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CN114729366A - 靶向CEBP/β的细胞外囊泡-ASO构建体 - Google Patents

靶向CEBP/β的细胞外囊泡-ASO构建体 Download PDF

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CN114729366A
CN114729366A CN202080072036.4A CN202080072036A CN114729366A CN 114729366 A CN114729366 A CN 114729366A CN 202080072036 A CN202080072036 A CN 202080072036A CN 114729366 A CN114729366 A CN 114729366A
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aso
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extracellular vesicle
nucleotides
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CN202080072036.4A
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达利亚·布尔兹因
苏什鲁特·卡默卡尔
亚当·T·布廷
温迪·布鲁姆
斯里拉姆·萨提亚那拉雅南
阿杰伊·维尔马
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Lhasa Sales Co ltd
Original Assignee
Codiak Biosciences Inc
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Abstract

本公开涉及细胞外囊泡，例如外泌体，所述细胞外囊泡包含反义寡核苷酸(ASO)，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/转录物内的核酸序列互补。本文还提供了用于产生所述外泌体的方法和使用所述外泌体治疗和/或预防疾病或病症的方法。

Description

靶向CEBP/β的细胞外囊泡-ASO构建体
通过EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用
与本申请一起提交的以ASCII文本文件(名称：4000_058PC07_Seqlisting_ST25.txt；大小：280,024字节；以及创建日期：2020年8月13日)以电子方式提交的序列表的内容以引用的方式整体并入本文。
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2019年8月14日提交的美国临时申请号62/886,930；2019年9月13日提交的美国临时申请号62/900,136；2019年11月15日提交的美国临时申请号62/936,220；2019年12月5日提交的美国临时申请号62/944,204；2020年3月13日提交的美国临时申请号62/989,540；2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,065；2020年6月5日提交的美国临时申请号63/035,357的优先权，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物内的核酸序列互补。在本公开的某些方面中，所述细胞外囊泡还包含支架蛋白。
背景技术
外泌体是由每个真核细胞天然产生的小的细胞外囊泡。外泌体包含封闭内部空间(即，腔)的膜。作为药物递送载体，EV(例如，外泌体)在许多治疗领域作为新的治疗方式提供相对于传统药物递送方法的许多优点。特别地，外泌体具有固有的低免疫原性，即使在施用于不同物种时也如此。
反义寡核苷酸已成为在体外或体内调控靶基因表达的有力手段。然而，仍然需要提高ASO在体内的稳定性和靶向性。因此，需要新的和更有效的工程化EV(例如，外泌体)，特别是可用于递送可降低与疾病相关的基因(例如，对于癌症N)表达的治疗剂的那些，以更好地实现基于EV的技术的治疗用途和其它应用。
发明内容
本公开的某些方面涉及一种包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡，所述反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13)内的核酸序列互补。在一些方面中，所述ASO不是TGGATTTAAAGGCAGGCGGC(SEQ ID NO:90)。
在一些方面中，所述细胞外囊泡靶向选自由以下组成的组的细胞：巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及它们的任何组合。
在一些方面中，所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸1至518或对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸521至2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。在一些方面中，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/β蛋白表达，其中所述人细胞表达所述CEBP/β蛋白。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/β蛋白表达相比，所述CEBP/β蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面中，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/βmRNA的水平，其中所述人细胞表达所述CEBP/βmRNA。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/βmRNA的水平相比，所述CEBP/βmRNA的水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面中，所述ASO是间隙聚体(gapmer)、混合聚体(mixmer)或全聚体(totalmer)。在一些方面中，所述ASO包含一种或多种核苷类似物。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2'-氨基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA；或双环核苷类似物。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者是糖修饰的核苷。在一些方面中，所述糖修饰的核苷是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括包含双环糖的核苷。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括LNA。
在一些方面中，所述核苷酸类似物中的一者或多者选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'-限制性2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)、氨基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。在一些方面中，所述ASO包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
在一些方面中，所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物的(i)5'非翻译区(UTR)；(ii)编码区；或(iii)3'UTR内的核酸序列互补。在一些方面中，所述连续核苷酸序列与包含(i)SEQ ID NO:13的核苷酸1–600；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸100–600；(iii)SEQID NO:13的核苷酸200–600；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸300–600；(v)SEQ ID NO:13的400–600；(vi)SEQ ID NO:13的核苷酸500–1000；(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸900–1200；(viii)SEQ ID NO:13的核苷酸1000–1300；(ix)SEQ ID NO:13的核苷酸1300–1500；(x)SEQ ID NO:13的489–649；(xi)SEQ ID NO:13的核苷酸594–728；(xii)SEQ ID NO:13的核苷酸765–700；(xiii)SEQ ID NO:13的核苷酸936–1076；(xiv)SEQ ID NO:13的核苷酸999–2068；(xv)SEQID NO:13的1203–1357；(xvi)SEQ ID NO:13的核苷酸1355–1487；(xvii)SEQ ID NO:13的529–609；(xviii)SEQ ID NO:13的核苷酸634–688；(xix)SEQ ID NO:13的核苷酸805-700；(xx)SEQ ID NO:13的核苷酸976–1036；(xxi)SEQ ID NO:13的核苷酸1039–2028；(xxii)SEQID NO:13的1243–1317；或(xxiii)SEQ ID NO:13的核苷酸1395–1447的核酸序列互补。在一些方面中，所述连续核苷酸序列与(i)SEQ ID NO:13的539–599；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸644–678；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸815–690；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸986–1026；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸1049–2018；(vi)SEQ ID NO:13的1253–1307；或(vii)SEQ IDNO:13的核苷酸1405–1437内的核酸序列互补。
在一些方面中，所述连续核苷酸序列包含与选自图1中的序列的序列互补的核苷酸序列。
在一些方面中，所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的核苷酸序列完全互补。在一些方面中，所述ASO包含选自SEQ ID NO:194-296的核苷酸序列，具有一个或两个错配。在一些方面中，所述ASO具有选自由图1中的设计组成的组的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是DNA。在一些方面中，所述ASO的长度是14至20个核苷酸。
在一些方面中，所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。在一些方面中，所述一个或多个经修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在一些方面中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间键联经修饰。在一些方面中，所述ASO中的核苷间键联中的每一者是硫代磷酸酯键联。
在一些方面中，所述细胞外囊泡还包含锚定部分。在一些方面中，所述ASO连接至所述锚定部分。在一些方面中，所述细胞外囊泡还包含外源靶向部分。在一些方面中，所述外源靶向部分包含肽、抗体或其抗原结合片段、化学化合物、RNA适体或它们的任何组合。在一些方面中，所述外源靶向部分包含肽。在一些方面中，所述外源靶向部分包含微蛋白、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、抗运载蛋白、adnectin、适体、肽模拟物分子、受体的天然配体、骆驼科动物纳米抗体或它们的任何组合。
在一些方面中，所述外源靶向部分包含全长抗体、单结构域抗体、仅重链抗体(VHH)、单链抗体、仅鲨鱼重链抗体(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或它们的任何组合。
在一些方面中，所述抗体是单链抗体。
在一些方面中，所述外源靶向部分使外泌体靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或它们的任何组合。在一些方面中，所述外源靶向部分使所述外泌体靶向肿瘤细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、神经元、肝细胞、库普弗细胞、髓系细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞、MDSC(例如，单核细胞性MDSC或粒细胞性MDSC))或它们的任何组合。
在一些方面中，所述EV包含将所述外源靶向部分连接至所述EV的支架部分。在一些方面中，所述锚定部分和/或所述支架部分是支架X。在一些方面中，所述锚定部分和/或所述支架部分是支架Y。
在一些方面中，所述支架X是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。
在一些方面中，所述支架Y是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。
在一些方面中，所述ASO与所述EV的所述外表面上的所述锚定部分和/或所述支架部分连接。在一些方面中，所述ASO与所述EV的所述腔表面上的所述锚定部分和/或所述支架部分连接。在一些方面中，所述锚定部分包含固醇、GM1、脂质、维生素、小分子、肽或它们的组合。在一些方面中，所述锚定部分包含胆固醇。在一些方面中，所述锚定部分包含磷脂、溶血磷脂、脂肪酸、维生素(例如，维生素D和/或维生素E)或它们的任何组合。在一些方面中，所述ASO通过接头与所述锚定部分和/或所述支架部分连接。
在一些方面中，所述ASO通过接头与所述EV连接。在一些方面中，所述接头是多肽。在一些方面中，所述接头是非多肽部分。在一些方面中，所述接头包含乙二醇。在一些方面中，所述接头包含HEG、TEG、PEG或它们的任何组合。
在一些方面中，所述接头包含丙烯酸亚磷酰胺(例如，ACRYDITETM)、腺苷酸化、叠氮化物(NHS酯)、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG、I-LINKERTM、氨基修饰剂(例如，氨基修饰剂C6、氨基修饰剂C12、氨基修饰剂C6 dT或Uni-LinkTM氨基修饰剂)、炔烃、5'己炔基、5-辛二炔基dU、生物素化(例如，生物素、生物素(叠氮化物)、生物素dT、生物素-TEG、双重生物素、PC生物素或脱硫生物素)、硫醇修饰(硫醇修饰剂C3 S-S、二硫醇或硫醇修饰剂C6 S-S)或它们的任何组合。在一些方面中，所述接头是可裂解接头。在一些方面中，所述接头包含缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。在一些方面中，所述接头包含(i)马来酰亚胺部分和(ii)缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯
在一些方面中，所述EV是外泌体。
本公开的某些方面涉及一种反义寡核苷酸(ASO)，所述反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13)内的核酸序列互补。在一些方面中，所述ASO不是TGGATTTAAAGGC AGGCGGC(SEQ ID NO:90)。在一些方面中，所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸1至518或对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEB P/β转录物的核苷酸521至2113内的核酸序列互补。在一些方面中，其所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。在一些方面中，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/β蛋白表达，其中所述人细胞表达所述CEBP/β蛋白。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/β蛋白表达相比，所述CEB P/β蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些方面中，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/βmRNA的水平，其中所述人细胞表达所述CEBP/βmRNA。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/βmRNA的水平相比，所述CEBP/βmRNA的水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
在一些方面中，所述ASO是间隙聚体(gapmer)、混合聚体(mixmer)或全聚体(totalmer)。在一些方面中，所述ASO包含一种或多种核苷类似物。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2'-氨基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA；或双环核苷类似物(LNA)。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者是糖修饰的核苷。在一些方面中，所述糖修饰的核苷是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括包含双环糖的核苷。在一些方面中，所述核苷类似物中的一者或多者包括LNA。在一些方面中，所述LNA选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'-限制性2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)、氨基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。在一些方面中，所述ASO包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
在一些方面中，所述ASO包含SEQ ID NO:194至SEQ ID NO:296中的任一个。在一些方面中，所述ASO具有选自由图1中的设计组成的组的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是DNA。在一些方面中，所述ASO的长度是14至20个核苷酸。
在一些方面中，所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。在一些方面中，所述一个或多个经修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在一些方面中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间键联经修饰。在一些方面中，所述ASO中的核苷间键联中的每一者是硫代磷酸酯键联。
本公开的某些方面涉及一种缀合物，所述缀合物包含与至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分共价连接的本文所述的ASO。在一些方面中，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或它们的任何组合。
本公开的某些方面涉及一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含本文公开的ASO或本文公开的缀合物。
本公开的某些方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO或本文公开的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
在一些方面中，所述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、铵盐或它们的任何组合。在一些方面中，所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。
在一些方面中，所述另外的治疗剂是CEBP/β拮抗剂。在一些方面中，所述CEBP/β拮抗剂是化学化合物、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、蛋白质或它们的任何组合。在一些方面中，所述CEBP/β拮抗剂是抗CEBP/β抗体或其片段。在一些方面中，所述CEBP/β拮抗剂包含反义寡核苷酸(ASO)。
本公开的某些方面涉及一种药盒，所述药盒包括本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物，以及使用说明书。
本公开的某些方面涉及一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物，以及使用说明书。
本公开的某些方面涉及一种抑制或降低细胞中的CEBP/β蛋白表达的方法，所述方法包括向表达CEBP/β蛋白的细胞施用本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物，其中所述细胞中的所述CEBP/β蛋白表达在所述施用后受到抑制或降低。
本公开的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物。
本公开的某些方面涉及本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物在制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药物中的用途。
本公开的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物，其中所述疾病或病症选自纤维化、炎症、神经变性疾病、代谢病症/CVD以及它们的任何组合。
本公开的某些方面涉及本文公开的细胞外囊泡、本文公开的ASO、本文公开的缀合物或本文公开的药物组合物在制造用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自纤维化、炎症、神经变性疾病、代谢病症/CVD以及它们的任何组合。
在一些方面中，在所述施用后，所述ASO抑制或降低所述细胞中CEBP/βmRNA的表达。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的细胞中CEBP/βmRNA的水平相比，在所述施用后，CEBP/βmRNA的水平降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。在一些方面中，与未暴露于所述ASO的细胞中CEBP/β蛋白的表达相比，在所述施用后，CEBP/β蛋白的表达降低至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
在一些方面中，所述细胞外囊泡、所述ASO、所述缀合物或所述药物组合物心内、经口、胃肠外、鞘内、脑室内、经肺、局部或心室内施用。
在一些方面中，所述癌症选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤以及它们的任何组合。
在一些方面中，所述疾病或病症包括纤维化。在一些方面中，所述疾病或病症包括选自由以下组成的组的纤维化：肝纤维化(NASH)、肝硬化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性溃疡性结肠炎/IBD、膀胱纤维化、肾纤维化、CAPS(穆-韦二氏综合征)、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、陈旧性心肌梗死、胶质瘢痕、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩氏病、杜普伊特伦挛缩、瘢痕疙瘩纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾原性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病/系统性硬化症、粘连性关节囊炎以及它们的任何组合。
本公开的某些方面涉及一种活化有需要的受试者中的脑膜巨噬细胞、治疗有需要的受试者的中枢神经系统癌症、诱导有需要的受试者中的脑膜巨噬细胞的M1极化或诱导有需要的受试者中的脑膜巨噬细胞浸润的方法，所述方法包括施用本文所述的细胞外囊泡、本文所述的ASO、本文所述的缀合物或本文所述的药物组合物。
附图说明
图1是列出靶向CEBP/β转录物的各种ASO序列的表。所述表包括以下信息(从左至右)：(i)ASO的描述，(ii)没有任何特定设计或化学结构的ASO序列，(iii)仅针对ASO序列指定的SEQ ID编号，(iv)ASO长度，(v)具有化学结构的ASO序列，和(vi)靶转录物序列(SEQID:13，如所指示)上的目标起始和终止位置。ASO是从5’至3’。化学结构中的符号是如下：Nb表示LNA；dN表示DNA；5MdC表示5-甲基-dC；Nm表示MOE；并且s表示硫代磷酸酯。
图2A-2E是如通过荧光(MFI)检测并针对PBS对照归一化的Cy5水平的图形表示。如所指示，在从血液(图2A)、肝脏(图2B)、脾脏(图2C)和肿瘤(CT26；图2D-2E)分离的各种细胞类型中，Cy5用作包含ASO的外泌体(“Exo ASO”；左)或游离ASO(右)的摄取的标志物。水平线表示平均MFI。
图2F-2K是各自从两只小鼠取得的骨髓组织样品的荧光图像，示出与PBS阴性对照(图2J-2K)相比，包含ASO的外泌体(图2F-2G)或游离ASO(图2H-2I)的摄取。
图2L是在瘤内施用荧光标记的exoASO后，用于定量Cy5标记的肿瘤细胞和巨噬细胞的数量的流式细胞术的结果的图形表示。
图2M是在瘤内施用荧光标记的exoASO后，用于定量Cy5标记的骨髓源性抑制细胞、巨噬细胞和树突细胞的数量的流式细胞术的结果的图形表示。MDSC＝骨髓源性抑制细胞；mMDSC＝单核细胞MDSC；gMDSC＝粒细胞性MDSC；cDC1＝1型常规树突细胞；cDC2＝2型常规树突细胞。
图2N是在跨五个靶标的各种细胞类型中，成胶质细胞瘤(GBM)中PTGFRN同源受体的表达水平的图形表示。
图3A-3B是在用CEBP/β-Exo-ASO、CEBP/β游离ASO或乱序Exo ASO(阴性对照)处理后，极化巨噬细胞中CEBP/β(图3A)和CD163(图3B)的归一化基因表达(％)的图形表示，如所指示(图3A-3B)。
图4A-4N是如所指示，在未处理或用乱序Exo ASO、CEBP/β-Exo-ASO或CEBP/β游离ASO处理的原代人巨噬细胞中，TGFβ1(图4A)、CD163(图4B)、STAT5b(图4C)、STAT6(图4D)、CEBP/β(图4E)、IL12β(图4F)、AIF1(图4G)、MYC(图4H)、HLA DQA(图4I)、CD74(MIF)(图4J)、TNF-α(图4K)、IL12p40(图4L)、IL-10(图4M)、TARC/CCL17(图4N)和CD206(图4O)的表达的图形表示。***＝p<0.001；和****＝P<0.0001。
图5A-5F是用于分离CD11b+细胞的流式细胞术的结果的图形表示。图5A-5C示出处理前(图5A)、在用阴性对照(乱序Exo ASO；图5B)处理后或用Exo-ASO(图5C)处理后的CD45表达。图5D-5F示出处理前(图5D)、在用阴性对照(乱序Exo ASO；图5E)处理后或用Exo-ASO(图5F)处理后的CD11b表达。图5G是在用阴性对照(乱序Exo ASO)处理后或用Exo-ASO处理后，小鼠中肿瘤体积的图形表示。
图6A-6B是在暴露于乱序Exo-ASO(图6A-6B)、CEBP/β游离ASO(图6A)或CEBP/β-Exo-ASO(图6A-6B)后，与非富集细胞相比，在CD11b富集的细胞中CEBP/β(图6A)和ARG1(图6C)的表达的图形表示。
图7A-7V是如所指示，在用乱序Exo ASO或CEBP/β-Exo-ASO处理的CD11b富集的细胞中，STAT6(图7A)、CEBP/β(图7B)、TGFβ1(图7C)、STAT3(图7D)、SIRP-α(图7E)、CD47(图7F)、NOS2(图7G)、ARG1(图7H)、CD206(图7I)、CD274(图7J)、NLRP3(图7K)、CSF1R(图7L)、CD36(图7M)、STAB1(图7N)、IL13(图7O)、PI3KG(图7P)、LY6C(图7Q)、LY6G(图7R)、IFNβ1(图7S)、IFNγ(图7T)、IFNα1(图7U)和IL6Rα(图7V)的表达的图形表示。
图7W是使用nCounter Human Myeloid Innate Immunity Panel v2通过Nanostring进行的CD11b富集的肿瘤相关骨髓细胞中的基因表达的层次聚类的图像。
图8A和8B是如所指示，在用IL-13/TGFβ处理极化、随后用CEBP/βExo ASO、CEBP/β游离ASO或乱序Exo ASO(阴性对照)处理的原代人M2巨噬细胞中CEBP/β(图8A)和TGFβ1(图8B)的归一化基因表达(％)的图形表示。
图9是在向初次接受实验的小鼠或用博莱霉素处理以诱发肺纤维化的小鼠(“bleo”)经鼻施用阴性对照(-C)或Exo-ASO-Cy5(“IN”)后，肺TD2中如通过Cy5水平所证明的外泌体摄取的图形表示。
图10A-10H是荧光原位杂交以检测正常肺组织和诱发的纤维化肺组织的外泌体摄取的图像。
图11A-11H是原位杂交以检测正常肺组织和诱发的纤维化肺组织的外泌体摄取的图像。
图12A-12B是荧光原位杂交以检测Hepa1-6小鼠中肺组织的外泌体摄取的图像。
图13A-13H示出与游离CEBP/βASO、抗PD1抗体和抗CSF1R抗体相比，exoASO-CEBP/β的抗肿瘤活性。图13A示出exoASO-CE BP/β、游离CEBP/βASO、抗PD1抗体和抗CSF1R抗体施用的时间线。图13B示出用exo-ASO-CEBP/β、ASO-CEBP/β、抗PD1抗体或抗CSF1R抗体(每组n＝10)处理的小鼠中的平均肿瘤生长。图13C-13H示出如所指示，用exo-ASO-CEBP/β(图13G)、ASO-CEBP/β(图13H)、PBS阴性对照(图13C)、抗PD1抗体(图13D)、抗CSF1R抗体和exoASO-乱序阴性对照(图13F)处理的小鼠中的个体肿瘤生长。CR＝完全反应者的数量。
图14A示出用exo-ASO-CEBP/β、ASO-CEBP/β、抗PD-1抗体或抗CSF1R抗体处理的小鼠中的平均肿瘤生长。图14B示出exoASO-CEBP/β、游离CEBP/βASO、抗PD-1抗体和抗CSF1R抗体施用的时间线。
图15A-15H示出与游离CEBP/βASO、抗PD-1抗体和抗CSF1R抗体相比，exoASO-CEBP/β的抗肿瘤活性。图15B-15F示出如所指示，用exo-ASO-CEBP/β(图15C)、ASO-CEBP/β(图15D)、PBS阴性对照(图15A)、抗PD-1抗体(图15F)、抗CSF1R抗体(图15E)和exoASO-乱序阴性对照(图15B)处理的小鼠中的个体肿瘤生长。CR＝完全反应者的数量。
图16示出不同处理组的动物在肿瘤植入后的存活百分比。
图17示出不同处理组在再激发后完全反应者(CR)在肿瘤植入后测量的肿瘤体积。
图18A示出Hepa 1-6肿瘤中的CEBP/β和DAPI染色。图18B-18H示出未处理(图18B)和用媒介物对照(图18F)、CEBP/β游离ASO(图18C)、exo-CEBP/βASO(图18D和18G)以及exo-CEBP/βASO加抗PD-1抗体(图18H)处理后，Hepa 1-6肿瘤的肝脏样品。
图19A-19B示出在用抗PD-1抗体(图19A和19B)、exo-ASO乱序加抗PD-1抗体(图19B)、exo-CEBP/βASO(图19A和19B)、exo-CEBP/βASO加抗PD-1抗体(图19B)、CEBP/β游离ASO(图19A和19B)、抗CSF1R(图19A和19B)、媒介物对照(图19B)后和未处理组(图19A)的评分病灶百分比。图19C示出在用抗PD-1抗体、exo-ASO乱序加抗PD-1抗体、exo-CEBP/βASO、exo-CEBP/βASO加抗PD-1抗体、CEBP/β游离ASO和媒介物对照处理后，mCEBP/β的归一化表达。图19D和19E是在用媒介物对照(图19D)或exo-CEBP/βASO(图19E)处理后，肿瘤组织的组织学图像。
图20示出在用抗PD-1、exo-CEBP/βASO、CEBP/β游离ASO、抗CSF1R处理后和未处理组，与评分病灶百分比相比，肝脏重量与体重的比率。
图21A-21L是示出在注射exoASO乱序(图21A-21D)、游离CEBP/βASO(图21E-21H)或exo-CEBP/βASO(图21I-21L)后，促炎性M1标志物TNFα(图21A、21E和21I)、CD11b(图21B、21F和21J)、INOS(图21C、21G和21K)以及F4/80(图21D、21H和21L)的表达的图像。
图22A-22D是可在本文所述的细胞外囊泡上表达的示例性CD47-支架X融合构建体以及靶向CEBP/β转录物的ASO的示意图。图22A示出包含与flag-标记的(1083和1084)或非flag-标记的(1085和1086)全长支架X(1083和1086)或截短的支架X(1084和1085)融合的野生型CD47(具有C15S取代)的细胞外结构域的构建体。图22B示出包含与flag-标记的(1087和1088)或非flag-标记的(1089和1090)全长支架X(1087和1090)或截短的支架X(1088和1089)融合的Velcro-CD47的细胞外结构域的构建体。图22C示出构建体，其中野生型CD47(具有C15S取代；1127和1128)或Velcro-CD47(1129和1130)的第一跨膜结构域被支架X的片段替代，所述片段包含支架X的跨膜结构域和第一细胞外基序。图22D示出包含与flag-标记的(1158和1159)或非flag-标记的(1160和1161)全长支架X(1158和1161)或截短的支架X(1159和1160)融合的最小“自身”肽(GNYTCEVTELTREGETIIELK；SEQ ID NO:628)的各种构建体。
图23示出可在修饰的外泌体表面上表达的示例性小鼠CD47-支架X融合构建体以及靶向CEBP/β转录物的ASO的表达。所述构建体包含与flag-标记的(1923和1925)或非flag-标记的(1924和1922)全长支架X(1923和1922)或截短的支架X(1925和1924)融合的野生型鼠CD47(具有C15S取代)的细胞外结构域。
图24A示出可与靶向CEBP/β转录物的ASO一起表达的使用神经营养蛋白-支架X融合构建体靶向Trk的示例性细胞外囊泡(例如，外泌体)的示意图。神经营养蛋白结合至呈同二聚体形式的Trk受体，并允许EV靶向感觉神经元。
图24B示出示例性细胞外囊泡(例如，外泌体)的示意图，所述细胞外囊泡具有(i)亲神经性以及(ii)在可与(iii)靶向CEBP/β转录物的ASO一起表达的EV的外表面上的抗吞噬信号，例如CD47和/或CD24。
具体实施方式
本公开的某些方面涉及包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物内的核酸序列互补。
I.定义
为了能够更容易地理解本说明书，首先定义某些术语。另外的定义在整个详细描述中阐述。
应注意，术语“一个/种(a或an)”实体是指一个/种或多个/种所述实体；例如，“一个核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/种(a或an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换地使用。
此外，本文使用的“和/或”应被视为具体地公开两个指定特征或组分中的每个与或不与另一个一起存在。因此，如在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独的)和“B”(单独的)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用术语“和/或”旨在包括以下方面的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独的)；B(单独的)；和C(单独的)。
应当理解，本文无论在何处用措辞“包含/包括(comprising)”来描述方面，都还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology，第3版，1999,Academic Press；和the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(Système International de Unites)(SI)认可的形式表示。数值范围包括定义范围的数值。除非另有说明，否则核苷酸序列从左至右以5’至3’方向书写。氨基酸序列从左至右以氨基至羧基的取向书写。本文提供的标题不限制本公开的各种方面，所述方面可通过参考整个说明书得出。因此，通过整体参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
术语“约”在本文中用于意指近似、大致、约或在……左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过使边界延伸高于和低于所述数值来修饰所述范围。一般来说，术语“约”可通过例如向上或向下(升高或降低)10％的变化修饰高于或低于所述值的数值。例如，如果陈述“在施用ASO后，ASO使细胞中CEBP/β蛋白的表达降低至少约60％”，则意味着CEBP/β水平降低50％至70％的范围。
术语“反义寡核苷酸”(ASO)是指通过核苷酸间键联彼此共价连接的核苷(如天然存在的核苷或其修饰形式)的寡聚物或聚合物。可用于本公开的ASO包含至少一种非天然存在的核苷。ASO与靶核酸至少部分互补，使得ASO与靶核酸序列杂交。
术语“核酸”或“核苷酸”意图涵盖多种核酸。在一些方面中，术语“核酸”或“核苷酸”是指靶序列，例如体内或体外的前体mRNA、mRNA或DNA。当所述术语是指靶序列中的核酸或核苷酸时，核酸或核苷酸可以是细胞内天然存在的序列。在其它方面中，“核酸”或“核苷酸”是指本公开的ASO中的序列。当所述术语是指ASO中的序列时，核酸或核苷酸可以是非天然存在的，即化学合成的、酶促产生的、重组产生的或它们的任何组合。在一些方面中，ASO中的核酸或核苷酸是合成或重组产生的，但不是天然存在的序列或其片段。在一些方面中，ASO中的核酸或核苷酸不是天然存在的，因为它们含有至少一种在自然界中非天然存在的核苷类似物。
如本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接基团(键联基团)如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间键联基团的糖苷，并且涵盖两种天然存在的核苷酸如DNA或RNA，以及包含经修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，它们在本文中也称为“核苷酸类似物”。本文中，单个核苷酸可被称为单体或单元。在某些方面中，术语“核苷酸类似物”是指具有经修饰的糖部分的核苷酸。具有经修饰的糖部分的核苷酸(例如，LNA)的非限制性实例在本文别处公开。在其它方面中，术语“核苷酸类似物”是指具有经修饰的核碱基部分的核苷酸。具有经修饰的核碱基部分的核苷酸包括但不限于5-甲基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些方面中，术语“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。将认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是诸如A、T、G、C或U以及其类似物的碱基的序列。
如本文所用的术语“核苷”用于指包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且因此可用于在提及通过ASO的核苷酸之间的核苷酸间键联共价连接的核苷酸单元时使用。在生物技术领域，术语“核苷酸”通常用于指核酸单体或单元。在ASO的上下文中，术语“核苷酸”可指单独的碱基，即包含胞嘧啶(DNA和RNA)、鸟嘌呤(DNA和RNA)、腺嘌呤(DNA和RNA)、胸腺嘧啶(DNA)和尿嘧啶(RNA)的核碱基序列，其中糖主链和核苷酸间键联的存在是隐含的。同样，特别是在一个或多个核苷酸间键联基团经修饰的寡核苷酸的情况下，术语“核苷酸”可指“核苷”。例如，可使用术语“核苷酸”，即使在指定核苷之间的键联的存在或性质时也是如此。
如本文所用的术语“核苷酸长度”是指给定序列中核苷酸(单体)的总数。例如，ASO-CEBP/β-540(SEQ ID NO:194)的序列具有15个核苷酸；因此所述序列的核苷酸长度是15。因此，术语“核苷酸长度”在本文中可与“核苷酸数量”互换使用。
如本领域普通技术人员将认识到的，寡核苷酸的5'末端核苷酸不包含5'核苷酸间键联基团，尽管它可包含5'末端基团。
本文所述的化合物可包含若干不对称中心并且可以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体的混合物形式存在。在一些方面中，不对称中心可以是不对称碳原子。术语“不对称碳原子”是指具有四个不同取代基的碳原子。根据Cahn-Ingold-Prelog公约，不对称碳原子可具有“R”或“S”构型。
如本文所用，术语“双环糖”是指包含4至7元环的经修饰的糖部分，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二个环、从而产生双环结构的桥联。在一些方面中，所述桥联连接核苷的核糖环的C2'和C4'(即，2'-4'桥联)，如在LNA核苷中观察到的。
如本文所用，“编码区”或“编码序列”是多核苷酸中由可翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常未被翻译成氨基酸，它可被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“UTR”)等)并非编码区的一部分。编码区的边界通常通过位于5’末端处编码所得多肽的氨基末端的起始密码子和位于3’末端处编码所得多肽的羧基末端的翻译终止密码子决定。
如本文所用的术语“非编码区”是指不是编码区的核苷酸序列。非编码区的实例包括但不限于启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、非翻译区(“UTR”)、非编码外显子等。一些外显子可以是每种转录物的5'非翻译区(5'UTR)或3'非翻译区(3'UTR)的全部或部分。非翻译区对于转录物的有效翻译以及控制转录物的翻译速率和半衰期是重要的。
当用于核苷酸序列的上下文中时，术语“区域”是指所述序列的一部分。例如，短语“核苷酸序列内的区域”或“核苷酸序列的互补序列内的区域”是指比核苷酸序列短、但比分别位于特定核苷酸序列或所述核苷酸序列的互补序列内的至少10个核苷酸长的序列。术语“子序列(sub-sequence)”或“子序列(subsequence)”也可指核苷酸序列的区域。
当提及核苷酸序列时，术语“下游”是指核酸或核苷酸序列位于参考核苷酸序列的3'。在某些方面中，下游核苷酸序列涉及转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“下游”是指位于参考核苷酸序列5'的核苷酸序列。
如本文所用，术语“调控区”是指位于编码区上游(5'非编码序列)、编码区内或编码区下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译。调控区可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、UTR和茎环结构。如果编码区意图在真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码区的3'。
如本文所用的术语“转录物”可指通过DNA的转录合成并在加工后成为信使RNA(mRNA)(即前体信使RNA(pre-mRNA)和加工的mRNA本身)的初级转录物。术语“转录物”可与“前体mRNA”和“mRNA”互换使用。在DNA链转录成初级转录物后，新合成的初级转录物以多种方式进行修饰，以转化为它们的成熟功能形式，从而产生不同的蛋白质和RNA，如mRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、miRNA等。因此，术语“转录物”可包括外显子、内含子、5'UTR和3'UTR。
如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物，例如RNA或多肽的过程。它包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)和将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸，例如由基因转录产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，所述修饰例如为聚腺苷酸化或剪接；或具有翻译后修饰的多肽，所述修饰例如为甲基化、糖基化、添加脂质、与其它蛋白质亚基缔合或蛋白水解裂解。
在两种或更多种核酸的背景下的术语“同一的”或“同一性”百分比是指当针对最大对应进行比较和比对时(如果必要，引入空位)，两个或更多个序列是相同的或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，而不考虑任何保守性氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的不同算法和软件是本领域已知的。
序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中进行描述的，在Karlin等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中进行修改的并且并入至NBLAST和XBLAST程序(Altschul等人,1991,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)中的算法。在某些方面中，可如Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述而使用空位BLAST。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等人,1996,Methods in Enzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用于比对序列的另外可公开获得的软件程序。在某些方面中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比使用GCG软件包中的GAP程序来确定(例如，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或90的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重)。在某些替代方面中，并入Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的算法的GCG软件包中的GAP程序可用于确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比(例如，使用BLOSUM 62矩阵抑或PAM250矩阵和16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5的长度权重)。或者，在某些方面中，使用Myers和Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))来确定核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。例如，可使用ALIGN程序(2.0版)和使用具有残基表、空位长度罚分12和空位罚分4的PAM120来确定同一性百分比。本领域技术人员可通过特定比对软件确定用于达到最大比对的适当参数。在某些方面中，使用比对软件的默认参数。
在某些方面中，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性百分比“X”计算为100x(Y/Z)，其中Y是在第一序列和第二序列的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数(如通过目视检查或特定序列比对程序所比对)，并且Z是第二序列中的残基总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
与多核苷酸参考序列比对的单个多核苷酸靶序列内的不同区域可各自具有其自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
如本文所用，术语“同源的”和“同源性”可与术语“同一性”和“同一的”互换。
术语“其天然存在的变体”是指CEBP/β多肽序列或CEBP/β核酸序列(例如，转录物)的变体，所述变体天然存在于所定义的分类群中，如哺乳动物，如小鼠、猴和人中。通常，当提及多核苷酸的“天然存在的变体”时，所述术语还可涵盖通过染色体易位或复制在染色体位置1q44的247,416,156-247,449,108(即，GenBank登录号NC_000001.11的核苷酸247,416,156-247,449,108)处发现的编码CEBP/β的基因组DNA以及源自其的RNA如mRNA的任何等位基因变体。“天然存在的变体”还可包括源自CEBP/βmRNA的选择性剪接的变体。当提及特定多肽序列时，例如，所述术语还包括蛋白质的天然存在的形式，其因此可通过例如共翻译或翻译后修饰(如信号肽裂解、蛋白水解裂解、糖基化等)进行加工。
在确定本公开的ASO(或其区域)与编码哺乳动物CEBP/β(例如，CEBP/β基因)的核酸的靶区域(如本文公开的那些)之间的“互补性”程度时，“互补性”(也称为“同源性”或“同一性”)的程度表示为ASO(或其区域)的序列和与其最佳比对的靶区域的序列(或靶区域的反向互补序列)之间的同一性百分比(或同源性百分比)。所述百分比是通过计数两个序列之间同一的比对碱基数、除以ASO中连续单体的总数、并且乘以100而计算的。在这样的比较中，如果存在空位，则优选地，此类空位仅仅是错配，而不是在本公开的ASO与靶区域之间空位内的单体数量不同的区域。
如本文所用的术语“互补”表示与参考序列互补的序列。众所周知，互补性是DNA复制和转录的基本原理，因为它是两个DNA或RNA序列之间共有的性质，因此当它们彼此反平行比对时，序列中每个位置的核苷酸碱基将是互补的，就像照镜子和看到事物的反面一样。因此，例如，5”'ATGC”3'序列的互补序列可书写为3”'TACG”5'或5”'GCAT”3'。如本文所用的术语“反向互补序列”、“反向互补”和“反向互补性”可与术语“互补序列”、“互补”和“互补性”互换。在一些方面中，术语“互补性”是指与CEBP/β转录物内的连续核酸序列100％匹配或互补性(即，完全互补)。在一些方面中，术语“互补”是指与CEBP/β转录物内的连续核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％匹配或互补性。
当提及两个单独的核酸或核苷酸序列时，术语“对应于(corresponding to)”和“对应于(corresponds to)”可用于阐明基于同源性和/或功能性彼此对应或相似的序列区域，尽管具体序列的核苷酸可不同地编号。例如，基因转录物的不同同种型可具有核苷酸序列的相似或保守部分，其编号可基于选择性剪接和/或其它修饰在相应同种型中不同。此外，应认识到，在表征核酸或核苷酸序列(例如，基因转录物以及是否从翻译起始密码子开始对序列进行编号或是否包括5'UTR)时，可采用不同的编号系统。此外，应认识到，基因或基因转录物的不同变体的核酸或核苷酸序列可变化。然而，如本文所用，共享核酸或核苷酸序列同源性和/或功能性的变体区域被视为彼此“对应”。例如，对应于SEQ ID NO:1(“参考序列”)的核苷酸X至Y的CEBP/β转录物的核苷酸序列是指与SEQ ID NO:1的核苷酸X至Y具有同一序列或相似序列的CEBP/β转录物序列(例如，CEBP/β前体mRNA或mRNA)，其中X是起始位点，并且Y是终止位点(如图1所示)。本领域普通技术人员可通过将CEBP/β转录物序列与SEQID NO:1进行比对来鉴定CEBP/β转录物序列中的对应X和Y残基。
术语“对应的核苷酸类似物”和“对应的核苷酸”旨在表示核苷酸类似物和天然存在的核苷酸中的核碱基具有相同的配对或杂交能力。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“对应的核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。
ASO化学的注释如下：β-D-氧基LNA核苷酸由氧基B指定，其中B表示核苷酸碱基，如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(MC)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，并且因此包括氧基A、氧基T、氧基MC、氧基C和氧基G。DNA核苷酸由DNAb指定，其中小写b表示核苷酸碱基，如胸腺嘧啶(T)、尿苷(U)、胞嘧啶(C)、5-甲基胞嘧啶(Mc)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，并且因此包括DNAa、DNAt、DNA和DNAg。C或c前的字母M表示5-甲基胞嘧啶。字母“s”表示硫代磷酸酯核苷酸间键联。
如本文所用的术语“ASO编号(ASO Number)”或“ASO编号(ASO No.)”是指针对具有组分的详细化学结构的核苷酸序列给予的独特编号，所述组分例如核苷(例如，DNA)、核苷类似物(例如，β-D-氧基-LNA)、核碱基(例如，A、T、G、C、U或MC)和主链结构(例如，硫代磷酸酯或磷酸二酯)。例如，ASO-CEBP/β-540可指CEBP/β-540(SEQ ID NO:194)。
除非另有说明，否则“效力”通常表示为以μM、nM或pM计的IC50或EC50值。效力也可用抑制百分比来表示。IC50是治疗性分子的中值抑制浓度。EC50是治疗性分子相对于媒介物或对照(例如，盐水)的中值有效浓度。在功能测定中，IC50是治疗性分子的浓度，所述浓度可使生物反应(例如，mRNA转录或蛋白质表达)降低由治疗性分子实现的生物反应的50％。在功能测定中，EC50是产生50％的生物反应(例如，mRNA转录或蛋白质表达)的治疗性分子的浓度。可通过本领域中已知的任何数量的方式来计算IC50或EC50。
