CN114755427B - 一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂包括以下组分：第一盐离子、第一稳定剂、第一防腐剂、第一缓冲液、抗凝血酶；且第一试剂的pH值为7.2~7.6；第二试剂包括以下组分：第二盐离子、第二稳定剂、第二防腐剂、第二缓冲液、凝血因子；且第二缓冲液的pH值为7.8~8.2；第三试剂包括以下组分：第三盐离子、第三稳定剂、第三防腐剂、第三缓冲液、发色底物；且第三缓冲液的pH值为7.8~8.2。本发明对低抗凝血酶活性样本的检测更准确，且线性范围宽、试剂稳定性好。

Description

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒

技术领域

本发明涉及医学体外诊断技术领域，尤其涉及一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒。

背景技术

近几十年来，普通肝素（UFH）、低分子肝素（LMWH）、肝素衍生物及直接口服抗凝剂已被批准用于血栓栓塞性疾病的防治。其中，普通肝素和低分子肝素，是目前应用最为广泛的抗凝药物，主要在ICU、心外科、心内科、血液透析、骨科等科室使用。由于肝素具有复杂的药代动力学和药效学特性，导致治疗浓度范围窄和个体差异极大，需要频繁的实验室监测和剂量调整。活化部分凝血活酶时间（APTT）实验是传统监测UFH的方法，虽然该方法简单、快速、便宜，但却难以标准化，各实验室之间的差异会多达4倍，并且其相关临床治疗范围尚不明确。目前，结果可标准化、测量结果稳定，可靠反应治疗范围的抗Xa（凝血因子）活性测定试剂盒成为UFH和LMWH监测的更优选择。肝素的抗凝作用依赖于抗凝血酶（AT）活性，当体内抗凝血酶活性低于50%时，肝素效果明显降低；低于30%时，肝素几乎无法发挥抗凝作用。为了更准确地检测低AT患者体内肝素的含量，需外源性添加抗凝血酶。

市售的大部分外源添加凝血酶抗Xa活性测定试剂盒仍为冻干粉形态，使用前均需要复溶，并且静置一段时间后才能使用，不利于客户的操作。该类抗Xa活性测定试剂盒不附赠复溶剂，客户自行选用的复溶剂质量无法把控，对测试结果带来了一定的影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术中，市售的大部分外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒仍为冻干粉形态，使用前均需要复溶，提供一种液态的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：10~30g第一盐离子、56~130g第一稳定剂、0.1~1g第一防腐剂、含量为50~100mmol的第一缓冲液、含量为3000~5000 IU的抗凝血酶；且第一试剂的pH值为7.2~7.6；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第二盐离子、67~165g第二稳定剂、0.1~1g第二防腐剂、含量为50~100mmol的第二缓冲液、含量为1000~5000 IU的凝血因子；且第二缓冲液的pH值为7.8~8.2；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第三盐离子、46~100g第三稳定剂、0.1~1g第三防腐剂、含量为50~100mmol的第三缓冲液、含量为0.5~1.5mmol的发色底物；且第三缓冲液的pH值为7.8~8.2。

优选地，第一稳定剂包括包括多羟基醇、糖类、表面活性剂和蛋白质；第二稳定剂包括多羟基醇、糖类、氨基酸、表面活性剂和蛋白质；第三稳定剂包括多羟基醇、糖类和表面活性剂。

优选地，第一稳定剂包括甘露醇、蔗糖、PEG-8000、Tween-20和BSA；第二稳定剂包括甘露醇、蔗糖、甘氨酸、PEG-8000、Tween-20和BSA、硫酸葡聚糖；第三稳定剂包括甘露醇、蔗糖、PVP和Tween-20。

优选地，第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子分别为氯化钠、氯化钙、硫酸铵中的一种。

优选地，第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子都为氯化钠。

优选地，第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂分别为叠氮化钠、ProClin 300、ProClin 150中的一种。

优选地，第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂都为叠氮化钠。

优选地，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PBS缓冲液中的一种。

优选地，第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液都为Tris缓冲液。

优选地，抗凝血酶为人源抗凝血酶、猪源抗凝血酶、牛源抗凝血酶中的一种。

优选地，抗凝血酶为人源抗凝血酶。

优选地，凝血因子为牛Xa因子、猪Xa因子、人Xa 因子中的一种。

优选地，凝血因子为牛Xa因子。

优选地，发色底物为s-5288。

本发明的有益效果：

1.本发明提供了一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒（发色底物法），通过外源添加抗凝血酶使其与低抗凝血酶活性患者血浆中的UFH或LMWH充分结合，再使用牛Xa因子及发色底物s-5288检测UFH或LMWH的浓度，解决了先天性抗凝血酶缺乏、新生儿等抗凝血酶活性低患者使用抗Xa活性测定试剂盒检测肝素结果偏低问题，并且填补了国内市场这一试剂盒的空白。

