亡刺激敏感。结论是，SBDS可能起到维持粒细胞前体细胞存活的作用(Yamaguchi等人，Exp Hematol.2007 Apr；35(4):579-86)。

Sezgin等人显示了用shRNA敲低SBDS会导致生长抑制和核糖体成熟的缺陷，这暗示野生型SBDS在pre-60S亚基的核输出中的作用(Sezgin等人，Pediatric BloodCancer.2013 Feb；60(2):281-6.doi:10.1002/pbc.24300。Epub 2012 Sep 1)。

在HeLa细胞中通过shRNA敲低SBDS导致了细胞死亡增加。通过SBDS抑制的细胞死亡加速被认为是通过Fas途径发生的(Rujkijyanont等人，Haematologica.2008年3月；93(3):363-71.doi:10.3324/haematol.11579；和Ambekar等人，Pediatric BloodCancer.2010 Dec 1；55(6):1138-44.doi:10.1002/pbc.22700)。

Liu等人显示了使用shRNA抑制SBDS会导致端粒缩短。这暗示SBDS可以在细胞周期中特异性结合至TPP1端粒酶，从而起到对TPP1-端粒酶相互作用的稳定剂的作用。结论是SBDS可能作为端粒保护蛋白参与调节端粒酶募集(Liu等人，Cell Rep.2018 Feb 13；22(7):1849-1860.doi:10.1016/j.celrep.2018.01.057)。

据我们所知，尚未发现SBDS与HBV有关。特别地，在cccDNA的稳定性和维持性方面，从未将其识别为cccDNA依赖性因子，也未曾提出将抑制SBDS的分子用作用于治疗HBV感染的cccDNA去稳定剂。

发明目的

本发明显示，靶向SBDS(SBDS核糖体成熟因子或Shwachman-Bodian-Diamond综合征核糖体成熟因子)的核酸分子具有减少感染HBV的细胞中的cccDNA的作用，而这与感染HBV的个体的治疗有关。本发明的目的是识别减少感染HBV的细胞中的cccDNA的SBDS抑制剂。此类SBDS抑制剂可用于治疗HBV感染。

本发明进一步识别了新型核酸分子，其能够在体外和体内抑制SBDS的表达。

发明内容

本发明涉及靶向核酸的寡核苷酸，该寡核苷酸能够调节SBDS的表达并治疗或预防与SBDS功能有关的疾病。

因此，在第一方面，本发明提供了一种用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染的SBDS抑制剂。特别地，能够减少HBV cccDNA和/或HBV前基因组RNA(pgRNA)的SBDS抑制剂是有用的。这种抑制剂有利地是长度为12至60个核苷酸的核酸分子，其能够减少SBDSmRNA。

另一方面，本发明涉及12-60个核苷酸(例如12-30个核苷酸)的核酸分子，其包含与哺乳动物SBDS(例如人SBDS、小鼠SBDS或食蟹猴SBDS)至少90％互补的至少12个核苷酸(特别是16至20个核苷酸)的连续核苷酸序列。这种核酸分子能够抑制SBDS在表达SBDS的细胞中的表达。SBDS的抑制允许减少细胞中存在的cccDNA的量。核酸分子可以选自单链反义寡核苷酸、双链siRNA分子或shRNA核酸分子(特别是化学产生的shRNA分子)。

本发明的另一方面涉及抑制SBDS的表达和/或活性的单链反义寡核苷酸或siRNA。特别地，包含减少SBDS mRNA的一个或多个2'糖修饰的核苷和一个或多个硫代磷酸酯键的经修饰的反义寡核苷酸或经修饰的siRNA是有利的。

另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的SBDS抑制剂(例如本发明的反义寡核苷酸或siRNA)和药用赋形剂。

另一方面，本发明提供了用于在体内或体外调节表达SBDS的靶细胞中的SBDS表达的方法，该方法是通过向所述细胞施用有效量的本发明的SBDS抑制剂(例如本发明的反义寡核苷酸或组合物)。在一些实施例中，与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，靶细胞中的SBDS表达降低至少50％或至少60％。在一些实施例中，靶细胞感染HBV，并且与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，在感染HBV的靶细胞中，感染HBV的细胞中的cccDNA减少至少50％或至少60％。在一些实施例中，靶细胞感染HBV，并且与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，在感染HBV的靶细胞中，感染HBV的细胞中的cccDNA减少至少25％，例如至少40％。

在一些实施例中，靶细胞感染HBV，并且与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，在感染HBV的靶细胞中，感染HBV的细胞中的pgRNA减少至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％。

另一方面，本发明提供了用于治疗或预防与SBDS的体内活性有关的疾病、病症或功能障碍的方法，该方法包括向罹患或易患所述疾病、病症或功能障碍的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的SBDS抑制剂(例如本发明的反义寡核苷酸或siRNA)。

本发明的其他方面是本发明的核酸分子与药物组合物的缀合物，该缀合物包含本发明的分子。特别关注靶向肝脏的缀合物，例如GalNAc簇。

附图说明

图1A-L：说明示例性反义寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸由术语“寡核苷酸”表示，并且脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合部分是三价N-乙酰半乳糖胺部分。图1A-D中的化合物包含二赖氨酸支链分子、PEG3间隔物和三个末端GalNAc碳水化合物部分。在图1A(图1A-1和图1A-2显示同一化合物的两种不同非对映体)和图1B(图1B-1和图1B-2显示同一化合物的两种不同非对映体)中的化合物中，寡核苷酸直接附着到脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合部分，没有接头。在图1C(图1C-1和图1C-2显示同一化合物的两种不同非对映体)和图1D(图1D-1和图1D-2显示同一化合物的两种不同非对映体)中的化合物中，寡核苷酸经由C6接头附着到脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合部分。图1E-K中的化合物包含可商购的三倍体支链分子和不同长度和结构的间隔物以及三个末端GalNAc碳水化合物部分。图1L中的化合物由单体GalNAc亚磷酰胺组成，该单体GalNAc亚磷酰胺作为合成的一部分添加到寡核苷酸上，同时仍在固体支持物上，其中X＝S或O，并且独立地Y＝S或O，且n＝1-3(参见WO 2017/178656)。图1B和图1D在本文中也被称为GalNAc2或GN2，分别是没有接头和有C6接头。

图1A-D的每一个中显示的两种不同的非对映体是共轭反应的结果。因此，特定反义寡核苷酸缀合物的池可以仅包含两种不同非对映体之一，或者特定反义寡核苷酸缀合物的池可以包含两种不同非对映体的混合物。

定义

HBV感染

术语“乙型肝炎病毒感染”或“HBV感染”在本领域中是公知的，是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染是一种全球性疾病难题，影响着全球2.48亿人。每年约有686,000例死亡归因于HBV相关的晚期肝病和肝细胞癌(HCC)(GBD 2013；Schweitzer等人，Lancet.2015 Oct17；386(10003):1546-55)。WHO预测，如果不加大干预措施，未来40至50年内，CHB感染者的人数将保持在目前的高水平，2015年至2030年之间累计死亡人数将达到2000万(WHO 2016)。CHB感染不是具有单一临床表现的同质性疾病。感染者在其一生中经历了与CHB相关的肝病的几个阶段，这些疾病阶段也是采用标准护理(SOC)治疗的基础。目前的指南建议根据三个标准(血清ALT水平、HBV DNA水平和肝病严重程度)，仅对选定的CHB感染者进行治疗(EASL，2017)。该建议归因于SOC(即核苷(核苷酸)类似物(NAs)和聚乙二醇化干扰素-α(PEG-IFN))无法治愈，必须长期施用从而增加其安全风险的事实。NAs可以有效抑制HBV DNA复制；然而，它们对其他病毒标记物的作用非常有限/没有影响。HBV感染的两个标志，即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和共价闭合环状DNA(cccDNA)，是针对治愈HBV的新药的主要目标。在CHB个体的血浆中，HBsAg亚病毒(空)颗粒数超过HBV病毒粒子103到105倍(Ganem&Prince,N EnglJMed.2004 Mar 11；350(11):1118-29)；据信，其过量可能导致该疾病的免疫发病机制，包括个体无法产生中和性抗HBs抗体，这是在急性HBV感染消退后观察到的血清学标记物。

在一些实施例中，术语“HBV感染”是指“慢性HBV感染”。

此外，该术语涵盖具有任何HBV基因型的感染。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型A。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型B。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型C。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型D。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型E。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型F。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型G。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型H。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型I。

在一些实施例中，待治疗的患者感染HBV基因型J。

cccDNA(共价闭合环状DNA)

cccDNA是HBV的病毒基因模板，其位于感染的肝细胞的细胞核中，在其中它会产生增殖性感染所需的所有HBV RNA转录物，并在慢性HBV感染的自然过程中对病毒的持续性起主要作用(Locarnini&Zoulim,Antivir Ther.2010；15Suppl 3:3-14.doi:10.3851/IMP1619)。cccDNA充当病毒库，是停止治疗后病毒反弹的来源，因此需要长期(通常是终生)治疗。由于各种副作用，因此PEG-IFN仅可施用于一小部分CHB。

因此，大多数CHB患者迫切需要新的治疗方法，即通过降解或清除HBV cccDNA来实现完全治愈。

化合物

在本文中，术语“化合物”是指能够抑制SBDS表达或活性的任何分子。本发明的特别化合物是核酸分子，例如根据本发明的RNAi分子或反义寡核苷酸或包含这种核酸分子的任何缀合物。例如，本文中化合物可以是靶向SBDS的核酸分子，特别是反义寡核苷酸或siRNA。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。

说明书和权利要求书中提及的寡核苷酸通常是长度小于70个核苷酸的治疗性寡核苷酸。寡核苷酸可以是或者可以包含单链反义寡核苷酸，或者可以是另一种核酸分子，例如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、适体或核酶。治疗性寡核苷酸分子通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化和分离来制备。然而，shRNA通常使用慢病毒载体传递至细胞中，然后从慢病毒载体中转录以产生单链RNA，该单链RNA将形成茎环(发夹)RNA结构，该结构能够与RNA干扰机制(包括RNA诱导沉默复合物(RISC))相互作用。在本发明的实施例中，shRNA是通过化学方法产生的shRNA分子(不依赖于来自质粒或病毒的基于细胞的表达)。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。通常，本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。尽管在一些实施例中，本发明的寡核苷酸是在进入靶细胞时从载体转录的shRNA。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含长度为10至70个核苷酸或由其组成，例如长度为12至60个、例如13至50个、例如14至40个、例如15至30个、例如16至25个、例如16至22个、例如16至20个连续核苷酸。因此，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以具有12至25个核苷酸的长度。替代地，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以具有15至22个核苷酸的长度。