如本文所用，术语“抑制”例如CEBP/β基因转录物和/或CEBP/β蛋白的表达是指ASO降低细胞或组织中的CEBP/β基因转录物和/或CEBP/β蛋白的表达。在一些方面中，术语“抑制”是指对CEBP/β基因转录物或CEBP/β蛋白的完全抑制(100％抑制或不可检测水平)。在其它方面中，术语“抑制”是指对细胞或组织中的CEBP/β基因转录物和/或CEBP/β蛋白表达的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％抑制。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”或“EV”是指包含包封内部空间的膜的细胞来源的囊泡。细胞外囊泡包括直径小于其所源自的细胞的直径的所有膜结合的囊泡(例如，外泌体、纳米囊泡)。在一些方面中，细胞外囊泡的直径在20nm至1000nm的范围内，并且可包含在内部空间(即，腔)内、展示在细胞外囊泡的外表面上和/或跨膜的各种大分子有效载荷。在一些方面中，有效载荷可包括核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、小分子和/或它们的组合。在某些方面中，细胞外囊泡包含支架部分。举例而言并且非限制性地，细胞外囊泡包括凋亡小体、细胞片段、通过直接或间接操纵(例如，通过连续挤出或用碱性溶液进行的处理)而来源于细胞的囊泡、含有小囊的胞器和由活细胞产生(例如，通过直接质膜出芽(plasmamembrane budding)或晚期内体与质膜的融合)的囊泡。细胞外囊泡可源自活的或死的生物体、外植组织或器官、原核或真核细胞和/或培养的细胞。在一些方面中，细胞外囊泡由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
如本文所用，术语“外泌体”是指直径介于20-300nm之间(例如，介于40-200nm之间)的细胞外囊泡。外泌体包含封闭内部空间(即，腔)的膜，并且在一些方面中，可通过直接质膜出芽或通过晚期内体与质膜的融合而从细胞(例如，生产细胞)生产。在某些方面中，外泌体包含支架部分。如下文所描述，外泌体可来源于生产细胞，并且基于其大小、密度、生物化学参数或它们的组合从生产细胞中分离。在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。
如本文所用，术语“纳米囊泡”是指直径介于20-250nm之间(例如，介于30-150nm之间)的细胞外囊泡，并且通过直接或间接操纵由细胞(例如，生产细胞)产生，以使得在无操纵的情况下所述细胞将不产生纳米囊泡。为了产生纳米囊泡而对细胞进行的适当操纵包括但不限于连续挤出、用碱性溶液进行的处理、超声处理或它们的组合。在一些方面中，纳米囊泡的产生可导致生产细胞的破坏。在一些方面中，本文所述的纳米囊泡群体基本上不含通过从质膜直接出芽或晚期内体与质膜融合的方式而来源于细胞的囊泡。在某些方面中，纳米囊泡包含支架部分。纳米囊泡，一旦来源于生产细胞，就可基于其大小、密度、生物化学参数或它们的组合从生产细胞中分离。
如本文所用，术语“表面工程化EV，例如外泌体”(例如，支架X工程化EV，例如外泌体)是指以下EV(例如，外泌体)：EV(例如，外泌体)的膜或表面在其组成方面进行了修饰，以使得工程化EV(例如，外泌体)的表面不同于修饰前EV(例如，外泌体)的表面或天然存在的EV(例如，外泌体)的表面。工程化可在EV(例如，外泌体)的表面上或在EV(例如，外泌体)的膜中进行，以使得EV(例如，外泌体)的表面被改变。例如，膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面进行修饰。可通过化学、物理或生物学方法或通过由先前或同时通过化学、物理或生物学方法进行修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过遗传工程化或通过由先前通过遗传工程化进行修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面中，表面工程化EV(例如，外泌体)包含外源性蛋白质(即，EV(例如，外泌体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源性蛋白质或其片段或变体可暴露于EV(例如，外泌体)的表面，或者可以是暴露于EV(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接)。在其它方面中，表面工程化EV(例如，外泌体)包含天然外泌体蛋白(例如，支架X)或其片段或变体的更高表达(例如，更高数量)，所述蛋白质或其片段或变体可暴露于EV(例如，外泌体)的表面，或者可以是暴露于EV(例如，外泌体)的表面上的部分的锚定点(连接)。
如本文所用，术语“腔工程化外泌体”(例如，支架Y工程化外泌体)是指以下EV(例如，外泌体)：EV(例如，外泌体)的膜或腔在其组成方面进行了修饰，以使得工程化EV(例如，外泌体)的腔不同于修饰前EV(例如，外泌体)的腔或天然存在的EV(例如，外泌体)的腔。工程化可在EV(例如，外泌体)的表面上或在EV(例如，外泌体)的膜中进行，以使得EV(例如，外泌体)的表面被改变。例如，将膜在其蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面进行修饰，以使得EV(例如，外泌体)的腔得到修饰。可通过化学、物理或生物学方法或通过由先前通过化学、物理或生物学方法进行修饰的细胞产生来改变组成。具体地，可通过遗传工程化或通过由先前通过遗传工程化进行修饰的细胞产生来改变组成。在一些方面中，腔工程化外泌体包含外源性蛋白质(即，EV(例如，外泌体)不天然表达的蛋白质)或其片段或变体，所述外源性蛋白质或其片段或变体可暴露于EV(例如，外泌体)的腔中，或者可以是暴露于EV(例如，外泌体)的内层上的部分的锚定点(连接)。在其它方面中，腔工程化EV(例如，外泌体)包含天然外泌体蛋白(例如，支架X或支架Y)或其片段或变体的更高表达，所述蛋白质或其片段或变体可暴露于外泌体的腔，或者可以是暴露于外泌体的腔中的部分的锚定点(连接)。
术语“经修饰的”当在本文所述的EV(例如，外泌体)的背景中使用时，是指EV(例如外泌体和/或其生产细胞)的改变或工程化，以使得经修饰的EV(例如，外泌体)不同于天然存在的EV(例如，外泌体)。在一些方面中，本文所述的经修饰的EV(例如，外泌体)包含与天然存在的EV(例如，外泌体)的膜相比在蛋白质、脂质、小分子、碳水化合物等的组成方面不同的膜(例如，膜包含更高密度或数量的天然外泌体蛋白和/或膜包含在外泌体中非天然存在的蛋白质(例如，ASO))。，在某些方面中，对膜的此类修饰改变EV(例如，外泌体)(例如，本文所述的表面工程化EV，例如外泌体)的外表面。在某些方面中，对膜的此类修饰改变EV(例如，外泌体)(例如，本文所述的腔工程化EV，例如外泌体)的腔。
如本文所用，术语“支架部分”是指可用于将目标载荷或任何其它化合物(例如，ASO)在EV(例如，外泌体)的腔表面上或外表面上锚定至EV(例如，外泌体)的分子。在某些方面中，支架部分包含合成分子。在一些方面中，支架部分包含非多肽部分。在其它方面中，支架部分包含天然存在于EV(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面中，支架部分包含不天然存在于EV(例如，外泌体)中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在某些方面中，支架部分是支架X。在一些方面中，支架部分是支架Y。在另外的方面中，支架部分包括支架X和支架Y两者。可用于本公开的其它支架部分的非限制性实例包括：氨基肽酶N(CD13)；脑啡肽酶，AKA膜金属内肽酶(MME)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)；神经纤毛蛋白-1(NRP1)；CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素、LAMP2和LAMP2B。
如本文所用，术语“支架X”是指最近在外泌体的表面上鉴定的外泌体蛋白。参见例如，美国专利号10,195,290，其以引用的方式整体并入本文。支架X蛋白的非限制性实例包括：前列腺素F2受体负调控因子(“PTGFRN蛋白”)；basigin(“BSG蛋白”)；免疫球蛋白超家族成员2(“IGSF2蛋白”)；免疫球蛋白超家族成员3(“IGSF3蛋白”)；免疫球蛋白超家族成员8(“IGSF8蛋白”)；整联蛋白β-1(“ITGB1蛋白”)；整联蛋白α-4(“ITGA4蛋白”)；4F2细胞表面抗原重链(“SLC3A2蛋白”)；一类ATP转运蛋白(“ATP1A1蛋白”、“ATP1A2蛋白”、“ATP1A3蛋白”、“ATP1A4蛋白”、“ATP1B3蛋白”、“ATP2B1蛋白”、“ATP2B2蛋白”、“ATP2B3蛋白”、“ATP2B蛋白”)；以及它们的功能片段。在一些方面中，支架X蛋白可以是完整蛋白质或其片段(例如，功能片段，例如，能够将另一部分锚定在EV(例如，外泌体)的外表面上或腔表面上的最小片段)。在一些方面中，支架X可将部分(例如，ASO)锚定至外泌体的外表面或腔表面。
如本文所用，术语“支架Y”是指在外泌体的腔内新鉴定的外泌体蛋白。参见例如，国际公布号WO/2019/099942，其以引用的方式整体并入本文。支架Y蛋白的非限制性实例包括：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物(“MARCKS蛋白”)；富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(“MARCKSL1蛋白”)；和脑酸溶性蛋白1(“BASP1”)。在一些方面中，支架Y蛋白可以是完整蛋白质或其片段(例如，功能片段，例如，能够将部分锚定至外泌体的腔表面的最小片段)。在一些方面中，支架Y可将部分(例如，ASO)锚定至EV(例如，外泌体)的腔表面。在一些方面中，支架Y可将部分(例如，ASO)锚定至EV(例如，外泌体)的外表面。
如本文所用，术语蛋白质(例如，治疗性蛋白质、支架X或支架Y)的“片段”是指蛋白质的氨基酸序列，所述氨基酸序列比天然存在的序列短，与天然存在的蛋白质相比，蛋白质的N和/或C末端缺失或任何部分缺失。如本文所用，术语“功能片段”是指保留蛋白质功能的蛋白质片段。因此，在一些方面中，支架X蛋白的功能片段保留将部分锚定在EV(例如，外泌体)的腔表面上或外表面上的能力。类似地，在某些方面中，支架Y蛋白的功能片段保留将部分锚定在EV(例如，外泌体)的腔表面或外表面上的能力。片段是否是功能片段可通过任何本领域已知的测定EV(例如，外泌体)的蛋白质含量的方法来评估，所述方法包括蛋白质印迹、FACS分析和片段与自发荧光蛋白(如例如GFP)的融合。在某些方面中，支架X蛋白的功能片段保留天然存在的支架X蛋白的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的能力，例如锚定部分的能力。在一些方面中，支架Y蛋白的功能片段保留天然存在的支架Y蛋白的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％的能力，例如锚定另一分子的能力。
如本文所用，术语分子(例如，功能性分子、抗原、支架X和/或支架Y)的“变体”是指通过本领域已知的方法进行比较后与另一分子共有某些结构和功能属性的分子。例如，蛋白质的变体可包括另一蛋白质中的取代、插入、缺失、移码或重排。
在一些方面中，支架X的变体包括与全长、成熟PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白或PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2或ATP转运蛋白的片段(例如，功能片段)具有至少约70％同一性的变体。在一些方面中，PTGFRN的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:301的PTGFRN或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，BSG的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:303的BSG或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，IGSF2的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:308的IGSF2或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，IGSF3的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:309的IGSF3或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，IGSF8的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:304的IGSF8或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ITGB1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:305的ITGB1或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ITGA4的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:306的ITGA4或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，SLC3A2的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:307的SLC3A2或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP1A1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:310的ATP1A1或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP1A2的变体或片段的变体与根据SEQ IDNO:311的ATP1A2或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP1A3的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:312的ATP1A3或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP1A4的变体或片段的变体与根据SEQ IDNO:313的ATP1A4或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP1B3的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:314的ATP1B3或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP2B1的变体或片段的变体与根据SEQ IDNO:315的ATP2B1或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP2B2的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:316的ATP2B2或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP2B3的变体或片段的变体与根据SEQ IDNO:317的ATP2B3或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，ATP2B4的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:318的ATP2B4或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，本文公开的支架X蛋白的变体或片段的变体保留特异性地靶向EV(例如，外泌体)的能力。在一些方面中，支架X包含一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
在一些方面中，支架Y的变体包括与MARCKS、MARCKSL1、BASP1或MARCKS、MARCKSL1或BASP1的片段具有至少70％同一性的变体。在一些方面中，MARCKS的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:401的MARCKS或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，MARCKSL 1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:402的MARCKSL 1或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，BASP1的变体或片段的变体与根据SEQ ID NO:403的BASP1或其功能片段共有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性。在一些方面中，支架Y蛋白的变体或片段的变体保留特异性地靶向EV(例如，外泌体)的腔表面的能力。在一些方面中，支架Y包含一个或多个突变，例如保守氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自同一侧链家族的另一种氨基酸替代，则所述取代被认为是保守的。在另一个方面中，氨基酸串可被在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构相似的串保守地替代。
术语两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列两者中呈现相同核苷酸或氨基酸的任何位置。呈现在靶序列中的空位未计数，因为空位并非核苷酸或氨基酸。同样地，呈现在参考序列中的空位未计数，因为对靶序列核苷酸或氨基酸进行计数，而不对来自参考序列的核苷酸或氨基酸进行计数。
序列同一性百分比通过以下方式计算：确定两个序列中出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间的序列同一性百分比的确定可使用供在线使用和供下载的易于获得的软件完成。合适的软件程序可从各种来源获得，并且用于蛋白质和核苷酸序列的比对。用于确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国家生物技术信息中心BLAST网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)在www.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。序列比对可来源于多重序列比对。产生多重序列比对的一种合适的程序是可从www.CLUSTAL.org获得的ClustalW2。另一种合适的程序是可从www.drive5.com/muscle/获得的MUSCLE。ClustalW2和MUSCLE可替代地例如从EBI获得。
还应理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据整合而产生。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org获得且可替代地可例如从EBI获得的T-Coffee。还应理解，用于计算百分比序列同一性的最终比对可自动地或人工地加以验证。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中含有改变。在一个方面中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码多肽的性质或活性的改变。在另一个方面中，由于遗传密码的简并性，通过沉默取代产生核苷酸变体。在其它方面中，其中以任何组合取代、缺失或添加5-10个、1-5个或1-2个氨基酸的变体。可出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，为了优化用于特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为其它密码子，例如，细菌宿主诸如大肠杆菌)。
天然存在的变体被称为“等位基因变体”，并且是指占据生物体的染色体上的给定基因座的基因的若干替代形式之一(Genes II,Lewin,B.编辑,John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平上变化，并且包括在本公开中。或者，非天然存在的变体可通过诱变技术或直接合成产生。
使用蛋白质工程化和重组DNA技术的已知方法，可产生变体以改进或改变多肽的特征。例如，可从分泌蛋白质的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸，而基本上不损失生物功能。Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(以引用的方式整体并入本文)报告了即使在缺失3个、8个或27个氨基末端氨基酸残基之后仍具有肝素结合活性的变体KGF蛋白。类似地，干扰素γ在从这种蛋白至的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基后表现出高达10倍的活性。(Dobeli等人，J.Biotechnology 7:199-216(1988)，以引用的方式整体并入本文)。
此外，大量的证据表明，变体通常保留与天然存在的蛋白质相似的生物活性。例如，Gayle和同事(J.Biol.Chem 268:22105-22111(1993)，以引用的方式整体并入本文)对人细胞因子IL-1a进行了广泛的突变分析。他们利用随机诱变生成了3,500多种单独的IL-1a突变体，在分子的整个长度上每种变体具有平均2.5个氨基酸变化。在每个可能的氨基酸位置都检查到多重突变。研究人员发现，“[大多数]分子可被改变，而对[结合或生物活性]几乎没有影响。”(参见摘要)。事实上，在所检查的3,500多个核苷酸序列中，只有23个独特的氨基酸序列产生了与野生型活性显著不同的蛋白质。
如上所述，多肽变体包括例如经修饰的多肽。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(Mei等人,Blood 116:270-79(2010)，其以引用的方式整体并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质中添加氨基酸，诸如精氨酰化和遍在蛋白化。在一些方面中，可在任何方便的位置修饰支架X和/或支架Y。
如本文所用，术语“与……连接”或“与……缀合”可互换使用，并且是指第一部分与第二部分(例如，分别为支架X和ASO，例如，在细胞外囊泡中或细胞外囊泡上表达的支架部分和ASO，例如，分别在细胞外囊泡的腔表面中或外表面上表达的支架X(例如，PTGFRN蛋白))之间形成的共价键或非共价键。
术语“包封的”，或所述术语的语法上不同的形式(例如，包封(encapsulation)或包封(encapsulating))是指在第二部分(例如，EV，例如外泌体)内具有第一部分(例如，ASO)而两个部分没有化学或物理地连接的状态或过程。在一些方面中，术语“包封的”可与“在……的腔中”互换使用。在本文别处公开了将第一部分(例如，ASO)包封到第二部分(例如，EV，例如外泌体)中的非限制性实例。
如本文所用，术语“生产细胞”是指用于产生EV(例如，外泌体)的细胞。生产细胞可以是体外培养的细胞，或者是体内细胞。生产细胞包括但不限于已知可有效产生EV(例如，外泌体)的细胞，例如，HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、间充质干细胞(MSC)、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、AGE.
Figure BDA0003596121310000381
神经元前体细胞、
Figure BDA0003596121310000382
羊水细胞、脂肪间充质干细胞、RPTEC/TERT1细胞。在某些方面中，生产细胞不是抗原呈递细胞。在一些方面中，生产细胞不是树突细胞、B细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞或它们的任何组合。在一些方面中，可用于本公开中的EV(例如，外泌体)不在暴露于EV(例如，外泌体)的表面上的MHC I类或II类分子上携带抗原，而是可通过连接至支架X和/或支架Y而在EV(例如，外泌体)的腔中或在EV(例如，外泌体)的表面上携带抗原。
如本文所用，术语“分离(isolate)”、“分离的(isolated)”和“分离(isolating)”或“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”和“纯化(purifying)”以及“提取的(extracted)”和“提取(extracting)”可互换使用，并且是指已进行一个或多个纯化过程(例如，所需EV制剂的选择或富集)的所需EV的制剂状态(例如，多个已知或未知的量和/或浓度)。在一些方面中，如本文所用的分离或纯化是从含有生产细胞的样品中除去、部分除去(例如，一部分)EV的过程。在一些方面中，分离的EV组合物没有可检测的不希望的活性，或者可替代地，不希望的活性的水平或量处于或低于可接受的水平或量。在其它方面中，分离的EV组合物的所需EV的量和/或浓度处于或高于可接受的量和/或浓度。在其它方面中，与从其中获得组合物的起始材料(例如，生产细胞制剂)相比，分离的EV组合物得到富集。这种富集可以是与起始材料相比，富集至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％、至少约99.99％、至少约99.999％、至少约99.9999％或大于99.9999％。在一些方面中，分离的EV制剂基本上不含残留生物产物。在一些方面中，分离的EV制剂100％不含、99％不含、98％不含、97％不含、96％不含、95％不含、94％不含、93％不含、92％不含、91％不含或90％不含任何污染性生物物质。残留生物产物可包括非生物物质(包括化学物质)或不想要的核酸、蛋白质、脂质或代谢物。基本上不含残留生物产物也可意味着EV组合物不含可检测的生产细胞，并且仅EV是可检测的。
如本文所用，术语“有效载荷”是指作用于与EV接触的靶标(例如，靶细胞)的剂。可包含在EV(例如，外泌体)上的有效载荷的非限制性实例是ASO。可引入到EV(例如，外泌体)和/或生产细胞中的有效载荷包括治疗剂，诸如核苷酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏转录的核苷酸)、核酸(例如，编码诸如酶的多肽的DNA或mRNA分子，或具有调控功能的RNA分子诸如miRNA、dsDNA、lncRNA和siRNA)、氨基酸(例如，包含可检测部分或毒素或破坏翻译的氨基酸)、多肽(例如，酶)、脂质、碳水化合物和小分子(例如，小分子药物和毒素)。在某些方面中，有效载荷包含ASO。如本文所用，术语“抗体”涵盖免疫球蛋白(无论是天然产生的还是部分或完全合成产生的)及其片段。所述术语还覆盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括多肽，所述多肽包含来自免疫球蛋白基因或其片段的特异性结合和识别抗原的框架区。如本文所用，术语“抗原”是指当引入受试者时引发针对自身的免疫反应(细胞或体液)的任何剂。术语抗体的使用意在包括完全抗体、多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合单克隆抗体、小鼠-人单克隆抗体、小鼠-灵长类动物单克隆抗体、灵长类动物-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段(诸如，例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(abl)2、Fv、dAb和Fd片段)、双功能抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性或功能即可。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。本文描述的组合物和方法适用于人的疗法和兽医应用。在一些方面中，受试者是哺乳动物，并且在其它方面中，受试者是人。如本文所用，“哺乳动物受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人、家畜(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(例如，猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等)。
术语“药物组合物”是指处于允许活性成分的生物活性有效的形式并且不含对将向其施用所述组合的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。这种组合物可以是无菌的。
如本文所用，术语“基本上不含”意指包含EV(例如，外泌体)的样品包含按质量/体积(m/v)百分比浓度计少于10％的大分子。一些级分可含有少于0.001％、少于0.01％、少于0.05％、少于0.1％、少于0.2％、少于0.3％、少于0.4％、少于0.5％、少于0.6％、少于0.7％、少于0.8％、少于0.9％、少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于6％、少于7％、少于8％、少于9％或少于10％(m/v)的大分子。
如本文所用，术语“大分子”意指核酸、污染物蛋白质、脂质、碳水化合物、代谢物或它们的组合。
如本文所用，术语“常规外泌体蛋白”意指先前已知富集于外泌体中的蛋白质，所述蛋白质包括但不限于CD9、CD63、CD81、PDGFR、GPI锚蛋白、乳凝集素(MFGE8)、LAMP2和LAMP2B、它们的片段、或与它们结合的肽。
如本文所用的“施用”意指通过药学上可接受的途径向受试者给予本文公开的包含EV(例如，外泌体)的组合物。施用途径可以是静脉内途径，例如静脉内注射和静脉内输注。另外的施用途径包括例如皮下、肌内、经口、经鼻和经肺施用。EV(例如，外泌体)可作为包含至少一种赋形剂的药物组合物的一部分施用。
如本文所公开的例如ASO或细胞外囊泡的“有效量”是足以执行明确说明的目的的量。关于所阐述的目的，可根据经验并且以常规方式确定“有效量”。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指例如疾病或疾患的严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。所述术语还包括疾病或疾患或其症状的防治或预防。在一个方面中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括在有需要的受试者中诱导造血。在一些方面中，疾病或疾患与造血或其缺陷相关。在某些方面中，疾病或疾患是癌症。在一些方面中，治疗增强患有癌症的受试者的造血，其中增强的造血包括受试者中一种或多种免疫细胞的增殖和/或分化增加。
如本文所用，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指减少或降低特定结果的发生或严重程度。在一些方面中，通过防治性治疗来实现预防结果。在一些方面中，将本文所述的包含ASO的EV(例如，外泌体)防治性地施用于受试者。在一些方面中，受试者处于发展癌症的风险中。在一些方面中，受试者处于发展造血系统病症的风险中。
II.反义寡核苷酸(ASO)
本公开采用反义寡核苷酸(ASO)用于调节编码哺乳动物CEBP/β的核酸分子(如CEBP/β核酸，例如CEBP/β转录物，包括CEBP/β前体mRNA和CEBP/βmRNA)或编码哺乳动物CEBP/β的此类核酸分子的天然变体的功能。在本公开的上下文中，术语“ASO”是指由两个或更多个核苷酸的共价键联形成的分子(即，寡核苷酸)。
ASO包含长度为约10至约30，如10-20、14-20、16-20或15-25个核苷酸的连续核苷酸序列。在某些方面中，ASO的长度是20个核苷酸。在某些方面中，ASO的长度是18个核苷酸。在某些方面中，ASO的长度是19个核苷酸。在某些方面中，ASO的长度是17个核苷酸。在某些方面中，ASO的长度是16个核苷酸。在某些方面中，ASO的长度是15个核苷酸。如本文所用，术语“反义ASO”、“反义寡核苷酸”和“寡聚物”可与术语“ASO”互换。可用于本公开的ASO不是天然存在的，并且不能在自然界中找到。在一些方面中，ASO经化学修饰。
对SEQ ID编号的引用包括特定核碱基序列，但不包括任何设计或完整的化学结构。此外，本文图中公开的ASO示出代表性设计，但不限于图中所示的具体设计，除非另有说明。例如，当权利要求书(或本说明书)提及SEQ ID NO:101时，它仅包含SEQ ID NO:101的核苷酸序列。本文公开的任何ASO的设计可书写为SEQ ID NO:XX，其中从5'端起的第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸、第一核苷酸、第二核苷酸和第N核苷酸中的每一者都是经修饰的核苷酸，例如LNA，并且其它核苷酸中的每一者是未修饰的核苷酸(例如，DNA)。
在各个方面中，本公开的ASO不包含RNA(单元)。在一些方面中，ASO包含一个或多个DNA单元。在一个方面中，根据本公开的ASO是线性分子或被合成为线性分子。在一些方面中，ASO是单链分子，并且不包含例如至少3、4或5个连续核苷酸的短区域，所述短区域与同一ASO内的等效区域(即双链体)互补-在此方面，ASO(基本上)不是双链的。在一些方面中，ASO基本上不是双链的。在一些方面中，ASO不是siRNA。在各个方面中，本公开的ASO可完全由连续核苷酸区域组成。因此，在一些方面中，ASO基本上不是自身互补的。
在其它方面中，本公开包括ASO的片段。例如，本公开包括本文公开的ASO的至少一个核苷酸、至少两个连续核苷酸、至少三个连续核苷酸、至少四个连续核苷酸、至少五个连续核苷酸、至少六个连续核苷酸、至少七个连续核苷酸、至少八个连续核苷酸或至少九个连续核苷酸。本文公开的任何序列的片段被考虑为本公开的一部分。
在一些方面中，用于本公开的ASO包括二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)或肽缀合的二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PPMO)。
II.A.靶标
合适地，本公开的ASO能够下调(例如，降低或除去)CEBP/βmRNA或CEBP/β蛋白的表达。在此方面，本发明的ASO可促进M2巨噬细胞的分化和/或减少M1巨噬细胞的分化。特别地，本公开涉及靶向CEBP/β前体mRNA的一个或多个区域(例如，内含子区域、外显子区域和/或外显子-内含子接合点区域)的ASO。
除非另有说明，否则如本文所用的术语“CEBP/β”可指来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的CEBP/β。
CEBP/β(CEBP/β)也称为CCAAT/增强子结合蛋白β。CEBP/β/CEBP/β的同义词是已知的，并且包括C/EBPβ；·肝脏活化因子蛋白；LAP；肝脏富集的抑制蛋白；LIP；核因子NF-IL6；转录因子5；TCF-5；CEBPB；CEBPb；CEBPβ；CEBP/B；和TCF5。人CEBP/β基因的序列可在可公开获得的GenBank登录号NC_000020.11(50190583..50192690)下找到。人CEBP/β基因可见于染色体位置20q13.13的50190583-50192690。
人CEBP/β前体mRNA转录物的序列(SEQ ID NO:11)对应于染色体20q13.13的残基50190583-50192690的反向互补序列。CEBP/βmRNA序列(GenBank登录号NM_001285878.1)提供于SEQ ID NO:13(表1)中，除了SEQ ID NO:13中的核苷酸“t”在mRNA中显示为“u”。人CEBP/β蛋白的序列可在可公开获得的登录号：P17676(规范序列，SEQ ID NO:12)、P17676-2(SEQ ID NO:14)和P17676-3(SEQ ID NO:15)下找到，其各自以引用的方式整体并入本文。
表1.CEBP/βmRNA和蛋白序列
Figure BDA0003596121310000441
Figure BDA0003596121310000451
人CEBP/β基因产物的天然变体是已知的。例如，人CEBP/β蛋白的天然变体可含有选自以下的一个或多个氨基酸取代：A241P、A253G、G195S和它们的任何组合。由选择性剪接产生的人CEBP/β蛋白的另外变体也是本领域已知的。CEBP/β同种型2(UniProt的标识符：P17676-2)与规范序列(SEQ ID NO:13)的不同之处如下：相对于SEQ ID NO:13的残基1-23的缺失。CEBP/β同种型3(标识符：P17676-3)的序列与规范序列(SEQ ID NO:13)的不同之处如下：相对于SEQ ID NO:13的残基1-198的缺失。因此，本公开的ASO可被设计为降低或抑制所述蛋白的天然变体的表达。
ASO的靶核酸序列的一个实例是CEBP/β前体mRNA。SEQ ID NO:11表示人CEBP/β基因组序列(即，染色体20q13.13的核苷酸50190583-50192690的反向互补序列)。SEQ ID NO:11与CEBP/β前体mRNA序列同一，除了SEQ ID NO:11中的核苷酸“t”在前体mRNA中显示为“u”。在某些方面中，“靶核酸”包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的内含子。在其它方面中，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子区域。在其它方面中，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体以及源自其的RNA核酸(例如，前体mRNA)的外显子-内含子接合点。在一些方面中，例如当用于研究或诊断时，“靶核酸”可以是源自上述DNA或RNA核酸靶标的cDNA或合成寡核苷酸。由CEBP/β前体mRNA编码的人CEBP/β蛋白序列显示为SEQ ID NO:13。在其它方面中，靶核酸包含编码CEBP/β蛋白的核酸或其天然存在的变体的非翻译区，例如5'UTR、3'UTR或两者。
在一些方面中，本公开的ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:11)的内含子内的区域杂交。在某些方面中，本公开的ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:11)的外显子内的区域杂交。在其它方面中，本公开的ASO与CEBP/β转录物(例如，SEQ ID NO:11)的外显子-内含子接合点内的区域杂交。在一些方面中，本公开的ASO与CEBP/β转录物(例如，内含子、外显子或外显子-内含子接合点)，例如SEQ ID NO:11内的区域杂交，其中ASO具有根据下式的设计：如本文别处所述的5'A-B-C 3'。
在一些方面中，ASO靶向编码CEBP/β蛋白的特定同种型(例如，同种型1)的mRNA。在一些方面中，ASO靶向CEBP/β蛋白的所有同种型。在其它方面中，ASO靶向CEBP/β蛋白的两种同种型(例如，同种型1和同种型2、同种型1和同种型3、或同种型2和同种型3)。
在一些方面中，ASO包含与CEBP/β转录物内的核酸序列(例如对应于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的区域)互补的连续核苷酸序列(例如，长度为10至30个核苷酸，例如，长度为20个核苷酸)。在一些方面中，ASO包含与CEBP/β转录物的核酸序列或所述序列内的区域(“靶区域”)杂交的连续核苷酸序列，其中所述核酸序列对应于(i)SEQ ID NO:13的核苷酸1–600；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸100–600；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸200–600；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸300–600；(v)SEQ ID NO:13的400–600；(vi)SEQ ID NO:13的核苷酸500–1000；(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸900–1200；(viii)SEQ ID NO:13的核苷酸1000–1300；(ix)SEQ ID NO:13的核苷酸1300–1500，并且其中，任选地，所述ASO具有本文所述的设计中的一者或本文别处所示的化学结构。
在一些方面中，ASO包含与CEBP/β转录物的核酸序列或所述序列内的区域(“靶区域”)杂交的连续核苷酸序列，其中所述核酸序列对应于(i)SEQ ID NO:13的439–699；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸544–778；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸715–750；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸886–1126；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸949–2118；或(vi)SEQ ID NO:13的1153–1407，并且其中，任选地，所述ASO具有本文所述的设计中的一者或本文别处所示的化学结构。
在一些方面中，ASO包含与CEBP/β转录物的核酸序列或所述序列内的区域(“靶区域”)杂交的连续核苷酸序列，其中所述核酸序列对应于(i)SEQ ID NO:13的核苷酸489–649；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸594–728；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸765–700；(iv)SEQID NO:13的核苷酸936–1076；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸999–2068；或(vi)SEQ ID NO:13的1203–1357，并且其中，任选地，所述ASO具有本文所述的设计中的一者或本文别处所示的化学结构。
在一些方面中，ASO包含与CEBP/β转录物的核酸序列或所述序列内的区域(“靶区域”)杂交的连续核苷酸序列，其中所述核酸序列对应于(i)SEQ ID NO:13的核苷酸1355–1487；(ii)SEQ ID NO:13的529–609；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸634–688；(iv)SEQ IDNO:13的核苷酸805-700；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸976–1036；(vi)SEQ ID NO:13的核苷酸1039–2028；(vii)SEQ ID NO:13的1243–1317；或(viii)SEQ ID NO:13的核苷酸1395–1447，并且其中，任选地，所述ASO具有本文所述的设计中的一者或本文别处所示的化学结构。
在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸540-554(例如，ASO-CEBPb-540；SEQ ID NO:194)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸565-579(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:195)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸569-583(例如，ASO-CEBPb-569；SEQ ID NO:196)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸648-662(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ ID NO:197)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸816-830(例如，ASO-CEBPb-816；SEQ IDNO:198)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸817-831(例如，ASO-CEBPb-817；SEQ ID NO:199)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸818-832(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:200)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸819-833(例如，ASO-CEBPb-819；SEQ ID NO:201)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸820-834(例如，ASO-CEBPb-820；SEQ ID NO:202)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸851-865(例如，ASO-CEBPb-851；SEQ IDNO:203)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸853-867(例如，ASO-CEBPb-853；SEQ ID NO:204)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸856-870(例如，ASO-CEBPb-856；SEQ ID NO:205)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸858-872(例如，ASO-CEBPb-858；SEQ ID NO:206)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸987-1001(例如，ASO-CEBPb-987；SEQ ID NO:207)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1056-1070(例如，ASO-CEBPb-1056；SEQID NO:208)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1078(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:209)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1079(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ ID NO:210)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1066-1080(例如，ASO-CEBPb-1066；SEQ ID NO:211)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1071-1085(例如，ASO-CEBPb-1071；SEQ IDNO:212)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1284(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:213)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1273-1287(例如，ASO-CEBPb-1273；SEQ ID NO:214)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1274-1288(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:215)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1405-1419(例如，ASO-CEBPb-1405；SEQ ID NO:216)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1407-1421(例如，ASO-CEBPb-1407；SEQ ID NO:217)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸539-554(例如，ASO-CEBPb-539；SEQ ID NO:218)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸540-555(例如，ASO-CEBPb-540；SEQ ID NO:219)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸563-578(例如，ASO-CEBPb-563；SEQ ID NO:220)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸564-579(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ IDNO:221)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸565-580(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:222)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸568-583(例如，ASO-CEBPb-568；SEQ ID NO:223)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸644-659(例如，ASO-CEBPb-644；SEQ ID NO:224)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸645-660(例如，ASO-CEBPb-645；SEQ ID NO:225)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸648-663(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ IDNO:226)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸819-834(例如，ASO-CEBPb-819；SEQ ID NO:227)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸855-870(例如，ASO-CEBPb-855；SEQ ID NO:228)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸860-875(例如，ASO-CEBPb-860；SEQ ID NO:229)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸986-1001(例如，ASO-CEBPb-986；SEQ ID NO:230)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸987-1002(例如，ASO-CEBPb-987；SEQ IDNO:231)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸996-1011(例如，ASO-CEBPb-996；SEQ ID NO:232)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1049-1064(例如，ASO-CEBPb-1049；SEQ ID NO:233)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1050-1065(例如，ASO-CEBPb-1050；SEQ ID NO:234)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1079(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:235)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1080(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ ID NO:236)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1066-1081(例如，ASO-CEBPb-1066；SEQ ID NO:237)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1083-1098(例如，ASO-CEBPb-1083；SEQ ID NO:238)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1088-1103(例如，ASO-CEBPb-1088；SEQ ID NO:239)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1253-1268(例如，ASO-CEBPb-1253；SEQ ID NO:240)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1269-1284(例如，ASO-CEBPb-1269；SEQ ID NO:241)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1272-1287(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ ID NO:242)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1289(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:243)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸539-555(例如，ASO-CEBPb-539；SEQ ID NO:244)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸564-580(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ ID