CN114788875B

CN114788875B - 一种激活Hippo通路的超分子纳米药物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114788875B
Application number: CN202210571890.6A
Authority: CN
Inventors: 刘鉴峰; 任春华; 王志龙; 杨翠红; 王忠彦; 杨丽军; 肖萌; 张嘉敏
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2042-05-25
Also published as: CN114788875A

Abstract

本发明公开了一种靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物与应用。它是将含有双重药物组分的疏水性短肽片段与亲水性聚乙二醇片段，通过二硫键连接得到的两亲性化合物Fmoc‑S(FA)FFYSV‑SS‑PEG(FASP)。该化合物能够通过分子间非共价相互作用自组装形成无活性的纳米前药，被癌细胞摄取后发生形态转变，原位形成活性肽纳米纤维并释放出氟灭酸（FA），从而激活失调的Hippo通路用于肿瘤放化疗联合治疗及转移抑制，其特点是：合成简单，可重复性高，生物相容性好，临床转化潜力大。同时，与游离FA相比，本发明得到的超分子纳米药物能够通过共价连接递送和响应性原位释放，显著提高FA对肿瘤细胞的生长抑制效果并降低其对正常细胞的毒副作用，具有良好的临床转化和应用前景。

Description

一种激活Hippo通路的超分子纳米药物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药材料领域，涉及一种靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物的制备方法及其在肿瘤放化疗联合治疗中的应用。

背景技术

Hippo通路首次在果蝇中发现，在哺乳动物中高度保守，自发现以来一直是生命医学领域的研究热点之一。研究表明，Hippo通路在器官大小控制、细胞增殖、癌症发展以及病毒诱发疾病等广泛的生物进程中发挥着关键作用。Hippo通路主要是由三部分组成，分别是上游核心激酶MST-LATS模块，信号级联传递关键因子YAP蛋白以及下游转录因子家族TEADs模块。当Hippo通路被上游生长抑制信号激活后，上游核心激酶磷酸化YAP，进而促进其泛素化及蛋白酶体降解，同时阻止YAP转移至细胞核中与TEADs结合，最终抑制相关增殖和促存活基因的转录和表达。现有研究表明，Hippo通路的失调导致YAP在多种癌细胞中高表达，包括乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌以及黑色素瘤等。

除了直接调控肿瘤细胞的生长增殖，YAP还能够作为肿瘤微环境的信号中枢来调节肿瘤免疫微环境。研究表明，YAP与TEADs结合将会通过诱导免疫抑制性细胞因子、趋化因子以及程序性死亡配体1（PD-L1）等基因的表达，激活和招募肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞和癌症相关成纤维细胞，从而协助肿瘤逃避免疫系统的监视和攻击。因此，靶向激活癌细胞内的Hippo信号通路，有效阻遏YAP-TEADs相互作用，能够达到抑制肿瘤细胞生长和重塑肿瘤免疫微环境的双重目的，从而为肿瘤化疗、放疗以及免疫治疗提供新的策略。

目前，Hippo通路靶向的癌症治疗仍处于起步阶段，研究关注点主要集中于如何抑制 YAP和TEADs之间相互作用。已经报道的相关小分子药物，包括维替泊芬、氟苯肟化合物以及氟灭酸化合物等。其中，氟灭酸（FA），是一种非甾体类小分子药物，研究发现其可以结合在TEADs棕榈酰化的脂质袋，影响TEADs的折叠以及活性，从而降低YAP与TEADs结合后引起的下游靶基因的转录，是一种有效的Hippo通路激活剂。但是，由于它的小分子属性，FA水溶性较差，表现出较低的生物利用度，对正常组织细胞同样有毒副作用，从而限制了其在临床的推广与应用。酪氨酸-丝氨酸-缬氨酸是一段具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂功能的短肽，有望通过对Hippo通路上游核心激酶的乙酰化调控，促进YAP磷酸化，进而与 FA协同作用实现对Hippo通路的有效激活。但是，该活性短肽存在活性较差、易被蛋白酶降解的缺陷，需要通过合理的策略提高其稳定性。