在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含或由24个或更少的核苷酸组成，例如22个、例如20个或更少、例如18个或更少、例如14个、15个、16个或17个核苷酸。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。因此，如果说核酸分子包含12个至25个核苷酸，则12个和25个核苷酸均包含在内。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含或由长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸组成

寡核苷酸用于调节哺乳动物中靶核酸的表达。在一些实施例中，核酸分子，例如siRNA、shRNA和反义寡核苷酸的核酸分子通常用于抑制靶核酸的表达。

在本发明的一实施例中，寡核苷酸选自RNAi剂，例如siRNA或shRNA。在另一个实施例中，寡核苷酸是单链反义寡核苷酸，例如与RNA酶H相互作用的高亲和力修饰的反义寡核苷酸。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如2'糖修饰的核苷。

在一些实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，寡核苷酸可以缀合至非核苷部分(缀合部分)。

寡核苷酸文库应理解为变体寡核苷酸的集合。寡核苷酸文库的目的可以变化。在一些实施例中，寡核苷酸文库由具有重叠核碱基序列的寡核苷酸组成，该核碱基序列靶向一个或多个哺乳动物SBDS靶核酸，目的是识别寡核苷酸文库中最有效的序列。在一些实施例中，寡核苷酸文库是亲代或祖代寡核苷酸的寡核苷酸设计变体(子核酸分子)文库，其中寡核苷酸设计变体保留了亲代核酸分子的核心核碱基序列。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”或“ASO”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不为双链的，因此不为siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应当理解的是，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或相互间的自身互补程度小于寡核苷酸全长的50％。

优选地，本发明的单链反义寡核苷酸不包含RNA核苷，因为这将降低核酸酶抗性。

优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如2'糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。

RNAi分子

本文中，术语“RNA干扰(RNAi)分子”是指含有RNA核苷的短双链寡核苷酸，其经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导RNA转录物的靶向裂解，其中它们与催化性RISC组分argonaute相互作用。例如，RNAi分子调节抑制靶核酸在细胞中的表达，例如受试者体内的细胞。例如哺乳动物受试者。RNAi分子包括单链RNAi分子(Lima等人2012 Cell 150:883)和双链siRNA，以及短发夹RNA(shRNA)。在本发明的一些实施例中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列是RNAi剂，诸如siRNA。

siRNA

术语“小干扰核糖核酸”或“siRNA”是指小干扰核糖核酸RNAi分子。它是一类双链RNA分子，在本领域中也称为短干扰RNA或沉默RNA。siRNA通常包含正义链(也称为过客链)和反义链(也称为指导链)，其中每条链的长度为17至30个核苷酸，通常为19至25个核苷，其中反义链与靶核酸(合适地是成熟的mRNA序列)互补(例如至少95％互补，例如完全互补)，并且正义链与反义链互补，使得正义链和反义链形成双链体或双链体区域。siRNA链可形成平末端双链体，或者优选地，正义和反义链的3'端可形成3'突出端，例如1个、2个或3个核苷，类似于Dicer生产的产物，可在体内形成RISC底物。Dicer底物的有效扩展形式已在US8,349,809和US 8,513,207中进行了描述，在此通过引用并入。在一些实施例中，正义链和反义链均具有2nt 3'突出端。因此，双链体区域的长度可以是例如17至25个核苷酸，例如长度为21至23个核苷酸。

一旦进入细胞内，反义链就被掺入到RISC复合物中，该RISC复合物介导靶核酸的靶降解或靶抑制。siRNA除了RNA核苷外，通常还包含修饰的核苷。在一个实施例中，siRNA分子可以使用修饰的核苷酸间键和2'糖修饰的核苷进行化学修饰，例如2'-4'双环核糖修饰的核苷(包括LNA和cET)或2'取代的修饰，例如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA，2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA。特别地，可以将2′氟、2′-O-甲基或2′-O-甲氧基乙基掺入siRNA。

在一些实施例中，可以用2'糖修饰的核苷例如LNA来修饰siRNA正义(过客)链的所有核苷酸(例如，参见WO2004/083430、WO2007/085485)。在一些实施例中，siRNA的过客链可以是不连续的(例如，参见WO2007/107162)。已经报道了在siRNA的反义链的种子区域中出现的热不稳定核苷酸的掺入可用于减少siRNA的脱靶活性(例如，参见WO2018/098328)。合适地，siRNA在反义链的5'端包含5'磷酸酯基团或5'-磷酸模拟物。在一些实施例中，反义链的5'端是RNA核苷。

在一个实施例中，siRNA分子进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或正义链)的3'-末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或正义链)的5'末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键可以在一条或两条链(例如反义链；或正义链)的5'-末端和3'-末端二者上。在一些实施例中，剩余的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，siRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。在siRNA分子中，硫代磷酸酯核苷间键可能会减少或在RICS中进行核酸酶切割，因此优选的是，并非反义链中的所有核苷间键都被修饰。

siRNA分子可以进一步包含配体。在一些实施例中，配体缀合至正义链的3'端。

对于生物学分布，可将siRNA缀合至靶向配体和/或配制成脂质纳米颗粒。

本发明的其他方面涉及包含这些dsRNA的药物组合物，例如适合用于治疗用途的siRNA分子，以及通过施用dsRNA分子(例如本发明的siRNA)来抑制靶基因表达的方法，例如用于治疗如本文所公开的各种疾病。

shRNA

术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指这样的分子，其长度通常介于40至70个核苷酸之间，例如长度介于45至65个核苷酸之间，例如长度介于50至60个核苷酸之间，并形成茎环(发夹)RNA结构，该结构与称为Dicer的核酸内切酶相互作用，据信，Dicer将dsRNA加工成具有特征性的双碱基3'突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA，然后将其掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解靶标以诱导沉默。shRNA寡核苷酸可以使用修饰的核苷酸间键和2'糖修饰的核苷进行化学修饰，例如2‘-4‘双环核糖修饰的核苷(包括LNA和cET)或2'取代的修饰，例如2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA。

在一些实施例中，shRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。在RNAi分子中，硫代磷酸酯核苷间键可减少或在RICS中进行核酸酶切割，因此优选的是，并非shRNA分子茎环中的所有核苷间键都被修饰。硫代磷酸酯核苷间键可以有利地位于shRNA分子的茎环的3'和/或5'端，特别是在与靶核酸不互补的分子部分。然而，shRNA分子的与靶核酸互补的区域也可以在预计通过Dicer切割后会成为3'和/或5'末端部分的前2个至3个核苷间键中被修饰。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指核酸分子与靶核酸互补的区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列被包含在siRNA分子的指导链中。在一些实施例中，连续核苷酸序列是shRNA分子的部分，其与靶核酸100％互补。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，例如F-G-F’缺口聚体区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团(例如用于靶向的缀合物基团)附着至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的核碱基序列是连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，一个或多个修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。

修饰的核苷间键

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键，或一个或多个二硫代磷酸酯核苷间键。

对于本发明的寡核苷酸，使用硫代磷酸酯核苷间键是优选的。

硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯。

在一些有利的实施例中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。

应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间键，其根据EP 2 742135可以例如在其他DNA硫代磷酸酯间隔区域中耐受。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚物，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的寡核苷酸

术语“修饰的寡核苷酸”描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合”寡核苷酸是已经在文献中用来描述包含修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。本发明的反义寡核苷酸优选地是嵌合寡核苷酸。

互补性

术语“互补性”或“互补”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts ofChemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols inNucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3’和3'-5’的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未比对(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5’-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

术语“完全互补”是指100％互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(T_m)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，T_m并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix,2003年，Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态的吉布斯自由能ΔG°更精确地表示结合亲和力，并且通过ΔG°＝-RTln(K_d)与反应的解离常数(K_d)相关，其中R为气体常数，T为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，而自发反应的ΔG°小于零。ΔG°可经由实验来测量，例如，通过使用如Hansen等人，1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人，2005,DrugDiscov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。技术人员将知道商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°还可以使用SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465中描述的最近邻模型，使用由Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405中描述的适当推导的热力学参数进行数值评估。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸与靶核酸以低于-10kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°衡量。对于长度为8至30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal、诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10至-60kcal范围内，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal诸如-18至-25kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。

靶核酸

根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物SBDS的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟的mRNA或cDNA序列。靶标因此可以称为SBDS靶核酸。

合适地，靶核酸编码SBDS蛋白，特别是哺乳动物SBDS，例如在本文中提供为SEQ IDNO:1、4和/或5的编码前体mRNA或mRNA序列的人SBDS基因。

本发明的治疗性寡核苷酸可以例如靶向哺乳动物SBDS的外显子区域(特别是siRNA和shRNA，但也可以是反义寡核苷酸)，或者可以例如靶向SBDS前体mRNA中的任何内含子区域(特别是反义寡核苷酸)。人类SBDS基因编码5个转录物，其中两个(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)时编码蛋白质的并且因此是潜在的核酸靶标。

表1列出了SEQ ID NO:1(即人SBDS前体mRNA序列)的预测的外显子和内含子区域。

表1.人SBDS前体mRNA中的外显子和内含子区域。

合适地，靶核酸编码SBDS蛋白，特别是哺乳动物SBDS，例如人SBDS(参见例如表2和表3)，其提供了关于人、食蟹猴和小鼠SBDS(表2)的基因组序列的概述以及关于人、猴和小鼠SBDS的前体mRNA序列和关于人SBDS的成熟mRNA的概述(表3)。

在一些实施例中，靶核酸选自由SEQ ID NO:1、2、3、4和/或5或其天然存在的变体(例如，编码哺乳动物SBDS的序列)组成的组。

表2.跨物种的SBDS的基因组和组装体信息。

Fwd＝正向链。Rv＝反向链。基因组坐标提供了前体mRNA序列(基因组序列)。

如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

对于体内或体外应用，本发明的治疗性核酸分子通常能够抑制表达SBDS靶核酸的细胞中SBDS靶核酸的表达。在一些实施例中，所述细胞包含HBV cccDNA。如在核酸分子长度上测量的，本发明的核酸分子的核碱基的连续序列通常与SBDS靶核酸的反向区域互补，任选地有一个或两个错配的例外，并且任选地不包含可将寡核苷酸连接至诸如缀合物等任选官能基团或其他非互补末端核苷酸的基于核苷酸的接头区域。靶核酸是信使RNA，例如编码哺乳动物SBDS蛋白(例如，人SBDS)的前体mRNA，例如，人SBDS前体mRNA序列(例如如SEQ IDNO:1公开的序列)、猴SBDS前体mRNA序列(例如如SEQ ID NO:2公开的序列)或鼠SBDS前体mRNA序列(例如如SEQ ID NO:3公开的序列)或成熟SBDS mRNA(例如如SEQ ID NO:4或5公开的人成熟mRNA)。SEQ ID NO 1-5是DNA序列-应当理解，靶RNA序列具有代替胸苷碱基(T)的尿嘧啶(U)碱基。