NO:245)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸565-581(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:246)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸567-583(例如，ASO-CEBPb-567；SEQ ID NO:247)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸647-663(例如，ASO-CEBPb-647；SEQ ID NO:248)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸648-664(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ ID NO:249)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸815-831(例如，ASO-CEBPb-815；SEQ ID NO:250)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸818-834(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:251)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸820-836(例如，ASO-CEBPb-820；SEQ ID NO:252)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸854-870(例如，ASO-CEBPb-854；SEQ ID NO:253)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸855-871(例如，ASO-CEBPb-855；SEQ ID NO:254)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸859-875(例如，ASO-CEBPb-859；SEQ ID NO:255)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1050-1066(例如，ASO-CEBPb-1050；SEQ ID NO:256)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1053-1069(例如，ASO-CEBPb-1053；SEQ ID NO:257)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1062-1078(例如，ASO-CEBPb-1062；SEQID NO:258)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1063-1079(例如，ASO-CEBPb-1063；SEQ ID NO:259)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1080(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:260)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1081(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ ID NO:261)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1265-1281(例如，ASO-CEBPb-1265；SEQ IDNO:262)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1286(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:263)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1271-1287(例如，ASO-CEBPb-1271；SEQ ID NO:264)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1272-1288(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ ID NO:265)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1290(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:266)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1277-1293(例如，ASO-CEBPb-1277；SEQ ID NO:267)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸564-583(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ ID NO:268)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸565-584(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:269)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸818-837(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:270)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1061-1080(例如，ASO-CEBPb-1061；SEQID NO:271)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1062-1081(例如，ASO-CEBPb-1062；SEQ ID NO:272)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1083(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:273)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1267-1286(例如，ASO-CEBPb-1267；SEQ ID NO:274)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1272-1291(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ IDNO:275)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸645-664(例如，ASO-CEBPb-645；SEQ ID NO:276)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸848-867(例如，ASO-CEBPb-848；SEQ ID NO:277)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸849-868(例如，ASO-CEBPb-849；SEQ ID NO:278)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸850-869(例如，ASO-CEBPb-850；SEQ ID NO:279)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1063-1082(例如，ASO-CEBPb-1063；SEQID NO:280)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1070-1089(例如，ASO-CEBPb-1070；SEQ ID NO:281)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1071-1090(例如，ASO-CEBPb-1071；SEQ ID NO:282)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1262-1281(例如，ASO-CEBPb-1262；SEQ ID NO:283)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1293(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ IDNO:284)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1275-1294(例如，ASO-CEBPb-1275；SEQ ID NO:285)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸644-663(例如，ASO-CEBPb-644；SEQ ID NO:286)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ IDNO:13的核苷酸647-666(例如，ASO-CEBPb-647；SEQ ID NO:287)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸851-870(例如，ASO-CEBPb-851；SEQ ID NO:288)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1266-1285(例如，ASO-CEBPb-1266；SEQID NO:289)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1268-1287(例如，ASO-CEBPb-1268；SEQ ID NO:290)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1289(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:291)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸646-665(例如，ASO-CEBPb-646；SEQ ID NO:292)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1060-1079(例如，ASO-CEBPb-1060；SEQ ID NO:293)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1263-1282(例如，ASO-CEBPb-1263；SEQ ID NO:294)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQ ID NO:13的核苷酸1269-1288(例如，ASO-CEBPb-1269；SEQ ID NO:295)。在一些方面中，所述靶区域对应于SEQID NO:13的核苷酸1271-1290(例如，ASO-CEBPb-1271；SEQ ID NO:296)。
在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸540-554(例如，ASO-CEBPb-540；SEQ ID NO:194)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸565-579(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:195)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸569-583(例如，ASO-CEBPb-569；SEQ ID NO:196)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸648-662(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ ID NO:197)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸816-830(例如，ASO-CEBPb-816；SEQ ID NO:198)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQID NO:13的核苷酸817-831(例如，ASO-CEBPb-817；SEQ ID NO:199)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸818-832(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:200)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸819-833(例如，ASO-CEBPb-819；SEQ ID NO:201)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸820-834(例如，ASO-CEBPb-820；SEQ ID NO:202)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸851-865(例如，ASO-CEBPb-851；SEQ ID NO:203)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸853-867(例如，ASO-CEBPb-853；SEQ ID NO:204)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸856-870(例如，ASO-CEBPb-856；SEQ ID NO:205)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸858-872(例如，ASO-CEBPb-858；SEQ ID NO:206)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸987-1001(例如，ASO-CEBPb-987；SEQ ID NO:207)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQID NO:13的核苷酸1056-1070(例如，ASO-CEBPb-1056；SEQ ID NO:208)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1078(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:209)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1079(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ IDNO:210)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1066-1080(例如，ASO-CEBPb-1066；SEQ ID NO:211)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1071-1085(例如，ASO-CEBPb-1071；SEQ ID NO:212)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1284(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:213)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1273-1287(例如，ASO-CEBPb-1273；SEQ ID NO:214)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1288(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:215)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1405-1419(例如，ASO-CEBPb-1405；SEQ ID NO:216)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1407-1421(例如，ASO-CEBPb-1407；SEQ ID NO:217)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸539-554(例如，ASO-CEBPb-539；SEQ ID NO:218)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸540-555(例如，ASO-CEBPb-540；SEQ ID NO:219)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸563-578(例如，ASO-CEBPb-563；SEQ ID NO:220)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸564-579(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ ID NO:221)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸565-580(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:222)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸568-583(例如，ASO-CEBPb-568；SEQ ID NO:223)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸644-659(例如，ASO-CEBPb-644；SEQ ID NO:224)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸645-660(例如，ASO-CEBPb-645；SEQ ID NO:225)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸648-663(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ ID NO:226)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸819-834(例如，ASO-CEBPb-819；SEQ ID NO:227)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸855-870(例如，ASO-CEBPb-855；SEQ ID NO:228)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸860-875(例如，ASO-CEBPb-860；SEQ ID NO:229)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQID NO:13的核苷酸986-1001(例如，ASO-CEBPb-986；SEQ ID NO:230)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸987-1002(例如，ASO-CEBPb-987；SEQ ID NO:231)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸996-1011(例如，ASO-CEBPb-996；SEQ ID NO:232)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1049-1064(例如，ASO-CEBPb-1049；SEQID NO:233)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1050-1065(例如，ASO-CEBPb-1050；SEQ ID NO:234)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1079(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:235)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1080(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ ID NO:236)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1066-1081(例如，ASO-CEBPb-1066；SEQ ID NO:237)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1083-1098(例如，ASO-CEBPb-1083；SEQ ID NO:238)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1088-1103(例如，ASO-CEBPb-1088；SEQ ID NO:239)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1253-1268(例如，ASO-CEBPb-1253；SEQ ID NO:240)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1269-1284(例如，ASO-CEBPb-1269；SEQ ID NO:241)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1272-1287(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ ID NO:242)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1274-1289(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:243)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸539-555(例如，ASO-CEBPb-539；SEQ ID NO:244)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸564-580(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ ID NO:245)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸565-581(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:246)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸567-583(例如，ASO-CEBPb-567；SEQ ID NO:247)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸647-663(例如，ASO-CEBPb-647；SEQ ID NO:248)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸648-664(例如，ASO-CEBPb-648；SEQ ID NO:249)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸815-831(例如，ASO-CEBPb-815；SEQ ID NO:250)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸818-834(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:251)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQID NO:13的核苷酸820-836(例如，ASO-CEBPb-820；SEQ ID NO:252)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸854-870(例如，ASO-CEBPb-854；SEQ ID NO:253)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸855-871(例如，ASO-CEBPb-855；SEQ ID NO:254)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸859-875(例如，ASO-CEBPb-859；SEQ ID NO:255)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1050-1066(例如，ASO-CEBPb-1050；SEQ ID NO:256)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1053-1069(例如，ASO-CEBPb-1053；SEQ ID NO:257)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1062-1078(例如，ASO-CEBPb-1062；SEQ ID NO:258)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1063-1079(例如，ASO-CEBPb-1063；SEQ ID NO:259)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1080(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:260)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1065-1081(例如，ASO-CEBPb-1065；SEQ ID NO:261)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1265-1281(例如，ASO-CEBPb-1265；SEQ ID NO:262)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1286(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:263)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1271-1287(例如，ASO-CEBPb-1271；SEQ ID NO:264)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1272-1288(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ ID NO:265)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1290(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:266)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1277-1293(例如，ASO-CEBPb-1277；SEQ ID NO:267)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸564-583(例如，ASO-CEBPb-564；SEQ ID NO:268)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸565-584(例如，ASO-CEBPb-565；SEQ ID NO:269)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸818-837(例如，ASO-CEBPb-818；SEQ ID NO:270)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1061-1080(例如，ASO-CEBPb-1061；SEQ ID NO:271)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸1062-1081(例如，ASO-CEBPb-1062；SEQ ID NO:272)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1064-1083(例如，ASO-CEBPb-1064；SEQ ID NO:273)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1267-1286(例如，ASO-CEBPb-1267；SEQ ID NO:274)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1272-1291(例如，ASO-CEBPb-1272；SEQ ID NO:275)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸645-664(例如，ASO-CEBPb-645；SEQ ID NO:276)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸848-867(例如，ASO-CEBPb-848；SEQ ID NO:277)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸849-868(例如，ASO-CEBPb-849；SEQ ID NO:278)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸850-869(例如，ASO-CEBPb-850；SEQ ID NO:279)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1063-1082(例如，ASO-CEBPb-1063；SEQ ID NO:280)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1070-1089(例如，ASO-CEBPb-1070；SEQ ID NO:281)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1071-1090(例如，ASO-CEBPb-1071；SEQID NO:282)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1262-1281(例如，ASO-CEBPb-1262；SEQ ID NO:283)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1274-1293(例如，ASO-CEBPb-1274；SEQ ID NO:284)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1275-1294(例如，ASO-CEBPb-1275；SEQ ID NO:285)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ IDNO:13的核苷酸644-663(例如，ASO-CEBPb-644；SEQ ID NO:286)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸647-666(例如，ASO-CEBPb-647；SEQ ID NO:287)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸851-870(例如，ASO-CEBPb-851；SEQ ID NO:288)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1266-1285(例如，ASO-CEBPb-1266；SEQ IDNO:289)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1268-1287(例如，ASO-CEBPb-1268；SEQ ID NO:290)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1270-1289(例如，ASO-CEBPb-1270；SEQ ID NO:291)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸646-665(例如，ASO-CEBPb-646；SEQ ID NO:292)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1060-1079(例如，ASO-CEBPb-1060；SEQ ID NO:293)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1263-1282(例如，ASO-CEBPb-1263；SEQ ID NO:294)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1269-1288(例如，ASO-CEBPb-1269；SEQ ID NO:295)。在一些方面中，所述靶区域对应于在3'端和/或5'端±10、±20、±30、±40、±50、±60、±70、±80或±90个核苷酸的SEQ ID NO:13的核苷酸1271-1290(例如，ASO-CEBPb-1271；SEQID NO:296)。
在一些方面中，所述ASO不是TGGATTTAAAGGCAGGCGGC(SEQ ID NO:90)。在一些方面中，所述靶区域包含。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-518内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-517内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-516内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-515内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-514内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-513内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-512内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-511内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-510内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-509内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-508内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-507内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-506内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-505内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-504内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-503内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-502内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸1-501内的核酸序列互补。
在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸504-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQID NO:13的核苷酸505-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸506-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸507-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸508-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸509-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸510-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸511-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸512-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸513-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸514-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸515-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸516-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸517-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸518-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸519-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸520-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸521-2113内的核酸序列互补。在一些方面中，所述靶区域对应于长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:13的核苷酸522-2113内的核酸序列互补。
在一些方面中，本公开的ASO与CEBP/β转录物(例如，基因组序列，分别SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11)内的多个靶区域杂交。在一些方面中，ASO与CEBP/β转录物内的两个不同靶区域杂交。在一些方面中，ASO与CEBP/β转录物内的三个不同靶区域杂交。与多个靶区域杂交的示例性ASO的序列以及不同靶区域的起始/终止位点提供于图1中。在一些方面中，相较于与CEBP/β转录物(例如，基因组序列，分别SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11)内的单个区域杂交的ASO，与CEBP/β转录物(例如，基因组序列，分别SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11)内的多个区域杂交的ASO在降低CEBP/β表达方面更有效(例如，具有较低EC50)。
在一些方面中，本公开的ASO能够在生理条件，即体内条件下与靶核酸(例如，CEBP/β转录物)杂交。在一些方面中，本公开的ASO能够在体外与靶核酸(例如，CEBP/β转录物)杂交。在一些方面中，本公开的ASO能够在严格条件下在体外与靶核酸(例如，CEBP/β转录物)杂交。用于在体外杂交的严格性条件尤其取决于生产性细胞摄取、RNA可及性、温度、缔合自由能、盐浓度和时间(参见例如，Stanley T Crooke,Antisense Drug Technology:Principles,Strategies and Applications,第2版,CRC Press(2007))。一般而言，高至中等严格性条件用于体外特异性杂交，以使得杂交在大致上相似的核酸之间发生，而不在不相似的核酸之间发生。严格杂交条件的一个实例包括在40℃下在5X柠檬酸钠(SSC)缓冲液(0.75M氯化钠/0.075M柠檬酸钠)中杂交1小时，然后将样品在40℃下在1X SSC中洗涤10次以及在室温下在1X SSC缓冲液中洗涤5次。体内杂交条件由支配反义寡核苷酸与靶序列的杂交的细胞内条件(例如，生理pH和细胞内离子条件)组成。可通过相对低的严格性条件在体外模拟体内条件。例如，可在体外在37℃下在2X SSC(0.3M氯化钠/0.03M柠檬酸钠)、0.1％SDS中实施杂交。可在37℃下使用含有4X SSC、0.1％SDS的洗涤溶液，最后在45℃下在1X SSC中洗涤。
在一些方面中，本公开的ASO能够靶向来自一种或多种物种(例如，人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛和熊)的CEBP/β转录物。在某些方面中，本文公开的ASO能够靶向人和啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)CEBP/β转录物。因此，在一些方面中，ASO能够下调(例如，降低或除去)人和啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)两者中的CEBP/βmRNA或蛋白质的表达。在一些方面中，本文所述的任何ASO是缀合物的一部分，所述缀合物包含与至少一个非核苷酸或非多核苷酸共价连接的ASO。
本公开的某些方面涉及包含本文所述的ASO的缀合物。在某些方面中，所述缀合物包含与至少一种非核苷酸共价连接的ASO。在某些方面中，所述缀合物包含与至少一个非多核苷酸部分共价连接的ASO。在一些方面中，所述非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或它们的任何组合。
II.B.ASO序列
本公开的ASO包含连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列对应于CEBP/β转录物(例如，对应于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸序列)的区域的互补序列
在某些方面中，本公开提供了长度为10-30，如10-15个核苷酸、10-20个核苷酸、10-25个核苷酸或长度为约20个核苷酸的ASO，其中所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(如，SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或其天然存在的变体)的互补序列内的区域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性。因此，例如，所述ASO与具有SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或其一部分的序列的单链核酸分子杂交。
ASO可包含与编码哺乳动物CEBP/Β蛋白的核酸(例如，SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13)的等效区域完全互补(fully complemen tary)(完全互补(perfectlycomplementary))的连续核苷酸序列。ASO可包含与对应于SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13的核苷酸X-Y的核酸序列或所述序列内的区域完全互补(完全互补)的连续核苷酸序列，其中X和Y分别是起始位点和终止位点，如图1B所示。
ASO可包含与编码哺乳动物CEBP/Β蛋白的mRNA(例如，SEQ ID NO:13)的等效区域完全互补(完全互补)的连续核苷酸序列。ASO可包含与对应于SEQ ID NO:13的核苷酸X-Y的mRNA序列或所述序列内的区域完全互补(完全互补)的连续核苷酸序列，其中X和Y分别是起始位点和终止位点。
在一些方面中，本公开的ASO的核苷酸序列或连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO:194至296的序列(即，图1B中的序列)具有至少约80％序列同一性，如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、至少约99％序列同一性，如约100％序列同一性(同源)。在一些方面中，ASO具有本文别处描述的设计或本文别处所示的化学结构(例如，图1B)。
在一些方面中，ASO(或其连续核苷酸部分)选自或包含选自由以下组成的组的序列中的一个：SEQ ID NO:194至296或其至少10个连续核苷酸的区域，其中当与相应的CEBP/Β转录物相比时，ASO(或其连续核苷酸部分)可任选地包含1个、2个、3个或4个错配。
在一些方面中，ASO包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:194(例如，ASO-CEBPb-540)、SEQ ID NO:195(例如，ASO-CEBPb-565)、SEQ ID NO:196(例如，ASO-CEBPb-569)、SEQ ID NO:197(例如，ASO-CEBPb-648)、SEQ ID NO:198(例如，ASO-CEBPb-816)、SEQID NO:199(例如，ASO-CEBPb-817)、SEQ ID NO:200(例如，ASO-CEBPb-818)、SEQ ID NO:201(例如，ASO-CEBPb-819)、SEQ ID NO:202(例如，ASO-CEBPb-820)、SEQ ID NO:203(例如，ASO-CEBPb-851)、SEQ ID NO:204(例如，ASO-CEBPb-853)、SEQ ID NO:205(例如，ASO-CEBPb-856)、SEQ ID NO:206(例如，ASO-CEBPb-858)、SEQ ID NO:207(例如，ASO-CEBPb-987)、SEQ ID NO:208(例如，ASO-CEBPb-1056)、SEQ ID NO:209(例如，ASO-CEBPb-1064)、SEQ ID NO:210(例如，ASO-CEBPb-1065)、SEQ ID NO:211(例如，ASO-CEBPb-1066)、SEQ IDNO:212(例如，ASO-CEBPb-1071)、SEQ ID NO:213(例如，ASO-CEBPb-1270)、SEQ ID NO:214(例如，ASO-CEBPb-1273)、SEQ ID NO:215(例如，ASO-CEBPb-1274)、SEQ ID NO:216(例如，ASO-CEBPb-1405)、SEQ ID NO:217(例如，ASO-CEBPb-1407)、SEQ ID NO:218(例如，ASO-CEBPb-539)、SEQ ID NO:219(例如，ASO-CEBPb-540)、SEQ ID NO:220(例如，ASO-CEBPb-563)、SEQ ID NO:221(例如，ASO-CEBPb-564)、SEQ ID NO:222(例如，ASO-CEBPb-565)、SEQID NO:223(例如，ASO-CEBPb-568)、SEQ ID NO:224(例如，ASO-CEBPb-644)、SEQ ID NO:225(例如，ASO-CEBPb-645)、SEQ ID NO:226(例如，ASO-CEBPb-648)、SEQ ID NO:227(例如，ASO-CEBPb-819)、SEQ ID NO:228(例如，ASO-CEBPb-855)、SEQ ID NO:229(例如，ASO-CEBPb-860)、SEQ ID NO:230(例如，ASO-CEBPb-986)、SEQ ID NO:231(例如，ASO-CEBPb-987)、SEQ ID NO:232(例如，ASO-CEBPb-996)、SEQ ID NO:233(例如，ASO-CEBPb-1049)、SEQID NO:234(例如，ASO-CEBPb-1050)、SEQ ID NO:235(例如，ASO-CEBPb-1064)、SEQ ID NO:236(例如，ASO-CEBPb-1065)、SEQ ID NO:237(例如，ASO-CEBPb-1066)、SEQ ID NO:238(例如，ASO-CEBPb-1083)、SEQ ID NO:239(例如，ASO-CEBPb-1088)、SEQ ID NO:240(例如，ASO-CEBPb-1253)、SEQ ID NO:241(例如，ASO-CEBPb-1269)、SEQ ID NO:242(例如，ASO-CEBPb-1272)、SEQ ID NO:243(例如，ASO-CEBPb-1274)、SEQ ID NO:244(例如，ASO-CEBPb-539)、SEQ ID NO:245(例如，ASO-CEBPb-564)、SEQ ID NO:246(例如，ASO-CEBPb-565)、SEQ IDNO:247(例如，ASO-CEBPb-567)、SEQ ID NO:248(例如，ASO-CEBPb-647)、SEQ ID NO:249(例如，ASO-CEBPb-648)、SEQ ID NO:250(例如，ASO-CEBPb-815)、SEQ ID NO:251(例如，ASO-CEBPb-818)、SEQ ID NO:252(例如，ASO-CEBPb-820)、SEQ ID NO:253(例如，ASO-CEBPb-854)、SEQ ID NO:254(例如，ASO-CEBPb-855)、SEQ ID NO:255(例如，ASO-CEBPb-859)、SEQID NO:256(例如，ASO-CEBPb-1050)、SEQ ID NO:257(例如，ASO-CEBPb-1053)、SEQ ID NO:258(例如，ASO-CEBPb-1062)、SEQ ID NO:259(例如，ASO-CEBPb-1063)、SEQ ID NO:260(例如，ASO-CEBPb-1064)、SEQ ID NO:261(例如，ASO-CEBPb-1065)、SEQ ID NO:262(例如，ASO-CEBPb-1265)、SEQ ID NO:263(例如，ASO-CEBPb-1270)、SEQ ID NO:264(例如，ASO-CEBPb-1271)、SEQ ID NO:265(例如，ASO-CEBPb-1272)、SEQ ID NO:266(例如，ASO-CEBPb-1274)、SEQ ID NO:267(例如，ASO-CEBPb-1277)、SEQ ID NO:268(例如，ASO-CEBPb-564)、SEQ IDNO:269(例如，ASO-CEBPb-565)、SEQ ID NO:270(例如，ASO-CEBPb-818)、SEQ ID NO:271(例如，ASO-CEBPb-1061)、SEQ ID NO:272(例如，ASO-CEBPb-1062)、SEQ ID NO:273(例如，ASO-CEBPb-1064)、SEQ ID NO:274(例如，ASO-CEBPb-1267)、SEQ ID NO:275(例如，ASO-CEBPb-1272)、SEQ ID NO:276(例如，ASO-CEBPb-645)、SEQ ID NO:277(例如，ASO-CEBPb-848)、SEQID NO:278(例如，ASO-CEBPb-849)、SEQ ID NO:279(例如，ASO-CEBPb-850)、SEQ ID NO:280(例如，ASO-CEBPb-1063)、SEQ ID NO:281(例如，ASO-CEBPb-1070)、SEQ ID NO:282(例如，ASO-CEBPb-1071)、SEQ ID NO:283(例如，ASO-CEBPb-1262)、SEQ ID NO:284(例如，ASO-CEBPb-1274)、SEQ ID NO:285(例如，ASO-CEBPb-1275)、SEQ ID NO:286(例如，ASO-CEBPb-644)、SEQ ID NO:287(例如，ASO-CEBPb-647)、SEQ ID NO:288(例如，ASO-CEBPb-851)、SEQID NO:289(例如，ASO-CEBPb-1266)、SEQ ID NO:290(例如，ASO-CEBPb-1268)、SEQ ID NO:291(例如，ASO-CEBPb-1270)、SEQ ID NO:292(例如，ASO-CEBPb-646)、SEQ ID NO:293(例如，ASO-CEBPb-1060)、SEQ ID NO:294(例如，ASO-CEBPb-1263)、SEQ ID NO:295(例如，ASO-CEBPb-1269)和SEQ ID NO:296(例如，ASO-CEBPb-1271)。