2.本发明试剂盒为全液态试剂，使用方便、成本低廉、线性范围宽、稳定性好。可以实现对进口外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求的同时降低医院购买检测试剂的成本，减少病人的检测费用。

附图说明

图1是参比试剂盒和实施例1测试UFH样本的线性相关性；

图2是参比试剂盒和实施例1测试LMWH样本的线性相关性；

图3是参比试剂盒和实施例2测试UFH样本的线性相关性；

图4是参比试剂盒和实施例2测试LMWH样本的线性相关性；

图5是参比试剂盒和实施例3测试UFH样本的线性相关性；

图6是参比试剂盒和实施例3测试LMWH样本的线性相关性；

图7是参比试剂盒和对比例1测试UFH样本的线性相关性；

图8是参比试剂盒和对比例1测试LMWH样本的线性相关性。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：10~30g第一盐离子、56~130g第一稳定剂、0.1~1g第一防腐剂、含量为50~100mmol的第一缓冲液、含量为3000~5000IU的抗凝血酶；且第一试剂的pH值为7.2~7.6；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第二盐离子、67~165g第二稳定剂、0.1~1g第二防腐剂、含量为50~100mmol的第二缓冲液、含量为1000~5000 IU的凝血因子；且第二缓冲液的pH值为7.8~8.2；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第三盐离子、46~100g第三稳定剂、0.1~1g第三防腐剂、含量为50~100mmol的第三缓冲液、含量为0.5~1.5mmol的发色底物；且第三缓冲液的pH值为7.8~8.2。

第一稳定剂包括包括多羟基醇、糖类、表面活性剂和蛋白质，多羟基醇：糖类：表面活性剂：蛋白质的质量比为：（3.5-6.5）：（1-3）：（0.1-0.5）：（1-3），优选甘露醇、蔗糖、PEG-8000、Tween-20和BSA；第二稳定剂包括多羟基醇、糖类、氨基酸、表面活性剂和蛋白质，多羟基醇：糖类：氨基酸：表面活性剂：蛋白质的质量比为：（3.5-6.5）：（1.1-3.5）：（1-3）：（0.1-0.5）：（1-3），优选甘露醇、蔗糖、甘氨酸、PEG-8000、Tween-20、BSA和硫酸葡聚糖；第三稳定剂包括多羟基醇、糖类和表面活性剂，多羟基醇：糖类：表面活性剂的质量比为：（3-5）：（1-3）：（0.6-2），优选甘露醇、蔗糖、PVP和Tween-20。其中，硫酸葡聚糖在本发明中主要用于中和血浆中血小板释放的游离PF4，降低其干扰，避免血浆肝素测试结果的不准确。

第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子分别为氯化钠、氯化钙、硫酸铵中的一种，本发明优选氯化钠。适当含量的盐离子对反应过程中的OD信号有所提升，可提高试剂的分辨率，因此本发明第一盐离子的含量优选10~30g，第二盐离子和第三盐离子的含量优选5~15g；考虑到成本和最终效果，氯化钠的效果最佳，因此本发明中第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子均优选氯化钠。

第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂分别为叠氮化钠、ProClin 300、ProClin150中的一种，本发明优选叠氮化钠。

第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PBS缓冲液中的一种，本发明优选Tris缓冲液。

抗凝血酶为人源抗凝血酶、猪源抗凝血酶、牛源抗凝血酶中的一种，本发明中优选人源抗凝血酶。

凝血因子为牛Xa因子、猪Xa因子、人Xa因子中的一种，本发明中优选牛Xa因子。

发色底物在本发明中优选s-5288。

本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒通过两步法准确且灵敏地测量血浆中肝素浓度。首先，在外源抗凝血酶存在下待测血浆中的肝素与抗凝血酶结合形成复合物，抑制恒定量的牛Xa因子；然后过量的牛Xa因子水解Xa因子特异性发色底物（s-5288）释放出显色基团对硝基苯胺（pNA），pNA在405nm波长下有最大吸收峰，其显色程度与剩余牛Xa因子的量呈正相关，与血浆样本中肝素的含量呈负相关。在试剂盒中添加抗凝血酶可以解决检测低抗凝血酶活性样本时检测结果偏低的问题，为抗凝血酶活性低患者提供更准确的检测结果。