表2和表3提供了有关示例性靶核酸的更多信息。

表3关于靶核酸的概述。

靶核酸，物种，参考	序列ID
		SBDS智人前体mRNA	SEQ ID NO:1
SBDS食蟹猕猴前体mRNA	SEQ ID NO:2
		SBDS小家鼠前体mRNA	SEQ ID NO:3
SBDS智人成熟mRNA，变体1(ENST00000246868.7)	SEQ ID NO:4
		SBDS智人成熟mRNA，变体2(ENST00000617799.1)	SEQ ID NO:5

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:2。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:3。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:4。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:5。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1、4和/或5。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1和/或4。

在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO:1和/或5。

靶序列

如本文所用，术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸或核酸分子互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，靶序列比本发明的核酸分子的互补序列更长，并且可以例如代表可被本发明的若干核酸分子所靶向的靶核酸的优选区域。

在一些实施例中，靶序列是选自由人SBDS mRNA外显子(诸如选自由e1、e2、e3、e4和e5(参见例如上表1)组成的组的人SBDS mRNA外显子)组成的组的序列。

因此，本发明提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与选自由e1–e5(参见表1)组成的组的SEQ ID NO:1的外显子区域至少90％互补(例如完全互补)的连续序列。

在一些实施例中，靶序列是选自由人SBDS mRNA内含子(诸如选自由i1、i2、i3和i4(参见例如上表1)组成的组的人SBDS mRNA内含子)组成的组的序列。

因此，本发明提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与选自由i1–i4(参见表1)组成的组的SEQ ID NO:1的内含子区域至少90％互补(例如完全互补)的连续序列。

在一些实施例中，靶序列选自由SEQ ID NO:6、7、8和9组成的组。在一些实施例中，本文所指的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:6、7、8和9组成的组的靶序列至少90％互补(例如至少95％互补)。在一些实施例中，连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:6、7、8和9组成的组的靶序列完全互补。

本发明的核酸分子包含与靶核酸(例如本文所述的靶序列)上的区域互补或杂交的连续核苷酸序列。

与治疗性核酸分子互补或杂交的靶核酸序列通常包含至少10个核苷酸的连续核碱基段。该邻接核苷酸序列的长度介于12至70个核苷酸，诸如12至50个、诸如13至30个、诸如14至25个、诸如15至20个、诸如16至18个邻接核苷酸。

在一些实施例中，本发明的核酸分子靶向表4或5中所示的区域。

表4：示例性靶区域

在一些实施例中，靶序列选自由如上表4中所示的靶区域1A至251A组成的组。

表5：示例性靶区域

在一些实施例中，靶序列选自由如上表5中所示的靶区域1C至39C组成的组。

靶细胞

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。对于本发明的治疗用途，如果靶细胞被HBV感染则是优选的。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞或土拨鼠细胞，或者灵长类细胞，诸如猴细胞(例如食蟹猴细胞)或人类细胞。

在优选的实施例中，靶细胞表达SBDS mRNA，诸如SBDS前体mRNA或SBDS成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向，通常不考虑SBDS mRNA的多聚A尾。

此外，靶细胞可以是肝细胞。在一个实施例中，靶细胞是HBV感染的原代人肝细胞，其衍生自HBV感染者或具有人源化肝脏的HBV感染的小鼠(PhoenixBio，PXB-小鼠)。

根据本发明，靶细胞可以被HBV感染。此外，靶细胞可包含HBV cccDNA。因此，靶细胞优选地包含SBDS mRNA，诸如SBDS前体mRNA或SBDS成熟mRNA，以及HBV cccDNA。

天然存在的变体

术语“天然存在的变体”指与靶核酸源自相同基因座但可有差异的SBDS基因或转录物的变体，所述差异可例如是出于遗传编码的简并性造成多重密码子编码同一个氨基酸，或因前体mRNA的交替性剪接，或多态性的存在，诸如单核苷酸多态性(SNP)及等位基因变体。基于与寡核苷酸足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。

在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物SBDS靶核酸(诸如SEQ ID NO 1和/或SEQ ID NO 2的靶核酸)具有至少95％，诸如至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO:1的人SBDS靶核酸具有至少99％的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体是已知的多态性。

表达的抑制

如本文所用，术语“表达的抑制”应理解为SBDS(SBDS核糖体成熟因子)抑制剂抑，即降低靶细胞中SBDS的量或活性的能力的总称。表达或活性的抑制可以通过测量SBDS前体mRNA或SBDS mRNA的水平，或通过测量细胞中SBDS蛋白的水平或活性来确定。可以在体外或体内确定表达的抑制。有利地，相对于在施用SBDS抑制剂之前的SBDS的量来评估抑制。替代地，通过参考对照物来确定抑制。通常应当理解的是，对照物是用盐水组合物处理的个体或靶细胞，或者用非靶向寡核苷酸(模拟物)处理的个体或靶细胞。

术语“抑制”或“抑制”也可称为下调、降低、阻遏、减轻、下降、减少SBDS的表达或活性。

SBDS表达的抑制可以例如使用募集RNA酶H的寡核苷酸(例如缺口聚体)或经由RNA干扰途径起作用的核酸分子(例如siRNA或shRNA)例如通过前体mRNA或mRNA的降解而发生。替代地，本发明的抑制剂可以与SBDS多肽结合并抑制SBDS的活性或阻止其与其他分子的结合。

在一些实施例中，SBDS靶核酸的表达或SBDS蛋白的活性的抑制导致靶细胞中HBVcccDNA的量减少。优选地，与对照物相比，HBV cccDNA的量减少。在一些实施例中，与对照物相比，HBV cccDNA的量减少至少20％、至少30％。在一些实施例中，与对照物相比，感染HBV的细胞中cccDNA的量减少至少50％，例如60％。

在一些实施例中，SBDS靶核酸的表达或SBDS蛋白的活性的抑制导致靶细胞中HBVpgRNA的量减少。优选地，与对照物相比，HBVpgRNA的量减少。在一些实施例中，与对照物相比，HBV pgRNA的量减少至少20％、至少30％。在一些实施例中，与对照物相比，感染HBV的细胞中pgRNA的量减少至少50％，例如60％。

糖修饰

本发明的寡核苷酸可包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷，所述修饰的糖部分即与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时糖部分的修饰。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括其中核糖环结构如下被修饰的那些：例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2与C4碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2与C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。例如，可在2’、3’、4’或5’位置引入取代基。

高亲和力修饰的核苷

高亲和力修饰的核苷是修饰的核苷酸，其在掺入到寡核苷酸中时，增强了寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(T^m)测量。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加+0.5℃至+12℃的范围，更优选地+1.5℃至+10℃的范围并且最优选地+3℃至+8℃的范围。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.AcidRes.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。

2'糖修饰的核苷

2'糖修饰的核苷为在2'位置具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2'取代的核苷)，或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳之间形成桥的2'连接的双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连的)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2'糖取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012,19,937。下面为一些2’取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2'取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2'桥连的核苷。

锁定的核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”是一种2'-糖修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76、Seth等人.J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81,Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667。

本发明的LNA核苷的具体示例在方案1中给出(其中B如上所定义)。

方案1

特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。

RNaseH活性和募集

反义寡核苷酸的RNase H活性是指当其与互补RNA分子形成双链体时募集RNase H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。如果寡核苷酸在提供互补靶核酸序列时，使用WO 01/23613(通过引用并入本文)的实例91至95提供的方法论测量的初始速率(以pmol/l/min计)是使用具有与所测试的经修饰寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸时所测之初始速率的至少5％(诸如至少10％或超过20％时)，则通常被认为能够募集RNA酶H。为了用于确定RNA酶H活性，可从Creative

获得重组人RNA酶H1(与大肠杆菌中表达的His标签融合的重组人RNA酶H1)。

缺口聚体

本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚体，也称为缺口聚体寡核苷酸或缺口聚体设计。反义缺口聚体一般用于通过RNase H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚体寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，即‘5->3'方向的5'-侧翼、缺口和3'侧翼F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNase H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰，诸如独立地选自LNA和2'-MOE。

在缺口聚体设计中，缺口区域的5'和3'最末端核苷是DNA核苷，分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5’侧翼的5’端和3’侧翼的3’端，具有至少一个糖修饰的核苷。

区域F-G-F'形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F'的缺口聚体区域。

缺口聚体设计F-G-F’的总长度可以是例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如15至20个核苷，诸如16至18个核苷。

举例而言，本发明的缺口聚体寡核苷酸可由下式代表：

F_1-8-G_5-18-F'_1-8，诸如

F_1-8-G_7-18-F'_2-8

前提条件是缺口聚体区域F-G-F'的总长度至少为12，诸如至少14个核苷酸。

在本发明的方面，反义寡核苷酸或其邻接核苷酸序列由式5'-F-G-F'-3'的缺口聚体组成或包含式5'-F-G-F'-3'的缺口聚体，其中区域F及F'独立地包含1-8个核苷或由1-8个核苷组成，其中1-4个是经2'糖修饰的且界定该F及F'区域的5'及3'端，并且G为能够募集RNA酶H的介于6与18个核苷之间的区域。在一些实施例中，G区域由DNA核苷组成。

在一些实施例中，区域F和F'独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。

在一些实施例中，区域F和F'独立地包含LNA和2'取代的糖修饰核苷酸两者(混合型翼设计)。在一些实施例中，2'取代的糖修饰核苷酸独立地选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。

在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰的核苷都是LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以任选地包含DNA核苷。在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以任选地包含DNA核苷。在此类实施例中，侧翼区域F或F'，或F和F'两者，包含至少三个核苷，其中F和/或F'区域的5'和3'最末端核苷为LNA核苷。

LNA缺口聚体

LNA缺口聚体是其中区域F和F'中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚体。β-D-氧基缺口聚体是其中区域F和F'中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚体。

在一些实施例中，LNA缺口聚体具有下式：[LNA]_1-5-[区域G]_6-18-[LNA]_1-5，其中区域G如在缺口聚体区域G定义中的定义。

MOE缺口聚体

MOE缺口聚体是其中区域F和F'由MOE核苷所构成的缺口聚体。在一些实施例中，MOE缺口聚体的设计为[MOE]_1-8-[区域G]_5-16-[MOE]_1-8，诸如[MOE]_2-7-[区域G]_6-14-[MOE]_2-7，诸如[MOE]_3-6-[区域G]_8-12-[MOE]_3-6，诸如[MOE]₅-[区域G]₁₀-[MOE]₅，其中区域G具有如缺口聚体定义中的定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚体已广泛用于本技术领域中。

寡核苷酸中的区域D'或D”

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列(例如缺口聚体区域F-G-F')以及进一步的5'和/或3'核苷，或由其组成。所述其他的5'和/或3'核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5'和/或3'核苷本文中可称为区域D'和D”。