在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:194中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-540)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:195中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-565)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:196中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-569)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:197中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-648)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:198中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-816)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:199中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-817)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:200中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-818)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:201中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-819)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:202中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-820)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:203中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-851)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:204中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-853)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:205中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-856)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:206中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-858)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:207中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-987)。在一些方面中，ASO包含如SEQ IDNO:208中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1056)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:209中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1064)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:210中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1065)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:211中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1066)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:212中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1071)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:213中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1270)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:214中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1273)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:215中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1274)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:216中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1405)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:217中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1407)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:218中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-539)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:219中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-540)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:220中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-563)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:221中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-564)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:222中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-565)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:223中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-568)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:224中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-644)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:225中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-645)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:226中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-648)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:227中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-819)。在一些方面中，ASO包含如SEQ IDNO:228中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-855)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:229中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-860)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:230中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-986)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:231中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-987)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:232中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-996)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:233中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1049)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:234中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1050)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:235中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1064)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:236中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1065)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:237中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1066)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:238中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1083)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:239中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1088)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:240中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1253)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:241中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1269)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:242中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1272)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:243中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1274)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:244中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-539)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:245中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-564)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:246中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-565)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:247中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-567)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:248中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-647)。在一些方面中，ASO包含如SEQ IDNO:249中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-648)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:250中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-815)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:251中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-818)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:252中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-820)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:253中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-854)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:254中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-855)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:255中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-859)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:256中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1050)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:257中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1053)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:258中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1062)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:259中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1063)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:260中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1064)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:261中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1065)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:262中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1265)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:263中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1270)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:264中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1271)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:265中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1272)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:266中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1274)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:267中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1277)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:268中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-564)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:269中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-565)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:270中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-818)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:271中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1061)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:272中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1062)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:273中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1064)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:274中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1267)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:275中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1272)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:276中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-645)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:277中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-848)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:278中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-849)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:279中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-850)。在一些方面中，ASO包含如SEQID NO:280中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1063)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:281中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1070)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:282中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1071)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:283中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1262)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:284中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1274)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:285中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1275)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:286中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-644)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:287中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-647)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:288中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-851)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:289中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1266)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:290中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1268)。在一些方面中，ASO包含如SEQ IDNO:291中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1270)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:292中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-646)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:293中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1060)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:294中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1263)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:295中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1269)。在一些方面中，ASO包含如SEQ ID NO:296中列出的序列(例如，ASO-CEBPb-1271)。
在一些方面中，本公开的ASO结合至靶核酸序列(例如，CEBP/Β转录物)，并且能够使CEBP/Β转录物的表达与细胞中的正常(即对照)表达水平相比抑制或降低至少10％或20％，例如与正常表达水平(例如，尚未暴露于ASO的细胞中的表达水平)相比抑制或降低至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
在一些方面中，与未与ASO接触(例如，与盐水接触)的细胞相比，当使细胞与ASO接触时，本公开的ASO能够在体外使靶细胞中CEBP/ΒmRNA的表达降低至少20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
在一些方面中，当与靶序列杂交时，ASO可容许1个、2个、3个或4个(或更多个)错配，并且仍然与靶标充分结合以显示所需作用，即靶mRNA和/或蛋白质的下调。错配可例如通过增加ASO核苷酸序列的长度和/或增加数量的核苷酸类似物来补偿，这在本文别处进行了公开。
在一些方面中，当与靶序列杂交时，本公开的ASO包含不超过三个错配。在其它方面中，当与靶序列杂交时，连续核苷酸序列包含不超过两个错配。在其它方面中，当与靶序列杂交时，连续核苷酸序列包含不超过一个错配。
II.C.ASO长度
ASO可包含长度为总共10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸的连续核苷酸序列。应当理解，当给出ASO或连续核苷酸序列长度的范围时，所述范围包括在所述范围内提供的下限和上限长度，例如10-30(或介于10-30之间)，包括10和30。
在一些方面中，ASO包含长度为总共约14-20、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的连续核苷酸序列。在某些方面中，ASO包含长度为总共约20个连续核苷酸的连续核苷酸序列。在某些方面中，本公开的ASO的长度是14个核苷酸。在某些方面中，本公开的ASO的长度是15个核苷酸。在某些方面中，本公开的ASO的长度是16个核苷酸。在某些方面中，本公开的ASO的长度是17个核苷酸。在某些方面中，本公开的ASO的长度是18个核苷酸。在某些方面中，本公开的ASO的长度是19个核苷酸。
II.D.核苷和核苷类似物
在本公开的一个方面中，ASO包含一种或多种非天然存在的核苷类似物。如本文所用，“核苷类似物”是天然核苷(如DNA或RNA核苷)通过糖和/或碱基部分的修饰所得的变体。原则上，在寡核苷酸的情况下，类似物可能仅与天然核苷“沉默”或“等效”，即对寡核苷酸起作用以抑制靶基因表达的方式没有功能性影响。然而，如果此类“等效”类似物例如更容易或更便宜地制造，或者对储存或制造条件更稳定，或者代表标签或标记，则它们仍然可以是有用的。然而，在一些方面中，类似物将对ASO起作用以抑制表达的方式具有功能性影响；例如通过产生增加的对靶标的结合亲和力和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加的转运进入细胞的容易性。核苷类似物的具体实例由例如Freier和Altmann；Nucl.AcidRes.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及在方案1中描述。本公开的ASO可含有多于1个、多于2个、多于3个、多于4个、多于5个、多于6个、多于7个、多于8个、多于9个、多于10个、多于11个、多于12个、多于13个、多于14个、多于15个、多于16个、多于18个、多于19个或多于20个核苷类似物。在一些方面中，ASO中的核苷类似物是相同的。在其它方面中，ASO中的核苷类似物是不同的。ASO中的核苷酸类似物可以是以下核苷类似物中的任一者或其组合。
在一些方面中，核苷类似物包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2'-氨基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA；双环核苷类似物；或它们的任何组合。在一些方面中，核苷类似物包括糖修饰的核苷。在一些方面中，核苷类似物包括包含双环糖的核苷。在一些方面中，核苷类似物包括LNA。
在一些方面中，核苷类似物选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'-限制性2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)、氨基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。在一些方面中，ASO包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
II.D.1.核碱基
术语核碱基包括存在于在核酸杂交中形成氢键的核苷和核苷酸中的嘌呤(例如，腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如，尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分。在本公开的上下文中，术语核碱基还涵盖经修饰的核碱基，其可能不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是有功能的。在一些方面中，通过修饰或替代核碱基来修饰核碱基部分。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如在Hirao等人,(2012)Accounts of ChemicalResearch第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic AcidChemistry增刊37 1.4.1中进行了描述。
在一些方面中，核碱基部分通过将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，如取代的嘌呤或取代的嘧啶来进行修饰，如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有等效功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基-胞嘧啶。任选地，对于LNA间隙聚体，可使用5-甲基-胞嘧啶LNA核苷。
II.D.2.糖修饰
本公开的ASO可包含具有经修饰的糖部分(即当与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时，对糖部分的修饰)的一个或多个核苷。已经制备了具有核糖部分的修饰的许多核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括其中核糖环结构例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2'与C4'碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2'与C3'碳之间缺乏键的未连接核糖环(例如，UNA)替代而进行修饰的那些修饰。其它糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或改变RNA核苷中天然存在的2'-OH基团进行的修饰。可例如在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。具有经修饰的糖部分的核苷还包括2'修饰的核苷，如2'取代的核苷。实际上，已经将很多重点放在开发2'取代的核苷上，并且已经发现许多2'取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益性质，如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
II.D.2.a.2'修饰的核苷
2'糖修饰的核苷是在2'位置具有除H或–OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含2'连接的双基的核苷，并且包括2'取代的核苷和LNA(2'-4'双基桥联)核苷。例如，2'修饰的糖可提供增强的结合亲和力(例如，亲和力增强2'糖修饰的核苷)和/或对寡核苷酸的增加的核酸酶抗性。2'取代的经修饰核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-DNA、阿拉伯核酸(ANA)和2'-氟-ANA核苷。关于其它实例，请参见例如，Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443；Uhlmann,Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213；以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下文是一些2'取代的经修饰核苷的说明。
Figure BDA0003596121310000811
II.D.2.b.锁核酸核苷(LNA)。
LNA核苷是经修饰的核苷，其在核苷的核糖环的C2'与C4'之间包含接头基团(称为双基或桥)(即2'-4'桥)，它限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥联核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与增强的杂交亲和力(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/补体双链体的解链温度来常规地确定。
非限制性示例性LNA核苷在WO 99/014226、WO 00/66604、WO98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729；Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76；Seth等人,J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页；以及Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research 2009,37(4),1225-1238中有所公开。
在一些方面中，本公开的ASO的经修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的通式结构：
Figure BDA0003596121310000821
其中
W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，特别是–O-；
B是核碱基或经修饰的核碱基部分；
Z是与相邻核苷或5'-末端基团的核苷间键联；
Z*是与相邻核苷或3'-末端基团的核苷间键联；
R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧基烷基、烯氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲酰基、叠氮化物、杂环和芳基；并且
X、Y、Ra和Rb如本文所定义。
在–X-Y-的一些方面中，Ra是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–X-Y-的一些方面中，Rb是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–X-Y-的其它方面中，Ra和Rb中的一者或两者是氢。在–X-Y-的其它方面中，Ra和Rb中仅一者是氢。在-X-Y-的一些方面中，Ra和Rb中的一者是甲基并且另一者是氢。在–X-Y-的其它方面中，Ra和Rb同时均是甲基。
在–X-的一些方面中，Ra是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–X-的一些方面中，Rb是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–X-的其它方面中，Ra和Rb中的一者或两者是氢。在–X-的某些方面中，Ra和Rb中仅一者是氢。在–X-的某些方面中，Ra和Rb中的一者是甲基并且另一者是氢。在–X-的某些方面中，Ra和Rb同时均是甲基。
在–Y-的一些方面中，Ra是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–Y-的某些方面中，Rb是氢或烷基，特别是氢或甲基。在–Y-的其它方面中，Ra和Rb中的一者或两者是氢。在–Y-的一些方面中，Ra和Rb中仅一者是氢。在–Y-的其它方面中，Ra和Rb中的一者是甲基并且另一者是氢。在–Y-的一些方面中，Ra和Rb同时均是甲基。
在一些方面中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢和烷基，特别是氢和甲基。
在一些方面中，R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。
在一些方面中，R1、R2、R3同时都是氢，R5和R5*中的一者是氢并且另一者如上文所定义，特别是烷基，更特别是甲基。
在一些方面中，R1、R2、R3同时都是氢，R5和R5*中的一者是氢并且另一者是叠氮化物。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类LNA核苷公开于WO 99/014226、WO00/66604、WO 98/039352和WO 2004/046160中，其全部特此以引用的方式并入，并且包括本领域公知的β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷。
在一些方面中，-X-Y-是-S-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类硫代LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-NH-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类氨基LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH2CH2-或-OCH2CH2CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76中，其特此以引用的方式并入，并且包括本领域公知的2'-O-4'C-亚乙基桥联核酸(ENA)。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH2-，W是氧，R1、R2、R3同时都是氢，R5和R5*中的一者是氢并且另一者不是氢，如烷基，例如甲基。此类5'取代的LNA核苷公开于WO 2007/134181中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一者或两者不是氢，特别是烷基，如甲基，W是氧，R1、R2、R3同时都是氢，R5和R5*中的一者是氢并且另一者不是氢，特别是烷基，例如甲基。此类双修饰的LNA核苷公开于WO 2010/077578中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH(CH2-O-CH3)-(”2'O-甲氧基乙基双环核酸”，Seth等人,J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页)。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CHRa-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类6'-取代的LNA核苷公开于WO2010/036698和WO 2007/090071中，两者均特此以引用的方式并入。在此类6'-取代的LNA核苷中，Ra特别是C1-C6烷基，如甲基。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH(CH2-O-CH3)-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类LNA核苷在本领域中也称为环状MOE(cMOE)并且公开于WO 2007/090071中。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH(CH3)-。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH2-O-CH2-(Seth等人,J.Org.Chem2010op.cit.)。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类6'-甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)-cET或(R)-cET非对映异构体，如WO2007/090071(β-D)和WO 2010/036698(α-L)中所公开，两者均特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb都不是氢，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。在某些方面中，Ra和Rb同时均是烷基，特别是同时均是甲基。此类6'-二取代的LNA核苷公开于WO 2009/006478中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-S-CHRa-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类6'-取代的硫代LNA核苷公开于WO2011/156202中，其特此以引用的方式并入。在此类6'-取代的硫代LNA的某些方面中，Ra是烷基，特别是甲基。
在一些方面中，-X-Y-是-C(＝CH2)C(RaRb)-，如W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。此类乙烯基碳LNA核苷公开于WO2008/154401和WO 2009/067647中，两者均特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-N(ORa)-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。在一些方面中，Ra是烷基，如甲基。此类LNA核苷也称为N取代的LNA，并且公开于WO 2008/150729中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-NCH3-(Seth等人,J.Org.Chem 2010op.cit.)。
在一些方面中，-X-Y-是ON(Ra)-–N(Ra)-O-、-NRa-CRaRb-CRaRb-或–NRa-CRaRb-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。在某些方面中，Ra是烷基，如甲基。(Seth等人,J.Org.Chem 2010op.cit.)。
在一些方面中，R5和R5*同时均是氢。在其它方面中，R5和R5*中的一者是氢并且另一者是烷基，如甲基。在此类方面中，R1、R2和R3可特别是氢并且-X-Y-可特别是-O-CH2-或-O-CHC(Ra)3-，如-O-CH(CH3)-。
在一些方面中，-X-Y-是-CRaRb-O-CRaRb-，如-CH2-O-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。在此类方面中，Ra可特别是烷基，如甲基。此类LNA核苷也称为构象限制性核苷酸(CRN)，并且公开于WO 2013/036868中，其特此以引用的方式并入。
在一些方面中，-X-Y-是-O-CRaRb-O-CRaRb-，如-O-CH2-O-CH2-，W是氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*同时都是氢。在某些方面中，Ra可特别是烷基，如甲基。此类LNA核苷也称为COC核苷酸，并且公开于Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research 2009,37(4),1225-1238中，其特此以引用的方式并入。
除非另有说明，否则将认识到LNA核苷可呈β-D或α-L立体同工型。
方案1中呈现了LNA核苷酸的某些实例。
方案1
Figure BDA0003596121310000871
如别处所示，在本公开的一些方面中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧基-LNA核苷。
III.E.核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解是指在与互补核苷酸序列形成双链体时能够介导这种序列的降解的寡核苷酸。
在一些方面中，寡核苷酸可通过核酸酶介导的靶核酸降解起作用，其中本公开的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选核糖核酸内切酶(RNA酶)，如RNA酶H。通过核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的实例是通常包含至少5或6个DNA核苷的区域并且在一侧或两侧侧接增强亲和力的核苷(例如间隙聚体)的寡核苷酸。
II.F.RNA酶H活性和募集
反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其在与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H和诱导互补RNA分子降解的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，所述方法可用于确定募集RNA酶H的能力。通常，如果在提供互补靶核酸序列时寡核苷酸具有如以pmol/l/min测量的至少5％，如至少10％的初始速率或超过20％的初始速率，则认为所述寡核苷酸能够募集RNA酶H，所述初始速率是在使用与所测试的经修饰寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有DNA单体、在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯键联的寡核苷酸并使用由WO01/23613的实施例91-95提供的方法确定的。
在一些方面中，如果在提供互补靶核酸时RNA酶H初始速率(如以pmol/l/min测量)是初始速率的小于20％，如小于10％，如小于5％，则认为寡核苷酸基本上不能募集RNA酶H，所述初始速率是在使用与所测试的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有DNA单体、无2'取代、在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯键联的寡核苷酸并使用由WO01/23613的实施例91-95提供的方法确定的。
II.G.ASO设计
本公开的ASO可包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含核苷和核苷类似物两者，并且可呈间隙聚体的形式。可与本公开的ASO一起使用的间隙聚体的构型的实例描述于美国专利申请公布号2012/0322851中。
如本文所用的术语“间隙聚体”是指包含RNA酶H募集寡核苷酸的区域(间隙)的反义寡核苷酸，所述区域在5'和3'侧接一个或多个增强亲和力的经修饰核苷(侧翼)。术语“LNA间隙聚体”是间隙聚体寡核苷酸，其中所述增强亲和力的经修饰核苷中的至少一者是LNA核苷。术语“混合翼间隙聚体”是指LNA间隙聚体，其中侧翼区包含至少一种LNA核苷和至少一种DNA核苷或非LNA修饰的核苷，如至少一种2'取代的经修饰核苷，诸如，例如，2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-DNA、阿拉伯核酸(ANA)和2'-氟-ANA核苷。
在一些方面中，本公开的ASO可呈混合聚体的形式。在一些方面中，本公开的ASO可呈全聚体的形式。在一些方面中，除了增强ASO对靶区域的亲和力外，一些核苷类似物还介导RNA酶(例如，RNA酶H)结合和裂解。由于α-L-LNA单体在一定程度上募集RNA酶H活性，所以在一些方面中，含有α-L-LNA单体的ASO的间隙区(例如，如本文所提及的区域B)由较少的可被RNA酶H识别和裂解的单体组成，并在混合聚体构型中引入了更多灵活性。
II.G.1.间隙聚体设计
在一些方面中，本公开的ASO是间隙聚体并且包含能够募集RNA酶(例如RNA酶H)的连续核苷酸段(例如，一个或多个DNA)，在本文中称为区域B(B)，其中区域B在5'和3'侧接核苷类似物的区域，所述核苷类似物的区域位于区域B的连续核苷酸段的5'和3'——这些区域分别称为区域A(A)和C(C)。在一些方面中，核苷类似物是糖修饰的核苷(例如，高亲和力糖修饰的核苷)。在某些方面中，区域A和区域C的糖修饰核苷增强ASO对靶核酸的亲和力(即增强亲和力的2'糖修饰核苷)。在一些方面中，糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，如高亲和力2'糖修饰，如LNA和/或2'-MOE。
在间隙聚体中，区域B的最5'和最3'核苷是DNA核苷，并且分别位于区域A和区域C的核苷类似物(例如，高亲和力糖修饰的核苷)附近。在一些方面中，区域A和区域C可通过在距离B区最远的端(即在区域A的5'端和区域C的3'端)具有核苷类似物来进一步限定。
在一些方面中，本公开的ASO包含式(5'至3')A-B-C的核苷酸序列，其中：(A)(5'区或第一翼序列)包含至少一个核苷类似物(例如，3-5个LNA单元)；(B)包含至少四个连续核苷(例如，4-24个DNA单位)，它们能够募集RNA酶(当与互补RNA分子如前体mRNA或mRNA靶标形成双链体时)；以及(C)(3'区或第二侧翼序列)包含至少一个核苷类似物(例如，3-5个LNA单元)。
在一些方面中，区域A包含3-5个核苷类似物如LNA，区域B由6-24(例如，6、7、8、9、10、11、12、13或14)个DNA单元组成，并且区域C由3或4个核苷类似物如LNA组成。此类设计包括(A-B-C)3-14-3、3-11-3、3-12-3、3-13-3、4-9-4、4-10-4、4-11-4、4-12-4和5-10-5。在一些方面中，ASO具有LLLDnLLL、LLLLDnLLLL或LLLLLDnLLLLL的设计，其中L是核苷类似物，D是DNA，并且n可以是介于4与24之间的任何整数。在一些方面中，n可以是介于6与14之间的任何整数。在一些方面中，n可以是介于8与12之间的任何整数。在一些方面中，ASO具有LLLMMDnMMLLL、LLLMDnMLLL、LLLLMMDnMMLLLL、LLLLMDnMLLLL、LLLLLLMMDnMMLLLLL或LLLLLLMDnMLLLLL的设计，其中D是DNA，n可以是介于3与15之间的任何整数，L是LNA，并且M是2'MOE。
另外的间隙聚体设计公开于WO2004/046160、WO 2007/146511和WO2008/113832中，其各自特此以引用的方式整体并入。
II.H.核苷酸间键联
本文所述的ASO的单体通过键联基团偶联在一起。合适地，每个单体通过键联基团与3'相邻单体连接。
本领域普通技术人员将理解，在本公开的上下文中，ASO末端的5'单体不包含5'键联基团，尽管它可以或可以不包含5'末端基团。
在一些方面中，连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。术语“键联基团”或“核苷间键联”旨在表示能够将两个核苷共价偶联在一起的基团。非限制性实例包括磷酸基团和硫代磷酸酯基团。
本公开的ASO的核苷或其连续核苷序列通过键联基团偶联在一起。合适地，每个核苷通过键联基团与3'相邻核苷连接。
在一些方面中，核苷间键联从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击具有更强抗性的一种，如可被RNA酶H裂解、还允许反义抑制途径降低靶基因的表达的硫代磷酸酯。在一些方面中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的核苷间键联经修饰。
III.细胞外囊泡，例如外泌体
本文公开了包含ASO的EV，例如外泌体。ASO可以是本文所述的任何ASO或其功能片段。在某些方面中，ASO降低靶细胞中的CEBP/βmRNA或CEBP/β蛋白的水平。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少一个ASO。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少两个ASO，例如，包含第一核苷酸序列的第一ASO和包含第二核苷酸序列的第二ASO。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少三个ASO、至少四个ASO、至少五个ASO、至少六个ASO或多于六个ASO。在一些方面中，第一ASO、第二ASO、第三ASO、第四ASO、第五ASO、第六ASO和/或第九ASO中的每一者都是不同的。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含第一ASO和第二ASO，其中所述第一ASO包含与第一转录物中的第一靶序列互补的第一核苷酸序列，并且其中所述第二ASO包含与所述第一转录物中的第二靶序列互补的第二核苷酸序列。在一些方面中，第一靶序列不与第二靶序列重叠。在一些方面中，第一靶序列包含位于转录物的5'UTR内的至少一个核苷酸，并且第二靶序列不包含位于5'UTR内的核苷酸。在一些方面中，第一靶序列包含位于转录物的3'UTR内的至少一个核苷酸，并且第二靶序列不包含位于3'UTR内的核苷酸。在一些方面中，第一靶序列包含位于转录物的5'UTR内的至少一个核苷酸，并且第二靶序列包含位于3'UTR内的至少一个核苷酸。