过去几十年，超分子纳米药物递送系统的发展在癌症靶向治疗中显示出了较好的应用效果，具体表现为能够有效提高小分子药物的生物利用度及抗癌疗效并降低其毒副作用。研究表明，球形纳米粒子在肿瘤部位可以更好的扩散和渗透，但其胞内滞留能力相对较弱；而具有高纵横比的纳米棒或纳米纤维虽然可以在细胞内获得较高的积累，但其肿瘤穿透能力相对较弱。具备“纳米球-纳米纤维”原位转变性能的超分子纳米药物，由于可以同时满足肿瘤高渗透和胞内长滞留的双重要求，近年来受到了越来越多的关注，在临床转化和应用中显示出了较大的潜力。因此，通过合理设计开发具有原位转变性能并有效激活Hippo通路的超分子纳米药物，对于加快推进靶向Hippo通路的临床癌症治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明旨在开发一种靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物，并将其应用肿瘤联合治疗以提高肿瘤治疗效果。

本发明的超分子纳米药物将具备以下一些优势：1）载体成分基本由氨基酸和聚乙二醇构成，具有良好的生物相容性和生物可降解性；2）提高疏水性药物氟灭酸的溶解性和生物利用度；3）能够特异性在癌细胞内发生原位转变并激活Hippo通路，增强游离药物对肿瘤细胞的选择性作用；4）兼具靶向治疗和放疗增敏的作用，实现肿瘤协同治疗。

为实现上述目的，本发明公开了如下技术内容：

一种靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG，其特征在于它是将含有双重药物组分的疏水性短肽片段与亲水性聚乙二醇片段通过二硫键共价连接，得到的两亲性化合物能够在水溶液中通过分子间非共价键相互作用自组装形成微观形貌为球形胶束的纳米前药，其化学结构如下：

其中Fmoc-S(FA)为侧链羟基修饰小分子药物FA，氨基端修饰Fmoc的丝氨酸；FFYSV为苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-丝氨酸-缬氨酸残基构成的短肽，SS为二硫键，PEG为聚乙二醇片段。

所述的Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG目标化合物，其特征在于按如下方法进行合成：

以Fmoc-Wang-Gly树脂为载体，在定制的合成管里加入10-20 mL DMF使其充分溶胀后切除Fmoc保护基，按照多肽Fmoc固相合成标准方法，先后依次加入Fmoc-PEG、Fmoc-SS以及Fmoc保护氨基酸（Val、Ser、Tyr、Phe），最后加入Fmoc-Ser(FA)-COOH。反应完成后，加入10-20 mL的95%三氟乙酸反应1-2 h从树脂上将多肽衍生物切割，通过反相HPLC分离纯化得到目的产物。其中，所述的Fmoc-Ser(FA)-COOH制备方法如下：

（1）将FA（562.46 mg，2 mmol）和Fmoc-Ser-OtBu（766.88 mg，2 mmol）溶于10-25mL无水二氯甲烷中，加入EDCI（575.1 mg，3 mmol）和DMAP（36.6 mg，0.3 mmol）室温下搅拌反应24-48 h；

（2）旋蒸除去二氯甲烷后，浓缩液通过硅胶层析柱分离得到浅黄色中间产物Fmoc-Ser(FA)-OtBu；在中间产物中加入5-10 mL三氟乙酸，室温搅拌反应1-2 h脱去保护基团，无水乙醚溶解干燥后得到产物Fmoc-Ser(FA)-COOH。

本发明更进一步公开了所述靶向激活Hippo通路的超分子纳米药物在提高抗肿瘤药物治疗疗效中的应用。其中提高抗肿瘤药物治疗疗效指的是提高游离氟灭酸对肿瘤的特异性杀伤及协同性治疗效果。

本发明同时也公开了所述靶向激活Hippo通路的超分子纳米药物在提高肿瘤对放疗敏感性的应用。实验结果显示，与单独超分子纳米药物介导的靶向治疗或γ射线介导的放疗相比，超分子纳米药物与放疗联合应用具有更显著的肿瘤抑制效果。肿瘤抑制率提高至90%左右，表现出了高效的靶向治疗与放疗协同治疗效果。特别是FASP能够显著抑制肿瘤的肝脏转移，同时联合放疗后可以显著提高三阴性乳腺癌的存活率。