出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D'或D”。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。

可以将区域D'和D”分别附着于区域F的5'端或区域F'的3'端，以生成下式D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或D'-F-G-F'-D”的设计。在这种情况下，F-G-F'是寡核苷酸的缺口聚体部分，而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。

区域D'或D”可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F'区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D'或D”区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯键连接，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D’或D”的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的使用，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如缺口聚体区域)。

在一实施例中，除构成缺口聚体的连续核苷酸序列之外，本发明的寡核苷酸还包含区域D'和/或D”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可由下式代表：

F-G-F’；特别是F_1-8-G_5-18-F’_2-8

D'-F-G-F'，特别是D'_1-3-F_1-8-G_5-18-F'_2-8

F-G-F'-D”，特别是F_1-8-G_5-18-F'_2-8-D”_1-3

D'-F-G-F'-D”，特别是D'_1-3-F_1-8-G_5-18-F'_2-8-D”_1-3

在一些实施例中，位于区域D'与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F'与区域D”之间的核苷间键是磷酸二酯键。

缀合物

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。缀合部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头基团，例如区域D'或D”。

寡核苷酸缀合物及其合成已报道在Manoharan的综合评述中：Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies,andApplications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,MarcelDekker,Inc.,2001和Manoharan的Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103，所述各者以引用方式全部并入本文。

在一些实施例中，非核苷酸部分(缀合部分)选自由碳水化合物(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质(例如抗体)、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。

示例性的缀合部分是那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于与ASGPR结合，参见例如WO 2014/076196、WO2014/207232和WO 2014/179620(通过引用并入本文)。此类缀合物用于增强寡核苷酸到肝脏的摄取。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如接头或系链)附着于寡核苷酸。接头用于将第三区域，例如缀合部分(区域C)，共价连接至第一区域，例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。

区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。在优选的实施例中，核酸酶敏感接头包含1与5个核苷，诸如1、2、3、4或5个核苷，更优选地是2至4个核苷，最优选地是2或3个连接的核苷，所述连接的核苷包含至少两个连续磷酸二酯键，诸如至少3或4或5个连续磷酸二酯键。优选地，该核苷是DNA或RNA。包含生物可切断型接头的磷酸二酯的详细说明请参阅WO 2014/076195(以引用方式并入本文)。

区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含链结构或重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团的寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域元件构建：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些实施例中，接头(区域Y)是氨基烷基，诸如C2–C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。

治疗

如本文所用，术语“治疗”是指既存疾病(例如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的阻止，即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。预防可理解为阻止HBV感染转变为慢性HBV感染或阻止由慢性HBV感染引起的严重肝病，诸如肝硬化和肝细胞癌。

患者

为了本发明的目的，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。

如本文其他地方所述，待治疗的患者可能患有HBV感染，例如慢性HBV感染。在一些实施例中，患有HBV感染的患者可能患有肝细胞癌(HCC)。在一些实施例中，患有HBV感染的患者不患有肝细胞癌。优选地，患者不患有Shwachman-Diamond综合征。

具体实施方式

感染的肝细胞中的HBV cccDNA负责持续的慢性感染和再激活，是所有病毒亚基因组转录本和前基因组RNA(pgRNA)的模板，以确保新合成的病毒后代和cccDNA池通过细胞内核衣壳回收而得到补充。在本发明的上下文中，第一次显示SBDS与cccDNA稳定性有关。这种认知为HBV感染受试者体内的cccDNA去稳定化提供机会，这反过来又为彻底治愈慢性感染HBV患者创造机会。

本发明的一方面是一种SBDS抑制剂，其用于在乙型肝炎病毒(HBV)感染(特别是慢性HBV感染)的治疗和/或预防中使用。

SBDS抑制剂可以是例如与SBDS蛋白特异性结合的小分子，其中所述抑制剂防止或减少SBDS蛋白与cccDNA的结合。

本发明的实施例是SBDS抑制剂，其能够减少感染细胞(例如感染HBV的细胞)中的cccDNA和/或pgRNA。

在另一实施例中，SBDS抑制剂能够在HBV感染个体的体内降低HBsAg和/或HBeAg。

SBDS抑制剂用于HBV的治疗

不受理论束缚，据信SBDS经由直接或间接结合至ccc DNA而参与细胞核中cccDNA的稳定化，并且通过阻止SBDS与cccDNA的结合/缔合，cccDNA不稳定并变得容易降解。因此，本发明的一个实施例是一种SBDS抑制剂，其与SBDS蛋白相互作用，并防止或减少SBDS蛋白与cccDNA的结合/缔合。

在本发明的一些实施例中，抑制剂是抗体、抗体片段或小分子化合物。在一些实施例中，抑制剂可以是特异性结合至SBDS蛋白(例如由SEQ ID NO:1、4或5编码的SBDS蛋白)的抗体、抗体片段或小分子。例如，所述抑制剂可以防止或减少SBDS蛋白与ccc DNA的缔合。

本发明的核酸分子

治疗性核酸分子可能是出色的SBDS抑制剂，因为它们可以靶向SBDS转录物并经由RNA干扰途径或经由RNA酶H裂解而促进其降解。替代地，寡核苷酸诸如适体也可以充当SBDS蛋白相互作用的抑制剂。

本发明的一个方面是一种SBDS靶向核酸分子，其用于在乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗和/或预防中的用途。这样的核酸分子可以选自由单链反义寡核苷酸、siRNA分子和shRNA分子组成的组。

本章节描述了适用于在乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗和/或预防中使用的新型核酸分子。

本发明的核酸分子能够在体外和体内抑制SBDS的表达。抑制是通过将寡核苷酸与编码SBDS或参与SBDS调节的靶核酸杂交来实现的。靶核酸可以是哺乳动物SBDS序列。在一些实施例中，靶核酸可以人SBDS前体mRNA序列，例如SEQ ID NO:1的序列，或选自SEQ IDNO:4和5的人SBDS mRNA序列。在一些实施例中，靶核酸可以食蟹猴SBDS序列，例如SEQ IDNO:2的序列。

在一些实施例中，本发明的核酸分子能够通过抑制或调降靶标的表达而对其产生调节的效果。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达抑制，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％、至少40％、至少50％的抑制。在一些实施例中，本发明的核酸分子可以能够通过将25nM核酸分子转染到PXB-PHH细胞中，在体外将SBDSmRNA的表达水平抑制至少50％或60％，就选择与cccDNA减少具有良好相关性的核酸分子而言，靶标减少的这一范围是优选的。适合的是，实例中提供了可用于测量SBDS RNA或蛋白质抑制的测定(例如实例1及“材料和方法”章节)。靶标抑制是通过寡核苷酸的连续核苷酸序列(例如反义寡核苷酸的siRNA或缺口聚体区域的指导链)与靶核酸之间的杂交来触发。在一些实施例中，本发明的核酸分子包含寡核苷酸与靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可能足以显示出所需的SBDS表达抑制。由错配导致降低的结合亲和力可以优选地通过寡核苷酸中与靶核酸互补的核苷酸数量的增加和/或能够增加与靶标的结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，所述修饰核苷诸如存在于寡核苷酸序列中的2'糖修饰的核苷，包括LNA。

本发明的一个方面涉及长度为12至60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸，诸如长度为至少12至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物SBDS靶核酸特别是人SBDS核酸至少95％互补，诸如完全互补。这些核酸分子能够抑制SBDS的表达。

本发明的一个方面涉及长度为12至30个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸，诸如12至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物SBDS靶序列至少90％互补，诸如完全互补。

本发明的另一方面涉及根据本发明的核酸分子，其包含长度为14至22个核苷酸且与SEQ ID NO:1的靶序列至少90％互补(诸如完全互补)的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，核酸分子包含长度为12至30个核苷酸的连续序列，其与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补。

如果核酸分子或其连续核苷酸序列与靶序列的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施例中可包含寡核苷酸与靶序列之间的一个或两个错配，则是优选的。

在一些实施例中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:4和/或5的靶序列区域100％互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和2的靶核酸至少90％或95％互补，例如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4或5的靶核酸至少90％或95％互补，例如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的靶核酸至少90％或95％互补，例如完全(或100％)互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子的连续序列与选自由如表4中所示的靶区域1A至251A组成的组的SEQ ID NO:1的区域至少90％互补，例如完全互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子的连续序列与选自由如表5中所示的靶区域1C至39C组成的组的SEQ ID NO:1的区域至少90％互补，例如完全互补。

在一些实施例中，本发明的核酸分子包含长度为12至60个的核苷酸，诸如长度为13至50个、诸如14至35个、诸如15至30个、诸如16至22个的连续核苷酸，或由其组成。在优选的实施例中，核酸分子包含长度为15、16、17、18、19、20、21或22个的核苷酸或由其组成。

在一些实施例中，与靶核酸互补的核酸分子的连续核苷酸序列包含长度为12至30个，诸如13至25个、诸如15至23个、诸如16至22个的连续核苷酸，或由其组成。

在一些实施例中，寡核苷酸选自由反义寡核苷酸、siRNA和shRNA组成的组。

在一些实施例中，与靶序列互补的siRNA或shRNA的连续核苷酸序列包含长度为18至28个，诸如19至26个、诸如20至24个、诸如21至23个的连续核苷酸，或由其组成。

在一些实施例中，与靶核酸互补的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含长度为12至22个，诸如14至20个、诸如16至20个、诸如15至18个、诸如16至18个、诸如16、17、18、19或20个的连续核苷酸，或由其组成。

应当理解的是，可以修饰连续寡核苷酸序列(基序序列)以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。

将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。

本发明的核酸分子可以用修饰的核苷和RNA核苷(特别是针对siRNA和shRNA分子)或DNA核苷(特别是针对单链反义寡核苷酸)设计。优选地，使用高亲和力修饰的核苷。

在有利的实施例中，核酸分子或连续核苷酸序列包含一个或多个糖修饰的核苷，例如2'糖修饰的核苷，例如包含一个或多个2'糖修饰的核苷，其独立地选自由2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷组成的组。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)核苷。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)核苷和DNA核苷。

有利地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的最3'端的核苷是2'糖修饰的核苷。

在另一实施例中，核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键。合适的核苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键”下。

有利地，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。

在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。

如果在寡核苷酸的5’或3’端的至少2个至3个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，则是优选的。

对于单链反义寡核苷酸，如果连续核苷酸序列内的至少75％(诸如所有)的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，则是优选的。在一些实施例中，单链反义寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。

在本发明的有利的实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNA酶H，例如RNA酶H1。有利的结构设计是如“定义”章节中，例如在“缺口聚体”、“LNA缺口聚体”和“MOE缺口聚体”下描述的缺口聚体设计。在本发明中，如果本发明的反义寡核苷酸是具有F-G-F’设计的缺口聚体，则是优选的。