在一些方面中，第一ASO靶向外显子-内含子接合点内的序列，并且第二ASO靶向外显子-内含子接合点内的序列。在一些方面中，第一ASO靶向外显子-内含子接合点内的序列，并且第二ASO靶向外显子内的序列。在一些方面中，第一ASO靶向外显子-内含子接合点内的序列，并且第二ASO靶向内含子内的序列。在一些方面中，第一ASO靶向外显子内的序列，并且第二ASO靶向外显子内的序列。在一些方面中，第一ASO靶向内含子内的序列，并且第二ASO靶向外显子内的序列。在一些方面中，第一ASO靶向内含子内的序列，并且第二ASO靶向内含子内的序列。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含第一ASO和第二ASO，其中所述第一ASO包含与第一转录物中的第一靶序列互补的第一核苷酸序列，并且其中所述第二ASO包含与第二转录物中的第二靶序列互补的第二核苷酸序列，其中所述第一转录物与所述第二转录物不是同一基因的产物。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)靶向肿瘤细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、神经元、肝细胞、库普弗细胞、髓系细胞(例如，嗜中性粒细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC，例如单核细胞性MDSC或粒细胞性MDSC)、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞)或它们的任何组合。在一些方面中，EV(例如，外泌体)靶向髓系细胞。在一些方面中，EV(例如，外泌体)靶向巨噬细胞。在某些方面中，EV(例如，外泌体)靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或它们的任何组合。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)降低由CEBP/β上调的一种或多种基因的表达。在一些方面中，EV(例如，外泌体)促进M2巨噬细胞的分化。在一些方面中，EV(例如，外泌体)减少M1巨噬细胞的分化。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗有需要的受试者的癌症。在一些方面中，癌症选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤以及它们的任何组合。在一些方面中，EV(例如，外泌体)增加免疫细胞(例如，巨噬细胞)对肿瘤的浸润。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗受试者的中枢神经系统肿瘤。在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗受试者的脑肿瘤。在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗受试者的成胶质细胞瘤。在一些方面中，成胶质细胞瘤是多形性成胶质细胞瘤(GBM)。在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗受试者的软脑膜癌病。在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)活化中枢神经系统内的巨噬细胞。在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)诱导中枢神经系统内的巨噬细胞的M1极化。在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)活化脑膜巨噬细胞。在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)诱导脑膜巨噬细胞的M1极化。在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)诱导脑膜巨噬细胞的肿瘤浸润。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗有需要的受试者的纤维化。过度M2巨噬细胞活化导致TGFβ和生长因子的持续产生，所述TGFβ和生长因子促进肌成纤维细胞的增殖、EMT/EndoMT的活化和细胞外基质沉积。M2巨噬细胞代表伤口愈合与促纤维化过程恶化之间的转折点。在一些方面中，纤维化选自肝纤维化(NASH)、肝硬化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性溃疡性结肠炎/IBD、膀胱纤维化、肾纤维化、CAPS(穆-韦二氏综合征)、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、陈旧性心肌梗死、胶质瘢痕、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩氏病、杜普伊特伦挛缩、瘢痕疙瘩纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾原性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病/系统性硬化症、粘连性关节囊炎以及它们的任何组合。在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗肝纤维化(NASH)。在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗CAPS(穆-韦二氏综合征)。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗神经变性疾病。在一些方面中，神经变性疾病选自阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、朊病毒病、运动神经元疾病、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症以及它们的任何组合。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)治疗代谢病症/CVD。在一些方面中，代谢病症/CVD选自酸碱失衡、代谢性脑病、钙代谢紊乱、DNA修复缺陷障碍、葡萄糖代谢紊乱、高乳酸血症、铁代谢紊乱、脂质代谢紊乱、吸收不良综合征、代谢综合征X、先天性代谢缺陷、线粒体疾病、磷代谢紊乱、卟啉症、蛋白质稳态缺乏症、代谢性皮肤疾病、消耗综合征、水电解质失衡以及它们的任何组合。
如上文所述，本文所述的EV(例如，外泌体)是直径介于约20-300nm之间的细胞外囊泡。本文所述的EV(例如，外泌体)的大小可根据下文描述的方法测量。
在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)包含双脂质膜(“EV(例如，外泌体)膜”)，所述膜包含内(腔)表面和外表面。在某些方面中，内(腔)表面面向EV(例如，外泌体)的内核(即，腔)。在某些方面中，外表面可与内体、多囊泡体或生产细胞或靶细胞的膜/细胞质接触。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)膜包含脂质和脂肪酸。在一些方面中，EV(例如，外泌体)膜包含磷脂、糖脂、脂肪酸、鞘脂、磷酸甘油酯、固醇、胆固醇和磷脂酰丝氨酸。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)膜包含内部小叶和外部小叶。内部小叶和外部小叶的组成可通过本领域中已知的跨双层分布测定来确定，参见例如,Kuypers等人,BiohimBiophys Acta 1985 819:170。在一些方面中，外部小叶的组成是介于约70％-90％之间的胆碱磷脂、介于约0％-15％之间的酸性磷脂和介于约5％-30％之间的磷脂酰乙醇胺。在一些方面中，内部小叶的组成是介于约15％-40％之间的胆碱磷脂、介于约10％-50％之间的酸性磷脂和介于约30％-60％之间的磷脂酰乙醇胺。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)膜包含一种或多种多糖，诸如聚糖。
在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)包含ASO，其中所述ASO通过支架部分与EV连接，在EV的外表面上或在EV的腔表面上。
在一些方面中，包含ASO的EV(例如，外泌体)在所述ASO与外泌体膜之间包含锚定部分，所述锚定部分任选地包含接头。接头的非限制性实例在本文别处公开。
III.A.锚定部分(AM)
一种或多种锚定部分(AM)可用于将ASO锚定至本公开的EV。在一些方面中，ASO直接与锚定部分连接或通过接头连接。在一些方面中，ASO可通过“反应性基团”(RG；例如胺、硫醇、羟基、羧酸或叠氮化物)与“反应性部分”(RM；例如马来酰亚胺、琥珀酸酯，NHS)之间的反应连接至锚定部分或接头组合。设想了几种潜在合成途径，例如：
[AM]-/反应性部分/+/反应性基团/-[ASO]
[AM]-[接头]n-/反应性部分/+/反应性基团/-[ASO]
[AM]-/反应性部分/+/反应性基团/-[接头]n-[ASO]
[AM]-[接头]n-/反应性部分/+/反应性基团/-[接头]n-[ASO]
锚定部分可插入EV(例如，外泌体)的脂质双层中，从而允许外泌体负载ASO。目前，外泌体作为极性ASO的递送媒介物的商业化的主要障碍是非常低效的负载。这一障碍可通过在将极性ASO负载至外泌体中之前对其进行修饰来克服。因此，如本文所述，ASO的修饰有助于将它们负载至外泌体中。
与先前报告的通过例如电穿孔或阳离子脂质转染将未修饰的ASO引入外泌体中的负载效率相比，本文阐述的使外泌体负载经修饰的极性ASO的方法显著提高负载效率。
在一些方面中，相对于天然(未修饰的)ASO，修饰使ASO的疏水性增加至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10倍。在一些方面中，相对于天然(未修饰的)ASO，修饰使ASO的疏水性增加至少约1、至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约6、至少约7、至少约8、至少约9或至少约10个数量级。
在一些方面中，相对于天然(未修饰的)ASO(例如相应的未修饰的ASO)，修饰使ASO的疏水性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约125％、至少约150％、至少约175％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1000％。可使用任何合适的方法评估疏水性的增加。例如，可通过与在水性溶剂如水中的溶解度相比，测量在有机溶剂如辛醇中的溶解度百分来确定疏水性。
在一些方面中，锚定部分可化学缀合至ASO以增强其疏水特性。在示例性方面中，锚定部分是固醇(例如，胆固醇)、GM1、脂质、维生素、小分子、肽或它们的组合。在一些方面中，所述部分是脂质。在一些方面中，锚定部分是固醇，例如胆固醇。另外的疏水性部分包括例如磷脂、溶血磷脂、脂肪酸或维生素(例如，维生素D或维生素E)。
在一些方面中，锚定部分直接或通过一个或多个接头在ASO的末端缀合(即“末端修饰”)。在其它方面中，锚定部分缀合至ASO的其它部分。
在一些方面中，ASO可包含可检测标记。示例性标记包括荧光标记和/或放射性标记。在一些方面中，其中ASO进行荧光标记，可检测标记可以是例如Cy3。向经修饰的ASO添加可检测标记可用作标记外泌体并跟踪其生物分布的一种方式。在其它方面中，可检测标记可直接地，例如通过标记外泌体脂质和/或外泌体肽而连接至外泌体。
ASO的不同组分(即，锚定部分、接头和接头组合，以及ASO)可通过酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、氨基磷酸酯、磷酸三酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸二酯或硫代磷酸酯键联或可替代地任何或其它键联连接。
在一些方面中，ASO的不同组分可以是使用双功能接头(即，含有两个官能团的接头)的接头，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫代)半胱胺、碘乙酰氧基琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3'-马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、N-(5-氨基戊基)-亚氨基二乙酸等。
III.A.1.锚定部分
如下文详细描述的，能够将ASO锚定至EV(例如，外泌体)的表面的合适锚定部分包含例如固醇(例如，胆固醇)、脂质、溶血磷脂、脂肪酸或脂溶性维生素。
在一些方面中，锚定部分可以是脂质。脂质锚定部分可以是本领域已知的任何脂质，例如棕榈酸或糖基磷脂酰肌醇。在一些方面中，脂质是脂肪酸、磷脂(phosphatide)、磷脂(phospholipid)(例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰乙醇胺)或其类似物(例如，磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、脑磷脂或磷脂酰丝氨酸或其类似物或部分，如其部分水解的部分)。
通常，锚定部分是化学连接的。然而，锚定部分可酶促连接至ASO。在一些方面中，有可能通过改变细胞培养条件来将锚定部分连接至ASO。例如，通过使用限制肉豆蔻酸的培养基，一些其它脂肪酸(包括短链和不饱和脂肪酸)可连接至N末端甘氨酸。例如，据报告，在BK通道中，肉豆蔻酸通过羟基酯键联在翻译后连接至内部丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸残基。
锚定部分可在任何化学上可行的位置，例如在ASO的5'和/或3'端，直接地或通过接头组合间接地缀合至ASO。在一个方面中，锚定部分仅缀合至ASO的3'端。在一个方面中，锚定部分仅缀合至ASO的5'端。在一个方面中，锚定部分缀合在不是ASO的3'端或5'端的位置。
可用于实践本公开的方法的一些类型的膜锚呈现于下表中：
Figure BDA0003596121310001001
在一些方面中，本公开的锚定部分可包含本文公开的两种或更多种类型的锚定部分。例如，在一些方面中，锚定部分可包含两种脂质(例如磷脂和脂肪酸)、或两种磷脂、或两种脂肪酸、或脂质和维生素、或胆固醇和维生素等，合在一起具有6-80个碳原子(即，6-80的等价碳数(ECN))。
在一些方面中，锚定部分的组合，例如脂质(例如，脂肪酸)的组合具有6-80、8-80、10-80、12-80、14-80、16-80、18-80、20-80、22-80、24-80、26-80、28-80、30-80、4-76、6-76、8-76、10-76、12-76、14-76、16-76、18-76、20-76、22-76、24-76、26-76、28-76、30-76、6-72、8-72、10-72、12-72、14-72、16-72、18-72、20-72、22-72、24-72、26-72、28-72、30-72、6-68、8-68、10-68、12-68、14-68、16-68、18-68、20-68、22-68、24-68、26-68、28-68、30-68、6-64、8-64、10-64、12-64、14-64、16-64、18-64、20-64、22-64、24-64、26-64、28-64、30-64、6-60、8-60、10-60、12-56、14-56、16-56、18-56、20-56、22-56、24-56、26-56、28-56、30-56、6-52、8-52、10-52、12-52、14-52、16-52、18-52、20-52、22-52、24-52、26-52、28-52、30-52、6-48、8-48、10-48、12-48、14-48、16-48、18-48、20-48、22-48、24-48、26-48、28-48、30-48、6-44、8-44、10-44、12-44、14-44、16-44、18-44、20-44、22-44、24-44、26-44、28-44、30-44、6-40、8-40、10-40、12-40、14-40、16-40、18-40、20-40、22-40、24-40、26-40、28-40、30-40、6-36、8-36、10-36、12-36、14-36、16-36、18-36、20-36、22-36、24-36、26-36、28-36、30-36、6-32、8-32、10-32、12-32、14-32、16-32、18-32、20-32、22-32、24-32、26-32、28-32或30-32的ECN。
III.A.1.a.胆固醇和其它固醇
在一些方面中，锚定部分包含固醇、类固醇、藿烷类、羟基类固醇、开环类固醇、或它们的具有亲脂性质的类似物。在一些方面中，锚定部分包含固醇，如植物固醇、真菌固醇(mycosterol)或动物固醇。示例性动物固醇包括胆固醇和24S-羟基胆固醇；示例性植物固醇包括麦角固醇(真菌固醇)、菜油固醇、谷固醇和豆固醇。在一些方面中，固醇选自麦角固醇、7-脱氢胆固醇、胆固醇、24S-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇(saringosterol)、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇或豆固醇。固醇可以游离固醇、酰化(固醇酯)、烷基化(固醇烷基醚)、硫酸化(硫酸固醇)形式存在，或与糖苷部分连接(固醇糖苷)，其本身可被酰化(酰化固醇糖苷)。
在一些方面中，锚定部分包含类固醇。在一些方面中，类固醇选自二氢睾酮、熊果醇、龙舌蓝皂苷配基、薯蓣皂苷配基、黄体酮或皮质醇。
例如，固醇可直接或通过接头组合在固醇的可用—OH基团处与ASO缀合。示例性固醇具有如下所示的通用骨架：
Figure BDA0003596121310001021
作为另一实例，麦角固醇具有以下结构：
Figure BDA0003596121310001022
胆固醇具有以下结构：
Figure BDA0003596121310001023
因此，在一些实施方案中，固醇或类固醇的游离—OH基团用于将ASO直接或通过接头组合缀合至固醇(例如胆固醇)或类固醇。
III.A.1.b.脂肪酸
在一些方面中，锚定部分是脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是短链、中链或长链脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是不饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是单不饱和脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是多不饱和脂肪酸，如ω-3(ω-3)或ω-6(ω-6)脂肪酸。
在一些方面中，脂质(例如脂肪酸)具有C2-C60链。在一些实施方案中，脂质(例如脂肪酸)具有C2-C28链。在一些方面中，脂肪酸具有C2-C40链。在一些方面中，脂肪酸具有C2-C12或C4-C12链。在一些方面中，脂肪酸具有C4-C40链。在一些方面中，脂肪酸具有C4-C40、C2-C38、C2-C36、C2-C34、C2-C32、C2-C30、C4-C30、C2-C28、C4-C28、C2-C26、C4-C26、C2-C24、C4-C24、C6-C24、C8-C24、C10-C24、C2-C22、C4-C22、C6-C22、C8-C22、C10-C22、C2-C20、C4-C20、C6-C20、C8-C20、C10-C20、C2-C18、C4-C18、C6-C18、C8-C18、C10-C18、C12-C18、C14-C18、C16-C18、C2-C16、C4-C16、C6-C16、C8-C16、C10-C16、C12-C16、C14-C16、C2-C15、C4-C15、C6-C15、C8-C15、C9-C15、C10-C15、C11-C15、C12-C15、C13-C15、C2-C14、C4-C14、C6-C14、C8-C14、C9-C14、C10-C14、C11-C14、C12-C14、C2-C13、C4-C13、C6-C13、C7-C13、C8-C13、C9-C13、C10-C13、C10-C13、C11-C13、C2-C12、C4-C12、C6-C12、C7-C12、C8-C12、C9-C12、C10-C12、C2-C11、C4-C11、C6-C11、C7-C11、C8-C11、C9-C11、C2-C10、C4-C10、C2-C9、C4-C9、C2-C8、C2-C7、C4-C7、C2-C6或C4-C6链。在一些方面中，脂肪酸具有C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28、C29、C30、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C37、C38、C39、C40、C41、C42、C43、C44、C45、C46、C47、C48、C49、C50、C51、C52、C53、C54、C55、C56、C57、C58、C59或C60链。
在一些方面中，锚定部分包含两种脂肪酸，所述脂肪酸各自独立地选自具有链的脂肪酸，所述链具有前述碳原子范围或碳原子数中的任一者。在一些方面中，一种脂肪酸独立地是具有C6-C21链的脂肪酸，并且一种脂肪酸独立地是具有C12-C36链的脂肪酸。在一些实施方案中，每种脂肪酸独立地具有11、12、13、14、15、16或17个碳原子的链。
合适的脂肪酸包括饱和直链脂肪酸、饱和支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸和多元羧酸。在一些方面中，此类脂肪酸具有多达32个碳原子。
有用的饱和直链脂肪酸的实例包括具有偶数个碳原子的那些，丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸、二十六烷酸、二十八烷酸、三十烷酸和正三十二烷酸，以及具有奇数个碳原子的那些，如丙酸、正戊酸、庚酸、壬酸、十一烷酸、十三烷酸、十五烷酸、十七烷酸、十九烷酸、二十一烷酸、二十三烷酸、二十五烷酸和二十七烷酸。
合适的饱和支链脂肪酸的实例包括异丁酸、异己酸、异辛酸、异癸酸、异月桂酸、11-甲基十二烷酸、异肉豆蔻酸、13-甲基-十四烷酸、异棕榈酸、15-甲基-十六烷酸、异硬脂酸、17-甲基十八烷酸、异花生酸、19-甲基-二十烷酸、α-乙基-己酸、α-己基癸酸、α-庚基十一烷酸、2-癸基十四烷酸、2-十一烷基十四烷酸、2-癸基十五烷酸、2-十一烷基十五烷酸和Fine oxocol 1800酸(Nissan Chemical Industries,Ltd.的产品)。合适的饱和奇数碳支链脂肪酸包括以异丁基封端的反异脂肪酸，如6-甲基-辛酸、8-甲基-癸酸、10-甲基-十二烷酸、12-甲基-十四烷酸、14-甲基-十六烷酸、16-甲基-十八烷酸、18-甲基-二十烷酸、20-甲基-二十二烷酸、22-甲基-二十四烷酸、24-甲基-二十六烷酸和26-甲基二十八烷酸。
合适的不饱和脂肪酸的实例包括4-癸烯酸、癸烯酸、4-十二碳烯酸、5-十二碳烯酸、月桂烯酸、4-十四碳烯酸、5-十四碳烯酸、9-十四碳烯酸、棕榈油酸、6-十八碳烯酸、油酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9-二十碳烯酸、顺式-11-二十碳烯酸、鲸蜡油酸、13-二十二碳烯酸、15-二十四碳烯酸,17-二十六碳烯酸、6,9,12,15-十六碳四烯酸、亚油酸、亚麻酸、α-桐酸、β-桐酸、石榴酸、6,9,12,15-十八碳四烯酸、杷荏酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸等。
合适的羟基脂肪酸的实例包括α-羟基月桂酸、α-羟基肉豆蔻酸、α-羟基棕榈酸、α-羟基硬脂酸、ω-羟基月桂酸、α-羟基花生酸、9-羟基-12-十八碳烯酸、蓖麻油酸、α-羟基山嵛酸、9-羟基-反式-10,12-十八碳二烯酸、粗糠柴酸、番红醇酸、9,10-二羟基硬脂酸、12-羟基硬脂酸等。
合适的多元羧酸的实例包括草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、D,L-苹果酸等。
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、山嵛酸、二十三酸、木蜡酸、二十五酸、蜡酸、二十七酸、褐煤酸、二十九酸、蜂花酸、三十一酸、紫胶蜡酸、叶虱酸、格地酸、三十六酸、三十六烷酸、三十七烷酸和三十八烷酸。
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、亚油酸、γ-亚油酸、二高-γ-亚油酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、棕榈油酸、异油酸、二十烯酸(paullinic acid)、油酸、反油酸、巨头鲸鱼酸(gondoic acid)、芥酸、神经酸、二十碳三烯酸(mead acid)、肾上腺酸、bosseopentaenoic酸、ozubondo酸、沙丁鱼酸(sardine acid)、鲱鱼酸(herring acid)、二十二碳六烯酸或二十四碳五烯酸，或另一种单不饱和或多不饱和脂肪酸。
在一些方面中，脂肪酸中的一者或两者是必需脂肪酸。鉴于某些必需脂肪酸的有益健康作用，可通过在治疗剂中包含此类脂肪酸来增加所公开的负载治疗剂的外泌体的治疗益处。在一些方面中，必需脂肪酸是选自由以下组成的组的n-6或n-3必需脂肪酸：亚麻酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯n-6酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、20:4n-3酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯n-3酸或二十二碳六烯酸。
在一些方面中，每种脂肪酸独立地选自全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十四碳五烯酸、二十四碳六烯酸或硫辛酸。在其它方面中，脂肪酸选自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或硫辛酸。脂肪酸的其它实例包括全顺式-7,10,13-十六碳三烯酸、α-亚麻酸(ALA或全顺式-9,12,15-十八碳三烯酸)、十八碳四烯酸(STD或全顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸)、二十碳三烯酸(ETE或全顺式-11,14,17-二十碳三烯酸)、二十碳四烯酸(ETA或全顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA，鰶鱼酸或全顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸)、二十二碳六烯酸(DHA或全顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸)、二十四碳五烯酸(全顺式-9,12,15,18,21-二十二碳六烯酸)或二十四碳六烯酸(尼生酸(nisinic acid)或全顺式-6,9,12,15,18,21-二十四碳烯酸)。在一些方面中，脂肪酸是中链脂肪酸，如硫辛酸。
脂肪酸链在其链长度方面差异很大，并且可根据链长进行分类，例如短至极长。短链脂肪酸(SCFA)是具有约五个或更少碳的链的脂肪酸(例如丁酸)。在一些方面中，脂肪酸是SCFA。中链脂肪酸(MCFA)包括具有约6-12个碳的链的脂肪酸，其可形成中链甘油三酯。在一些方面中，脂肪酸是MCFA。长链脂肪酸(LCFA)包括具有13-21个碳的链的脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是LCFA。在一些方面中，脂肪酸是LCFA。极长链脂肪酸(VLCFA)包括具有22个或更多个碳，如22-60、22-50或22-40个碳的链的脂肪酸。在一些方面中，脂肪酸是VLCFA。
III.A.1.c.磷脂
在一些方面中，所述锚定部分包含磷脂。磷脂是一类为所有细胞膜的主要组分的脂质。由于它们的两亲特性，它们可形成脂质双层。磷脂分子的结构通常由两个疏水性脂肪酸“尾部”和由磷酸酯基团组成的亲水性“头部”组成。例如，磷脂可以是根据下式的脂质：
Figure BDA0003596121310001071
其中Rp代表磷脂部分，并且R1和R2代表可相同或不同的具有或不具有不饱和度的脂肪酸部分。
磷脂部分可选自例如由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
特定的磷脂可促进与脂质双层，例如外泌体膜的脂质双层的融合。例如，阳离子磷脂可与膜的一种或多种带负电荷的磷脂相互作用。磷脂与膜的融合可允许含脂质组合物的一种或多种要素与所述膜结合或穿过所述膜。
脂肪酸部分可选自例如由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在本公开中用作锚定部分的磷脂可以是天然或非天然磷脂。还考虑了非天然磷脂物质，包括具有修饰和取代(包括支化、氧化、环化和炔烃)的天然物质。例如，磷脂可用一种或多种炔烃官能化与一种或多种炔烃(例如，其中一个或多个双键被三键替代的烯基)交联。在适当反应条件下，炔烃基团可在暴露于叠氮化物时经历铜催化的环加成反应。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。
可用于本文公开的锚定部分的磷脂的实例包括
·磷脂酰乙醇胺：例如，二月桂酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酰乙醇胺、1-油烯基-2-棕榈酰基磷脂酰乙醇胺和二芥酰基磷脂酰乙醇胺；
·磷脂酰甘油：例如，二月桂酰基磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油、二棕榈酰基磷脂酰甘油、二硬脂酰基磷脂酰甘油、二油酰基磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰甘油、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰甘油和二芥酰基磷脂酰甘油；
·磷脂酰丝氨酸：例如，诸如二月桂酰基磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰基磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰丝氨酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸和二芥酰基磷脂酰丝氨酸；
·磷脂酸：例如，二月桂酰基磷脂酸、二肉豆蔻酰基磷脂酸、二棕榈酰基磷脂酸、二硬脂酰基磷脂酸、二油酰基磷脂酸、1-棕榈酰基-2-油烯基磷脂酸、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酸和二芥酰基磷脂酸；以及，
·磷脂酰肌醇：例如，二月桂酰基磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰肌醇、二棕榈酰基磷脂酰肌醇、二硬脂酰基磷脂酰肌醇、二油酰基磷脂酰肌醇、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰肌醇、1-油烯基-2-棕榈酰基-磷脂酰肌醇和二芥酰基磷脂酰肌醇。
磷脂可以是对称或不对称类型。如本文所用，术语“对称磷脂”包括具有匹配的脂肪酸部分和鞘脂的甘油磷脂，其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含相当数量的碳原子。如本文所用，术语“不对称磷脂”包括溶血脂质，具有不同脂肪酸部分的甘油磷脂(例如，具有不同碳原子数和/或不饱和度(例如，双键)的脂肪酸部分)，和其中可变脂肪酸部分和鞘氨醇主链的烃链包含不同数量的碳原子的鞘脂(例如，可变脂肪酸部分包含比烃链多至少两个碳原子或比烃链少至少两个碳原子)。
在一些方面中，锚定部分包含至少一种对称磷脂。对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：
1,2-二丙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(03:0PC)、
1,2-二丁酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(04:0PC)、
1,2-二戊酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(05:0PC)、
1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0PC)、
1,2-二庚酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0PC)、
1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0PC)、
1,2-二壬酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0PC)、
1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0PC)、
1,2-双十一烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0PC，DUPC)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0PC)、
1,2-双十三烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0PC)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0PC，DMPC)、
1,2-双十五烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0PC)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0PC，DPPC)、
1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(4ME 16:0PC)、
1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0PC)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0PC，DSPC)、
1,2-双十九烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(19:0PC)、
1,2-双二十烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:0PC)、
1,2-双二十一烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(21:0PC)、
1,2-二山嵛酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:0PC)、
1,2-双二十三烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(23:0PC)、
1,2-双二十四烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:0PC)、
1,2-二肉豆蔻脑酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-顺式)PC)、
1,2-二反肉豆蔻脑酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-顺式)PC)、
1,2-二反棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二异岩芹酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-顺式)PC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-顺式)PC，DOPC)、
1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-反式)PC)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(顺式)PC，DLPC)、
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(顺式)PC，DLnPC)、
1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:1(顺式)PC)、
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:4(顺式)PC，DAPC)、
1,2-二瓢儿菜基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:1(顺式)PC)、
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:6(顺式)PC，DHAPC)、
1,2-二神经酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:1(顺式)PC)、
1,2-二己酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(06:0PE)、
1,2-二辛酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(08:0PE)、
1,2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(10:0PE)、
1,2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(12:0PE)、
1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0PE)、
1,2-双十五烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(15:0PE)、
1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0PE)、
1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0PE)、
1,2-双十七烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(17:0PE)、
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0PE，DSPE)、
1,2-二棕榈油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:1PE)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-顺式)PE，DOPE)、
1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1(Δ9-反式)PE)、
1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:2PE，DLPE)、
1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:3PE，DLnPE)、
1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(20:4PE，DAPE)、
1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(22:6PE，DHAPE)、
1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、
1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)以及它们的任何组合。
在一些方面中，锚定部分包含选自由以下组成的非限制性组的至少一种对称磷脂：DLPC、DMPC、DOPC、DPPC、DSPC、DUPC、18:0二醚PC、DLnPC、DAPC、DHAPC、DOPE、4ME 16:0PE、DSPE、DLPE、DLnPE、DAPE、DHAPE、DOPG以及它们的任何组合。
在一些方面中，锚定部分包含至少一种不对称磷脂。不对称磷脂可选自由以下组成的非限制性组：
1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-16:0PC，MPPC)、
1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-18:0PC，MSPC)、
1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-02:0PC)、
1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-14:0PC，PMPC)、
1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:0PC，PSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:1PC，POPC)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-18:2PC，PLPC)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0-20:4PC)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0-22:6PC)、
1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-14:0PC，SMPC)、
1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-16:0PC，SPPC)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:1PC，SOPC)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-20:4PC)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0-22:6PC)、
1-油酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-14:0PC，OMPC)、
1-油酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-16:0PC，OPPC)、
1-油酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1-18:0PC，OSPC)、
1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1PE，POPE)、
1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2PE)、
1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4PE)、
1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6PE)、
1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1PE)、
1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2PE)、
1-硬脂酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4PE)、
1-硬脂酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6PE)、
1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及
它们的任何组合。
为了提供更显著的核酸酶抗性、细胞摄取效率和更显著的RNA干扰效应，磷脂酰乙醇胺可用作锚定部分，例如二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油烯基-磷脂酰乙醇胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
可根据脂质和接头或ASO的类型适当地选择脂质(例如，磷脂)和接头组合或BAM(例如ASO)的结合位点。除脂质的疏水性基团以外的任何位置都可通过化学键与接头或ASO连接。例如，当使用磷脂酰乙醇胺时，可通过在磷脂酰乙醇胺的氨基与接头或ASO之间形成酰胺键等来进行连接。当使用磷脂酰甘油时，可通过在甘油残基的羟基与接头或ASO之间形成酯键、醚键等来进行连接。当使用磷脂酰丝氨酸时，可通过在丝氨酸残基的氨基或羧基与接头或ASO之间形成酰胺键或酯键等来进行连接。当使用磷脂酸时，可通过在磷酸酯残基与接头或ASO之间形成磷酸酯键等来进行连接。当使用磷脂酰肌醇时，可通过在肌醇残基的羟基与接头或ASO之间形成酯键、醚键等来进行连接。
III.A.1.d.溶血脂质(例如溶血磷脂)
在一些方面中，锚定部分包含溶血脂质，例如溶血磷脂。溶血脂质是脂质的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已被除去(通常通过水解)。溶血磷脂是磷脂的衍生物，其中一个或两个脂肪酰基链已通过水解除去。
在一些方面中，锚定部分包含上文公开的任何磷脂，其中一个或两个酰基链已通过水解除去，并且因此所得溶血磷脂包含一个脂肪酸酰基链或不包含脂肪酸酰基链。
在一些方面中，锚定部分包含溶血性甘油磷脂、溶血性鞘糖脂、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰肌醇或溶血性磷脂酰丝氨酸。
在一些方面中，锚定部分包含选自由以下组成的非限制性组的溶血脂质：
1-己酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(06:0Lyso PC)、
1-庚酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(07:0Lyso PC)、
1-辛酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(08:0Lyso PC)、
1-壬酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(09:0Lyso PC)、
1-癸酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(10:0Lyso PC)、
1-十一烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(11:0Lyso PC)、
1-月桂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(12:0Lyso PC)、
1-十三烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(13:0Lyso PC)、
1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:0Lyso PC)、
1-十五烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(15:0Lyso PC)、
1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:0Lyso PC)、
1-十七烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(17:0Lyso PC)、
1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:0Lyso PC)、
1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1Lyso PC)、
1-十九烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(19:0Lyso PC)、
1-二十烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:0Lyso PC)、
1-山嵛酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:0Lyso PC)、
1-二十四烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:0Lyso PC)、
1-二十六烷酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(26:0Lyso PC)、
1-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(14:0Lyso PE)、
1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(16:0Lyso PE)、
1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:0Lyso PE)、
1-油酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(18:1Lyso PE)、
1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)以及
它们的任何组合。
III.A.1.e.维生素
在一些方面中，锚定部分包含亲脂性维生素，例如叶酸、维生素A、维生素E或维生素K。
在一些方面中，锚定部分包含维生素A。维生素A是一组不饱和营养有机化合物，其包括视黄醇、视黄醛、视黄酸和几种维生素原A类胡萝卜素(最显著的是β-胡萝卜素)。在一些方面中，锚定部分包含视黄醇。在一些方面中，锚定部分包含类视黄醇。类视黄醇是一类为维生素A的同效维生素或与其化学相关的化学化合物。在一些方面中，锚定部分包含第一代类视黄醇(例如，视黄醇、维甲酸、异维甲酸或阿利维甲酸)、第二代类视黄醇(例如，依曲替酯或阿曲汀)、第三代类视黄醇(例如，阿达帕林、贝沙罗汀或他扎罗汀)或它们的任何组合。
Figure BDA0003596121310001181
在一些方面中，锚定部分包含维生素E。生育酚是一类甲基化酚，其中许多具有维生素E活性。因此，在一些方面中，锚定部分包含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚或它们的组合。
Figure BDA0003596121310001191
生育三烯酚也具有维生素E活性。生育三烯酚与生育酚之间的关键化学结构差异在于与生育酚的饱和侧链相比，生育三烯酚具有含三个碳-碳双键的不饱和类异戊二烯侧链。在一些方面中，锚定部分包含α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚或它们的组合。生育三烯酚可用下式表示
Figure BDA0003596121310001192
α(α)-生育三烯酚：R1＝Me，R2＝Me，R3＝Me；
β(β)-生育三烯酚：R1＝Me，R2＝H，R3＝Me；
γ(γ)-生育三烯酚：R1＝H，R2＝Me，R3＝Me；
δ(δ)-生育三烯酚：R1＝H，R2＝H，R3＝Me。
在一些方面中，锚定部分包含维生素K。在化学上，维生素K家族包含2-甲基-1.4-萘醌(3-)衍生物。维生素K包含两种天然同效维生素：维生素K1和维生素K2。维生素K1(也称为植物甲萘醌、叶绿醌或(E)-植物甲萘醌)的结构以存在植基为特征。维生素K2(甲基萘醌)的结构以分子中存在的聚异戊二烯侧链为特征，所述侧链可含有6至13个异戊二烯基单元。因此，维生素K2由许多相关的化学亚型组成，具有不同长度的由类异戊二烯原子组组成的碳侧链。MK-4是维生素K2的最常见形式。诸如MK-7、MK-8和MK-9的长链形式在发酵食品中占主导地位。更长链形式的维生素K2，诸如MK-10至MK-13由细菌合成，但它们未被良好吸收，并且几乎没有生物学功能。除了维生素K的天然形式外，还存在许多合成形式的维生素K，诸如维生素K3(甲萘醌；2-甲基萘-1,4-二酮)、维生素K4和维生素K5。
因此，在一些方面中，锚定部分包含维生素K1、K2(例如，MK-4、MK-5、MK-6、MK-7、MK-8、MK-9、MK-10、MK-11、MK-12或MK-13)、K3、K4、K5或它们的任何组合。
Figure BDA0003596121310001201
III.A.2.接头组合
在一些方面中，ASO通过接头组合与本文公开的疏水性膜锚定部分连接，所述接头组合可包含可裂解接头和/或不可裂解接头的任何组合。接头组合的主要功能是提供一个或多个锚定部分与BAM靶标之间的最佳间距。例如，在ASO的情况下，接头组合应减少空间位阻并定位ASO，以便它可与靶核酸(例如mRNA或miRNA)相互作用。
接头可易于裂解(“可裂解接头”)，从而促进生物活性分子的释放。因此，在一些方面中，本文公开的接头组合可包含可裂解接头。在生物活性分子保持活性的条件下，此类可裂解接头可能例如易感于酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。或者，接头可基本上抵抗裂解(“不可裂解接头”)。在一些方面中，可裂解接头包含间隔子。在一些方面中，间隔子是PEG。
在一些方面中，接头组合包含至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个或更多个本文公开的不同接头。在一些方面中，接头组合中的接头可通过酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)连接。
在一些方面中，接头是锚定部分与BAM(例如ASO)之间的直接键。
III.A.2.a.不可裂解接头
在一些方面中，接头组合包含“不可裂解接头”。不可裂解接头是能够以稳定的共价方式连接本公开的经修饰的生物活性分子的两种或更多种组分(例如，生物活性分子和锚定部分；生物活性分子和可裂解接头；锚定部分和可裂解接头)并且不属于上文针对可裂解接头列出的类别的任何化学部分。因此，不可裂解接头基本上耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键诱导的裂解。
此外，不可裂解是指接头中或与接头相邻的化学键在环状二核苷酸和/或抗体不会失去其活性的条件下经受由酸、光不稳定裂解剂、肽酶、酯酶或裂解二硫键的化学或生理化合物诱导的裂解的能力。在一些方面中，生物活性分子通过另一个接头(例如自分解性接头)连接至接头。
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，所述不可裂解接头包含例如四甘醇(TEG)、六甘醇(HEG)、聚乙二醇(PEG)、琥珀酰亚胺或它们的任何组合。在一些方面中，不可裂解接头包含间隔子单元以将生物活性分子连接至不可裂解接头。
在一些方面中，一个或多个不可裂解接头包含连接在一起的较小单元(例如，HEG、TEG、甘油、C2至C12烷基等)。在一个方面中，键联是酯键联(例如，磷酸二酯或硫代磷酸酯)或其它键联。
III.A.2.b.乙二醇(HEG、TEG、PEG)
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，其中所述不可裂解接头包含特征在于式R3-(O-CH2-CH2)n-或R3-(0-CH2-CH2)n-O-的聚乙二醇(PEG)，其中R3是氢、甲基或乙基，并且n具有2至200的值。在一些方面中，接头包含间隔子，其中所述间隔子是PEG。