本发明更加详细的描述如下：

将含有双重药物组分的疏水性短肽片段与亲水性聚乙二醇片段，通过二硫键连接得到的两亲性化合物Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG。该产物能够通过分子间非共价相互作用自组装形成纳米结构为球形胶束的纳米前药，并在癌细胞内高表达的谷胱甘肽和酯酶的作用下发生结构转变，原位形成Fmoc-SFFYSV纳米纤维并释放出游离小分子药物氟灭酸（FA），进而从上下游协同作用激活失调的Hippo通路用于肿瘤联合治疗及转移抑制。因此，发明的肽基纳米药物能够有效提高游离酪丝缬肽和氟灭酸的生物利用度，以达到增强抗癌活性的效果。

所述的Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG超分子纳米药物的制备方法：称取合成的化合物纯品5 mg溶于1 mL DMSO中，按照1:9的比例缓慢滴加到9 mL ddH₂O/PBS中，每30 s滴加一滴含有多肽的DMSO溶剂，边滴加边搅拌；滴加结束后，室温继续搅拌4 h，稳定胶束；将获得的产物透析袋（MWCO=1000 D）透析48 h，完全除去DMSO溶剂，获得目标超分子纳米药物。进一步的，所述的Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG衍生物合成步骤如下：以Fmoc-Wang-Gly树脂为载体，在定制的合成管里加入10-20 mL DMF使其充分溶胀后切除Fmoc保护基，按照多肽Fmoc固相合成标准方法，先后依次加入Fmoc-PEG、Fmoc-SS以及Fmoc保护的氨基酸（Val、Ser、Tyr、Phe），最后加入Fmoc-Ser(FA)-COOH。反应完成后，加入10-20 mL的95%三氟乙酸反应1-2 h从树脂上将多肽衍生物切割，通过反相HPLC分离纯化得到目的产物。进一步的，所述的Fmoc-Ser(FA)-COOH制备方法如下：

1）将FA（562.46 mg，2 mmol）和Fmoc-Ser-OtBu（766.88 mg，2 mmol）溶于10-25 mL无水二氯甲烷中，加入EDCI（575.1 mg，3 mmol）和DMAP（36.6 mg，0.3 mmol）室温下搅拌反应24-48 h；

2）旋蒸除去二氯甲烷后，浓缩液通过硅胶层析柱分离得到浅黄色中间产物Fmoc-Ser(FA)-OtBu；在中间产物中加入适量5-10 mL三氟乙酸，室温搅拌反应1-2 h脱去保护基团，无水乙醚溶解干燥后得到产物Fmoc-Ser(FA)-COOH。

本发明主要解决了小分子药物氟灭酸因溶解性差、生物利用度低导致对Hippo通路靶标调控不理想的问题，重点考察了疏水性短肽载体与亲水性聚乙二醇片段共价结合后，所得到的超分子纳米药物在谷胱甘肽和酯酶作用下的形态转变性能、对癌细胞内Hippo通路的激活及其在肿瘤联合治疗方面的应用。主要的难点在于，含氟灭酸和酪丝缬肽超分子化合物结构的合理设计，使其自组装形成能够在癌细胞内发生结构转变并协同激活Hippo通路的的纳米药物，从而增加氟灭酸的生物利用度和治疗疗效。

本发明公开的靶向激活Hippo通路的超分子纳米药物及其制备方法与应用所具有的积极效果在于：能够极大的提高小分子药物氟灭酸的溶解性和生物利用度，并通过与酪丝缬肽的协同作用增强其对Hippo通路关键靶基因的调控，为靶向Hippo通路用于癌症治疗提供新的方法。

本发明公开Fomc-S(FA)FFYSV-SS-PEG纳米药物以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂组成的药物组合物。该药物组合物可以制成固体口服制剂、液体口服制剂、注射剂等剂型。

本发明的Fomc-S(FA)FFYSV-SS-PEG纳米药物还可以通过非肠道形式给药。优选的非肠道给药形式为注射剂给药。所述固体及液体口服制剂包括：片剂、肠溶片、胶囊、糖浆剂、口服溶液剂、注射剂等等。

本发明的Fomc-S(FA)FFYSV-SS-PEG纳米药物组合物制备如下：使用标准和常规的技术，使本发明化合物与制剂学上可接受的固体或液体载体结合，以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成微粒或微球。固体剂型包括片剂、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质，其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。