试剂盒为全液态试剂，从2~8℃冰箱中取出直接使用。本发明试剂盒为全液态试剂，使用方便、成本低廉、线性范围宽、稳定性好。可以实现对进口外源添加抗Xa活性测定试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求的同时降低医院购买检测试剂的成本，减少病人的检测费用。

以下通过具体实施例进行说明：

实施例1

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、10g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10g BSA、含量为3000IU的人抗凝血酶、0.1g叠氮化钠，且第一试剂的pH值为7.2；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、10g甘氨酸、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10g BSA、1g硫酸葡聚糖、0.1g叠氮化钠、含量为1000IU的牛Xa因子，且第二缓冲液的pH值为7.8；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PVP、1mL Tween-20、0.1g叠氮化钠、含量为0.5mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为7.8。

上述的试剂盒中各试剂的制备方法如下：

1、配制浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中加入10g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10g BSA、含量为3000IU的人抗凝血酶和0.1g叠氮化钠，补充Tris缓冲液至1L混合均匀，并调整溶液的pH值为7.2，得到第一试剂。

由于第一缓冲液（Tris缓冲液）的含量远大于其他组分含量，在配制好的第一试剂中，第一缓冲液浓度和含量改变很小，可以认为保持原有浓度和含量。步骤2-3中的第二缓冲液和第三缓冲液与此相同。

2、配制浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中加入5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、10g甘氨酸、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10g BSA、1g硫酸葡聚糖、0.1g叠氮化钠和含量为1000IU的牛Xa因子，补充Tris缓冲液至1L混合均匀，并调整溶液的pH值为7.8，得到第二试剂。

3、配制浓度为50mmol/L的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中加入5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PVP、1mL Tween-20、0.1g叠氮化钠和含量为0.5mmol的发色底物s-5288，补充Tris缓冲液至1L混合均匀，并调整溶液的pH值为7.8，得到第三试剂。

以下实施例的制备与此相同。

实施例2

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、20g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、10g PEG-8000、2.5mL Tween-20、20g BSA、含量为4000IU的猪源抗凝血酶、0.5g ProClin 300，且第一试剂的pH值为7.4；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、10g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、20g甘氨酸、10g PEG-8000、2.5mL Tween-20、20g BSA、3g硫酸葡聚糖、0.5g ProClin 300、含量为3000IU的猪Xa因子，且第二缓冲液的pH值为8.0；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、10g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、10g PVP、2.5mLTween-20、0.5g ProClin 300、含量为1.0mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为8.0。

实施例3

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、30g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、15g PEG-8000、4.5mL Tween-20、30g BSA、含量为5000IU的牛源抗凝血酶、1g ProClin 150，且第一试剂的pH值为7.6；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、15g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、30g甘氨酸、15g PEG-8000、4.5mL Tween-20、30g BSA、5g硫酸葡聚糖、1g ProClin 150、含量为5000IU的人Xa因子，且第二缓冲液的pH值为8.2；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、15g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、15g PVP、4.5mL Tween-20、1g ProClin 150、含量为1.5mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为8.2。

对比例1

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、10g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10g BSA、0.1g叠氮化钠，且第一试剂的pH值为7.2；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、10g甘氨酸、5g PEG-8000、1mL Tween-20、10gBSA、1g硫酸葡聚糖、0.1g叠氮化钠、含量为1000IU的牛Xa因子，且第二缓冲液的pH值为7.8；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为50mmol的Tris缓冲液、5g氯化钠、30g甘露醇、10g蔗糖、5g PVP、1mL Tween-20、0.1g叠氮化钠、含量为0.5mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为7.8。

本实施例是对于实施例1的对比实施例，其区别是第一试剂中不含人抗凝血酶。

对比例2

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、20g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、10g PEG-8000、2.5mL Tween-20、20g BSA、0.5gProClin 300，且第一试剂的pH值为7.4；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、10g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、20g甘氨酸、10g PEG-8000、2.5mL Tween-20、20g BSA、3g硫酸葡聚糖、0.5g ProClin 300、含量为3000IU的猪Xa因子，且第二缓冲液的pH值为8.0；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为75mmol的HEPES缓冲液、10g氯化钙、40g甘露醇、20g蔗糖、10g PVP、2.5mL Tween-20、0.5g ProClin300、含量为1.0mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为8.0。