在一些方面中，PEG接头是低聚乙二醇，例如二甘醇、三甘醇、四甘醇(TEG)、五甘醇或六甘醇(HEG)接头。
在一些方面中，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17,18,19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200的值。
在一些方面中，n介于2与10之间、介于10与20之间、介于20与30之间、介于30与40之间、介于40与50之间、介于50与60之间、介于60与70之间、介于70与80之间、介于80与90之间、介于90与100之间、介于100与110之间、介于110与120之间、介于120与130之间、介于130与140之间、介于140与150之间、介于150与160之间、介于160与170之间、介于170与180之间、介于180与190之间或介于190与200之间。
在一些具体方面中，n具有3至200、3至20、10至30或9至45的值。
在一些方面中，PEG是支链PEG。支链PEG具有3至10个源自中心核心基团的PEG链。
在某些方面中，PEG部分是单分散聚乙二醇。在本公开的上下文中，单分散聚乙二醇(mdPEG)是具有单一的、限定链长和分子量的PEG。mdPEG通常通过色谱法从聚合混合物中分离而产生。在某些式中，单分散PEG部分被指定为缩写mdPEG。
在一些方面中，PEG是星形PEG。星形PEG具有10至100个源自中心核心基团的PEG链。
在一些方面中，PEG是梳形PEG。梳形PEG具有通常接枝到聚合物主链上的多个PEG链。
在某些方面中，PEG具有介于100g/mol与3000g/mol之间，特别是介于100g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约100g/mol至2000g/mol的摩尔质量。在某些方面中，PEG具有介于200g/mol与3000g/mol之间，特别是介于300g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约400g/mol至2000g/mol的摩尔质量。
在一些方面中，PEG是PEG100、PEG200、PEG300、PEG400、PEG500、PEG600、PEG700、PEG800、PEG900、PEG1000、PEG1100、PEG1200、PEG1300、PEG1400、PEG1500、PEG1600、PEG1700、PEG1800、PEG1900、PEG2000、PEG2100、PEG2200、PEG2300、PEG2400、PEG2500、PEG1600、PEG1700、PEG1800、PEG1900、PEG2000、PEG2100、PEG2200、PEG2300、PEG2400、PEG2500、PEG2600、PEG2700、PEG2800、PEG2900或PEG3000。在一个特定方面中，PEG是PEG400。在另一个特定方面中，PEG是PEG2000。
在一些方面中，本公开的接头组合可包含若干PEG接头，例如侧接PEG、HEG或TEG接头的可裂解接头。
在一些方面中，接头组合包含(HEG)n和/或(TEG)n，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
III.A.2.c.甘油和聚甘油(PG)
在一些方面中，接头组合包含不可裂解接头，所述不可裂解接头包含由式((R3—O—(CH2—CHOH—CH2O)n—)描述的甘油单元或聚甘油(PG)，其中R3是氢、甲基或乙基，并且n具有3至200的值。在一些方面中，n具有3至20的值。在一些方面中，n具有10至30的值。
在一些方面中，PG接头是二甘油、三甘油、四甘油(TG)、五甘油或六甘油(HG)接头。
在一些方面中，n具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17,18,19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、189、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200的值。
在一些方面中，n介于2与10之间、介于10与20之间、介于20与30之间、介于30与40之间、介于40与50之间、介于50与60之间、介于60与70之间、介于70与80之间、介于80与90之间、介于90与100之间、介于100与110之间、介于110与120之间、介于120与130之间、介于130与140之间、介于140与150之间、介于150与160之间、介于160与170之间、介于170与180之间、介于180与190之间或介于190与200之间。
在这些实施方案的一些替代方案中，n具有9至45的值。在一些方面中，异源部分是由式(R3—O—(CH2—CHOR5—CH2—O)n—)描述的支链聚甘油，其中R5是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOH—CH2—O)n—)描述的直链甘油链，并且R3是氢、甲基或乙基。在一些方面中，异源部分是由式(R3—O—(CH2—CHOR5—CH2—O)n—)描述的超支化聚甘油，其中R5是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOR6—CH2—O)n—)描述的甘油链，其中R6是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOR7—CH2—O)n—)描述的甘油链，其中R7是氢；或由式(R3—O—(CH2—CHOH—CH2—O)n—)描述的直链甘油链，并且R3是氢、甲基或乙基。超支化甘油及其合成方法描述于Oudshorn等人(2006)Biomateri als 27:5471-5479；Wilms等人(20100Acc.Chem.Res.43,129-41以及其中引用的参考文献中。
在某些方面中，PG具有介于100g/mol与3000g/mol之间，特别是介于100g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约100g/mol至2000g/mol的摩尔质量。在某些方面中，PG具有介于200g/mol与3000g/mol之间，特别是介于300g/mol与2500g/mol之间、更特别地大约400g/mol至2000g/mol的摩尔质量。
在一些方面中，PG是PG100、PG200、PG300、PG400、PG500、PG600、PG700、PG800、PG900、PG1000、PG1100、PG1200、PG1300、PG1400、PG1500、PG1600、PG1700、PG1800、PG1900、PG2000、PG2100、PG2200、PG2300、PG2400、PG2500、PG1600、PG1700、PG1800、PG1900、PG2000、PG2100、PG2200、PG2300、PG2400、PG2500、PG2600、PG2700、PG2800、PG2900或PG3000。在一个特定方面中，PG是PG400。在另一个特定方面中，PG是PG2000。
在一些方面中，接头组合包含(甘油)n、和/或(HG)n和/或(TG)n，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
III.A.2.d.脂肪族(烷基)接头
在一些方面中，接头组合包含至少一个脂肪族(烷基)接头，例如丙基、丁基、己基或C2-C12烷基，如C2-C10烷基或C2-C6烷基。
在一些方面中，接头组合包含烷基链，例如未取代的烷基。在一些方面中，接头组合包含取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基Reyl烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基或烯基杂环基炔基。
任选地，这些组分被取代。取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直链或支链烷基(如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰胺、磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br或I)、酰胺、烷基酰胺(如酰胺C1-C12烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸卤化物、醚、磺酰基卤化物、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、卤代甲酸酯、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、烷基磺酸酯、C(═O)CH═CHC(═O)(马来酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α,β-不饱和羰基、烷基汞或α,β-不饱和砜。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，意指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(例如，C1-C10意指1至10个碳原子)。通常，烷基将具有1至24个碳原子，例如具有1至10个碳原子、1至8个碳原子或1至6个碳原子。“低级烷基”是具有1至4个碳原子的烷基。术语“烷基”包括二价和多价基团。例如，在适当的情况下，例如，当式表示烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“烷基”包括“亚烷基”。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基以及例如正戊基、正己基、正庚基和正辛基的同系物和异构体。
术语“亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，意指二价(双基)烷基，其中烷基在本文中定义。“亚烷基”例如但不限于–CH2CH2CH2CH2-。通常，“亚烷基”将具有1至24个碳原子，例如，具有10个或更少碳原子(例如，1至8个或1至6个碳原子)。“低级亚烷基”是具有1至4个碳原子的亚烷基。
术语“烯基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个双键的直链或支链烃基。典型的烯基具有2至10个碳原子和至少一个双键。在一个实施方案中，烯基具有2至8个碳原子或2至6个碳原子和1至3个双键。示例性烯基包括乙烯基、2-丙烯基、1-丁-3-烯基、巴豆基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、2-异戊烯基、1-戊-3-烯基、1-己-5-烯基等。
术语“炔基”，本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有2至24个碳原子和至少一个三键的直链或支链、不饱和或多不饱和烃基。典型的“炔基”具有2至10个碳原子和至少一个三键。在本发明的一个方面中，炔基具有2至6个碳原子和至少一个三键。示例性炔基包括丙-1-炔基、丙-2-炔基(即，炔丙基)、乙炔基和3-丁炔基。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子连接至分子的其余部分的烷基。
术语“杂烷基”，本身或与另一个术语组合，意指由指定数目的碳原子(例如，C2-C10或C2-C8)和选自例如N、O、S、Si、B和P(在一个实施方案中，N、O和S)的至少一个杂原子组成的稳定的直链或支链烃基团，其中氮、硫和磷原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。一个或多个杂原子被置于杂烷基的任何内部位置。杂烷基的实例包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-CH2-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，诸如例如-CH2-NH-OCH3和–CH2-O-Si(CH3)3。
类似地，术语“杂亚烷基”，本身或作为另一取代基的一部分，是指衍生自杂烷基的二价基团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和–CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。通常，杂烷基将具有3至24个原子(碳和杂原子，不包括氢)(3至24元杂烷基)。在另一个实例中，杂烷基总共具有3至10个原子(3至10元杂烷基)或3至8个原子(3至8元杂烷基)。在适当的情况下，例如，当式表示杂烷基是二价时或者当取代基连接在一起形成环时，术语“杂烷基”包括“杂亚烷基”。
术语“环烷基”，本身或与其它术语组合，表示饱和或不饱和的非芳族碳环基团，所述基团具有3至24个碳原子，例如具有3至12个碳原子(例如，C3-C8环烷基或C3-C6环烷基)。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。术语“环烷基”也包括桥联多环(例如，双环)结构，诸如降冰片基、金刚烷基和双环[2.2.1]庚基。“环烷基”可与至少一个(例如，1至3个)选自芳基(例如，苯基)、杂芳基(例如，吡啶基)和非芳族(例如，碳环或杂环)环的其它环稠合。当“环烷基”包括稠合的芳基、杂芳基或杂环时，则“环烷基”通过碳环连接至分子的其余部分。
术语“杂环烷基”、“杂环的”、“杂环”或“杂环基”，本身或与其它术语组合，表示本领域技术人员已知的稳定组合的含有至少一个并且至多5个选自例如，N、O、S、Si、B和P(例如，N、O和S)的杂原子的碳环非芳族环(例如，3至8元环和例如，4、5、6或7元环)，其中氮、硫和磷原子任选被氧化，并且一个或多个氮原子任选被季铵化(例如，1至4个选自氮、氧和硫的杂原子)，或含有至少一个并且至多10个杂原子(例如，1至5个选自N、O和S的杂原子)的4至8元环的稠环系统。示例性杂环烷基包括稠合苯环。当“杂环”基团包括稠合的芳基、杂芳基或环烷基环时，则“杂环”基团通过杂环连接至分子的其余部分。杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。
本公开的示例性杂环烷基或杂环基团包括吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S,S-二氧化物、哌嗪基、高哌嗪基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、四氢吡喃基、哌啶基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、高哌啶基、高吗啉基、高硫代吗啉基(homothiomorpholinyl)、高硫代吗啉基S,S-二氧化物、噁唑烷酮基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、二氢吡唑基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、四氢噻吩基S-氧化物、四氢噻吩基S,S-二氧化物、高硫代吗啉基S-氧化物、1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
“芳基”意指具有单环(例如，苯基)或稠合至其它芳族或非芳族环(例如，1至3个其它环)的5、6或7元芳族碳环基团。当“芳基”包括非芳族环(诸如在1,2,3,4-四氢萘基中)或杂芳基时，则“芳基”通过芳环(例如，苯环)连接至分子的其余部分。芳基是任选取代的(例如，具有本文所述的1至5个取代基)。在一个实例中，芳基具有6至10个碳原子。芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、喹啉、茚满基、茚基、二氢萘基、芴基、四氢萘基(tetralinyl)、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基或6,7,8,9-四氢-5H-苯并[a]环庚烯基。在一个实施方案中，芳基选自苯基、苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯基和萘基。在另一个实施方案中，芳基是苯基。
术语“芳基烷基”或“芳烷基”旨在包括其中芳基或杂芳基与烷基连接以生成基团-烷基-芳基和-烷基-杂芳基(其中烷基、芳基和杂芳基在本文中定义)的那些基团。示例性“芳基烷基”或“芳烷基”包括苄基、苯乙基、吡啶基甲基等。
“芳氧基”意指基团-O-芳基，其中芳基如本文所定义。在一个实例中，芳氧基的芳基部分是苯基或萘基。在一个实施方案中，芳氧基的芳基部分是苯基。
术语“杂芳基”或“杂芳族”是指含有至少一个选自N、O、S、Si和B(例如，N、O和S)的杂原子(例如，1至5个杂原子，诸如1-3个杂原子)的多不饱和的5、6或7元芳族部分，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选被季铵化。“杂芳基”可以是单环或与其它芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基环(例如，1至3个其它环)稠合。当“杂芳基”包括稠合的芳基、环烷基或杂环烷基环时，则“杂芳基”通过杂芳环连接至分子的其余部分。杂芳基可通过碳或杂原子连接至分子的其余部分。
在一个实例中，杂芳基具有4至10个碳原子和1至5个选自O、S和N的杂原子。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、嘧啶基、喹啉基、苯并噻吩基、吲哚基、吲哚啉基、哒嗪基、吡嗪基、异吲哚基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑基、异噁唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、吲哚嗪基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、异噻唑基、萘啶基、异色满基、色满基、四氢异喹啉基、异吲哚啉基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噁唑基、吡啶并吡啶基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、嘌呤基、苯并二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、三嗪基、蝶啶基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、二氢苯并异噁嗪基(dihydrobenzisoxazinyl)、苯并异噁嗪基(benzisoxazinyl)、苯并噁嗪基、二氢苯并异噻嗪基(dihydrobenzisothiazinyl)、苯并吡喃基、苯并噻喃基、色酮基、色满酮基(chromanonyl)、吡啶基-N-氧化物、四氢喹啉基、二氢喹啉基、二氢喹啉酮基、二氢异喹啉酮基、二氢香豆素基、二氢异香豆素基、异吲哚啉酮基(isoindolinonyl)、苯并二噁烷基、苯并噁唑啉酮基(benzoxazolinonyl)、吡咯基N-氧化物、嘧啶基N-氧化物、哒嗪基N-氧化物、吡嗪基-N-氧化物、喹啉基-N-氧化物、吲哚基N-氧化物、吲哚啉基N-氧化物、异喹啉基N-氧化物、喹唑啉基N-氧化物、喹喔啉基N-氧化物、酞嗪基N-氧化物、咪唑基N-氧化物、异噁唑基N-氧化物、噁唑基N-氧化物、噻唑基N-氧化物、吲哚嗪基N-氧化物、吲唑基N-氧化物、苯并噻唑基N-氧化物、苯并咪唑基N-氧化物、吡咯基N-氧化物、噁二唑基N-氧化物、噻二唑基N-氧化物、三唑基N-氧化物、四唑基N-氧化物、苯并噻喃基S-氧化物、苯并噻喃基S,S-二氧化物。示例性杂芳基包括咪唑基、吡唑基、噻二唑基、三唑基、异噁唑基、异噻唑基、咪唑基、噻唑基、噁二唑基和吡啶基。其它示例性杂芳基包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、吡啶-4-基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、6-喹啉基。以上所提到的芳环和杂芳环体系中每个的取代基选自由以下所述的可接受的芳基取代基组成的组。
脂肪族接头的实例包括以下结构：
—O—CO—O—
—NH—CO—O—
—NH—CO—NH—
—NH—(CH2)n1—
—S—(CH2)n1—
—CO—(CH2)n1—CO
—CO—(CH2)n1—NH—
—NH—(CH2)n1—NH—
—CO—NH—(CH2)n1—NH—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—NH—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—NH—C—(═S)——CO—O—(CH2)n1—O—CO—
—C(═S)—O—(CH2)n1—O—CO—
—C(═S)—O—(CH2)n1—O—C—(═S)—
—CO—NH—(CH2)n1—O—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—C—(═S)—
—CO—NH—(CH2)n1—O—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—CO—
—C(═S)—O—(CH2)n1—NH—CO—
—C(═S)—NH—(CH2)n1—O—C—(═S)—
—NH—(CH2CH2O)n2—CH(CH2OH)—
—NH—(CH2CH2O)n2—CH2—
—NH—(CH2CH2O)n2—CH2—CO—
—O—(CH2)n3—S—S—(CH2)n4—O—P(═O)2—
—CO—(CH2)n3—O—CO—NH—(CH2)n4—
—CO—(CH2)n3—CO—NH—(CH2)n4—
—(CH2)n1NH—
—C(O)(CH2)n1NH—
—C(O)—(CH2)n1-C(O)—
—C(O)—(CH2)n1-C(O)O—
—C(O)—O—
—C(O)—(CH2)n1-NH—C(O)—
—C(O)—(CH2)n1—
—C(O)—NH—
—C(O)—
—(CH2)n1-C(O)—
—(CH2)n1-C(O)O—
—(CH2)n1—
—(CH2)n1-NH—C(O)—
n1是介于1与40之间(例如，2至20或2至12)的整数；n2是介于1与20之间(例如，1至10或1至6)的整数；n3和n4可相同或不同，并且是介于1与20之间(例如，1至10或1至6)的整数。
在一些方面中，接头组合包含(C3)n、(C4)n、(C5)n、(C6)n、(C7)n或(C8)n或它们的组合，其中n是介于1与50之间的整数，并且每个单元例如通过磷酸酯接头、硫代磷酸酯键联或它们的组合连接。
III.A.3.可裂解接头
在一些方面中，本文公开的ASO的不同组分可以是可裂解接头的接头。术语可裂解接头是指包含至少一个可断裂或裂解的键联或化学键的接头。如本文所用，术语裂解是指以产生两个或更多个相对较小分子的方式使相对大的分子中的一个或多个化学键断裂。裂解可例如由例如核酸酶、肽酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶或还原酶介导，或者由特定物理化学条件，例如氧化还原环境、pH、活性氧类的存在或特定波长的光介导。
在一些方面中，如本文所用的术语“可裂解”是指例如可快速降解的接头，诸如例如磷酸二酯和二硫化物，而术语“不可裂解”是指例如更稳定的键联，诸如例如，耐核酸酶的硫代磷酸酯。
在一些方面中，可裂解接头是二核苷酸或三核苷酸接头、二硫化物、亚胺、硫缩酮、val-cit二肽或它们的任何组合。
在一些方面中，可裂解接头包含缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
III.A.3.a.氧化还原可裂解接头
在一些方面中，接头组合包含氧化还原可裂解接头。作为非限制性实例，一种类型的可裂解接头是在还原或在氧化时裂解的氧化还原可裂解连接基团。
在一些方面中，氧化还原可裂解接头含有二硫键，即，它是二硫化物可裂解接头。
可通例如过细胞内硫醇、氧化酶或还原酶来还原氧化还原可裂解接头。
III.A.3.b.活性氧类(ROS)可裂解接头
在一些方面中，接头组合可包含可裂解接头，所述可裂解接头可由活性氧类(ROS)，诸如例如由炎症过程如活化的嗜中性粒细胞产生的超氧化物(Of)或过氧化氢(H2O2)裂解。在一些方面中，ROS可裂解接头是硫缩酮可裂解接头。参见例如，美国专利8,354,455B2，所述专利以引用的方式整体并入本文。
III.A.3.c.pH依赖性可裂解接头
在一些方面中，接头是包含酸可裂解的连接基团的“酸不稳定型接头”，所述连接基团是在酸性条件(pH<7)下选择性地裂解的连接基团。
作为非限制性实例，酸可裂解的连接基团在酸性环境，例如约6.0、5.5、5.0或更低中裂解。在一些方面中，pH是约6.5或更低。在一些方面中，接头由诸如可充当广义酸的酶，例如肽酶(其可以是底物特异性的)或磷酸酶裂解。在细胞中，某些低pH细胞器(诸如内体和溶酶体)可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。虽然人血清的pH是7.4，但细胞中的平均pH略低，在约7.1-7.3范围内。内体也具有酸性pH，在5.5至6.0的范围内，并且溶酶体是在甚至更酸性的pH下约5.0。因此，pH依赖性可裂解接头在本领域中有时称为内体不稳定型接头。
酸可裂解基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。在另一个非限制性实例中，例如，当连接至酯氧(烷氧基)的碳连接至芳基、取代的烷基或叔烷基如二甲基戊基或叔丁基时。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于胺、亚胺、氨基酯、苯甲酸亚胺、二原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、顺式-乌头酸酯、酰肼、硫代氨基甲酰基、米帕明(imizine)、叠氮基甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内体溶解剂、柠康酰基(citraconyl)或它们的任何组合。二硫键联也对pH敏感。
在一些方面中，接头包含低pH不稳定型腙键。此类酸不稳定型键已广泛用于缀合物领域，例如抗体-药物缀合物。参见例如，Zhou等人,Biomacromolecules 2011,12,1460-7；Yuan等人,Acta Biomater.2008,4,1024-37；Zhang等人,Acta Biomater.2007,6,838-50；Yang等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.2007,321,462-8；Reddy等人,CancerChemother.Pharmacol.2006,58,229-36；Doronina等人,Nature Biotechnol.2003,21,778-84。
在某些实施方案中，接头包含选自以下的低pH不稳定型键：在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和酮的缩酮类；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成二醇和醛的缩醛类；在酸性环境(例如，pH小于7，大于约4)中不稳定、从而形成胺和醛或酮的亚胺类或亚胺鎓类(iminiums)；在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键联；硅-氮(硅氮烷)键联；硅-碳键联(例如，芳基硅烷、乙烯基硅烷和烯丙基硅烷)；马来酰胺酸(maleamate)(从马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键)；原酸酯；腙；被设计为经受酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如酯、酰胺)；或乙烯基醚。
其它实例可在美国专利号9,790,494B2和8,137,695B2中找到，其内容以引用的方式整体并入本文。
III.A.3.d.酶可裂解接头
在一些方面中，接头组合可包含可由细胞内或细胞外酶，例如蛋白酶、酯酶、核酸酶、酰胺酶(amidades)裂解的接头。可裂解接头组合中的特定接头的酶的范围取决于接头的特定键和化学结构。因此，肽接头可例如由肽酶(peptidades)裂解，含有酯键联的接头可例如由酯酶裂解；含有酰胺键联的接头可例如由酰胺酶裂解；等等。
III.A.3.e.蛋白酶可裂解接头
在一些方面中，接头组合包含蛋白酶可裂解接头，即可由内源性蛋白酶裂解的接头。只有某些肽在细胞内或细胞外容易地裂解。参见例如，Trout等人,79Proc.Natl.Acad.Sci.USA,626-629(1982)和Umemoto等人43Int.J.Cancer,677-684(1989)。可裂解接头可含有由α-氨基酸单元和肽键组成的可裂解位点，肽键在化学上是一个氨基酸的羧酸根与第二氨基酸的氨基之间的酰胺键。其它酰胺键，诸如羧酸根与赖氨酸的α-氨基之间的键不被理解为是肽键并且被认为是不可裂解的。
在一些方面中，蛋白酶可裂解接头包含蛋白酶的裂解位点，所述蛋白酶是例如脑啡肽酶(CALLA或CDlO)、甲拌磷寡肽酶(TOP)、白三烯A4水解酶、内皮缩血管肽转化酶、ste24蛋白酶、溶神经素、线粒体中间肽酶、间质胶原酶、胶原酶、溶基质素、巨噬细胞弹性酶、基质溶解因子、明胶酶、穿膜肽酶(meprins)、前胶原C-内肽酶、前胶原N-内肽酶、ADAM和ADAMT金属蛋白酶、髓磷脂相关的金属蛋白酶、釉质溶素(enamelysin)、肿瘤坏死因子α-转化酶、胰岛素溶酶(insulysin)、苯乙肼裂解酶(nardilysin)、线粒体加工肽酶、magnolysin、dactylysin样金属蛋白酶、嗜中性粒细胞胶原酶、基质金属蛋白酶、膜型基质金属蛋白酶、SP2内肽酶、前列腺特异性抗原(PSA)、纤溶酶、尿激酶、人成纤维细胞活化蛋白质(FAPα)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、降钙蛋白酶(caldecrin)、胰弹性蛋白酶、胰内肽酶、肠肽酶、白细胞弹性蛋白酶、成髓细胞、类糜蛋白酶(chymase)、类胰蛋白酶、颗粒酶、角质层糜蛋白酶、顶体蛋白酶、激肽释放酶、补体组分和因子、替代补体途径c3/c5转化酶、甘露糖结合蛋白相关的丝氨酸蛋白酶、凝血因子、凝血酶、蛋白c、u和t型纤溶酶原活化剂、组织蛋白酶G、丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin)、前列腺蛋白(prostasin)、肝细胞生长因子活化内肽酶、枯草杆菌蛋白酶/kexin型前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、前蛋白转化酶、脯氨酰肽酶、酰基氨基酰基肽酶、肽基-glycaminase、信号肽酶、n末端亲核试剂氨基水解酶、20s蛋白酶体、γ-谷氨酰转肽酶、线粒体内肽酶、线粒体内肽酶Ia、htra2肽酶、蛋白裂解酶(matriptase)、位点1蛋白酶、天冬酰胺内肽酶(legumain)、组织蛋白酶、半胱氨酸组织蛋白酶、钙蛋白酶、泛素异肽酶T、半胱天冬酶、糖基磷脂酰肌醇蛋白转酰胺酶、癌症促凝血剂、激素原硫醇蛋白酶、γ-谷氨酰基水解酶、博莱霉素水解酶、成纤维细胞活化蛋白(seprase)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、组织蛋白酶M、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝乳酶(chymosyn)、胃亚蛋白酶(gastricsin)、肾素、酵母天冬酶(yapsin)和/或mapsin、前列腺特异性抗原(PSA)或通常任何Asp-N、Glu-C、Lys-C或Arg-C蛋白酶。参见例如，Cancer Res.77(24):7027-7037(2017)，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面中，可裂解接头组分包含肽，所述肽包含一至十个氨基酸残基。在这些方面中，肽允许蛋白酶裂解接头，由此有助于在暴露于细胞内蛋白酶(如溶酶体酶)时释放生物活性分子(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性肽包括但不限于二肽、三肽、四肽、五肽和六肽。
肽可包含天然存在的和/或非天然氨基酸残基。术语“天然存在的氨基酸”是指Ala、Asp、Cys、Glu、Phe、Gly、His、He、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。“非天然氨基酸”(即氨基酸不是天然存在的)包括，作为非限制性实例，高丝氨酸、高精氨酸、瓜氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘代酪氨酸、硒代半胱氨酸、正亮氨酸(“Nle”)、正缬氨酸(“Nva”)、β-丙氨酸、L-或D-萘丙氨酸、鸟氨酸(“Orn”)等。肽可被设计和优化以由特定酶进行酶促裂解，所述特定酶例如，肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶。
氨基酸还包括天然和非天然氨基酸的D-形式。“D-”表示具有“D”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“L-”)氨基酸中的构型相反。可商购(Sigma Chemical Co.，AdvancedChemtech)或使用本领域已知的方法合成天然或非天然氨基酸。
示例性二肽包括但不限于缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。示例性三肽包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。
III.A.3.f.酯酶可裂解接头
一些接头由酯酶裂解(“酯酶可裂解接头”)。只有某些酯可由细胞内部或外部存在的酯酶和酰胺酶裂解。酯通过羧酸与醇之间的缩合作用形成。简单的酯是用简单的醇产生的酯，所述简单的醇诸如脂肪醇和小的环醇以及小的芳族醇。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。
III.A.3.g.磷酸酶可裂解接头
在一些方面中，接头组合可包含基于磷酸酯的可裂解的连接基团，所述连接基团由降解或水解磷酸酯基团的剂裂解。裂解细胞内磷酸酯基团的剂的一个实例是酶，如细胞内磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是—O—P(O)(OR k)—O—、—O—P(S)(ORk)—O—、—O—P(S)(SRk)—O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-SP(S)(ORk)-O-、-OP(O)(Rk)-O-、-OP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-O-、-SP(S)(Rk)-O-、-SP(O)(Rk)-S-或-OP(S)(Rk)-S-。
在各个方面中，Rk是以下中的任一者：NH2、BH3、CH3、C1-6烷基、C6-10芳基、C1-6烷氧基和C6-10芳基-氧基。在一些方面中，C1-6烷基和C6-10芳基是未取代的。其它非限制性实例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-SP(S)(H)-O-、-SP(O)(H)-S-、-OP(S)(H)-S-或-O-P(O)(OH)-O-。
III.A.3.h.光活化可裂解接头
在一些方面中，组合接头包含光活化可裂解接头，例如硝基苄基接头或包含硝基苄基反应性基团的接头。
III.A.3.i.自分解性接头
在一些方面中，接头组合包含自分解性接头。在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)中的自分解性接头在蛋白酶可裂解接头的酶促裂解后经历1,4消除。在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)中的自分解性接头在蛋白酶可裂解接头的酶促裂解后经历1,6消除。在一些方面中，自分解性接头是例如对氨基苄基(pAB)衍生物，如氨基甲酸对氨基苄酯(pABC)、对氨基苄基醚(PABE)、碳酸对氨基苄酯或它们的组合。
在某些方面中，自分解性接头包含芳族基团。在一些方面中，芳族基团选自由以下组成的组：苄基、肉桂基、萘基和联苯基。在一些方面中，芳族基团是杂环的。在其它方面中，芳族基团包含至少一个取代基。在一些方面中，至少一个取代基选自由以下组成的组：F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。在其它方面中，芳族基团中的至少一个C被N、O或C-R*取代，其中R*独立地选自H、F、Cl、I、Br、OH、甲基、甲氧基、NO2、NH2、NO3+、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、烷基、卤代烷基、C1-C8烷基卤化物、羧酸酯、硫酸酯、氨基磺酸酯和磺酸酯。
在一些方面中，自分解性接头包含氨基甲酸氨基苄酯基团(例如，氨基甲酸对氨基苄酯)、氨基苄基醚基团或碳酸氨基苄酯基团。在一个方面中，自分解性接头是氨基甲酸对氨基苄酯(pABC)。
pABC是用于自分解性位点特异性前药活化的最有效且最广泛的连接子(connector)键联(参见例如，Carl等人J.Med.Chem.24:479-480(1981)；WO 1981/001145；Rautio等人,Nature Reviews Drug Discovery7:255-270(2008)；Simplicio等人,Molecules 13:519-547(2008))。
在一些方面中，自分解性接头将生物活性分子(例如，ASO)连接至蛋白酶可裂解底物(例如，Val-Cit)。在具体方面中，pABC自分解性接头的氨基甲酸酯基团连接至生物活性分子(例如，ASO)的氨基，并且pABC自分解性接头的氨基连接至蛋白酶可裂解底物。
氨基苄基的芳环可任选地被芳环上的一个或多个(例如，R1和/或R2)取代基取代，所述取代基替代以其它方式连接至形成环的四个未取代的碳中的一个的氢。如本文所用，符号“Rx”(例如，R1、R2、R3、R4)是表示如本文所述的取代基的一般缩写。
取代基可提高对氨基苄基的自分解能力(Hay等人,J.Chem Soc.,PerkinTrans.1:2759-2770(1999)；还参见，Sykes等人J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1:1601-1608(2000))。
可例如通过1,4消除、1,6-消除(例如，pABC)、1,8消除(例如，对氨基肉桂醇)、β-消除、环化消除(例如，4-氨基丁醇酯和乙二胺)、环化/内酯化、环化/内酯化等发生自分解性消除。参见例如，Singh等人Curr.Med.Chem.15:1802-1826(2008)；Greenwald等人J.Med.Chem.43:475-487(2000)。
在一些方面中，自分解性间隔子可包含例如肉桂基、萘基或联苯基(参见例如，Blencowe等人Polym.Chem.2:773-790(2011))。在一些方面中，自分解性接头包含杂环(参见例如，美国专利号7,375,078；7,754,681)。许多同源芳族(参见例如，Carl等人J.Med.Chem.24:479(1981)；Senter等人J.Org.Chem.55:2975(1990)；Taylor等人J.Org.Chem.43:1197(1978)；Andrianomenjanahary等人Bioorg.Med.Chem.Lett.2:1903(1992))以及在水性和生理条件下可自分解的基于香豆素(参见例如，Weinstein等人Chem.Commun.46:553(2010))、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑(参见例如，Hay等人J.Med.Chem.46:5533(2003))、吡啶(参见例如，Perry-Feigenbaum等人Org.Biomol.Chem.7:4825(2009))、咪唑酮(参见例如，Nailor等人Bioorg.Med.Chem.Lett.Z:1267(1999)；Hay和Denny,Tetrahedron Lett.38:8425(1997))和三唑(参见例如，Bertrand和Gesson,J.Org.Chem.72:3596(2007))的杂芳族基团是本领域已知的。还参见美国专利号7,691,962；7,091,186；美国专利公布号US2006/0269480；US2010/0092496；US2010/0145036；US2003/0130189；US2005/0256030)。
在一些方面中，本文公开的接头组合包含串联的多于一个自分解性接头，例如两个或更多个pABC单元。参见例如，de Groot等人J.Org.Chem.66:8815-8830(2001)。在一些方面中，本文公开的接头组合可包含与荧光探针连接的自分解性接头(例如，对氨基苄醇或对羧基苯甲醛或乙醛酸(glyoxilic acid)的半硫代缩醛胺(hemithioaminal)衍生物)(参见例如，Meyer等人Org.Biomol.Chem.8:1777-1780(2010))。
当自分解性接头中的取代基由其从左至右书写的常规化学式指定时，其同样包括将由从右向左书写结构得到的化学上相同的取代基。例如，“-CH2O-”还意在表示“-OCH2-”。
自分解性，例如在如上所述的对氨基苄基自分解性接头中的R1和/或R2取代基中的取代基可包括例如烷基、亚烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷硫基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳基烷基、芳氧基、杂芳基等。当本公开的化合物包含多于一个取代基时，则独立地选择每个取代基。
在一些具体方面中，自分解性接头连接至具有下式的可裂解肽接头，组合具有下式：
-Aa-Yy-
其中每个–A-独立地是氨基酸单元，a独立地是1至12的整数；并且-Y-是自分解性间隔子，并且y是1或2。在一些方面中，-Aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。在一些方面中，–Aa-选自由以下组成的组：缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、N-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸和β-丙氨酸-赖氨酸。在一些方面中，–Aa-是缬氨酸-丙氨酸或缬氨酸-瓜氨酸。
在一些方面中，自分解性接头–Yy-具有下式：
Figure BDA0003596121310001441
其中每个R2独立地是C1-8烷基、-O-(C1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面中，m是0、1或2。在一些方面中，m是0。
在一些方面中，所述可裂解接头是缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
III.A.4.反应性部分(RM)
本公开的ASO通过化学合成或通过它们的组分之间的化学反应产生。例如，在一些方面中，包含反应性基团(例如，马来酰亚胺)的锚定部分可与包含马来酰亚胺反应基团的ASO反应，以产生本公开的疏水性修饰的ASO，其中所述锚定部分可插入外泌体的膜的脂质双层中，从而将ASO连接至外泌体的表面。
本公开的疏水性修饰的ASO的任何组分或组分组可至少包含RG和/或RM，这将允许所述组分通过一个反应或一系列反应连接，以产生本公开的疏水性修饰的ASO。用于产生疏水性修饰的ASO的示例性合成模式包括：
[AM]-/RG/+/RM/-[ASO]→[AM]-[ASO]
[AM]-/RM/+/RG/-[ASO]→[AM]-[ASO]
[AM]-[L]-/RM/+/RG/-[ASO]→[AM]-[L]-[ASO]
[AM]-[L]-/RG/+/RM/-[ASO]→[AM]-[L]-[ASO]
[AM]-/RM/+/RG/-[L]-[ASO]→[AM]-[L]-[ASO]
[AM]-/RG/+/RM/-[L]-[ASO]→[AM]-[L]-[ASO]
[AM]-[L]-/RM/+/RG/-[L]-[ASO]→[AM]-[L]-[L]-[ASO]
[AM]-[L]-/RG/+/RM/-[L]-[ASO]→[AM]-[L]-[L]-[ASO]
其中[AM]是锚定部分，[ASO]是反义寡核苷酸，[L]是接头或接头组合，/RM/是反应性部分，并且/RG/是反应性基团。在所提供的任何示意图中，ASO可例如通过其5'端或3'端连接。
用于在ASO的合成中产生中间体的示例性合成模式包括：
[AM]-/RM/+/RG/-[L]→[AM]-[L]
[AM]-/RG/+/RM/-[L]→[AM]-[L]
[L]-/RM/+/RG/-[L]→[L]-[L]
[L]-/RG/+/RM/-[L]→[L]-[L]
[L]-/RM/+/RG/-[ASO]→[L]-[ASO]
[L]-/RG/+/RM/-[ASO]→[L]-[ASO]
其中[AM]是锚定部分，[ASO]是反义寡核苷酸，[L]是接头或接头组合，/RM/是反应性部分，并且/RG/是反应性基团。在所提供的任何示意图中，ASO可例如通过其5'端或3'端连接。
在一些方面中，反应性基团“/RG/”可以是例如氨基、硫醇基团、羟基、羧酸基团或叠氮化物基团。可与这些反应性基团反应的特定反应性部分“/RM/”在下文更详细地描述。
[AM]-(/RM/)n+(/RG/-[L]-[ASO])n→[AM]-[L]-[ASO]
本文公开的任何锚定部分、接头或接头组合或ASO可缀合至反应性部分，例如氨基反应性部分(例如，NHS-酯、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯或醛)、硫醇反应性部分(例如，丙烯酸酯、马来酰亚胺或吡啶基二硫化物)、羟基反应性部分(例如，异硫氰酸酯或异氰酸酯)、羧酸反应性部分(例如，环氧化物)或叠氮化物反应性部分(例如，炔烃)。
可用于共价结合本文公开的两种组分(例如，锚定部分和ASO，或锚定部分和接头，或锚定部分和接头，或两个接头，或接头和ASO，或两个锚定部分)的示例性反应性部分包括例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫代)半胱胺、碘乙酰氧基琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁酰基氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3'-马来酰亚胺丙基酰胺)-1-羧基戊基]亚氨基二乙酸、N-(5-氨基戊基)亚氨基二乙酸和1'-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。双功能接头(含有两个官能团的接头)也是可用的。
在一些方面中，锚定部分、接头或ASO可包含末端氧氨基，例如—ONH2、肼基、—NHNH2、巯基(即，SH或硫醇)或烯烃(例如，CH═CH2)。在一些方面中，锚定部分、接头或ASO可例如在末端位置包含亲电子部分，例如醛、烷基卤化物、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、间硝基苯磺酸或对溴苯磺酸酯，或活化的羧酸酯，例如NHS酯、亚磷酰胺或五氟苯基酯。在一些方面中，可通过将配体的亲核基团(例如羟基、硫醇或氨基)与亲电子基团偶联来形成共价键。
本发明适用于所有方式的反应性基团和反应性部分，包括但不限于本领域已知的那些。
如本文所用，术语“保护基团”是指本领域中已知在合成程序期间保护反应性基团(包括但不限于羟基、氨基和硫醇基团)免于不需要的反应的不稳定化学部分。保护基团通常选择性地和/或正交地用于在其它反应性位点的反应期间保护位点，并且然后可除去以留下原样未受保护的基团或可用于进一步反应。如本领域中已知的保护基团通常描述于Greene和Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,NewYork(1999)中。
另外，各种合成步骤可以交替顺序或次序执行以得到所需化合物。可用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基团方法论(保护和脱保护)在本领域中是已知的，并且包括例如如以下文献中描述的那些：R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective GroupsinOrganic Synthesis,第2版,John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser,Fieserand Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette,编辑,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley andSons(1995),以及其后续版本。
可另外地或替代地使用本领域中已知的固相合成。合适的固相技术(包括自动化合成技术)描述于F.Eckstein(编辑),Oligonucleotides and Analogues,a PracticalApproach,Oxford University Press,New York(1991)和Toy,P.H.；Lam,Y(编辑),Solid-Phase Organic synthesis,concepts,Strategies,and Applications,John Wiley&Sons,Inc.New Jersey(2012)。
在一些方面中，反应性基团可替代地与下文所述的反应性部分中的多于一者反应。
III.A.4.a.胺反应性部分
在一些方面中，反应性部分是胺反应性部分。如本文所用，术语“胺反应性部分”是指可与具有氨基部分(例如伯胺)的反应性基团反应的化学基团。示例性胺反应性部分是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)、对硝基苯酚、异硫氰酸酯、异氰酸酯和醛。与伯胺反应的替代反应性部分在本领域中也是众所周知的。在一些方面中，胺反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或ASO的末端位置。
在一些方面中，胺反应性部分是NHS-酯。通常，NHS-酯反应性部分与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的酰胺键和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
在一些方面中，胺反应性部分是对硝基苯酚基团。通常，对硝基苯酚反应性部分是与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分和对硝基苯酚的活化的氨基甲酸酯。
在一些方面中，胺反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的硫脲部分。
在一些方面中，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的伯胺反应而产生稳定的脲部分。
在一些方面中，胺反应性部分是醛。通常，醛与伯胺反应而形成席夫碱，席夫碱可通过还原性胺化进一步还原而形成共价键。
III.A.4.b.硫醇反应性部分
在一些方面中，反应性部分是硫醇反应性部分。如本文所用，术语“硫醇反应性部分”是指可与具有硫醇部分(或巯基)的反应性基团反应的化学基团。示例性的硫醇反应性部分是丙烯酸酯、马来酰亚胺和吡啶基二硫化物。与硫醇反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，硫醇反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或ASO的末端位置。
在一些方面中，硫醇反应性部分是丙烯酸酯。通常，丙烯酸酯与硫醇在硫醇的β碳处与丙烯酸酯的羰基反应而形成稳定的硫化物键。
在一些方面中，硫醇反应性部分是马来酰亚胺。通常，马来酰亚胺与硫醇在硫醇的β碳处与羰基反应而形成稳定的硫化物键。
在一些方面中，硫醇反应性部分是吡啶基二硫化物。通常，吡啶基二硫化物与硫醇在硫醇的β硫原子处与吡啶基反应而形成稳定的二硫键和吡啶-2-硫酮。
III.A.4.c.羟基反应性部分
在一些方面中，反应性部分是羟基反应性部分。如本文所用，术语“羟基反应性部分”是指可与具有羟基部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羟基反应性部分是异硫氰酸酯和异氰酸酯。与羟基部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羟基反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或ASO的末端位置。
在一些方面中，羟基反应性部分是异硫氰酸酯。通常，异硫氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的硫代氨基甲酸酯部分。
在一些方面中，胺反应性部分是异氰酸酯。通常，异氰酸酯与反应性基团的羟基反应而产生稳定的氨基甲酸酯部分。
III.A.4.d.羧酸反应性部分
在一些方面中，反应性部分是羧酸反应性部分。如本文所用，术语“羧酸反应性部分”是指可与具有羧酸部分的反应性基团反应的化学基团。示例性的羧酸反应性部分是环氧化物。与羧酸部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羧酸反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或ASO的末端位置。
在一些方面中，羧酸反应性部分是环氧化物。通常，环氧化物与反应性基团的羧酸在环氧化物的任一碳原子处反应而形成乙酸2-羟基乙酯部分。
III.A.4.e.叠氮化物反应性部分
在一些方面中，反应性部分是叠氮化物反应性部分。如本文所用，术语“叠氮化物反应性部分”是指可与具有叠氮化物部分的反应性基团反应的化学基团。示例性叠氮化物反应性部分是炔烃。与叠氮化物部分反应的替代反应性部分也是本领域中众所周知的。在一些方面中，羧酸反应性部分可连接至本公开的锚定部分、接头组合或ASO的末端位置。
在一些方面中，叠氮化物反应性部分是炔烃。通常，炔烃通过1,3-偶极环加成反应(也称为“点击化学”)与反应性基团的叠氮化物反应而形成1,2,3-三唑部分。
III.A.5.具体实例和拓扑结构
在本公开的具体方面中，接头组合由下式的接头组成：
[烷基接头]m-[PEG1]n-[PEG2]o
其中m、n和o是0或1，并且m、n或o中的至少一者不为零。根据这样的式的示例性接头组合是C6-TEG-HEG、C6-HEG、C6-TEG、C6、TEG-HEG、TEG、C8-TEG-HEG、C8-HEG、C8-TEG和C8。
在一些方面中，接头组合包含与一种或多种可裂解接头(例如酶可裂解接头和自分解性接头)组合的不可裂解接头(例如，TEG或HEG)。
在一个具体方面中，接头组合包括接头组合TEG(不可裂解接头)-Val-Cit(可裂解接头)-pAB(自分解性接头)，如下所示：
Figure BDA0003596121310001501
锚定部分和接头组合的具体组合在下表中说明。
表2.
Figure BDA0003596121310001511
表3.