本发明制备的激活Hippo通路的超分子纳米药物具备以下优势：

1）原料易得，成本低、产率高并且重复性好，能够为以后的实际应用提供方便；

2）制备方法简单，具有相对稳定的纳米胶束形貌；

3）在体内具有良好的生物相容性，容易临床转化；

4）能够提高氟灭酸对癌细胞的选择性并降低其对正常细胞的毒副作用。

附图说明

图1为超分子纳米药物的表征：A）分别代表不同纳米药物在PBS中与谷胱甘肽和猪肝酯酶孵育前后的TEM图像；B）HPLC监测纳米药物FASP在谷胱甘肽和猪肝酯酶作用下的水解反应；C）FASP分别在H₂O、0.9% NaCl、PBS和RPMI 1640+10% 血清中48 h内的稳定性；D）在不同催化条件下孵育FASP后FA的时间依赖性释放曲线。标尺为100 nm；

图2为超分子纳米药物与游离药物分子对三阴性乳腺癌细胞（MDA-MB-231和4T1）及正常细胞（3T3）的生长抑制效果：A）不同纳米药物及药物游离分子对小鼠成纤维细胞3T3的生长抑制效果；B）不同纳米药物及药物游离分子对小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1的生长抑制效果；C）不同纳米药物及药物分子对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制效果；

图3为超分子纳米药物与游离药物分子对MDA-MB-231中Hippo通路的调控：A-D）不同纳米药物及游离药物分子处理MDA-MB-231后，q-PCR分析Hippo通路促增殖迁移相关基因表达情况；E）免疫印迹显示纳米药物及药物分子处理MDA-MB-231后MST1、p-YAP、YAP、AxL蛋白的表达；F）根据E）中的免疫印迹图像，定量分析p-YAP/YAP的比例；

图4为超分子纳米药物与游离药物分子体外放疗增敏效果：A）不同剂量射线照射后的克隆形成实验结果；B）不同剂量射线照射后的细胞存活曲线。^✱✱✱ p < 0.001；

图5为超分子纳米药物与游离药物分子联合放疗后在裸鼠体内抑制MDA-MB-231乳腺癌生长及肝脏转移的效果：A）治疗过程中小鼠肿瘤体积生长曲线；B）小鼠体重变化曲线；C）各组小鼠的存活曲线；D）不同处理组小鼠肿瘤抑制率；E）不同处理组小鼠肝脏转移图片及对应的组织切片苏木精-伊红染色（H＆E）结果。标尺为100 μm。^✱✱ p < 0.01，^✱✱✱ p <0.001。

具体实施方式

下面通过具体的实施例叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施例应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施例中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用原料氟灭酸、Fmoc氨基酸、二氯甲烷、三氟乙酸、三异丙基硅烷、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶、胱胺二盐酸盐、碳酸氢钠、1,4-二氧六环、丁二酸酐、无水乙醚、丙酮、碳酸氢钠均有市售。

实施例1

超分子纳米药物的制备及表征，包括Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG（缩写为FASP）、没有FA的对照材料Fmoc-SFFYSV-SS-PEG（缩写为FSSP）、没有组蛋白去乙酰化酶抑制功能肽YSV的对照材料Fmoc-S(FA)FFY-SS-PEG（缩写为FAYP）、以及没有谷胱甘肽响应的对照材料Fmoc-S(FA)FFYSV-CC-PEG（缩写为FACP），以FASP纳米药物为例，具体制备步骤如下：

（一）称取多肽纯品5 mg溶于1 mL DMSO中，按照1:9的比例缓慢滴加到9 mLddH₂O/PBS中，每30 s滴加一滴含有多肽的DMSO溶剂，边滴加边搅拌；滴加结束后，室温继续搅拌4 h，稳定胶束；将获得的产物透析袋（MWCO=1000 D）透析48 h，完全除去DMSO溶剂，获得FASP 胶束溶液。

对照材料的纳米胶束制备方法相同。

（二）分别吸取10 μL纳米胶束于300 目铜网上，静置5 min，用滤纸吸除多余液体，在铜网上滴加5 μL醋酸铀染色3 min，滤纸吸走多余液体后置于干燥器中过夜干燥，用透射电子显微镜观察微观形貌检测。结果如下：