在所有情况下，F-G-F’设计还可包括区域D’和/或D”，如“定义”章节中“寡核苷酸中的区域D’或D””下所述。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，例如长度为12-24个、例如长度为12-18个核苷的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 19中的至少14个，例如至少16个、例如17个连续核苷酸。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，例如长度为12-24个(例如长度为12-18个)核苷的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 20中的至少14个，例如至少16个、例如17个连续核苷酸。

本发明提供了根据本发明的LNA缺口聚体，该LNA缺口聚体包含在SEQ ID NO 19或20中所示的连续核苷酸序列，或由其组成。在一些实施例中，LNA缺口聚体是具有在表7中的CMP ID NO:19_1或20_1的LNA缺口聚体。

在本发明的另一方面，本发明的核酸分子诸如反义寡核苷酸、siRNA或shRNA可以通过将其共价附着至缀合部分而直接靶向至肝脏，该缀合部分能够结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)，例如二价或三价GalNAc簇。

缀合

因为HBV感染主要影响肝脏中的肝细胞，所以将SBDS抑制剂缀合至缀合部分是有利的，与未缀合的抑制剂相比，缀合部分将增加抑制剂向肝脏的递送。在一个实施例中，肝脏靶向部分选自包含结合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的包含胆固醇的部分，或其他脂质或缀合部分。

在一些实施例中，本发明提供了缀合物，其包含共价附着于缀合物部分的本发明的核酸分子。

脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)缀合物部分包含一种或多种能够以等于或大于半乳糖的亲和力结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR靶向部分)的碳水化合物部分。许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力已经进行过研究(例如：Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或使用本领域典型的方法容易地确定。

在一个实施例中，缀合物部分包含至少一个选自由半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。优选地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

为了生成ASGPR缀合物部分，可以将ASPGR靶向部分(优选地GalNAc)附着于缀合物支架上。通常，ASGPR靶向部分可以在支架的相同端。在一个实施例中，缀合物部分由连接至间隔物的二至四个末端GalNAc部分组成，所述间隔物将每一个GalNAc部分连接至可与反义寡核苷酸缀合的支链分子。

在另一个实施例中，缀合物部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价。优选地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。

GalNAc缀合物部分可包括例如那些WO 2014/179620和WO 2016/055601和PCT/EP2017/059080(通过引用并入本文)中所述的缀合物部分，以及附着有GalNAc部分的小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见，例如，Duff等人，Methods Enzymol,2000,313,297)；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人，Cardovasc.Med.,1999,214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的碳水化合物识别基序)。

可以使用本领域已知的方法将ASGPR缀合物部分，特别是三价GalNAc缀合物部分附着于寡核苷酸的3’端或5’端。在一实施例中，ASGPR缀合物部分连接至寡核苷酸的5′端。

在一个实施例中，缀合部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，例如图1中所示的那些。在一个实施例中，缀合部分是图1A-1或图1A-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或是二者的混合物。在一个实施例中，缀合部分是图1B-1或图1B-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或是二者的混合物。在一个实施例中，缀合部分是图1C-1或图1C-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或是二者的混合物。在一个实施例中，缀合部分是图1D-1或图1D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或是二者的混合物。

制造方法

在另一方面，本发明提供了用于制造本发明的寡核苷酸的方法，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见例如Caruthers等人，1987,Methods in Enzymology，第154卷，第287-313页)。在另一个实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合物部分(配体)反应以将缀合物部分共价附着于寡核苷酸。在另一方面，提供了一种用于制备本发明的组合物的方法，该方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、运载体、盐和/或佐剂混合。

药用盐

根据本发明的化合物可以以其药用盐的形式存在。术语“药用盐”是指保留本发明化合物的生物有效性和性质的常规酸加成盐或碱加成盐。

在另一方面，本发明提供了核酸分子或其缀合物的药用盐，例如药用钠盐、铵盐或钾盐。

药物组合物

在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的任何化合物，特别是前述核酸分子和/或核酸分子缀合物或其盐以及药用稀释剂、运载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，核酸分子以50至300μM溶液的浓度在药用稀释剂中使用。

用于本发明的合适的制剂可见于《雷明顿药物科学(第十七版)》(Remington'sPharmaceutical Sciences,MackPublishing Company,Philadelphia,Pa.,17th ed.,1985)中。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。WO 2007/031091(通过引用并入本文)提供了药学上可接受的稀释剂、运载体和佐剂的其他合适的和优选的实例。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。

在一些实施例中，本发明的核酸分子或核酸分子缀合物或其药用盐为固体形式，诸如粉末，诸如冻干粉末。

可以将本发明的化合物、核酸分子或核酸分子缀合物与药用活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性运载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。

在一些实施例中，本发明的核酸分子或核酸分子缀合物是前药。特别地，对于核酸分子缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合部分就从核酸分子上裂解下来。

施用

本发明的化合物、核酸分子、核酸分子缀合物或药物组合物可以局部施用(诸如施用至皮肤、吸入、眼部或耳部)或肠内施用(诸如口服或通过胃肠道施用)或肠胃外施用(诸如静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内或鞘内施用)。

在优选的实施例中，本发明的寡核苷酸或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注。在一个实施例中，活性的核酸分子或核酸分子缀合物静脉内施用。在另一个实施例中，活性的核酸分子或核酸分子缀合物皮下施用。

在一些实施例中，本发明的核酸分子、核酸分子缀合物或药物组合物以0.1–15mg/kg，诸如0.2–10mg/kg、诸如0.25–5mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每二周一次、每三周一次或甚至每月一次。

本发明还提供了如所述的本发明的SBDS抑制剂(诸如核酸分子或核酸分子缀合物)在制备药物中的用途，其中所述药物处于用于皮下施用的剂型中。

联合疗法

在一些实施例中，本发明的抑制剂诸如本发明的核酸分子、核酸分子缀合物或药物组合物用于与另一种治疗剂的联合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的护理标准。

举例来说，本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子或核酸分子缀合物可以与其他活性物质联合使用，诸如基于寡核苷酸的抗病毒药(诸如基于序列特异性寡核苷酸的抗病毒剂)，其通过反义(包括其他LNA寡聚物)、siRNA(诸如ARC520)、适体、吗啉代物或任何其他抗病毒药，核苷酸序列依赖性作用模式作用。

作为进一步的实例，本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子或核酸分子缀合物可以与其他活性物质联合使用，诸如免疫刺激性抗病毒化合物，诸如干扰素(例如聚乙二醇化干扰素α)、TLR7激动剂(例如GS-9620)或治疗性疫苗。

作为进一步的实例，本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子或核酸分子缀合物可以与具有抗病毒活性的其他活性物质诸如小分子联合使用。这些其他活性物质可以是例如核苷/核苷酸抑制剂(例如恩替卡韦或富马酸替诺福韦二吡呋酯)、衣壳化抑制剂、进入抑制剂(例如Myrcludex B)。

在某些实施例中，另外的治疗剂可以是HBV药剂、丙型肝炎病毒(HCV)剂、化疗剂、抗生素、镇痛剂、非甾体抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、止吐剂、抗腹泻剂或免疫抑制剂。

在特别相关的实施例中，另外的HBV药剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二反义寡聚物；HBV治疗性疫苗；HBV预防性疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韦(ETV)；富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韦；或HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)。

在其他特定的相关实施例中，另外的HCV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)；利巴韦林；Pegasys；HCV RNA复制抑制剂(例如ViroPharma的VP50406系列)；HCV反义剂；HCV治疗性疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体疗法。

应用

本发明的核酸分子可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。

在研究中，此类核酸分子可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中SBDS蛋白的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA从而防止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA来实现靶标调节。

如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。

本发明还包括一种用于调节表达SBDS的靶细胞中SBDS表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物。

在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞。在优选的实施例中，靶细胞存在于肝脏中。靶细胞可以是肝细胞。

本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物。

在本发明的一个方面，本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物能够降低感染的细胞中的cccDNA水平，并因此抑制HBV感染。特别地，反义寡核苷酸能够影响以下参数中的一个或多个：i)减少cccDNA和/或ii)减少pgRNA和/或iii)减少HBVDNA和/或iv)减少感染的细胞中的HBV病毒抗原。

例如，抑制HBV感染的核酸分子可以i)与对照物相比，将感染的细胞中的cccDNA水平降低至少40％，诸如降低50％、60％；或ii)与对照物相比，将pgRNA的水平降低至少40％，诸如降低50％、60％。对照物可以是未处理的细胞或动物，或用适当的阴性对照物处理的细胞或动物。

HBV感染的抑制作用可以在体外使用HBV感染的原代人肝细胞进行测量，或在体内使用人源化肝细胞PXB小鼠模型(可从PhoenixBio获得，也参见Kakuni等人，2014Int.J.Mol.Sci.15:58-74)进行测量。对HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制可以通过ELISA测定，例如使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)根据制造商的说明进行。细胞内cccDNA或HBV mRNA和pgRNA的减少可通过qPCR测定，例如，如“材料和方法”章节所述。评估测试化合物是否抑制HBV感染的其他方法是通过例如WO 2015/173208中所述的qPCR测量HBV DNA的分泌，或使用Northern印迹杂交、原位杂交或免疫荧光测量。

由于SBDS水平的降低，本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物可用于抑制HBV感染的发展或治疗HBV感染。特别地，与仅减少HBsAg分泌的化合物相比，本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物通过对cccDNA的去稳定化和减少而更有效地抑制了慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染。

因此，本发明的一个方面涉及本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物用于减少HBV感染个体中的cccDNA和/或pgRNA的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物在抑制慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染中的用途。

本发明的另一方面涉及本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物在降低HBV感染者的传染性中的用途。在本发明的一个特定方面，本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物抑制慢性HBV感染的发展。

用本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物治疗(或预防性地接受本发明的核酸分子、缀合化合物或药物组合物)的受试者优选为人，更优选地为HBsAg阳性和/或HBeAg阳性的人类患者，甚至更优选地为HBsAg阳性和HBeAg阳性的人类患者。

因此，本发明涉及一种治疗HBV感染的方法，其中该方法包括施用有效量的本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物。本发明还涉及预防由慢性HBV感染引起的肝硬化和肝细胞癌的方法。在一个实施例中，本发明的SBDS抑制剂不旨在用于治疗肝细胞癌，仅用于其预防。在另一个实施例中，本发明的SBDS抑制剂不旨在用于治疗Shwachman-Diamond综合征。

本发明还提供了本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物或药物组合物在制备药物，特别是用于治疗HBV感染或慢性HBV感染或降低HBV感染者的传染性的药物中的用途。在优选的实施例中，药物被制备成用于皮下施用的剂型。

本发明还提供了本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合化合物、药物组合物在制备药物中的用途，其中所述药物为用于静脉内施用的剂型。