Figure BDA0003596121310001512
Figure BDA0003596121310001521
下文举例说明本公开的具体寡核苷酸，如ASO
[胆固醇]-[TEG]-[HEG]-[ASO]
Figure BDA0003596121310001522
[胆固醇]-[SMal]-[Val-Cit]-[pAB]-[ASO]
Figure BDA0003596121310001523
[胆固醇]-[TEG]-[Val-Cit]-[C6]-[ASO]
Figure BDA0003596121310001524
[胆固醇]-[TEG]-[SS]-[C6]-[ASO]
Figure BDA0003596121310001531
其中[胆固醇]是胆固醇锚定部分，[TEG]是TEG不可裂解接头，[HEG]是HEG不可裂解接头，[SS]是二硫化物氧化还原可裂解接头，[C6]是烷基不可裂解接头，[SMal]是S-马来酰亚胺，[Val-Cit]是缬氨酸-瓜氨酸可裂解接头，[pAB]是pAB自分解性接头。在一些方面中，本公开的ASO具有根据上文提供的示例性结构的结构，其中一种或多种组分已被与实例中描绘的那些相同类别的组分替代。例如，[胆固醇]锚定部分可被本文公开的另一种锚定部分取代，[TEG]可被本文公开的另一种聚合不可裂解接头(例如，HEG、PEG、PG)取代，[Val-Cit]可被另一种肽酶可裂解的接头替代，或者[pAB]可被另一种自分解性接头取代。
III.B.支架部分
一个或多个支架部分可在EV中表达。在一些方面中，一个或多个支架部分用于将ASO锚定至本公开的EV。在其它方面中，一个或多个支架部分还用于将除ASO以外的蛋白质或分子锚定至EV。因此，本公开的EV包含连接ASO的锚定部分和连接蛋白质或分子的支架部分，例如靶向部分。在一些方面中，ASO与支架部分连接。在一些方面中，EV包含多于一个支架部分。在一些方面中，第一ASO与第一支架部分连接，并且第二ASO与第二支架部分连接。在一些方面中，第一支架部分和第二支架部分是相同类型的支架部分，例如，第一和第二支架部分两者均是支架X蛋白。在一些方面中，第一支架部分和第二支架部分是不同类型的支架部分，例如，第一支架部分是支架Y蛋白，并且第二支架部分是支架X蛋白。在一些方面中，第一支架部分是本文公开的支架Y。在一些方面中，第一支架部分是本文公开的支架X。在一些方面中，第二支架部分是本文公开的支架Y。在一些方面中，第二支架部分是本文公开的支架X。
在一些方面中，EV包含一个或多个支架部分，所述支架部分能够将ASO锚定至EV，例如外泌体(例如，在腔表面上或在外表面上)。在某些方面中，支架部分是多肽(“支架蛋白”)。在某些方面中，支架蛋白包含外泌体蛋白或其片段。在其它方面中，支架部分是非多肽部分。在一些方面中，支架蛋白包括各种膜蛋白，如跨膜蛋白、整合蛋白和外周蛋白，它们在外泌体膜上富集。它们可包括各种CD蛋白、转运蛋白、整联蛋白、凝集素和钙粘蛋白。在某些方面中，支架部分(例如，支架蛋白)包含支架X。在其它方面中，支架部分(例如，外泌体蛋白)包含支架Y。在另外的方面中，支架部分(例如，外泌体蛋白)包含支架X和支架Y两者。
III.B.1.支架X工程化EV(例如，外泌体)
在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)包含其组成被改变的膜。例如，可通过改变膜的蛋白质、脂质或聚糖含量来改变它们的膜组成。
在一些方面中，通过化学和/或物理方法，诸如PEG诱导的融合和/或超声融合来产生表面工程化EV(例如，外泌体)。在其它方面中，表面工程化EV(例如，外泌体)通过遗传工程化产生。从遗传修饰的生产细胞或遗传修饰的细胞的后代产生的EV(例如，外泌体)可含有改变的膜组成。在一些方面中，表面工程化EV(例如，外泌体)具有较高或较低密度(例如，较高数目)的支架部分(例如，外泌体蛋白，例如，支架X)，或者包括支架部分的变体或片段。
例如，表面(例如，支架X)工程化EV可从用编码支架部分(例如，外泌体蛋白，例如，支架X)或其变体或片段的外源序列转化的细胞(例如，HEK293细胞)产生。包含由外源序列表达的支架部分的EV可包括改变的膜组成。
支架部分的各种修饰或片段可用于本公开的方面。例如，经修饰而对结合剂具有增强的亲和力的支架部分可用于产生可使用结合剂纯化的表面工程化EV。可使用经修饰以更有效地靶向EV和/或膜的支架部分。还可使用经修饰以包含特异性且有效地靶向外泌体膜所需的最小片段的支架部分。
支架部分可被工程化以表达为融合分子，例如支架X与ASO的融合分子。例如，融合分子可包含连接至ASO的本文公开的支架部分(例如，支架X，例如PTGFRN、BSG、IGSF2、IGSF3、IGSF8、ITGB1、ITGA4、SLC3A2、ATP转运蛋白或它们的片段或变体)。
在一些方面中，与本领域已知的EV相比，本文所述的表面(例如，支架X)工程化EV表现出优异的特征。例如，与天然存在的EV或使用常规外泌体蛋白生产的EV相比，表面(例如，支架X)工程化在其表面上含有富集程度更高的经修饰的蛋白质。此外，与天然存在的EV或使用常规外泌体蛋白产生的EV相比，本公开的表面(例如，支架X)工程化EV可具有更大、更特异或更可控的生物活性。
在一些方面中，支架X包含前列腺素F2受体负调控因子(PTGFRN多肽)。PTGFRN蛋白也可称为CD9配偶体1(CD9P-1)、含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白F(EWI-F)、前列腺素F2-α受体调控蛋白、前列腺素F2-α受体相关蛋白或CD315。人PTGFRN蛋白(Uniprot登录号Q9P2B2)的全长氨基酸序列在表4中显示为SEQ ID NO:301。PTGFRN多肽含有信号肽(SEQ ID NO:301的氨基酸1至25)、细胞外结构域(SEQ ID NO:301的氨基酸26至832)、跨膜结构域(SEQ IDNO:301的氨基酸833至853)和细胞质结构域(SEQ ID NO:301的氨基酸854至879)。成熟PTGFRN多肽由不含信号肽的SEQ ID NO:301组成，即SEQ ID NO:301的氨基酸26至879。在一些方面中，可用于本公开的PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽的跨膜结构域。在其它方面中，可用于本公开的PTGFRN多肽片段包含PTGFRN多肽的跨膜结构域并且(i)在跨膜结构域的N末端包含至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150个氨基酸，(ii)在跨膜结构域的C末端包含至少5、至少10、至少15、至少20或至少25个氨基酸，或(i)和(ii)两者。
在一些方面中，PTGFRN多肽的片段缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:301的氨基酸26至879至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:302至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架X包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架X包含SEQ ID NO:302的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:302的N末端和/或C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317或318至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除了1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7七个氨基酸突变外，支架X包含SEQ ID NO:301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317或318的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架X包含SEQ ID NO:301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317或318的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317或318的N末端和/C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
表4.示例性支架X蛋白序列
Figure BDA0003596121310001571
Figure BDA0003596121310001581
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:319、320、321、322、323、323或325至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架X包含SEQ ID NO:319、320、321、322、323、323或325的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架X包含SEQ ID NO:319、320、321、322、323、323或325的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:319、320、321、322、323、323或325的N末端和/或C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在一些方面中，支架X包含由SEQ ID NO:303表示的Basigin(BSG蛋白)。BSG蛋白也称为5F7、胶原酶刺激因子、细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN)、白细胞活化抗原M6、OK血型抗原、肿瘤细胞源性胶原酶刺激因子(TCSF)或CD147。人BSG蛋白的Uniprot编号是P35613。BSG蛋白的信号肽是SEQ ID NO:303的氨基酸1至21。SEQ ID NO:303的氨基酸138-323是细胞外结构域，氨基酸324至344是跨膜结构域，并且SEQ ID NO:303的氨基酸345至385是细胞质结构域。
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:303的氨基酸22至385至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，BSG多肽的片段缺乏一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV，例如SEQ ID NO:303的氨基酸221至315。在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:326、327或328至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架X包含SEQ IDNO:326、327或328的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架X包含SEQ ID NO:326、327或328的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:326、327或328的N末端和/或C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在一些方面中，支架X包含免疫球蛋白超家族成员8(IgSF8或IGSF8蛋白)，其也被称为CD81配偶体3、含Glu-Trp-Ile EWI基序的蛋白2(EWI-2)、角质形成细胞相关跨膜蛋白4(KCT-4)、LIR-D1、前列腺素调控样蛋白(PGRL)或CD316。全长人IGSF8蛋白在Uniprot中的登录号为Q969P0，并且在本文中显示为SEQ ID NO:304。人IGSF8蛋白具有信号肽(SEQ ID NO:304的氨基酸1至27)、细胞外结构域(SEQ ID NO:304的氨基酸28至579)、跨膜结构域(SEQID NO:304的氨基酸580至600)和细胞质结构域(SEQ ID NO:304的氨基酸601至613)。
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:304的氨基酸28至613至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面中，IGSF8蛋白缺少一个或多个功能性或结构性结构域，诸如IgV。在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:330、331、332或333至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，支架X包含SEQ ID NO:330、331、332或333的氨基酸序列。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，支架X包含SEQ ID NO:330、331、332或333的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:330、331、332或333的N末端和/或C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、或20个氨基酸或更多个氨基酸。
其它支架X蛋白的非限制性实例可在2019年2月5日发布的美国专利号US10195290B1中找到，所述专利以引用的方式整体并入。
在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的N末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的C末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少来自天然蛋白质的N末端和C末端的至少5、10、50、100、200、300、400、500、600、700或800个氨基酸。在一些方面中，所述序列编码支架部分的片段，所述片段缺少天然蛋白质的一个或多个功能性或结构性结构域。
在一些方面中，支架部分，例如支架X(例如PTGFRN蛋白)与一种或多种异源蛋白连接。一种或多种异源蛋白质可与支架部分的N末端连接。一种或多种异源蛋白质可与支架部分的C末端连接。在一些方面中，一种或多种异源蛋白质与支架部分的N末端和C末端连接。在一些方面中，异源蛋白质是哺乳动物蛋白质。在一些方面中，异源蛋白质是人蛋白质。
在一些方面中，支架X可用于将任何部分(例如，ASO)同时连接至EV(例如，外泌体)的腔表面和外表面上。例如，除了EV(例如，外泌体)的外表面外，PTGFRN多肽还可用于连接腔内部(例如，腔表面上)的ASO。因此，在某些方面中，支架X可用于双重目的，例如，EV(例如，外泌体)的腔表面上的ASO和外表面上的ASO。在一些方面中，支架X是能够将ASO锚定在EV的腔表面上和/或EV的外表面上的支架蛋白。
III.B.2.支架Y工程化EV(例如，外泌体)
在一些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)包含不同于天然存在的EV的内部空间的内部空间(即，腔)。例如，可改变EV，使得EV(例如，外泌体)的腔表面中的组成具有与天然存在的外泌体的蛋白质、脂质或聚糖含量不同的蛋白质、脂质或聚糖含量。
在一些方面中，可从用编码支架部分(例如，外泌体蛋白，例如，支架Y)或改变EV(例如，外泌体)的腔表面的组成或内容物的支架部分的修饰或片段的外源序列转化的细胞产生工程化EV(例如，外泌体)。可在EV(例如，外泌体)的腔表面上表达的外泌体蛋白的各种修饰或片段可用于本公开的方面。
在一些方面中，可改变EV(例如，外泌体)的腔表面的外泌体蛋白包括但不限于，富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS)蛋白、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1)蛋白、脑酸溶性蛋白1(BASP1)蛋白或它们的任何组合。
在一些方面中，支架Y包含MARCKS蛋白(Uniprot登录号P29966)。MARCKS蛋白也称为蛋白激酶C底物，80kDa蛋白，轻链。全长人MARCKS蛋白的长度是332个氨基酸，并且在氨基酸残基152-176处包含钙调蛋白结合结构域。在一些方面中，支架Y包含MARCKSL1蛋白(Uniprot登录号P49006)。MARCKSL1蛋白也称为MARCKS样蛋白1，以及巨噬细胞富含肉豆蔻酰化丙氨酸的C激酶底物。全长人MARCKSL1蛋白的长度是195个氨基酸。MARCKSL1蛋白在氨基酸残基87-110处具有参与脂质结合和钙调蛋白结合的效应结构域。在一些方面中，支架Y包含BASP1蛋白(Uniprot登录号P80723)。BASP1蛋白也称为22kDa神经元组织富集的酸性蛋白或神经元轴突膜蛋白NAP-22。全长人BASP1蛋白序列(异构体1)的长度是227个氨基酸。通过选择性剪接产生的异构体缺失来自SEQ ID NO:403(异构体1)的氨基酸88至141。表5提供本文公开的示例性支架Y的全长序列(即，MARCKS、MARCKSL1和BASP1蛋白)。
表5.示例性支架Y蛋白序列
Figure BDA0003596121310001621
Figure BDA0003596121310001631
在其它方面中，可用于本公开的支架Y包含与SEQ ID NO:403的氨基酸2至227至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，支架Y包含与SEQ ID NO:404-567中的任一个至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，可用于本公开的支架Y包含SEQID NO:403的氨基酸序列。在其它方面中，除1个氨基酸突变、2个氨基酸突变、3个氨基酸突变、4个氨基酸突变、5个氨基酸突变、6个氨基酸突变或7个氨基酸突变外，可用于本公开的支架Y包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列，不含SEQ ID NO:403的氨基酸残基1处的Met。突变可以是取代、插入、缺失或它们的任何组合。在一些方面中，可用于本公开的支架Y包含SEQID NO:404-567中的任一个的氨基酸序列并且在SEQ ID NO:404-567的N末端和/或C末端包含1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸或更多个氨基酸。
在一些方面中，SEQ ID NO:404-567中的任一个的蛋白质序列足以成为本公开的支架Y(例如，连接至ASO的支架部分)。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y包含具有GXKLSKKK的肽，其中X是丙氨酸或任何其它氨基酸(SEQ ID NO:404)。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含具有序列(G)(π)(ξ)(Φ/π)(S/A/G/N)(+)(+)的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，ξ是选自由(Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His、Arg)组成的组的任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由(Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。在另外的方面中，本文所述的外泌体(例如，工程化外泌体)包含具有序列(G)(π)(X)(Φ/π)(π)(+)(+)的肽，其中每个括号位置代表氨基酸，并且其中π是选自由(Pro、Gly、Ala、Ser)组成的组的任何氨基酸，X是任何氨基酸，Φ是选自由(Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Met)组成的组的任何氨基酸，并且(+)是选自由Lys、Arg、His)组成的组的任何氨基酸；并且其中位置5不是(+)并且位置6既不是(+)也不是(Asp或Glu)。关于氨基酸命名法，参见Aasland等人,FEBS Letters 513(2002)141-144。
在其它方面中，支架X包含与SEQ ID NO:404-567中的任一个至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一的氨基酸序列。
本文所述的支架Y工程化EV(例如，外泌体)可从用SEQ ID NO:404-567中所示的序列转化的细胞产生。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白包含“N末端结构域”(ND)和“效应结构域”(ED)，其中所述ND和/或ED与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白包含细胞内结构域、跨膜结构域和细胞外结构域；其中所述细胞内结构域包含“N末端结构域”(ND)和“效应结构域”(ED)，其中所述ND和/或ED与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合。如本文所用，术语“与……缔合”是指支架蛋白与EV(例如，和外泌体)的腔表面之间的相互作用，所述相互作用不涉及与膜组分的共价连接。例如，可用于本公开的支架可例如通过脂质锚(例如，肉豆蔻酸)和/或与膜磷脂的带负电荷头部静电相互作用的多元结构域与EV的腔表面缔合。在其它方面中，支架Y蛋白包含N末端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND与EV的腔表面缔合，并且所述ED通过离子相互作用与EV的腔表面缔合，其中所述ED包含按顺序的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续碱性氨基酸，例如赖氨酸(Lys)。
在其它方面中，支架Y蛋白包含N末端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合，并且所述ED通过离子相互作用与EV的腔表面缔合，其中所述ED包含按顺序的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个连续碱性氨基酸，例如赖氨酸(Lys)。
在一些方面中，ND通过脂化，例如通过肉豆蔻酰化与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，ND在N末端具有Gly。在一些方面中，N末端Gly是肉豆蔻酰化的。
在一些方面中，ED通过离子相互作用与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合。在一些方面中，ED通过静电相互作用，特别是吸引静电相互作用与EV(例如，外泌体)的腔表面缔合。
在一些方面中，ED包含(i)碱性氨基酸(例如，赖氨酸)，或(ii)在多肽序列中彼此相邻的两个或更多个碱性氨基酸(例如，赖氨酸)。在一些方面中，碱性氨基酸是赖氨酸(Lys；K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)。在一些方面中，碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是介于1与10之间的整数。
在其它方面中，如果ED的N末端与ND的C末端的赖氨酸直接连接，即赖氨酸在ED的N末端中并且与ND的C末端中的赖氨酸融合，则ED包含至少一个赖氨酸并且ND在C末端包含赖氨酸。在其它方面中，当ED的N末端通过接头(例如一个或多个氨基酸)与ND的C末端连接时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
在一些方面中，ED包含K、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:405)、KKKKK(SEQ ID NO:406)、R、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:407)、RRRRR(SEQ ID NO:408)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:409)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:410)或它们的任何组合。在一些方面中，ED包含KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:405)、KKK KK(SEQ IDNO:406)或它们的任何组合。在一些方面中，ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中列出的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“:”表示肽键，其中X2至X6中的每一者独立地表示氨基酸，并且其中X6表示碱性氨基酸。在一些方面中，X6氨基酸选自由以下组成的组：Lys、Arg和His。在一些方面中，X5氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些方面中，X2氨基酸选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser。在一些方面中，X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met。
在一些方面中，支架Y蛋白包含N末端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中列出的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“:”表示肽键；其中X2至X6中的每一者独立地是氨基酸；其中X6包含碱性氨基酸，并且其中ED通过肽键与X6连接并且在ED的N末端包含至少一个赖氨酸。
在一些方面中，支架Y蛋白的ND包含氨基酸序列G:X2:X3:X4:X5:X6，其中G表示Gly；“:”代表肽键；X2表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；X3表示任何氨基酸；X4表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；X5表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；并且X6表示选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His。
在一些方面中，X3氨基酸选自由以下组成的组：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。
在一些方面中，ND和ED通过接头连接。在一些方面中，接头包含一个或多个氨基酸。在一些方面中，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面中，可将两个或更多个接头串联连接。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间位阻。接头通常不被裂解；然而，在某些方面中，这种裂解可以是合乎需要的。因此，在一些方面中，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可位于接头序列内或在接头序列的任一端侧接所述接头。当ND和ED通过接头连接时，ED包含至少两个赖氨酸、至少三个赖氨酸、至少四个赖氨酸、至少五个赖氨酸、至少六个赖氨酸或至少七个赖氨酸。
在一些方面中，接头是肽接头。在一些方面中，肽接头可包含至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
在一些方面中，接头是甘氨酸/丝氨酸接头。在一些方面中，肽接头是根据式[(Gly)n-Ser]m的甘氨酸/丝氨酸接头，其中n是1至100的任何整数并且m是1至100的任何整数。在其它方面中，甘氨酸/丝氨酸接头是根据式[(Gly)x-Sery]z，其中x是1至4的整数，y是0或1，并且z是1至50的整数。在一些方面中，肽接头包含序列Gn，其中n可以是1至100的整数。在一些方面中，肽接头可包含序列(GlyAla)n，其中n是介于1与100之间的整数。在其它方面中，肽接头可包含序列(GlyGlySer)n，其中n是介于1与100之间的整数。
在一些方面中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面中，肽接头包含肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，所述肽包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面中，肽接头可包含非天然存在的多肽，所述多肽是天然存在的多肽的经修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
在其它方面中，肽接头可包含非天然存在的氨基酸。在其它方面中，肽接头可包括在自然界中不存在的线性序列中存在的天然存在的氨基酸。在其它方面中，肽接头可包含天然存在的多肽序列。
本公开还提供了分离的细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体)，所述细胞外囊泡包含与支架Y蛋白连接的ASO，其中所述支架Y蛋白包含ND—ED，其中：ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6；其中：G表示Gly；“:”表示肽键；X2表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；X3表示任何氨基酸；X4表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Glu和Met；X5表示选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；X6表示选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His；“—”表示任选的接头；并且ED是包含(i)至少两个连续赖氨酸(Lys)的效应结构域，其通过肽键或一个或多个氨基酸与X6连接；或(ii)至少一个赖氨酸的效应结构域，其通过肽键直接连接至X6。
在一些方面中，X2氨基酸选自由以下组成的组：Gly和Ala。在一些方面中，X3氨基酸是Lys。在一些方面中，X4氨基酸是Leu或Glu。在一些方面中，X5氨基酸选自由以下组成的组：Ser和Ala。在一些方面中，X6氨基酸是Lys。在一些方面中，X2氨基酸是Gly、Ala或Ser；X3氨基酸是Lys或Glu；X4氨基酸是Leu、Phe、Ser或Glu；X5氨基酸是Ser或Ala；并且X6氨基酸是Lys。在一些方面中，“—”接头包含肽键或一个或多个氨基酸。
在一些方面中，支架蛋白中的ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:405)、KKKKK(SEQ ID NO:406)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:407)、RRRRR(SEQ ID NO:408)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:409)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:410)或它们的任何组合。
在一些方面中，支架Y蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:411)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:412)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:413)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:414)或(v)它们的任何组合。
在一些方面中，支架Y蛋白中的ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSK(SEQ ID NO:415)、(ii)GAKLSK(SEQ ID NO:416)、(iii)GGKQSK(SEQ ID NO:417)、(iv)GGKLAK(SEQ ID NO:418)或(v)它们的任何组合，并且支架蛋白中的ED包含K、KK、KKK、KKKG(SEQ ID NO:419)、KKKGY(SEQ ID NO:420)、KKKGYN(SEQ ID NO:421)、KKKGYNV(SEQ IDNO:422)、KKKGYNVN(SEQ ID NO:423)、KKKGYS(SEQ ID NO:424)、KKKGYG(SEQ ID NO:425)、KKKGYGG(SEQ ID NO:426)、KKKGS(SEQ ID NO:427)、KKKGSG(SEQ ID NO:428)、KKKGSGS(SEQID NO:429)、KKKS(SEQ ID NO:430)、KKKSG(SEQ ID NO:431)、KKKSGG(SEQ ID NO:432)、KKKSGGS(SEQ ID NO:433)、KKKSGGSG(SEQ ID NO:434)、KKSGGSGG(SEQ ID NO:435)、KKKSGGSGGS(SEQ ID NO:436)、KRFSFKKS(SEQ ID NO:437)。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:411)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:412)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:413)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:414)或(v)它们的任何组合。
在一些方面中，支架Y蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:438)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:439)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:440)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:441)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:442)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:443)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:444)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:445)和(ix)它们的任何组合。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白的多肽序列由选自由以下组成的组的氨基酸序列组成：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:438)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:439)、(iii)GAKLSKKK(SEQ ID NO:440)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:441)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:442)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:443)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:444)、(viii)GGKLAKKS(SEQ ID NO:445)和(ix)它们的任何组合。
在一些方面中，支架Y蛋白的长度是至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29、至少约30、至少31、至少约32、至少约33、至少约34、至少约35、至少约36、至少约37、至少约38、至少约39、至少约39、至少约40、至少约41、至少约42、至少约43、至少约44、至少约50、至少约46、至少约47、至少约48、至少约49、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约115、至少约120、至少约125、至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约155、至少约160、至少约165、至少约170、至少约175、至少约180、至少约185、至少约190、至少约195、至少约200、至少约205、至少约210、至少约215、至少约220、至少约225、至少约230、至少约235、至少约240、至少约245、至少约250、至少约255、至少约260、至少约265、至少约270、至少约275、至少约280、至少约285、至少约290、至少约295、至少约300、至少约305、至少约310、至少约315、至少约320、至少约325、至少约330、至少约335、至少约340、至少约345或至少约350个氨基酸。
在一些方面中，支架Y蛋白的长度介于约5与约10、介于约10与约20、介于约20与约30、介于约30与约40、介于约40与约50、介于约50与约60、介于约60与约70、介于约70与约80、介于约80与约90、介于约90与约100、介于约100与约110、介于约110与约120、介于约120与约130、介于约130与约140、介于约140与约150、介于约150与约160、介于约160与约170、介于约170与约180、介于约180与约190、介于约190与约200、介于约200与约210、介于约210与约220、介于约220与约230、介于约230与约240、介于约240与约250、介于约250与约260、介于约260与约270、介于约270与约280、介于约280与约290、介于约290与约300、介于约300与约310、介于约310与约320、介于约320与约330、介于约330与约340或介于约340与约350个氨基酸之间。
在一些方面中，支架Y蛋白包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SE Q ID NO:446)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:447)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:448)、(iv)GGKLAKKKK GYNVN(SEQ ID NO:449)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:450)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:451)、(vii)GG KLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:452)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:853)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:484)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:855)或(xi)GAKKSKK RFSFKKS(SEQ ID NO:456)。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白的多肽序列由以下组成：(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:446)、(ii)GAKLSK KKKGYNVN(SEQ ID NO:447)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SE Q ID NO:448)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:449)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:450)、(vi)GGKLSKKKKGS GGS(SEQ ID NO:451)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:452)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:453)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:454)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SE Q ID NO:455)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:456)。
在一些方面中，可用于本公开的支架Y蛋白不包含N末端Met。在一些方面中，支架Y蛋白在支架蛋白的N末端包含脂化氨基酸，例如肉豆蔻酰化氨基酸，其用作脂质锚。在一些方面中，支架蛋白N末端的氨基酸残基是Gly。N末端Gly的存在是N-肉豆蔻酰化的绝对要求。在一些方面中，支架蛋白N末端的氨基酸残基是合成的。在一些方面中，支架蛋白N末端的氨基酸残基是甘氨酸类似物，例如烯丙基甘氨酸、丁基甘氨酸或炔丙基甘氨酸。
支架蛋白的非限制性实例可在2019年5月23日公布的WO/2019/099942和2020年5月22日公布的WO/2020/101740中找到，它们以引用的方式整体并入。
III.C.靶向部分
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含靶向部分，例如外源靶向部分。在一些方面中，外源靶向部分包含肽、抗体或其抗原结合片段、化学化合物、RNA适体或它们的任何组合。在一些方面中，靶向部分包含微蛋白、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、抗运载蛋白、adnectin、适体、肽模拟物分子、受体的天然配体、骆驼科动物纳米抗体或它们的任何组合。在一些方面中，外源靶向部分包含全长抗体、单结构域抗体、仅重链抗体(VHH)、单链抗体、仅鲨鱼重链抗体(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或它们的任何组合。在一些方面中，抗体是单链抗体。
在一些方面中，靶向部分使外泌体靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或它们的任何组合。在一些方面中，靶向部分使外泌体靶向肿瘤细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、神经元、肝细胞、库普弗细胞、髓系细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或MDSC(例如，单核细胞性MDSC或粒细胞性MDSC))、造血干细胞或它们的任何组合。
在一些方面中，靶向部分通过支架蛋白连接至EV，例如外泌体。在一些方面中，支架蛋白是本文公开的任何支架蛋白。在一些方面中，支架蛋白是支架X。在一些方面中，支架蛋白是支架Y。
III.D.接头
如上文所述，本公开的细胞外囊泡(EV)(例如，外泌体和纳米囊泡)可包含将目标分子(例如，ASO)连接至EV(例如，连接至外表面或腔表面上)的一个或多个接头。在一些方面中，ASO直接或通过支架部分(例如，支架X或支架Y)连接至EV。在某些方面中，ASO通过接头连接至支架部分。在某些方面中，ASO通过接头连接至第二支架部分。
在某些方面中，ASO通过支架X连接至外泌体的外表面。在另外的方面中，ASO通过支架X或支架Y连接至外泌体的腔表面。接头可以是本领域已知的任何化学部分。
如本文所用，术语“接头”是指肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)或非多肽，例如烷基链。在一些方面中，可将两个或更多个接头串联连接。当存在多个接头时，每个接头可相同或不同。一般来说，接头提供了灵活性或防止/改善了空间位阻。接头通常不被裂解；然而，在某些方面中，这种裂解可以是合乎需要的。因此，在一些方面中，接头可包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，其可位于接头序列内或在接头序列的任一端侧接所述接头。
在一些方面中，接头是肽接头。在一些方面中，肽接头可包含至少约2、至少约3、至少约4、至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个氨基酸。
在一些方面中，肽接头是合成的，即非天然存在的。在一个方面中，肽接头包含肽(或多肽)(例如，天然或非天然存在的肽)，所述肽包含将第一线性氨基酸序列与第二线性氨基酸序列连接或遗传融合，所述第一线性氨基酸序列在自然界中与所述第二线性氨基酸序列不是天然连接或遗传融合的。例如，在一个方面中，肽接头可包含非天然存在的多肽，所述多肽是天然存在的多肽的经修饰形式(例如，包含突变诸如添加、取代或缺失)。
接头可易于裂解(“可裂解接头”)，从而促进生物活性分子(例如，ASO)的释放。
在一些方面中，接头是“还原敏感型接头”。在一些方面中，还原敏感型接头含有二硫键。在一些方面中，接头是“酸不稳定型接头”。在一些方面中，酸不稳定型接头含有腙。合适的酸不稳定型接头还包括，例如，顺式乌头酸接头、酰肼接头、硫代氨甲酰基接头或它们的任何组合。
在一些方面中，所述接头包括不可裂解接头。
在一些方面中，所述接头包含丙烯酸亚磷酰胺(例如，ACRYDITETM)、腺苷酸化、叠氮化物(NHS酯)、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG、I-LINKERTM、氨基修饰剂(例如，氨基修饰剂C6、氨基修饰剂C12、氨基修饰剂C6 dT或Uni-LinkTM氨基修饰剂)、炔烃、5'己炔基、5-辛二炔基dU、生物素化(例如，生物素、生物素(叠氮化物)、生物素dT、生物素-TEG、双重生物素、PC生物素或脱硫生物素)、硫醇修饰(硫醇修饰剂C3 S-S、二硫醇或硫醇修饰剂C6 S-S)或它们的任何组合。
在一些方面中，接头包含萜烯，如橙花叔醇、法尼醇、柠檬烯、芳樟醇、香叶醇、香芹酮、小茴香酮或薄荷醇；脂质，如棕榈酸或肉豆蔻酸；胆固醇；油烯基；视黄基；胆固醇基残基；胆酸；金刚烷乙酸；1-芘丁酸；二氢睾酮；1,3-双-O(十六烷基)甘油；香叶基氧基己基；十六烷基甘油；冰片；1,3-丙二醇；十七烷基；O3-(油酰基)石胆酸；O3-(油酰基)胆烯酸；二甲氧基三苯甲基；吩噁嗪，马来酰亚胺部分，glucorinidase型，CL2A-SN38型，叶酸；碳水化合物；维生素A；维生素E；维生素K；或它们的任何组合。
III.E.包含向性部分的经修饰EV
在一些方面中，本文公开的EV(例如，外泌体)可进行工程化以调节其性质(例如生物分布)，例如通过掺入免疫亲和配体或同源受体配体。例如，本文公开的EV(例如，外泌体)可进行工程化以将它们引导至特定细胞类型，例如雪旺氏细胞、感觉神经元、运动神经元、脑膜巨噬细胞或肿瘤细胞，或者可进行工程化以增强它们迁移至特定区室，例如迁移至CNS(以提高鞘内区室保留)或迁移至肿瘤微环境。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含(i)本文公开的ASO和(ii)生物分布调节剂或靶向部分。在一些方面中，生物分布调节剂或靶向部分包含单结构域抗原结合部分，例如VHH和/或vNAR。如本文所用，术语“生物分布调节剂”和“靶向部分”可互换使用，并且是指可在体内或体外(例如，在不同品种细胞的混合培养物中)调节细胞外囊泡(例如，外泌体、纳米囊泡)的分布的剂。在一些方面中，靶向部分改变EV(例如，外泌体)的向性，即靶向部分是“向性部分”。如本文所用，术语“向性部分”是指当在EV(例如，外泌体)上表达时改变和/或增强EV的自然运动的靶向部分。例如，在一些方面中，向性部分可促进EV(例如，外泌体)被特定细胞、组织或器官吸收。
EV(例如，外泌体)在离散细胞类型和组织中表现出优先摄取，并且可通过向其表面添加与靶细胞表面上的受体相互作用的蛋白质来引导它们的向性。向性部分可包含生物分子，如蛋白质、肽、脂质或碳水化合物，或合成分子。例如，在一些方面中，向性部分可包含亲和配体，例如抗体(如抗CD19纳米抗体、抗CD22纳米抗体、抗CLEC9A纳米抗体或抗CD3纳米抗体)、VHH结构域、噬菌体展示肽、纤连蛋白结构域、骆驼科动物纳米抗体和/或vNAR。在一些方面中，向性部分可包含例如合成聚合物(例如，PEG)、天然配体/分子(例如，CD40L、白蛋白、CD47、CD24、CD55、CD59)和/或重组蛋白(例如，XTEN)。
在一些方面中，向性部分可增加细胞对EV(例如，外泌体)的摄取。在一些方面中，可增加细胞对EV(例如，外泌体)的摄取的向性部分包含淋巴细胞抗原75(也称为DEC205或CD205)、C型凝集素结构域家族9成员A(CLEC9A)、C型凝集素结构域家族6(CLEC6)、C型凝集素结构域家族4成员A(也称为DCIR或CLEC4A)、捕获树突细胞特异性细胞间粘附分子-3的非整联蛋白(也称为DC-SIGN或CD209)、凝集素型氧化LDL受体1(LOX-1)、具有胶原结构的巨噬细胞受体(MARCO)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、C型凝集素结构域家族10成员A(CLEC10A)、DC-无唾液酸糖蛋白受体(DC-ASGPR)、DC免疫受体2(DCIR2)、Dectin-1、巨噬细胞甘露糖受体(MMR)、BDCA-2(CD303，CLEC4C)、Dectin-2、BST-2(CD317)、朗格汉斯蛋白(Langerin)、CD206、CD11b、CD11c、CD123、CD304、XCR1、AXL、SIGLEC 6、CD209、SIRPA、CX3CR1、GPR182、CD14、CD16、CD32、CD34、CD38、CD10、抗CD3抗体或它们的任何组合。
在一些方面中，当对中枢神经系统的向性为所需时，本公开的EV(例如，外泌体)可包含增加EV(例如，外泌体)对特定中枢神经系统组织或细胞的向性的组织或细胞特异性靶配体。在一些方面中，细胞是神经胶质细胞。在一些方面中，神经胶质细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、小神经胶质细胞、雪旺氏细胞、卫星神经胶质细胞、嗅鞘细胞或它们的组合。在一些方面中，细胞是神经干细胞。在一些方面中，增加EV(例如，外泌体)对雪旺氏细胞的向性的细胞特异性靶配体结合至雪旺氏细胞表面标志物，诸如髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白零(P0)、P75NTR、NCAM、PMP22或它们的任何组合。在一些方面中，细胞特异性向性部分包含抗体或其抗原结合部分、适体或在雪旺氏细胞表面上表达的受体的激动剂或拮抗剂。
在一些方面中，生物分布调节剂或靶向部分包含结合在肿瘤细胞上表达的抗原的抗原结合部分。在一些方面中，生物分布调节剂或靶向部分包含结合在肿瘤微环境中表达的抗原的抗原结合部分。在一些方面中，生物分布调节剂或靶向部分包含结合间皮素的抗原结合部分。本领域已知的能够结合间皮素的任何抗原结合部分都可用于本文公开的EV中。在一些方面中，生物分布调节剂或靶向部分包含结合CD33的抗原结合部分。本领域已知的能够结合CD33的任何抗原结合部分都可用于本文公开的EV中。在某些方面中，结合CD33的抗原结合部分选自美国专利号5,877,296中公开的抗CD33结合部分，所述专利以引用的方式整体并入本文。
原则上，包含可将EV(例如，外泌体)引导至特定靶细胞或组织(例如，CNS中的细胞或外周神经中的雪旺氏细胞)的至少一个向性部分的本公开的EV(例如，外泌体)可使用本领域已知的任何合适的施用方法(例如，静脉内注射或输注)施用，因为向性部分的存在(单独或与抗吞噬信号如CD47的存在和特定施用途径的使用组合)将诱导EV(例如，外泌体)朝向所需的靶细胞或组织的向性。
在某些方面中，向性部分连接(例如，经由马来酰亚胺部分化学连接)至EV(例如，外泌体)的外表面上的支架部分，例如支架X蛋白或其片段。向性可通过将抗吞噬信号(例如，CD47和/或CD24)、半衰期延长部分(例如，白蛋白或PEG)或它们的任何组合连接至本公开的EV(例如，外泌体)的外表面来进一步改善。在某些方面中，抗吞噬信号连接(例如，经由马来酰亚胺部分化学连接)至EV(例如，外泌体)的外表面上的支架部分，例如支架X蛋白或其片段。