如图1A所示，所有纳米药物的纳米形貌均为形态规则的纳米球，而加入猪肝酯酶（20 U/mL）和谷胱甘肽（10 mM）孵育后，除了FACP外，其他纳米药物的形貌均发生了纳米球到纳米纤维的转变。

（三）FASP（5 mg/mL）与谷胱甘肽（10 mM）和猪肝酯酶（20 U/mL）在 37 ℃ 下孵育。在指定的时间间隔，收集冻干样品并通过HPLC分析发现FASP可在12 h完全水解（图1B）。FASP在分别含有 10% 胎牛血清的 1640 培养基、H₂O、0.9% NaCl和PBS中孵育48 h，粒径没有明显变化，证实FASP具有良好的稳定性（图1C）。通过监测FA在350 nm特异吸收峰，测量FASP在不同条件下FA的释放速率，相较于单独酯酶催化，在酯酶和谷胱甘肽作用下FASP快速完全释放FA（图1D）。

实施例2

对实施例1制备得到的纳米药物FASP，FSSP，FAYP，FACP和游离药物FA在体外对肿瘤细胞和正常细胞的生长抑制效果进行评价，具体实施步骤如下：

1）取对数生长期的MDA-MB-231，4T1 和3T3细胞，每孔6000个接种到96孔板中，置于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养24 h；

2）用培养基将纳米药物FASP， FAYP， FACP，FSSP和游离药物FA稀释到预先设定好的浓度并与细胞共孵育48 h；

3）在避光条件下向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱中继续培养2-4 h后，用酶标仪检测450 nm处的吸光值，计算出各组不同浓度药物作用后各个细胞的存活率；

4）图2表明，纳米药物FASP能够显著提高FA对肿瘤细胞的生长抑制能力，而FSSP，FAYP，FACP则表现出较弱的肿瘤细胞毒性，同时纳米药物在一定程度上降低了FA对正常细胞的毒副作用。

实施例3

（一）对实施例1制备得到的超分子纳米药物和游离药物对Hippo通路关键靶基因的调控进行了荧光定量PCR分析，具体步骤如下：

1）取对数生长期MDA-MB-231细胞，以每孔10万的密度接种于6 cm培养皿中，置于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养24 h；

2）弃去原有培养基并加入含有50 μM的纳米药物及游离药物的新鲜培养基，培养箱中与细胞共孵育作用48 h；

3）PBS洗细胞2次，胰酶消化收集细胞；

4）PBS洗1次，3000 rpm，离心5 min，弃上清；

5）加入1 mL 4℃预冷 Trizol 试剂，室温裂解5 min；

6）加入200 μL氯仿，静置3min；

7）13500 rpm，15 min；

8）取上层RNA溶液并加入等体积异丙醇洗涤；

9）8℃，13500 g，15 min；

10）70%乙醇洗涤RNA，并离心收集RNA沉淀，利用反转录试剂盒得到cDNA;

11）通过实时定量PCR分析不同基因的表达情况。

结果如图3A-D所示，纳米药物FASP和FSSP处理组的YAP基因表达明显降低，且Hippo下游基因CTGF、CYR61、NRP1表达均受到抑制，其他对照纳米药物组对YAP及下游基因表达没有明显影响。由此结果可以证实，FASP可以在三阴性乳腺癌细胞中下调YAP及下游相关基因的表达。

（二）免疫印迹分析超分子纳米药物和游离药物对Hippo通路关键蛋白表达的调控，具体步骤如下：

1）取对数生长期MDA-MB-231细胞，以每孔40万的密度接种于6 cm培养皿中，置于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养24 h；