本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合物或药物组合物可用于联合疗法。例如，可以将本发明的SBDS抑制剂诸如核酸分子、缀合物或药物组合物可与其他抗HBV药剂诸如干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林、拉米夫定(3TC)、恩替卡韦、替诺福韦、替比夫定(LdT)、阿德福韦或其他新兴的抗HBV药剂诸如HBVRNA复制抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、HBV衣壳抑制剂、反义寡聚物(例如，如WO2012/145697、WO 2014/179629和WO2017/216390中所述)、siRNA(例如，在WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350和WO2017/015175中所述)、HBV治疗性疫苗、HBV预防性疫苗、HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)或TLR 2、3、7、8或9激动剂联合来治疗和/或预防HBV。

本发明的实施例

本发明的以下实施例可以与本文描述的任何其他实施例联合使用。本文在上文，特别是“发明内容”、“定义”和“具体实施方式”章节中提供的定义和解释在细节上作必要的修改后适用于下文。

1.一种SBDS(SBDS核糖体成熟因子)抑制剂，其用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染。

2.如实施例1所述使用的SBDS抑制剂，其中SBDS抑制剂以有效量施用。

3.如实施例1或2所述使用的SBDS抑制剂，其中HBV感染是慢性感染。

4.如实施例1至3所述使用的SBDS抑制剂，其中SBDS抑制剂能够减少感染细胞中的cccDNA和/或pgRNA。

5.如实施例1至4中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中SBDS抑制剂防止或减少SBDS与cccDNA的缔合。

6.如实施例5所述使用的SBDS抑制剂，其中所述抑制剂是特异性结合至SBDS蛋白的小分子，其中所述抑制剂防止或减少SBDS蛋白与cccDNA的缔合。

7.如实施例6所述使用的SBDS抑制剂，其中SBDS蛋白由SEQ ID NO:4或5编码。

8.如实施例1至7中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述抑制剂是长度为12-60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，所述连续核苷酸序列与哺乳动物SBDS靶核酸至少90％互补。

9.如实施例8所述使用的SBDS抑制剂，其能够降低哺乳动物SBDS靶核酸的水平。

10.如实施例8或9所述使用的SBDS抑制剂，其中哺乳动物SBDS靶核酸是RNA。

11.如实施例10所述使用的SBDS抑制剂，其中RNA是前体mRNA。

12.如实施例8至11中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中核酸分子选自由反义寡核苷酸、siRNA和shRNA组成的组。

13.如实施例12所述使用的SBDS抑制剂，其中核酸分子是单链反义寡核苷酸或双链siRNA。

14.如实施例8至13中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中哺乳动物SBDS靶核酸选自SEQ ID NO:1、4或5。

15.如实施例8至13中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中核酸分子的连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸至少98％互补。

16.如实施例8至13中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中核酸分子的连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的靶核酸至少98％互补。

17.如实施例1至16中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中当与对照相比时，感染HBV的细胞中的cccDNA减少至少50％，诸如60％。

18.如实施例1至16中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中当与对照相比时，感染HBV的细胞中的pgRNA减少至少50％，诸如60％。

19.如实施例8至18中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中当与对照相比时，哺乳动物SBDS靶核酸减少至少50％，诸如60％。

20.一种长度为12至60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为12至30个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，其中连续核苷酸序列与哺乳动物SBDS靶核酸至少90％互补，诸如95％、诸如98％、诸如完全互补。

21.如实施例20所述的核酸分子，其中核酸分子是化学产生的。

22.如实施例20或21所述的核酸分子，其中哺乳动物SBDS靶核酸选自由SEQ IDNO:1、4和5组成的组。

23.如实施例20或21所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的靶核酸至少98％互补。

24.如实施例20或21所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的靶核酸至少98％互补。

25.如实施例20至23中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子的长度为12至30个核苷酸。

26.如实施例20至25中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子是RNAi分子，诸如双链siRNA或shRNA。

27.如实施例20至25中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子是单链反义寡核苷酸。

28.如实施例20至27中任一项所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列与选自表4或表5的靶核酸序列完全互补。

29.如实施例20至28中任一项所述的核酸分子，其能够以低于-15kcal的ΔG°与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸杂交。

30.如实施例20至29中任一项所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列包含至少14个连续核苷酸，特别是15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸，或由其组成。

31.如实施例20至29中任一项所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列包含14至22个核苷酸或由其组成。

32.如实施例31所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列包含16至20个核苷酸或由其组成。

33.如实施例20至32中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子包含长度为14至25个的核苷酸或由其组成。

34.如实施例33所述的核酸分子，其中核酸分子包含长度为16至22个核苷酸的至少一个寡核苷酸链或由其组成。

35.如实施例20至34中任一项所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列与选自由SEQID NO:6、7、8和9组成的组的靶序列完全互补。

36.如实施例20至35中任一项所述的核酸分子，其中较之于与其互补的哺乳动物SBDS靶核酸，连续核苷酸序列具有零至三个错配。

37.如实施例36所述的核酸分子，其中与哺乳动物SBDS靶核酸相比，连续核苷酸序列具有一个错配。

38.如实施例36所述的核酸分子，其中与哺乳动物SBDS靶核酸相比，连续核苷酸序列具有两个错配。

39.如实施例36所述的核酸分子，其中连续核苷酸序列与哺乳动物SBDS靶核酸完全互补。

40.如实施例20至39中任一项所述的核酸分子，其包含一个或多个修饰的核苷。

41.如实施例40所述的核酸分子，其中一个或多个修饰的核苷是高亲和力修饰的核苷。

42.如实施例40或41所述的核酸分子，其中一个或多个修饰的核苷是2'糖修饰的核苷。

43.如实施例42所述的核酸分子，其中一个或多个2'糖修饰的核苷独立地选自由2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、2'-氟-ANA和LNA核苷组成的组。

44.如实施例40至43中任一项所述的核酸分子，其中一个或多个修饰的核苷是LNA核苷。

45.如实施例44所述的核酸分子，其中修饰的LNA核苷选自由氧基-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA、cET和ENA组成的组。

46.如实施例44或45所述的核酸分子，其中修饰的LNA核苷为氧基-LNA，其具有下列2'-4'桥–O-CH₂-。

47.如实施例46所述的核酸分子，其中氧基-LNA为β-D-氧基-LNA。

48.如实施例44或45所述的核酸分子，其中修饰的LNA核苷是cET，其具有下列2'-4'桥-O-CH(CH₃)-。

49.如实施例48所述的核酸分子，其中cET为(S)cET，即6'(S)甲基-β-D-氧基-LNA。

50.如实施例44或45所述的核酸分子，其中LNA为ENA，其具有下列2'-4'桥–O-CH₂-CH₂-。

51.如实施例20至50中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键。

52.如实施例51所述的核酸分子，其中至少一个修饰的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。

53.如实施例20至52中任一项所述的核酸分子，其中核酸分子是能够募集RNA酶H的反义寡核苷酸。

54.如实施例53所述的核酸分子，其中反义寡核苷酸或连续核苷酸序列是缺口聚体。

55.如实施例54所述的核酸分子，其中反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含式5'-F-G-F'-3’的缺口聚体或由其组成，其中区域F和F'独立地包括1-4个2'糖修饰的核苷或由其组成，并且G是介于6至18个核苷之间的能够募集RNA酶H的区域。

56.如实施例55所述的核酸分子，其中1-4个2'糖修饰的核苷独立地选自由2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷组成的组。

57.如实施例55或56所述的核酸分子，其中区域F和F'中的1-4个2'糖修饰的核苷中的一个或多个是LNA核苷。

58.如实施例57所述的核酸分子，其中区域F和F'中的所有2'糖修饰的核苷均为LNA核苷。

59.如实施例56至58中任一项所述的核酸分子，其中LNA核苷选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA、α-L-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、(S)cET、(R)cETβ-D-ENA和α-L-ENA。

60.如实施例56至59中任一项所述的核酸分子，其中区域F和F'由相同的LNA核苷组成。

61.如实施例56至60中任一项所述的核酸分子，其中区域F和F'中所有的2'糖修饰的核苷均为氧基-LNA核苷。

62.如实施例55至61中任一项所述的核酸分子，其中区域G中的核苷为DNA核苷。

63.如实施例62所述的核酸分子，其中区域G由至少75％的DNA核苷组成。

64.如实施例63所述的核酸分子，其中区域G中的所有核苷均为DNA核苷。

65.一种缀合化合物，其包含根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子和至少一个共价附着至所述核酸分子的缀合部分。

66.如实施例65所述的缀合化合物，其中核酸分子是双链siRNA，并且缀合部分共价附着于siRNA的正义链。

67.如实施例65或66所述的缀合化合物，其中缀合部分选自碳水化合物、细胞表面受体配体、药物物质、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素、维生素、病毒蛋白或其组合。

68.如实施例65至67中任一项所述的缀合化合物，其中缀合部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合。

69.如实施例68所述的缀合化合物，其中缀合部分包含至少一个选自由半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。

70.如实施例69所述的缀合化合物，其中脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

71.如实施例69或70所述的缀合化合物，其中缀合部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是一价、二价、三价或四价的。

72.如实施例71所述的缀合化合物，其中缀合部分由两个至四个末端GalNAc部分和将每一个GalNAc部分连接至可与反义化合物缀合的支链分子的间隔物组成。

73.如实施例72所述的缀合化合物，其中间隔物为PEG间隔物。

74.如实施例68至73中任一项所述的缀合化合物，其中缀合部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。

75.如实施例68至74中任一项所述的缀合化合物，其中缀合部分选自图1中的三价GalNAc部分之一。

76.如实施例75所述的缀合化合物，其中缀合部分是图1D中的三价GalNAc部分。

77.如实施例65至76中任一项所述的缀合化合物，其包含被定位在核酸分子与缀合部分之间的接头。

78.如实施例77所述的缀合化合物，其中接头是生理上不稳定的接头。

79.如实施例78所述的缀合化合物，其中生理上不稳定的接头是核酸酶敏感的接头。

80.如实施例78或79所述的缀合化合物，其中生理上不稳定的接头由2至5个连续的磷酸二酯键组成。

81.如实施例68至80中任一项所述的缀合化合物，其展示在肝脏与肾脏之间的改善的细胞分布，或者与未缀合的核酸分子相比，肝脏对缀合化合物的改善的细胞吸收。

82.一种药物组合物，其包含如实施例20至64中任一项所述的核酸分子、如实施例65至81中任一项所述的缀合化合物或其可接受的盐，以及药用稀释剂、运载体、盐和/或佐剂。