本实施例是对于实施例2的对比实施例，其区别是第一试剂不含抗凝血酶。

对比例3

一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其为全液态试剂，包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、30g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、15g PEG-8000、4.5mL Tween-20、30g BSA、1gProClin 150，且第一试剂的pH值为7.6；第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、30g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、30g甘氨酸、15g PEG-8000、4.5mLTween-20、30g BSA、5g硫酸葡聚糖、1g ProClin 150、含量为5000IU的牛Xa因子，且第二缓冲液的pH值为8.2；第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：含量为100mmol的PBS缓冲液、30g硫酸铵、50g甘露醇、30g蔗糖、15g PVP、4.5mL Tween-20、1g ProClin 150、含量为1.5mmol的发色底物s-5288，且第三缓冲液的pH值为8.2。

本实施例是对于实施例3的对比实施例，其区别是第一试剂不含抗凝血酶。

性能试验：

对实施例1~3以及对比例1~3的抗Xa活性测定试剂盒进行准确度及临床相关性比较，并对实施例1~3进行线性范围和加速稳定性评价。试验所使用的样本若无特殊说明，均为低抗凝血酶活性样本，即抗凝血酶活性低于50%。

一、准确度测试

试验仪器：全自动凝血分析仪

试验步骤：采用实施例1~3以及对比例1~3的试剂盒定标后分别测定UFH正确度控制品和LMWH正确度控制品的浓度，每个正确度控制品重复测试3次，按照公式（1）和（2）计算相对偏差，测试结果如表1~6所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±10.00%范围内。

公式（1）：

，公式（2）：

；

式中：

——测试结果的平均值；

——每次的实测值；

n——测试的次数；

i——测试的序号；

B——相对偏差；

T——正确度控制品标示值。

表1 实施例1的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

表2 实施例2的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

表3 实施例3的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

表4 对比例1的抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

表5 对比例2的抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

表6 对比例3的抗Xa活性测定试剂盒的准确度测试结果

从表1~6的测试结果发现，实施例1~3的相对偏差均比较低，符合在±10.0%范围内的要求，说明本发明的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒对于低抗凝血酶活性的样本的测定具有很好的准确性；对比例1-3的相对偏差均较高，不符合在±10.0%范围内的要求，使用没有外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒进行测定时，由于样本中抗凝血酶活性低，发生肝素抵抗，导致样本的测定结果与标示值相比偏低，从而导致肝素测试结果不准确。因此，本发明的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒的准确度较高。

二、临床相关性测试

试验仪器：全自动凝血分析仪

试验步骤：采用参比试剂盒和实施例1-3的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒和对比例1同时测试一组覆盖线性范围的临床样本（40例，样本的抗凝血酶活性均在50%以下），以参比试剂盒的实测值为x轴，以实施例1-3或对比例1的试剂盒的实测值为y轴，做线性回归分析，测试结果如表7-10和图1-8所示。测试结果应符合要求：线性回归分析应符合线性回归方程的斜率k在0.9~1.1之间且相关系数r≥0.975。

表7 实施例1的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的临床相关性测试结果

表8 实施例2的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的临床相关性测试结果

表9 实施例3的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的临床相关性测试结果

表10 对比例1的抗Xa活性测定试剂盒的临床相关性测试结果

从表13-16的测试结果发现，本发明的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒与参比试剂盒测试临床样本的结果做线性回归分析，其线性回归方程的斜率k为0.9~1.1且相关系数r≥0.975；而没有外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒与参比试剂盒的线性回归方程中斜率k均小于0.9，不符合相关性要求，测试结果的准确度较低。因此，本发明的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒与参比试剂盒的测试结果具有良好的相关性，对低抗凝血酶活性的肝素浓度测量更为准确。

三、线性范围测试

试验仪器：全自动凝血分析仪

试验步骤：将接近试剂盒线性范围上限的UFH高值样本及LMWH高值样本，分别稀释成5个不同浓度的样本，用本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒对每个浓度的样本测试3次，以样本浓度的理论值为x轴，实测值均值为y轴，求出线性回归方程，计算其相关系数（r），测试结果如表11~13所示。测试结果应符合要求：UFH高值样本的浓度在0.1-1.5IU/mL，LMWH高值样本的浓度在0.1-2.0 IU/mL的线性范围内时，线性相关系数r≥0.990。

表11 实施例1的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的线性范围测试结果

表12 实施例2的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的线性范围测试结果

表13 实施例3的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的线性范围测试结果

从表11~13的测试结果发现，本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒在UFH浓度为0.1-1.5 IU/mL，LMWH浓度为0.1-2.0 IU/mL的线性范围内时，线性相关系数r达0.990以上，线性相关性较好。因此，本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒具有较宽的样本浓度测定的线性范围。