3）PBS洗细胞3次，加入RIPA裂解液4℃裂解细胞30 min；

4）4℃，12500 rpm离心15 min；

5）定量:BCA定量后，用4*蛋白上样缓冲液稀释至相同蛋白浓度；

6）变性：100℃加热变性10 min；

7）电泳：配制12%聚丙烯酰胺凝胶，80 V -30 min；120 V-90 min；

8）转膜：200 mA, 湿转120 min；

9）封闭：取出转膜完毕的PVDF膜，浸泡在含有5%脱脂奶粉的TBST中，摇床震荡2 h；

10）一抗孵育：收集封闭液，加入由封闭液稀释的一抗，4℃摇床孵育过夜；

11）二抗孵育：收集一抗，用TBST洗PVDF膜3次/10 min，加入由封闭液稀释的二抗溶液，室温孵育1h；

12）显影：收集二抗，用TBST洗PVDF膜3次/10 min；ECL显影液显影并用凝胶成像仪成像。

13）图3E表明，相比于对照材料组FACP，FAYP，FSSP以及游离的FA，超分子纳米药物FASP可以通过促进MST1蛋白激酶表达从而磷酸化YAP，并使得YAP总蛋白含量下降，最终导致Hippo通路下游细胞迁移增殖相关基因AxL的下调。从图3F的p-YAP/YAP的比值可以看出，FASP可以明显提高p-YAP占总体YAP蛋白的水平，使YAP失活。该结果与图3A-D的基因检测结论一致，进一步证实了超分子纳米药物FASP可以激活三阴性乳腺癌中的Hippo通路，并影响下游靶基因的表达。

实施例4

对实施例1制备得到的超分子纳米药物和游离药物在体外抑制细胞照射后克隆形成的能力进行检测，以比较其放疗增敏能力，具体步骤如下：

1）取对数生长期MDA-MB-231细胞，以每孔1000个细胞的密度接种于六孔板中十字摇匀后，置于37℃，5% CO₂恒温培养箱中培养24 h；

2）弃去原有培养基并加入含有20 μM的纳米药物及游离药物的新鲜培养基，培养箱中与细胞共孵育作用12 h；

3）用PBS小心洗涤1次，再加入2 mL新鲜培养基，然后进行0, 2, 4, 6 Gy剂量的γ射线照射；

4）照射后将细胞置于培养箱中继续培养。观察克隆形成情况，当细胞形成肉眼可见的克隆团（每个克隆细胞在50-150个左右）时终止培养；

5）终止培养后，用PBS小心浸洗1次，每孔加入300 μL左右0.25% 结晶紫染液（纯乙醇配制），室温固定染色30 min后，弃去染液，在水中浸洗2次，倒扣于桌面上，晾干后，使用凝胶成像系统对克隆板进行扫描并保存图像（背面朝上），肉眼统计克隆数，使用Graphpadprism、Origin软件分析、绘图、计算SER值；

6）图4A表明，相比于游离FA及对照材料，纳米药物FASP具有更显著的抑制肿瘤细胞克隆团形成的能力。从图4B存活曲线可以看出，在较高剂量（4Gy和6Gy）射线下，纳米药物FASP的放疗增敏能力更为突出。

实施例5

对实施例1制备得到的超分子纳米药物及其对照组和游离药物在体内联合放疗治疗的效果进行评价，具体实验步骤如下：

1）取40只BALB/c裸鼠，每只胸部接种约1×10⁷的MDA-MB-231细胞，待肿瘤体积长至50-100 mm³后，随机分成8组：照射组（IR，IR+FA，IR+FAYP，IR+FASP），非照射组（Control，FA，FAYP，FASP）；

2）根据小鼠体重注射药物剂量，每组荷瘤小鼠尾静脉分别注射 100 μL 含有等物质的量的纳米药物或游离药物：纳米材料（20 mg/kg），FA（2.25 mg/kg）；注射12 h 后，所有照射组均进行肿瘤局部6 Gy剂量的γ射线照射；

3）从治疗前一天开始，每隔一日测量肿瘤大小和小鼠体重，肿瘤体积按照公式：长×宽²/2进行计算并作出各组体积增长变化曲线；

4）肿瘤生长抑制结果（图5A）表明，虽然非照射组的FASP纳米药物本身具有一定的化疗效果，但长期效果并不理想，与放疗联合应用后可将肿瘤抑制率提高至90%左右（图5D），表现出了高效的放化疗联合治疗效果。游离FA和IR+FA处理组小鼠体重下降比较明显（图5B），可能与FA具有一定的全身毒性有关。由存活曲线（图5C）可以看出FASP联合放疗后具有较好的治疗效果，显著提高了三阴性乳腺癌荷瘤小鼠的存活率。图5E的光学肝脏照片及对应的组织切片苏木精-伊红染色结果可以看出FASP可以显著抑制肿瘤肝脏转移。