83.一种识别预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，包括：

a.将测试化合物与

i.SBDS多肽；或

ii.表达SBDS的细胞接触；

b.在存在或不存在所述测试化合物的情况下，测量SBDS的表达和/或活性；以及

c.识别降低SBDS表达和/或活性并减少cccDNA的化合物。

84.一种用于在表达SBDS的靶细胞中调节SBDS表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用如实施例20至64中任一项所述的核酸分子、如实施例65至81中任一项所述的缀合化合物、或如实施例82所述的药物组合物。

85.如实施例84所述的方法，其中与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，靶细胞中的SBDS表达降低至少50％或至少60％。

86.如实施例84所述的方法，其中靶细胞感染HBV，并且与未经任何处理或经对照物处理时的水平相比，在感染HBV的靶细胞中，感染HBV的细胞中的cccDNA减少至少50％或至少60％。

87.一种用于治疗或预防疾病如HBV感染的方法，其包括向罹患或易患疾病的受试者施用治疗或预防有效量的如实施例20至64中任一项所述的核酸分子、如实施例65至81中任一项所述的缀合化合物、或如实施例82所述的药物组合物。

88.如实施例20至中任一项所述的核酸分子、或如实施例65至81中任一项所述的缀合化合物、或如实施例82所述的药物组合物，其用作用于治疗或预防受试者的疾病如HBV感染的药物。

89.如实施例20至64中任一项所述的核酸分子或如实施例65至81中任一项所述的缀合化合物用于制备用于治疗或预防受试者中的疾病如HBV感染的药物的用途。

90.如实施例87-89所述的方法、核酸分子、缀合化合物或用途，其中受试者是哺乳动物。

91.如实施例90所述的方法、核酸分子、缀合化合物或用途，其中哺乳动物是人。

92.如实施例75所述的缀合化合物，其中缀合部分是图1B-1或图1B-2的三价GalNAc部分或二者的混合物。

93.如实施例75所述的缀合化合物，其中缀合部分是图1D-1或图1D-2的三价GalNAc部分或二者的混合物。

现在将通过以下实例说明本发明，所述实例不具有限制性。

实例

材料和方法

siRNA序列和化合物

siRNA池和靶序列

表6A：由siRNA池的个体组分靶向的人SBDS序列

siRNA池(ON-TARGETplus SMART池siRNA目录号LU-019217-00-0005，Dharmacon)含有靶向上表中所列的序列的四种个体siRNA分子。

表6B：对照化合物

寡核苷酸合成

寡核苷酸合成是本领域公知的。以下是可以实施的方案。就设备、载体和所用浓度而言，本发明的寡核苷酸可以通过略有变化的方法来产生。

使用亚磷酰胺方法在Oligomaker48上以1μmol规模在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。合成结束时，使用氨水在60℃下将寡核苷酸从固体载体上裂解5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸，通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。

寡核苷酸的延伸：

通过使用5'-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的0.1M溶液和DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中用作激活剂，进行β-氰基乙基亚磷酰胺的偶联(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于附着缀合物基团或这样的缀合物基团的C6接头。通过使用氢化黄原素(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)进行硫醇化以引入硫代磷酸酯键。可以使用碘在THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M溶液引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。

对于固相合成后的缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护并从固体载体上裂解后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化来引入缀合物。

通过RP-HPLC纯化：

粗制化合物在Phenomenex Jupiter C18 10μm 150x10mm色谱柱上通过制备型RP-HPLC纯化。0.1M醋酸铵pH 8和乙腈以5mL/min的流速用作缓冲液。将收集的级分冻干以给出纯化的化合物，通常为白色固体。

缩写：

DCI： 4,5-二氰基咪唑

DCM： 二氯甲烷

DMF： 二甲基甲酰胺

DMT： 4,4’-二甲氧基三苯甲基

THF： 四氢呋喃

Bz： 苯甲酰基

Ibu： 异丁酰基

RP-HPLC： 反相高效液相色谱

T_m测定：

将寡核苷酸和RNA靶标(磷酸酯连接的，PO)双链体在500ml无Rnase的水中稀释至3mM，并与500ml 2x T_m缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠、pH 7.0)混合。将溶液加热3分钟到95℃，然后在室温下退火30分钟。使用PE Templab软件在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda40 UV/VIS分光光度计(PerkinElmer)上测量双链体解链温度(T_m)。温度从20℃上升到95℃，然后下降到25℃，记录在260nm处的吸收。使用一阶导数以及解链和退火的局部最大值来评估双链体T_m。

克隆生长培养基(dHCGM)。dHCGM是DMEM培养基，其包含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM Hepes、44mMNaHCO₃、15μg/ml L-脯氨酸、0.25μg/ml胰岛素、50nM地塞米松、5ng/ml EGF、0.1mM Asc-2P、2％DMSO和10％FBS(Ishida等人，2015)。将细胞在37℃的培养箱中于具有5％CO₂的潮湿气氛中进行培养。接种后24小时更换培养基，并每2天更换一次直至收获。

ASO序列和化合物

表7：本发明的寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO表示)以及基于基序序列设计的本发明的具体寡核苷酸化合物(由CMP ID NO表示)的列表。

表中的标题“寡核苷酸化合物”代表基序序列的特定设计。大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键(CMP ID NO＝化合物ID NO)

感染HBV的PHH细胞

新鲜的初代人肝细胞(PHH)由PhoenixBio,Higashi-Hiroshima City,Japan(PXB-细胞也在Ishida等人2015 Am J Pathol.185(5):1275-85中描述)在96-孔板形式中以70,000个细胞/孔提供。

到达后，通过将PHH细胞与在4％(v/v)PEG中的HBV于PHH培养基中孵育16小时，将PHH使用HepG2 2.2.15-衍生的HBV(批次Z12)以2GE/mL的MOI感染，或使用慢性患者衍生的纯化接种物(基因型C)以7E08 GE/mL的MOI感染。然后将细胞用PBS洗涤三次并在新鲜PHH培养基中以具有5％CO₂的潮湿气氛培养，该培养基由以下组成：补充有10％(v/v)热灭活胎牛血清(GIBCO,Cat#10082)的DMEM(GIBCO,Cat#21885)、2％(v/v)DMSO、1％(v/v)青霉素/链霉素(GIBCO,Cat#15140-148)、20mM HEPES(GIBCO,Cat#15630-080)、44mM NaHCO₃(Wako,Cat#195-14515)、15ug/ml L-脯氨酸(MP-Biomedicals,Cat#0219472825)、0.25μg/ml胰岛素(Sigma,Cat#I1882)、50nM地塞米松(Sigma,Cat#D8893)、5ng/ml EGF(Sigma,Cat#E9644)和0.1mM L-抗坏血酸2-磷酸酯(Wako,Cat#013-12061)。将细胞在37℃的培养箱中于具有5％CO₂的潮湿气氛中进行培养。培养基铺板后24小时更换，并每周更换三次直至收获。

siRNA转染

感染后四天，将细胞用SBDS siRNA池(参见表6A)转染，重复三次。包括无药物对照物(NDC)、阴性对照siRNA和HBx siRNA作为对照物(参见表6B)。

每孔用2μl的阴性对照siRNA(原液浓度1uM)、SBDS siRNA池(原液浓度1uM)、HBx对照siRNA(原液浓度0.12μM)或H2O(NDC)中的任一者以及18.2μl OptiMEM(Thermo FisherScientific减血清培养基)和0.6ul

RNAiMAX转染试剂(ThermofisherScientific目录号13778)制备转染混合物。在转染前5分钟将转染混合物混合并在室温下孵育。在转染之前，将培养基从PHH细胞中去除，并替换为100μl/孔William's E培养基+GlutaMAX(Gibco,#32551)，其补充有不含P/S的HepaRG补充剂(BiopredicInternational,#ADD711C)。将20ul转染混合物添加到每个孔中，产生16nM的最终浓度用于阴性对照siRNA或SBDS siRNA池，或1.92nM的最终浓度用于HBx对照siRNA，并且在放入培养箱之前轻轻摇动该板。6小时后将培养基更换为PHH培养基。如上所述在感染后第6天重复siRNA处理。在感染后第8天，收集上清液并储存在-20℃。如果需要，可以从上清液中测定HBsAg和HBeAg。

LNA处理

制备了两个来自500μM原液的LNA主混合物板。对于最终浓度为25μM的LNA处理，在第一个主混合物板中制备200μL的500μM原液LNA。包括100μM的SBDS LNA的第二个主混合物板被制备用于最终浓度为5μM的LNA处理，混合了40μL的为500μM的每种SBDS LNA和160μL的PBS。

感染四天后，细胞用最终浓度为25μM的SBDS LNA处理(参见表7)，重复两次或重复三次，或用PBS作为无药物对照物(NDC)。在LNA处理之前，旧培养基从细胞中去除并更换为114μl/孔的新鲜PHH培养基。每个孔，向114μL PHH培养基加入6μL各自为500μM的SBDS LNA，或PBS作为NDC。在感染后第4、11和18天重复相同的处理3次。在感染后第7、14和21天，每三天将细胞培养基更换为新鲜细胞培养基。

对于cccDNA的定量，从感染后第7天到第21天，用最终浓度为10nM的恩替卡韦(ETV)处理感染的细胞。在感染后第7、11、14、18和21天重复新鲜ETV处理5次。这种ETV处理用于抑制新病毒DNA中间体的合成并特异性检测HBV cccDNA序列。

HBV抗原表达的测量

如需要，HBV抗原表达和分泌可以在收集的上清液中测量。根据制造商的方案，使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic#CL0310-2,#CL0312-2)测量HBV传播参数、HBsAg和HBeAg水平。简而言之，将每孔25μL的上清液转移至由各自抗体包被的微量滴定板，并添加25μL的酶缀合试剂。将该板于室温下在摇床上孵育60分钟，然后使用自动洗涤器用洗涤缓冲液将孔洗涤五次。向每一个孔中添加25μL底物A和B。在使用

发光读数器(Perkin Elmer)测量发光之前，将板于室温下在摇床上孵育10分钟。

细胞活力测量

使用细胞计数试剂盒–8(来自SigmaAldrich CCK8，#96992)测量上清液游离细胞的细胞活力。对于该测量，CCK8试剂在正常培养基中按1:10稀释，并以100μl/孔加入至细胞。在培养箱中孵育1小时后，将80μl上清液转移到透明的平底96孔板，并使用酶标仪(Tecan)读取450nm处的吸光度。将吸光度值归一化到设置为100％的NDC，以计算相对细胞活力。

细胞活力测量用于确认病毒参数的任何降低不是细胞死亡的原因，该值越接近100％则毒性越低。进一步分析中排除了给予等于NDC或低于NDC 20％的细胞活力值的LNA处理。