四、加速稳定性测试

试验仪器：全自动凝血分析仪

试验步骤：将实施例1~3的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒中的试剂在未开封状态下置于37℃储存，分别在第0天、第3天、第6天、第7天、第8天进行准确度测试，测定UFH正确度控制品和LMWH正确度控制品的浓度并分别计算相对偏差，测试结果如表14~16所示。测试结果应符合要求：试剂盒中各组分在未开封状态下置于37℃储存可以稳定7天，即相对偏差应在±10%范围内。

表14 实施例1的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果

表15 实施例2的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果

表16 实施例3的外源添加抗凝血酶抗 Xa 活性测定试剂盒的加速稳定性测试结果

从表14~16的测试结果发现，本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒在加速8天内，对样本测定结果的相对偏差均在±10%以内，测定准确度较高。因此，本发明的外源添加抗凝血酶抗Xa活性测定试剂盒在未开封状态下以加速条件可稳定保存7天，其稳定性较好，与现有技术中抗Xa活性测定试剂盒相当。

以上测试结果表明，本发明在测定试剂盒中添加外源抗凝血酶，在进行低抗凝血酶活性样本中肝素浓度的检测时可以获得更准确的结果；本发明的试剂盒为全液态试剂，具有较宽的检测浓度线性范围和较好的稳定性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (13)

1.一种外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒为全液态试剂，其包括第一试剂、第二试剂和第三试剂；

所述第一试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：10~30g第一盐离子、56~130g第一稳定剂、0.1~1g第一防腐剂、含量为50~100mmol的第一缓冲液、含量为3000~5000 IU的抗凝血酶；且所述第一试剂的pH值为7.2~7.6；所述第一稳定剂包括多羟基醇、糖类、第一表面活性剂和蛋白质；多羟基醇：糖类：第一表面活性剂：蛋白质的质量比为：（3.5-6.5）：（1-3）：（0.1-0.5）：（1-3）；所述第一表面活性剂为Tween-20；

所述第二试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第二盐离子、67~165g第二稳定剂、0.1~1g第二防腐剂、含量为50~100mmol的第二缓冲液、含量为1000~5000 IU的凝血因子；且所述第二缓冲液的pH值为7.8~8.2；所述第二稳定剂包括多羟基醇、第二糖类、氨基酸、第二表面活性剂和蛋白质；多羟基醇：第二糖类：氨基酸：第二表面活性剂：蛋白质的质量比为：（3.5-6.5）：（1.1-3.5）：（1-3）：（0.1-0.5）：（1-3）；所述第二表面活性剂为Tween-20；所述第二糖类包括蔗糖和硫酸葡聚糖；

所述第三试剂以其总体积为1L计，包括以下组分：5~15g第三盐离子、46~100g第三稳定剂、0.1~1g第三防腐剂、含量为50~100mmol的第三缓冲液、含量为0.5~1.5mmol的发色底物；且所述第三缓冲液的pH值为7.8~8.2；所述第三稳定剂包括多羟基醇、糖类和第三表面活性剂；多羟基醇：糖类：第三表面活性剂的质量比为：（3-5）：（1-3）：（0.6-2）；所述第三表面活性剂包括Tween-20和PVP。

2.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一稳定剂包括甘露醇、蔗糖、PEG-8000、Tween-20和BSA；所述第二稳定剂包括甘露醇、蔗糖、甘氨酸、PEG-8000、Tween-20、BSA和硫酸葡聚糖；所述第三稳定剂包括甘露醇、蔗糖、PVP和Tween-20。

3.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子分别为氯化钠、氯化钙、硫酸铵中的一种。

4.根据权利要求3所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一盐离子、第二盐离子、第三盐离子都为氯化钠。

5.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂分别为叠氮化钠、ProClin 300、ProClin 150中的一种。

6.根据权利要求5所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一防腐剂、第二防腐剂、第三防腐剂都为叠氮化钠。

7.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液分别为Tris缓冲液、HEPES缓冲液、PBS缓冲液中的一种。

8.根据权利要求7所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液都为Tris缓冲液。

9.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述抗凝血酶为人源抗凝血酶、猪源抗凝血酶、牛源抗凝血酶中的一种。

10.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述抗凝血酶为人源抗凝血酶。

11.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述凝血因子为牛Xa因子、猪Xa因子、人Xa因子中的一种。

12.根据权利要求11所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述凝血因子为牛Xa因子。

13.根据权利要求1所述的外源添加抗凝血酶的抗Xa活性测定试剂盒，其特征在于，所述发色底物为s-5288。

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