实施例6

Fmoc-S(FA)FFYSV-SS-PEG （缩写为FASP）结构式如下：

以FASP作为活性成分，加入药学可接收的辅料按常规方法可制成各种规格的液体注射剂。

FASP的给药途径包括多种，如注射给药，腔内给药等。

（1）注射剂的制备：

FASP 200 mg，甘露醇700 mg，PEG₁₀₀₀ 10 mg，蒸馏水100 mL，使pH值为7.0-7.5过滤滤液浓度为3mg/mL，按每瓶2毫升分装，冷冻干燥后即得注射剂。

（2）片剂的制备：

FASP 10 mg ，微晶纤维素35 mg，淀粉 45 mg，聚乙烯吡咯烷酮 4 mg，羧甲基淀粉钠盐4.5 mg，硬脂酸镁 0.5 mg，滑石粉1 mg；将FASP活性成分，淀粉和纤维素过筛，并充分混合，将聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒于50℃干燥，将羧甲基淀粉钠盐，硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。

（3）胶囊的制备

FASP 10 mg，活性成分辅料分别过100目筛，称取处方量的主药和辅料充分混合，加入羟丙甲纤维素溶液适量制软材，过24目筛，制得湿颗粒于50-60 ℃烘箱中干燥约2-3h，将硬脂酸镁和滑石粉与颗粒混合均匀，整粒，测定中间体含量，用2号胶囊灌装。

Claims

1.一种靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物，其特征在于它是将含有双重药物组分的疏水性短肽片段与亲水性聚乙二醇片段通过二硫键共价连接，得到的两亲性化合物能够在水溶液中通过分子间非共价键相互作用自组装形成微观形貌为球形胶束的纳米前药，其化学结构如下：

2.权利要求1所述靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

以Fmoc-Wang-Gly树脂为载体，在定制的合成管里加入10-20 mL DMF使其充分溶胀后切除Fmoc保护基，按照多肽Fmoc固相合成标准方法，先后依次加入Fmoc-PEG、Fmoc-SS以及Fmoc保护的氨基酸，最后加入Fmoc-Ser(FA)-COOH；反应完成后，加入10-20 mL的95%三氟乙酸反应1-2 h从树脂上将多肽衍生物切割，通过反相HPLC分离纯化得到目的产物；其中，所述的Fmoc-Ser(FA)-COOH制备方法如下：

将2 mmol FA和2 mmol Fmoc-Ser-OtBu溶于10-25 mL无水二氯甲烷中，加入3 mmolEDCI和0.3 mmol DMAP室温下搅拌反应24-48 h；旋蒸除去二氯甲烷后，浓缩液通过硅胶层析柱分离得到浅黄色中间产物Fmoc-Ser(FA)-OtBu；在中间产物中加入5-10 mL三氟乙酸，室温搅拌反应1-2 h脱去保护基团，无水乙醚溶解干燥后得到产物Fmoc-Ser(FA)-COOH；

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3.权利要求1所述靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物在制备提高抗肿瘤药物的效果药物方面的应用：其中激活Hippo通路，指的是纳米前药在癌细胞内高表达的谷胱甘肽和酯酶的作用下发生结构转变，原位形成Fmoc-SFFYSV纳米纤维从Hippo通路上游调控MST1激酶的活性，促进YAP磷酸化失活；原位释放的游离小分子药物氟灭酸（FA）则进入细胞核与Hippo通路下游转录因子家族TEAD结合，进而上下游协同作用有效抑制YAP-TEAD相互作用，最终抑制促存活基因的转录表达；其中提高抗肿瘤药物指的是相较于游离小分子药物FA，纳米前药递送系统能够提高FA的溶解性和细胞利用度，并通过YSV的协同作用最终提高其对肿瘤细胞的生长抑制效果。

4.权利要求3所述应用，其中提高抗肿瘤药物的效果药物方面的应用指的是：靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物联合放疗后提高三阴性乳腺癌的存活率。

5.权利要求3所述应用，其中提高抗肿瘤药物的效果药物方面的应用指的是：靶向激活癌细胞内Hippo通路的超分子纳米药物抑制肿瘤肝脏的转移。