用于测量SBDS mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA定量的实时PCR

在细胞活力确定之后，将细胞用PBS洗涤一次。对于siRNA处理，细胞使用来自

Gene Expression Cells-to-CT^TM试剂盒(Thermo Fisher Scientific,#AM1729)的50μl/孔裂解溶液裂解并储存在-80℃。对于用LNA处理的细胞，根据制造商的方案，使用MagNA Pure机器人和MagNA Pure 96细胞RNA大容量试剂盒(Roche,#05467535001)提取总RNA。对于SBDS RNA和病毒pgRNA水平以及归一化对照物GUS B的定量，使用了

RNA-to-Ct^TM1-步式试剂盒(Life Technologies,#4392656)。对于每个反应，使用了2或4μl细胞裂解物、0.5μl 20x SBDS Taqman引物/探针、0.5μl 20x GUS B Taqman引物/探针、5μl 2x

RT-PCR混合物、0.25μl 40x

RT酶混合物和1.75μlDEPC处理的水。表8中列出了用于GUS B RNA和靶mRNA定量的引物。对每个样品进行技术复制，并包含-RT对照，以评估由于DNA存在而导致的潜在扩增。

使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)，采用以下方案通过RT-qPCR在技术重复中定量靶mRNA表达水平以及病毒pgRNA：48℃ 15分钟，95℃ 10分钟，然后95℃15秒和60℃ 60秒的40个循环。

使用归一化到参考基因GUS B和未转染的细胞的比较周期阈值2-ΔΔCt方法分析SBDS mRNA和pgRNA表达水平。siRNA处理的细胞中的表达水平表示为平均无药物对照样品的百分比(即值越低，抑制/减少越大)。在LNA处理的细胞中，表达水平表示为与设置为100％的未处理细胞(NDC)相比的抑制效果，并表示为来自测量的两个独立生物学重复的平均值+SD的百分比。对于cccDNA定量，从用siRNA或LNA处理的感染HBV的初代人肝细胞中提取总DNA。在cccDNA qPCR分析之前，用T5酶(10U/500ng DNA；New England Biolabs,#M0363L)消化一部分经siRNA处理的细胞裂解物，以去除病毒DNA中间体并仅定量cccDNA分子。T5消化在37℃下进行30分钟。T5消化未应用于经LNA处理的细胞裂解物以避免测定中的qPCR干扰。为了去除HBV DNA中间体并定量经LNA处理的细胞中的cccDNA水平，如LNA处理章节中所述，用恩替卡韦(10nM)处理细胞3周。

对于经siRNA处理的细胞中cccDNA的定量，每孔使用的每个反应混合物包含2μl经T5消化的细胞裂解物、0.5μl 20x cccDNA_DANDRI Taqman引物/探针(Life Technologies，定制#AI1RW7N，下表中列出的FAM染料)、5μl

Fast Advanced主混合物(AppliedBiosystems,#4444557)和2.5μl DEPC处理的水。对每个样品进行三次技术重复。

为了通过qPCR对LNA处理的细胞中的cccDNA进行定量，每孔制备了具有10ul 2xFast SYBR^TMGreen主混合物(Applied Biosystems,#4385614)、2ul cccDNA引物混合物(正向和反向各1uM)和4ul无核酸酶水的16uL/孔的主混合物。还每孔制备了具有10ul 2x FastSYBR^TMGreen主混合物(Applied Biosystems,#4385614)、2ul线粒体基因组引物混合物(正向和反向各1uM)和4ul无核酸酶水的主混合物，用于cccDNA的归一化。

对于细胞内HBV DNA和归一化对照物人血红蛋白β(HBB)的定量，使用的每个反应混合物包含2μl未消化的细胞裂解物、0.5μl 20x HBV Taqman引物/探针(LifeTechnologies，#Pa03453406_s1，FAM-染料)、0.5μl 20x HBB Taqman引物/探针(LifeTechnologies，#Hs00758889_s1，VIC-染料)、5μl

Fast Advanced主混合物(Applied Biosystems,#4444557)和2μl DEPC处理的水。对每个样品进行三次技术重复。

qPCR在QuantStudio^TMK12 Flex上运行，采用快速加热块的标准设置(95℃20秒，然后95℃1秒和60℃20秒的40个循环)。

通过排除与每种处理条件下所有三个生物学重复的中值Ct差异超过0.9的值，从数据集中去除任何异常值。经由2^-ddCT方法从Ct值确定cccDNA(siRNA和LNA处理的细胞)和总HBV DNA(仅siRNA处理的细胞)的倍数变化，并归一化到作为管家基因的HBB或线粒体DNA。对于siRNA处理的细胞，表达水平表示为平均无药物对照样品的百分比(即值越低，抑制/减少越大)。对于LNA处理的细胞，对cccDNA的抑制作用表示为与设置为100％的未处理细胞(NDC)相比，三个独立生物复制的平均值+/-SD的百分比。

表8：GUS B和靶mRNA qPCR引物(Thermo Fisher Scientific)

SBDS(FAM):Hs04188846_m1
	管家基因引物GUSB(VIC)：Hs00939627_m1
pgRNA(FAM):AILIKX5

实例1：感染HBV的PHH细胞中由siRNA处理引起的SBDS mRNA、HBV细胞内DNA和cccDNA的减少的测量

在以下实验中，测试了SBDS敲低对HBV参数HBV DNA和cccDNA的影响。

如材料和方法章节“siRNA转染”中所述，感染HBV的PHH细胞用来自Dharmacon的siRNA池(LU-019217-00-0005，参见表6A)进行处理。在4天的处理后，通过qPCR测量SBDSmRNA、cccDNA和细胞内HBV DNA，如材料和方法章节“用于测量SBDS mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA的实时PCR”中所述。

结果在表9中显示为平均无药物对照样品的百分比(即值越低，抑制/减少越大)。

表9：用siRNA池敲低SBDS后对HBV参数的影响。值以生物学和技术三次重复的平均值给出。

由此可见，SBDS siRNA池能够非常有效地减少cccDNA和HBV DNA。正如预期的那样，阳性对照物减少了细胞内HBV DNA，但与阴性对照物相比，对cccDNA没有影响。

实例2：感染HBV的PHH细胞中由LNA处理引起的SBDS mRNA、HBV细胞内pgRNA和cccDNA的减少的测量

在以下实验中，测试了SBDS敲低对HBV参数HBV DNA和cccDNA的影响。

如材料和方法章节“LNA处理”中所述，用SBDS裸LNA(参见表7)处理感染HBV的PHH细胞。

在21天的处理后，通过qPCR测量SBDS mRNA、cccDNA和细胞内HBVpgRNA，如材料和方法章节“用于测量SBDS mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA的实时PCR”中所述。结果在表10中显示为与设置为100％的未处理细胞(NDC)相比的抑制效果，并表示为来自测量的两个独立生物学重复的平均值+SD的百分比。

表10：用裸LNA敲低SBDS后对HBV参数的影响。值作为两次或三次生物学重复的平均值给出。数据显示最终浓度为25mM的LNA的效果

*未处理的细胞

由此可见，SBDS LNA能够显著降低SBDS mRNA表达，从而相当有效地降低pgRNA和cccDNA二者的表达水平。

Claims (32)

1.一种SBDS(SBDS核糖体成熟因子)抑制剂，其用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染。

2.根据权利要求1所述使用的SBDS抑制剂，其中所述HBV感染是慢性感染。

3.根据权利要求1或2所述使用的SBDS抑制剂，其中所述SBDS抑制剂能够减少感染HBV的细胞中的cccDNA(共价闭合环状DNA)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述抑制剂是长度为12至60个核苷酸的核酸分子，所述核酸分子包含与哺乳动物SBDS靶核酸，特别是人靶SBDS核酸至少95％互补例如完全互补的、长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，并且所述抑制剂能够减少表达SBDS mRNA的细胞中SBDS mRNA的表达。

5.根据权利要求1至4中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述抑制剂选自由以下项组成的组：单链反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。

6.根据权利要求1至5中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述哺乳动物SBDS靶序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:1、4和5。

7.根据权利要求4至6中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸至少98％互补，例如完全互补。

8.根据权利要求3至7中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中感染HBV的细胞中cccDNA的量减少至少60％。

9.根据权利要求4至7中任一项所述使用的SBDS抑制剂，其中所述SBDS mRNA减少至少60％。

10.一种长度为12至30个核苷酸的核酸分子，其包含与哺乳动物SBDS靶序列，特别是人SBDS靶序列90％互补例如完全互补的至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述核酸分子能够抑制SBDS mRNA的表达。

11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列完全互补：SEQ ID NO:1、4和5。

12.根据权利要求10或11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含长度为12至25，特别是16至20个核苷酸的连续核苷酸序列。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是RNAi分子，例如双链siRNA或shRNA。

14.根据权利要求10至12中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是单链反义寡核苷酸。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个2'糖修饰的核苷。

16.根据权利要求15所述的核酸分子，其中所述一个或多个2'糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷。

17.根据权利要求15或16所述的核酸分子，其中所述一个或多个2'糖修饰的核苷是LNA核苷。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。

19.根据权利要求18所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列内的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。

20.根据权利要求10至19中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子能够募集RNA酶H。

21.根据权利要求10至20中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子或其连续核苷酸序列包含式5'-F-G-F'-3'的缺口聚体，其中区域F和F'独立地包含1-4个2'糖修饰的核苷，并且G是能够募集RNA酶H的介于6与18个核苷之间的区域，例如包含介于6与18个DNA核苷之间的区域。

22.一种缀合化合物，其包含根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子和至少一个共价附着至所述核酸分子的缀合部分。

23.根据权利要求22所述的缀合化合物，其中所述缀合部分是或包含GalNAc部分，例如三价GalNAc部分，例如选自图1中的所述三价GalNAc部分中的一者的GalNAc部分。

24.根据权利要求22或23所述的缀合化合物，其中所述缀合化合物包含由包含至少两个连续的磷酸二酯键的2至5个连接的核苷组成的生理上不稳定的接头，其中所述生理上不稳定的接头共价结合在所述核酸分子的5'或3'末端处。

25.一种根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子或根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物的药用盐。

26.一种药物组合物，其包含根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、或根据权利要求25所述的药用盐，以及药用赋形剂。

27.一种用于抑制表达SBDS的靶细胞中的SBDS表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、根据权利要求25所述的药用盐、或根据权利要求26所述的药物组合物。

28.一种用于治疗或预防疾病的方法，其包括向罹患或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、根据权利要求25所述的药用盐、或根据权利要求26所述的药物组合物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病是乙型肝炎病毒(HBV)感染，例如慢性HBV感染。

30.根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、根据权利要求25所述的药用盐、或根据权利要求26所述的药物组合物，其用于医药。

31.根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、根据权利要求25所述的药用盐、或根据权利要求26所述的药物组合物，其用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染例如慢性HBV感染。

32.根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子、根据权利要求22至24中任一项所述的缀合化合物、根据权利要求25所述的药用盐、或根据权利要求26所述的药物组合物用于制备用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染例如慢性HBV感染的药物的用途。

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