还可通过选择合适的施用途径(例如，鞘内施用或眼内施用，以改善对中枢神经系统的向性)来实现药代动力学、生物分布，并且特别是向性和在所需的组织或解剖位置中的保留。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少两个不同的向性部分。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少三个不同的向性部分。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含至少四个不同的向性部分。在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含五个或更多个不同的向性部分。在一些方面中，一个或多个向性部分增加细胞对EV(例如，外泌体)的摄取。在一些方面中，每个向性部分连接至支架部分，例如支架X蛋白或其片段。在一些方面中，多个向性部分可连接至同一支架部分，例如支架X蛋白或其片段。在一些方面中，若干向性部分可串联连接至支架部分，例如支架X蛋白或其片段。在一些方面中，本文公开的向性部分或其组合通过接头或间隔子连接至支架部分，例如支架X蛋白或其片段。在一些方面中，接头或间隔子或它们的组合插入在本文公开的两个向性部分之间。
下文公开了能够将本公开的EV(例如，外泌体)引导至不同神经系统细胞类型的向性部分的非限制性实例。
III.E.1.靶向雪旺氏细胞的向性部分
在一些方面中，向性部分可靶向雪旺氏细胞。在一些方面中，向性部分将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至雪旺氏细胞靶标，例如转铁蛋白受体(TfR)、载脂蛋白D(ApoD)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、髓磷脂蛋白脂质蛋白(PLP)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖1或多配体聚糖3。在一些方面中，将本公开的EV(例如，外泌体)引导至雪旺氏细胞的向性部分是转铁蛋白或其片段、变体或衍生物。
在一些方面中，本公开的向性部分靶向转铁蛋白受体(TfR)。转铁蛋白受体(例如TfR1或TfR2)是转铁蛋白的载体蛋白。转铁蛋白受体通过受体介导的内吞作用将转铁蛋白-离子复合物内化来输入铁。
TfR1(参见例如，UniProt P02786 TFR1_人)或转铁蛋白受体1(也称为分化簇71或CD71)在血脑屏障(BBB)的内皮细胞上表达。已知TfR1在诸如红细胞、单核细胞、肝细胞、肠细胞和红系细胞的多种细胞中表达，并在诸如肿瘤细胞(非小细胞肺癌、结肠癌和白血病)的快速分裂细胞中以及受诸如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的病症影响的组织中上调。TfR2主要在肝脏和红系细胞中表达，在肺、脾脏和肌肉中发现的程度较低，并且与TfR1具有45％同一性和66％相似性。TfR1是具有二硫键且分子量为90kDa的形成760个残基的同二聚体的跨膜受体。对转铁蛋白的亲和力在两种受体类型之间不同，对TfR1的亲和力比对TfR2的亲和力高至少25-30倍。
与TfR1的结合允许大分子(例如抗体)转运至脑中。一些TfR1靶向抗体已被证明可穿过血脑屏障，而不会干扰铁的吸收。其中包括小鼠抗大鼠-TfR抗体OX26和大鼠抗小鼠-TfR抗体8D3。抗体-TfR相互作用的亲和力对于确定经BBB的内皮细胞转胞吞转运的成功而言是重要的。由于细胞内分选途径改变，单价TfR相互作用有利于BB B转运。二价相互作用的亲合力效应将转运重定向至溶酶体。此外，降低TfR结合亲和力直接促进与TfR的解离，这增加了TfR结合抗体的脑实质暴露。参见例如，美国专利号8,821,943，其全部内容以引用的方式并入本文。因此，在一些方面中，本公开的向性部分可包含能够靶向TfR(例如靶向TfR1)的配体，如转铁蛋白，或能够特异性地结合至TfR的抗体或其它结合分子。在一些方面中，靶向转铁蛋白受体的抗体是低亲和力抗转铁蛋白受体抗体(参见例如US20190202936A1，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些方面中，向性部分包含转铁蛋白受体的配体的全部或一部分(例如，结合部分)，例如在GenBank中作为登录号NM001063、XM002793、XM039847、NM002343或NM013900等可获得的人转铁蛋白或其变体、片段或衍生物。
在一些方面中，向性部分包含转铁蛋白受体靶向部分，即，针对转铁蛋白受体的靶向部分。合适的转铁蛋白受体靶向部分包括转铁蛋白或转铁蛋白变体，如但不限于血清转铁蛋白、乳转铁蛋白(乳铁蛋白)、卵转铁蛋白或黑素转铁蛋白。转铁蛋白是在脊椎动物中发现的非血红素铁结合蛋白家族，包括血清转铁蛋白、乳转铁蛋白(乳铁蛋白)、卵转铁蛋白和黑素转铁蛋白。血清转铁蛋白是分子量为约80kDa的糖蛋白，包含单个多肽链和两个N连接的多糖链，所述两个N连接的多糖链分支并终止于多个触角中，每个触角具有末端唾液酸残基。存在两个主要结构域，约330个氨基酸的N结构域和约340个氨基酸的C结构域，所述结构域各自分为两个亚结构域N1和N2，以及C1和C2。转铁蛋白的受体结合通过C结构域发生，与糖基化无关。
在一些方面中，向性部分是血清转铁蛋白或转铁蛋白变体，如但不限于六唾液酸转铁蛋白、五唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、二唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白或去唾液酸转铁蛋白，或糖缺失性转铁蛋白(CDT)如去唾液酸、单唾液酸或二唾液酸转铁蛋白，或不含糖的转铁蛋白(CFT)，如去唾液酸转铁蛋白。在一些方面中，向性部分是具有转铁蛋白的N末端结构域、转铁蛋白的C末端结构域、天然转铁蛋白的糖基化、与天然(野生型)转铁蛋白相比糖基化降低、无糖基化、转铁蛋白的至少两个N末端叶、转铁蛋白的至少两个C末端叶、N结构域中的至少一个突变、C结构域中的至少一个突变、其中突变体对转铁蛋白受体的结合亲合力比天然转铁蛋白弱的突变和/或其中突变体对转铁蛋白受体的结合亲合力比天然转铁蛋白强的突变或前述的任何组合的转铁蛋白变体。
在一些方面中，靶向转铁蛋白受体的向性部分包含抗转铁蛋白受体可变新抗原受体(vNAR)，例如，具有一般基序结构(FW1-CDR1-FW2-3-CDR3-FW4)的结合结构域。参见例如，美国2017-0348416，其以引用的方式整体并入本文。vNAR是鲨鱼的适应性免疫系统的关键组分。这些单结构域结构只有11kDa，是动物界中最小的IgG样蛋白，并且为分子工程化和生物制剂药物发现提供优异的平台。vNAR属性包括对靶标的高亲和力、易于表达、稳定性、溶解性、多特异性和增加的实体组织穿透潜力。参见Ubah等人Biochem.Soc.Trans.(2018)46(6):1559-1565。
在一些方面中，向性部分包含能够特异性地结合至TfR1的vNAR结构域，其中所述vNAR结构域包含具有US 2017-0348416的表1中的任一种CDR1肽与US 2017-0348416的表1中的任一种CDR3肽的组合的vNAR支架或基本上由其组成。
在一些方面中，本公开的向性部分靶向ApoD。与主要在肝脏中产生的其它脂蛋白不同，载脂蛋白D主要在大脑、小脑和周围神经中产生。ApoD是169个氨基酸长，包含20个氨基酸的分泌肽信号。它含有两个糖基化位点(天冬酰胺45和78)，并且成熟蛋白的分子量从20至32kDa变化。ApoD以相对强的亲和力结合类固醇激素如黄体酮和孕烯醇酮，并且以较弱的亲和力结合至雌激素。花生四烯酸(AA)是亲和力比黄体酮或孕烯醇酮好得多的ApoD配体。其它ApoD配体包括E-3-甲基-2-己烯酸、视黄酸、鞘磷脂和鞘脂。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含能够靶向ApoD的配体，例如能够特异性地结合至ApoD的抗体或其它结合分子。
在一些方面中，本公开的向性部分靶向半乳糖凝集素1。半乳糖凝集素-1蛋白的长度是135个氨基酸。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含能够靶向半乳糖凝集素1的配体，例如能够特异性地结合半乳糖凝集素1的抗体或其它结合分子。
在一些方面中，本公开的向性部分靶向PLP。PLP是来自CNS的主要髓鞘蛋白。它在髓磷脂的多层结构的形成或维持中起重要作用。髓鞘是神经系统独有的作为绝缘体可大大提高轴突脉冲传导的效率的多层膜。PLP是276至280个氨基酸的高度保守的疏水性蛋白质，其含有四个跨膜区段、两个二硫键并共价结合脂质(哺乳动物中的至少六个棕榈酸酯基团)。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含能够靶向PLP的配体，例如能够特异性地结合PLP的抗体或其它结合分子。
在一些方面中，本公开的向性部分靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含能够靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的配体，例如能够特异性地结合至磷脂酰肌醇蛋白聚糖1的抗体或其它结合分子。在一些方面中，本公开的向性部分靶向多配体聚糖3。因此，在一些方面方面中，本公开的向性部分包含能够靶向多配体聚糖3的配体，例如能够特异性地结合至多配体聚糖3的抗体或其它结合分子。
III.E.2.靶向感觉神经元的向性部分
在一些方面中，本文公开的向性部分可将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至感觉神经元。在一些方面中，将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至感觉神经元的向性部分靶向Trk受体，例如TrkA、TrkB、TrkC或它们的组合。
Trk(原肌球蛋白受体激酶)受体是酪氨酸激酶家族，其可调控哺乳动物神经系统中的突触强度和可塑性。Trk受体的常见配体是神经营养蛋白，其是对神经系统的功能至关重要的生长因子家族。这些分子的结合是高度特异性的。每种类型的神经营养蛋白对其相应的Trk受体具有不同的结合亲和力。因此，在一些方面中，将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至感觉神经元的向性部分包含神经营养蛋白。
神经营养蛋白结合至呈同二聚体形式的Trk受体。因此，在一些方面中，向性部分包含例如串联的至少两种本文公开的神经营养蛋白。在一些方面中，向性部分包含例如串联的至少两种本文公开的神经营养蛋白，所述神经营养蛋白通过接头连接至支架蛋白，例如蛋白X。在一些方面中，将支架蛋白(例如蛋白X)连接至神经营养蛋白(例如，神经营养蛋白同二聚体)的接头具有至少10个氨基酸的长度。在一些方面中，将支架蛋白(例如蛋白X)连接至神经营养蛋白(例如神经营养蛋白同二聚体)的接头具有至少约25个氨基酸、约30个氨基酸、约35个氨基酸、约40个氨基酸、约45个氨基酸或约50个氨基酸的长度。
在一些方面中，神经营养蛋白是神经营养蛋白前体，即神经营养蛋白前体蛋白(proneurotrophin)，其随后被裂解以产生成熟蛋白质。
神经生长因子(NGF)是神经营养蛋白家族中首个鉴定并且可能最佳表征的成员。它对周围神经系统的感觉和交感神经元的发育具有显著作用。脑源性神经营养因子(BDNF)具有类似于NGF的神经营养活性，并且主要在CNS中表达，并已在心脏、肺、骨骼肌和周围的坐骨神经中检测到(Leibrock,J.等人,Nature,341:149-152(1989))。神经营养蛋白-3(NT-3)是NGF家族的第三成员，并且主要在海马锥体和颗粒神经元的亚群中表达，并且已在小脑、大脑皮层和外周组织(如肝脏和骨骼肌)中检测到(Ernfors,P.等人,Neuron 1:983-996(1990))。神经营养蛋白-4(也称为NT-415)是神经营养蛋白家族中最可变的成员。神经营养蛋白-6(NT-5)在真骨鱼中发现并且结合至p75受体。
在一些方面中，靶向TrkB的神经营养蛋白包括例如NT-4或BDNF，或它们的片段、变体或衍生物。在一些方面中，靶向TrkA的神经营养蛋白包括例如NGF或其片段、变体或衍生物。在一些方面中，靶向TrkC的神经营养蛋白包括例如NT-3或其片段、变体或衍生物。
在一些方面中，向性部分包含脑源性神经营养因子(BDNF)。在一些方面中，BDNF是天然BDNF的变体，如两种氨基酸羧基截短的变体。在一些方面中，向性部分包含BDNF的全长119个氨基酸的序列(HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKV PVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSY VRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR；SEQ ID NO:161)。在一些方面中，使用了BDNF的一个氨基酸羧基截短的变体(SE Q ID NO:161的氨基酸1-118)。
在一些方面中，向性部分包含天然BDNF的羧基截短的变体，例如，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个氨基酸从BDNF的羧基末端缺失的变体。BDNF变体包括完整的119个氨基酸的BDNF、具有截短的羧基末端的117或118个氨基酸的变体、具有截短的氨基末端的变体、或氨基酸组成变化高达约20％、约30％或约40％的变体，只要蛋白质变体仍然以高亲和力结合至TrkB受体。
在一些方面中，向性部分包含BDNF的两个氨基酸羧基截短的变体(SEQ ID NO:161的氨基酸1-117)。在一些方面中，向性部分包含BDNF的三个氨基酸羧基截短的变体(SEQ IDNO:161的氨基酸1-116)。在一些方面中，向性部分包含BDNF的四个氨基酸羧基截短变体(SEQ ID NO:161的氨基酸1-115)。在一些方面中，向性部分包含BDNF的五个氨基酸羧基截短变体(SEQ ID NO:161的氨基酸1-114)。在一些方面中，向性部分包含与SEQ ID NO:161的序列或其截短型式(例如具有一个或两个氨基酸截短的羧基末端的117或118个氨基酸的变体或具有截短的氨基末端的变体)至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％同一的BDNF。参见例如，美国专利号8,053,569B2，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面中，向性部分包含神经生长因子(NGF)。在一些方面中，NGF是天然NGF的变体，如截短变体。在一些方面中，向性部分包含蛋白质的26-kDaβ亚基，它是7S NGF复合物的唯一具有生物活性的组分。在一些方面中，向性部分包含βNGF的全长120个氨基酸的序列(SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA；SEQ ID NO:162)。在一些方面中，向性部分包含天然NGF的羧基截短的变体，例如，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个氨基酸从NGF的羧基末端缺失的变体。NGF变体包括完整的120个氨基酸的NGF、具有截短的羧基末端的较短氨基酸变体、具有截短的氨基末端的变体、或氨基酸组成变化高达约20％、约30％或约40％的变体，只要向性部分仍然以高亲和力结合至TrkB受体。在一些方面中，向性部分包含与SEQ ID NO:162的序列或其截短型式至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％同一的NGF。
在一些方面中，向性部分包含神经营养蛋白-3(NT-3)。在一些方面中，NT-3是天然NT-3的变体，如截短变体。在一些方面中，向性部分包含NT-3的全长119个氨基酸的序列(YAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT；SEQ ID NO:163)。在一些方面中，向性部分包含天然NT-3的羧基截短的变体，例如，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个氨基酸从NT-3的羧基末端缺失的变体。NT-3变体包括完整的119个氨基酸的NT-3、具有截短的羧基末端的较短氨基酸变体、具有截短的氨基末端的变体、或氨基酸组成变化高达约20％、约30％或约40％的变体，只要向性部分仍然以高亲和力结合至TrkC受体。在一些方面中，向性部分包含与SEQ ID NO:163的序列或其截短型式至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％同一的NT-3。
在一些方面中，向性部分包含神经营养蛋白-4(NT-4)。在一些方面中，NT-4是天然NT-4的变体，如截短变体。在一些方面中，向性部分包含NT-4的全长130个氨基酸的序列(GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA；SEQ ID NO:164)。在一些方面中，向性部分包含天然NT-4的羧基截短的变体，例如，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个氨基酸从NT-4的羧基末端缺失的变体。NT-4变体包括完整的130个氨基酸的NT-4、具有截短的羧基末端的较短氨基酸变体、具有截短的氨基末端的变体、或氨基酸组成变化高达约20％、约30％或约40％的变体，只要向性部分仍然以高亲和力结合至TrkB受体。在一些方面中，向性部分包含与SEQ ID NO:164的序列或其截短型式至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％同一的NT-4。
NGF和NGF相关重组分子的结构/功能关系研究表明，NGF区域25-36以及其它β-发夹环和非环区域中的突变显著影响NGF/NGF受体相互作用(Ibanez等人,EMBO J.,10,2105-2110,(1991))。已证明源自此区域的小肽模拟NGF与模拟受体结合并影响生物反应(LeSauteur等人J.Biol.Chem.270,6564-6569,1995)。发现对应于NGF的β环区域的环化肽的二聚体充当部分NGF激动剂，因为它们同时具有促进存活和抑制NGF的活性，而单体和线性肽则无活性(Longo等人,J.Neurosci.Res.,48,1-17,1997)。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含此类肽。
还设计并合成了环肽以模拟NGF、BDNF、NT3和NT-4/5的β环区域。这些环肽的某些单体、二聚体或聚合物可具有三维结构，所述三维结构在生理条件下与神经营养蛋白受体结合。与神经细胞表面受体结合并被内化的神经营养蛋白的所有这些结构类似物都可充当根据本公开的化合物的结合剂B，以将缀合的治疗性部分TM递送至神经系统。因此，在一些方面中，本公开的向性部分包含此类环肽或其组合。
在一些方面中，能够与受体结合并被内化的针对神经细胞表面受体的抗体也可充当与Trk受体结合的向性部分。例如，单克隆抗体(MAb)5C3对人p140 TrkA受体的NGF对接位点具有特异性，与人TrkB受体没有交叉反应性。MAb 5C3及其Fab在体外模拟NGF的作用，并在体内对人Trk-A阳性肿瘤进行成像(Kramer等人,Eur.J.Cancer,33,2090-2091,(1997))。Mab 5C3可变区的分子克隆、重组、诱变和建模研究表明，其三个或更少的互补决定区(CDR)对于与TrkA的结合是相关的。对重组CDR和CDR样合成多肽的测定表明，它们具有与完整Mab5C3相似的激动生物活性。针对p75受体的单克隆抗体MC192也已被证明具有神经营养性作用。因此，这些抗体和它们的功能等效片段也可充当本公开的向性部分。
在一些方面中，通过掺入非天然氨基酸或其它有机分子而合成的肽模拟物也可充当本公开的向性部分。
其它神经营养因子是本领域已知的。因此，在一些方面中，靶部分包含选自由以下组成的组的神经营养因子：成纤维细胞生长因子(FGF)-2和其它FGF、促红细胞生成素(EPO)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)-a、TGF-(3、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、neurturin、血小板源性生长因子(PDGF)、调蛋白、神经调节蛋白、artemin、persephin、白细胞介素、粒细胞集落刺激因子(CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF、netrin、心肌营养蛋白-1、刺猬(hedgehog)、白血病抑制因子(LIF)、中期因子(midkine)、多效生长因子、骨形态发生蛋白(BMP)、netrin、鞘脂酶激活蛋白(saposin)、信号素(semaphorin)和干细胞因子(SCF)。
在一些方面中，将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至感觉神经元的向性部分包含水痘-带状疱疹病毒(VZV)肽。
III.E.3.靶向运动神经元的向性部分
在一些方面中，本文公开的向性部分可将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至运动神经元。在一些方面中，将本文公开的EV(例如，外泌体)引导至运动神经元的向性部分包含狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽、靶向轴突输入(TAxI)肽、P75R肽或Tet-C肽。
在一些方面中，向性部分包含狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽。参见例如，美国专利申请公布2014-00294727，其以引用的方式整体并入本文。在一些方面中，RVG肽包含RVG(YTIWMPENPRPGTPCDIF TNSRGKRASNG；SEQ ID NO:601)的氨基酸残基173-202或其变体、片段或衍生物。在一些方面中，向性部分是SEQ ID NO:601的片段。SEQ ID NO:601的这种片段可具有例如从SEQ ID NO:601的N末端和/或C末端缺失的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。源自SEQ ID NO:601的功能性片段可通过从SEQ ID NO:601顺序缺失N和/或C末端氨基酸并评估所得肽片段的功能，如肽片段结合乙酰胆碱受体的功能和/或通过血脑屏障传递的能力来鉴定。在一些方面中，向性部分包含SEQ ID NO:601的长度为28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个氨基酸的片段。在一些方面中，向性部分包含SEQ ID NO:601的长度小于15个肽的片段。
RGV肽(例如SEQ ID NO:601)的“变体”意指在结构和功能上基本相似的分子，即，其中功能是穿过BBB或通过BBB传递至整个分子或其片段的能力而实现。RVG肽的变体可含有不同于SEQ ID NO:601中的参考氨基酸的突变或修饰。在一些方面中，SEQ ID NO:601的变体是如本文公开的SEQ ID NO:601的片段。在一些方面中，RVG变体可以是SEQ ID NO:601的不同同种型，或者可包含不同的异构体氨基酸。变体可以是使用本领域熟知的方法分离或产生的天然存在的、合成的、重组的或化学修饰的多核苷酸或多肽。RVG变体可包含保守或非保守的氨基酸变化。参见例如，美国专利号9,757,470，其以引用的方式整体并入本文。
在一些方面中，向性部分包含靶向轴突输入(TAxI)肽。在一些方面中，TAxI肽是序列SACQSQSQMRCGGG(SEQ ID NO:602)的环化TAxI肽。参见例如，Sellers等人(2016)Proc.Natl.Acad.Sci.US A 113:2514-2519和美国专利号9,056,892，其以引用的方式整体并入本文。如本文所述的TAxI转运肽可具有任何长度。通常，转运肽的长度将介于6与50个氨基酸之间，更通常长度介于10与20个氨基酸之间。在一些方面中，TAxI转运肽包含氨基酸序列QSQSQMR(SEQ ID NO:603)、ASGAQAR(SEQ ID NO:604)、PF或TSTAPH LRLRLTSR(SEQ IDNO:605)。任选地，TAxI转运肽还包含侧接序列以促进掺入递送构建体或载体，例如接头中。在一个方面中，肽侧接半胱氨酸。在一些方面中，TAxI转运肽还包含经选择以促进递送至细胞核中的另外序列。例如，促进核递送的肽是核定位信号(NL S)。通常，此信号由一些带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成，如PPKKRKV(SEQ ID NO:606)。在一个方面中，NLS具有氨基酸序列PKKRKV(SEQ ID NO:607)。
在一些方面中，本公开的向性部分包含下表中公开的肽BBB穿梭。参见例如，Oller-Salvia等人(2016)Chem.Soc.Rev.45,4690-4707和Jafari等人(2019)ExpertOpinion on Drug Delivery 16:583-605，所述文献以引用的方式整体并入本文。
Figure BDA0003596121310001891
Figure BDA0003596121310001901
环肽(&)的命名法适用于Spengler等人Pept.Res.,2005,65,550–555描述的3字母氨基酸代码。
[Dap]代表二氨基丙酸。
III.F.抗吞噬信号
身体的免疫系统清除所施用的EV(例如，外泌体)可降低施用的EV(例如，外泌体)疗法的功效。在一些方面中，EV(例如，外泌体)的表面经修饰以限制或阻断免疫系统的细胞(例如，巨噬细胞)对EV(例如，外泌体)的摄取。在一些方面中，EV(例如，外泌体)的表面经修饰以表达一种或多种抑制巨噬细胞摄取EV(例如，外泌体)的表面抗原。在一些方面中，表面抗原与EV(例如，外泌体)的外表面缔合。
可用于本公开中的表面抗原包括但不限于将细胞标记为“自身”细胞的抗原。在一些方面中，表面抗原包含抗吞噬信号。在一些方面中，抗吞噬信号选自CD47、CD24、它们的片段以及它们的任何组合。在某些方面中，抗吞噬信号包含CD24，例如人CD24。在一些方面中，抗吞噬信号包含CD24(例如人CD24)的片段。在某些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以在EV(例如，外泌体)的外表面上表达CD47或其片段。
如本文所用，CD47，也称为白细胞表面抗原CD47和整联蛋白相关蛋白(IAP)，是在体内的许多细胞上发现的跨膜蛋白。CD47通常被称为“不要吃掉我”信号，因为它向免疫细胞、特别是骨髓细胞发出信号，表明表达CD47的特定细胞不是外来细胞。CD47是SIRPA的受体，与其结合可防止未成熟树突细胞成熟并抑制成熟树突细胞产生细胞因子。CD47与SIRPG的相互作用介导细胞-细胞粘附，增强超抗原依赖性T细胞介导的增殖并共同刺激T细胞活化。还已知CD47通过充当血小板上的THBS1的粘附受体而在细胞粘附中起作用，并且在整联蛋白的调节中起作用。CD47在海马的记忆形成和突触可塑性中也起着重要作用(由于相似性)。此外，CD47可在膜转运和/或整联蛋白依赖性信号转导中发挥作用，防止红细胞过早清除，并参与病毒感染后诱导的膜通透性变化。
在一些方面中，本文公开的EV(例如，外泌体)经修饰以在EV(例如，外泌体)的表面上表达人CD47。人CD47的规范氨基酸序列和各种已知同种型在本文中公开(UniProtKB-Q08722)为SEQ ID NO:629-632。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达包含SEQ IDNO:629中列出的氨基酸序列或其片段的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达包含SEQ ID NO:630中列出的氨基酸序列或其片段的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达包含SEQ ID NO:631中列出的氨基酸序列或其片段的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达包含SEQ ID NO:632中列出的氨基酸序列或其片段的多肽。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以在EV(例如，外泌体)的表面上表达全长CD47。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以在EV(例如，外泌体)的表面上表达CD47的片段，其中所述片段包含CD47(例如，人CD47)的细胞外结构域。保留阻断和/或抑制巨噬细胞的吞噬作用的能力的任何CD47片段都可用于本文公开的EV(例如，外泌体)中。在一些方面中，所述片段包含规范人CD47序列的氨基酸19至约141(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-141)。在一些方面中，所述片段包含规范人CD47序列的氨基酸19至约135(例如，SEQ IDNO 629的氨基酸19-135)。在一些方面中，所述片段包含规范人CD47序列的氨基酸19至约130(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-130)。在一些方面中，所述片段包含规范人CD47序列的氨基酸19至约125(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-125)。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与规范人CD47序列的氨基酸19至约141(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-141)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与规范人CD47序列的氨基酸19至约135(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-135)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与规范人CD47序列的氨基酸19至约130(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-130)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与规范人CD47序列的氨基酸19至约125(例如，SEQ ID NO 629的氨基酸19-125)具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多肽。
在一些方面中，CD47或其片段经修饰以增加CD47及其配体SIRPα的亲和力。在一些方面中，CD47的片段包含Velcro-CD47(参见例如，Ho等人,JBC 290:12650-63(2015)，其以引用的方式整体并入本文)。在一些方面中，Velcro-CD47包含相对于野生型人CD47序列(SEQ ID NO:629)的C15S取代。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)包含在EV(例如，外泌体)的表面上以高于未修饰的EV(例如,外泌体)的水平表达的CD47或其片段。在一些方面中，CD47或其片段与支架蛋白融合。本文公开的任何支架蛋白均可用于在EV(例如，外泌体)的表面上表达CD47或其片段。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与支架X蛋白的N末端融合的CD47片段。在一些方面中，EV(例如，外泌体)经修饰以表达与PTGFRN的N末端融合的CD47片段。
在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约20个分子、至少约30个分子、至少约40、至少约50、至少约75、至少约100、至少约125、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500、至少约750或至少约1000个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约20个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约30个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约40个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约50个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约100个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约200个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约300个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约400个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约500个分子。在一些方面中，EV(例如，外泌体)在所述EV(例如，外泌体)的表面上包含CD47的至少约1000个分子。
在一些方面中，与不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)相比，在EV(例如，外泌体)的表面上表达CD47或其片段使得骨髓细胞对所述EV(例如，外泌体)的摄取减少。在一些方面中，相对于骨髓细胞对不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的摄取，骨髓细胞对表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的摄取减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。
在一些方面中，与不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)相比，在EV(例如，外泌体)的表面上表达CD47或其片段使得EV(例如，外泌体)至肝脏的定位降低。在一些方面中，相对于不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)至肝脏的定位，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)至肝脏的定位降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。
在一些方面中，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的体内半衰期相对于不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的体内半衰期增加。在一些方面中，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的体内半衰期相对于不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)的体内半衰期增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
在一些方面中，相对于不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)在循环(例如血浆)中的保留，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)在循环(例如血浆)中具有增加的保留。在一些方面中，相对于不表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)在循环(例如血浆)中的保留，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)在循环(例如血浆)中的保留增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍。
在一些方面中，与不表达CD47或其片段的外泌体相比，表达CD47或其片段的EV(例如，外泌体)具有改变的生物分布。在一些方面中，改变的生物分布导致内皮细胞、T细胞中的摄取增加，或各种组织中的累积增加，所述组织包括但不限于骨骼肌、心肌、膈肌、肾脏、骨髓、中枢神经系统、肺、脑脊液(CSF)或它们的任何组合。
IV.用于产生工程化外泌体的生产细胞
本公开的EV(例如，外泌体)可从体外生长的细胞或受试者的体液中产生。当由体外细胞培养物产生外泌体时，可使用各种生产细胞，例如HEK293细胞、CHO细胞和MSC。在某些方面中，生产细胞不是树突细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞、源自这些细胞中的任一者的细胞或它们的任何组合。
人胚肾293细胞，通常也称为HEK 293、HEK-293、293细胞，或者不太准确地称为HEK细胞，是最初来源于在组织培养物中生长的人胚肾细胞的特定细胞系。
HEK 293细胞是1973年在荷兰莱顿的Alex van der Eb实验室通过用剪切的腺病毒5DNA转染正常人胚胎肾细胞培养物而产生的。培养细胞并用腺病毒转染。随后的分析表明，所述转化是通过从病毒基因组的左臂插入约4.5千碱基来实现的，其被整合至人染色体19中。
对HEK293和五种衍生细胞系的基因组和转录组的综合研究将HEK 293转录组与人肾脏、肾上腺、垂体和中枢神经组织的基因组和转录组进行了比较。HEK 293模式与肾上腺细胞最相似，肾上腺细胞具有许多神经元特性。
HEK 293细胞具有复杂的核型，每个染色体有两个或更多个拷贝，并且染色体模式数为64。它们被描述为亚三倍体，含有的染色体数量少于单倍体人配子的三倍。染色体异常包括X染色体的总计三个拷贝的以及染色体17和染色体22的四个拷贝。
可用于产生EV的HEK293细胞的变体包括但不限于HEK 293F、HEK 293FT和HEK293T。
可对生产细胞进行遗传修饰以包含编码ASO的外源序列以产生本文所述的EV。经遗传修饰的生产细胞可通过瞬时或稳定转化而含有所述外源序列。外源序列可转化为质粒。在一些方面中，外源序列是载体。可将外源序列在靶向位点或随机位点稳定地整合至生产细胞的基因组序列中。在一些方面中，生成稳定的细胞系以用于产生腔工程化外泌体。
可将外源序列插入生产细胞的基因组序列中，位于编码外泌体蛋白的内源序列内、其上游(5'端)或下游(3'端)。本领域已知的各种方法可用于将外源序列引入生产细胞中。例如，使用各种基因编辑方法(例如，使用同源重组、转座子介导的系统、loxP-Cre系统、CRISPR/Cas9或TALEN的方法)修饰的细胞在本公开的范围内。
外源序列可包含编码本文公开的支架部分或其片段或变体的序列。可引入编码支架部分的序列的额外拷贝以产生本文所述的外泌体(例如，在EV，例如外泌体的表面上或腔表面上具有更高密度的支架部分)。可引入编码支架部分的修饰或片段的外源序列以产生含有支架部分的修饰或片段的腔工程化和/或表面工程化外泌体。
在一些方面中，生产细胞可例如用编码与ASO连接的支架部分的一种或多种载体进行修饰，例如转染。
在一些方面中，本公开的EV，例如外泌体(例如，表面工程化和/或腔工程化外泌体)可由用编码本文公开的全长成熟支架部分或与ASO连接的支架部分的序列转化的细胞产生。本文所述的支架部分中的任一者都可从质粒、插入基因组中的外源序列或其它外源核酸诸如合成信使RNA(mRNA)中表达。
V.药物组合物
本文提供了呈适合施用于受试者的形式的药物组合物，所述药物组合物包含具有所需纯度的本公开的EV(例如，外泌体)和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的赋形剂或载体可部分地由所施用的特定组合物以及由用于施用组合物的特定方法决定。因此，存在多种多样的包含多个细胞外囊泡的药物组合物的合适制剂。(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.第21版(2005))。药物组合物通常被配制为无菌并且完全遵循美国食品与药品管理局的所有良好生产规范(GMP)条例。
在一些方面中，药物组合物包含一种或多种治疗剂和本文所述的外泌体。在某些方面中，EV(例如，外泌体)与一种或多种另外的治疗剂在药学上可接受的载体中共同施用。在一些方面中，用于本公开的ASO和一种或多种另外的治疗剂可在同一EV中施用。在其它方面中，用于本公开的ASO和一种或多种另外的治疗剂在不同的EV中施用。例如，本公开包括一种药物组合物，所述药物组合物包含含有ASO的EV和含有另外治疗剂的EV。在一些方面中，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之前施用。在其它方面中，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物在施用另外的治疗剂之后施用。在另外的方面中，包含EV(例如，外泌体)的药物组合物与另外的治疗剂同时施用。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者(例如，动物或人)是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。此类介质和化合物用于药物活性物质的用途在本领域中众所周知。除非任何常规介质或化合物与本文所述的细胞外囊泡不相容，否则考虑其在组合物中的使用。还可将补充治疗剂掺入组合物中。通常，将药物组合物配制成可与其预期施用途径相容。EV(例如，外泌体)可通过胃肠外、局部、静脉内、经口、皮下、动脉内、皮内、经皮、经直肠、颅内、腹膜内、鼻内、瘤内、肌内途径施用或以吸入剂形式施用。在某些方面中，静脉内施用(例如，通过注射)包含外泌体的药物组合物。EV(例如，外泌体)可任选地与在治疗所述EV(例如，外泌体)所要治疗的疾病、病症或疾患方面至少部分有效的其它治疗剂组合施用。
溶液或悬浮液可包含以下组分：诸如水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂的无菌稀释剂；诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯的抗菌化合物；诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂；诸如乙二胺四乙酸(EDTA)的螯合化合物；诸如乙酸酯、柠檬酸酯或磷酸酯的缓冲剂；以及诸如氯化钠或右旋糖的用于调整张力的化合物。可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调节pH。制剂可封闭在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性)或分散液和无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。组合物通常是无菌的并且具有达到容易注射的程度的流动性。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌化合物(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。如果需要，可向组合物中添加等渗化合物，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的化合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
根据需要，可通过将有效量的EV(例如，外泌体)在合适的溶剂中与本文列举或本领域已知的一种或多种成分混合来制备无菌注射溶液。一般来说，通过将EV(例如，外泌体)掺入含有基础分散介质和任何所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何另外所需成分的粉末。可将EV(例如，外泌体)以贮库注射或植入制剂的形式施用，所述制剂可以允许EV(例如，外泌体)的持续或脉冲释放的方式配制。
包含外泌体的组合物的全身性施用还可通过经粘膜方式来进行。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于待渗透的障壁的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过使用例如鼻喷剂来实现。
在某些方面中，将包含EV(例如，外泌体)的药物组合物静脉内施用于将从药物组合物受益的受试者中。在某些其它方面中，例如通过淋巴管内注射或通过结节内注射(参见例如，Senti等人,PNAS105(46):17908(2008))或通过肌内注射、通过皮下施用、通过瘤内注射、通过直接注射至胸腺中或至肝脏中来将组合物施用至淋巴系统。
在某些方面中，包含外泌体的药物组合物以液体悬浮液的形式施用。在某些方面中，药物组合物以能够在施用后形成贮库的制剂的形式施用。在某些优选的方面中，贮库将EV(例如，外泌体)缓慢地释放至循环中，或保持呈贮库形式。
通常，药学上可接受的组合物被高度纯化为不含污染物，具有生物相容性并且不具有毒性，并且适合于向受试者施用。如果水是载体的成分，则水经高度纯化并且被加工为不含例如内毒素的污染物。
药学上可接受的载体可以是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯啶酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、苯甲酸甲基羟酯、苯甲酸丙基羟酯、滑石、硬脂酸镁和/或矿物油，但不限于此。药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味增强剂、乳化剂、悬浮剂和/或防腐剂。
在一些方面中，本文所述的药物组合物包含药学上可接受的盐。在一些方面中，药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、铵盐或它们的任何组合。
本文所述的药物组合物包含本文所述的EV(例如，外泌体)和任选地另外的药物活性剂或治疗剂。另外的治疗剂可以是生物剂、小分子剂或核酸剂。在一些方面中，另外的治疗剂是另外的CEBP/β拮抗剂。在一些方面中，CEBP/β拮抗剂是本文公开的任何CEBP/β拮抗剂。在一些方面中，另外的CEBP/β拮抗剂是抗CEBP/β抗体。在一些方面中，另外的CEBP/β拮抗剂是小分子。在一些方面中，另外的CEBP/β拮抗剂是小分子。
在一些方面中，另外的CEBP/β拮抗剂包含ASO。在一些方面中，另外的CEBP/β拮抗剂包含本文所述的任何ASO。
提供了包含药物组合物的剂型，所述药物组合物包含本文所述的EV(例如，外泌体)。在一些方面中，剂型被配制为液体悬浮液以用于静脉内注射。在一些方面中，剂型被配制为液体悬浮液以用于瘤内注射。
在某些方面中，使外泌体制剂经受例如X射线、γ射线、β粒子、α粒子、中子、质子、元素核、UV射线的放射以便损坏残余具有复制能力的核酸。
在某些方面中，使用超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或超过100kGy的照射剂量使外泌体制剂经受γ照射。
在某些方面中，使用超过0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000或超过10000mSv的照射剂量使外泌体制剂经受X射线照射。
VI.药盒
本文还提供了包括本文所述的一种或多种外泌体的药盒。在一些方面中，本文提供了药物包或药盒，所述药物包或药盒包括填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分(如本文提供的一种或多种外泌体)的一个或多个容器，任选的使用说明书。在一些方面中，药盒含有本文所述的药物组合物和任何预防剂或治疗剂，如本文所述的那些。在一些方面中，药盒还包括根据本文公开的任何方法施用EV的说明书。在一些方面中，药盒用于治疗与造血相关的疾病或疾患。在一些方面中，药盒是诊断试剂盒。
VII.产生EV的方法
在一些方面中，本公开还涉及产生本文所述的EV的方法。在一些方面中，所述方法包括：从生产细胞获得所述EV(例如，外泌体)，其中所述生产细胞含有所述EV(例如，外泌体)的一种或多种组分(例如，ASO)；以及任选地分离所获得的EV(例如，外泌体)。在一些方面中，所述方法包括：通过引入本文公开的EV的一种或多种组分(例如，ASO)来修饰生产细胞；从所述经修饰的生产细胞获得所述EV(例如，外泌体)；以及任选地分离所获得的EV(例如，外泌体)。在另外的方面中，所述方法包括：从生产细胞获得EV；分离所获得的EV；以及修饰分离的EV。在某些方面中，所述方法还包括将分离的EV配制到药物组合物中。
VII.A.修饰生产细胞的方法
如上文所述，在一些方面中，产生EV的方法包括用一个或多个部分(例如，ASO)修饰生产细胞。在某些方面中，所述一个或多个部分包含ASO。在一些方面中，所述一个或多个部分还包含本文公开的支架部分(例如，支架X或支架Y)。
在一些方面中，生产细胞可以是哺乳动物细胞系、植物细胞系、昆虫细胞系、真菌细胞系或原核细胞系。在某些方面中，生产细胞是哺乳动物细胞系。哺乳动物细胞系的非限制性实例包：人胚肾(HEK)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT-1080细胞系、海拉细胞系(HeLa cell line)、PERC-6细胞系、CEVEC细胞系、成纤维细胞系、羊水细胞系、上皮细胞系和间充质干细胞(MSC)细胞系以及它们的组合。在某些方面中，哺乳动物细胞系包括HEK-293细胞、BJ人包皮成纤维细胞、fHDF成纤维细胞、AGE.
Figure BDA0003596121310002031
神经元前体细胞、
Figure BDA0003596121310002032
羊水细胞、脂肪间充质干细胞、RPTEC/TERT1细胞或它们的组合。在一些方面中，生产细胞是原代细胞。在某些方面中，原代细胞可以是原代哺乳动物细胞、原代植物细胞、原代昆虫细胞、原代真菌细胞或原代原核细胞。
在一些方面中，生产细胞不是免疫细胞，诸如抗原呈递细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、T辅助细胞或调控性T细胞(Treg细胞)。在其它方面中，生产细胞不是抗原呈递细胞(例如，树突细胞、巨噬细胞、B细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、Kupffer-Browicz细胞或源自任何此类细胞的细胞)。
在一些方面中，一个或多个部分可以是转基因或mRNA，并通过转染、病毒转导、电穿孔、挤出、超声处理、细胞融合或本领域技术人员已知的其它方法引入生产细胞中。
在一些方面中，通过转染将一个或多个部分引入生产细胞。在一些方面中，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分引入合适的生产细胞中(Papapetrou等人,Gene Therapy 12:S118-S130(2005))。在一些方面中，阳离子脂质通过电荷相互作用与一个或多个部分形成复合物。在这些方面中的一些中，带正电荷的复合物与带负电荷的细胞表面结合，并且由细胞通过内吞作用吸收。在一些其它方面中，阳离子聚合物可用于转染生产细胞。在这些方面中的一些中，阳离子聚合物是聚乙烯亚胺(PEI)。在某些方面中，诸如磷酸钙、环糊精或聚凝胺的化学物质可用于将一个或多个部分引入生产细胞。还可使用物理方法将一个或多个部分引入生产细胞中，所述物理方法如粒子介导的转染、“基因枪”、生物弹道技术(biolistics)或粒子轰击技术(Papapetrou等人,GeneTherapy 12:S118-S130(2005))。诸如(例如)β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白的报告基因可用于评估生产细胞的转染效率。
在某些方面中，通过病毒转导将一个或多个部分引入生产细胞。多种病毒可用作基因转移媒介物，所述病毒包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒和泡沫病毒。病毒介导的基因转移媒介物包括基于诸如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒的DNA病毒的载体以及基于逆转录病毒的载体。
在某些方面中，通过电穿孔将一个或多个部分引入生产细胞。电穿孔在细胞膜中产生瞬时孔隙，从而允许将各种分子引入细胞中。在一些方面中，可通过电穿孔将DNA和RNA以及多肽和非多肽治疗剂引入生产细胞中。
在某些方面中，通过显微注射将一个或多个部分引入生产细胞。在一些方面中，可使用玻璃微量吸移管将一个或多个部分以微量水平注入生产细胞中。
在某些方面中，通过挤出将一个或多个部分引入生产细胞。
在某些方面中，通过超声处理将一个或多个部分引入生产细胞。在一些方面中，使生产细胞暴露于高强度声波，引起细胞膜的瞬时破坏，从而允许负载一个或多个部分。
在某些方面中，通过细胞融合将一个或多个部分引入生产细胞。在一些方面中，通过电细胞融合引入一个或多个部分。在其它方面中，聚乙二醇(PEG)用于融合生产细胞。在另外的方面中，仙台病毒用于融合生产细胞。
在一些方面中，通过低渗裂解将一个或多个部分引入生产细胞。在此类方面中，可使生产细胞暴露于低离子强度缓冲液，引起生产细胞破裂，从而允许负载一个或多个部分。在其它方面中，针对低渗溶液的受控透析可用于使生产细胞溶胀并在生产细胞膜中产生孔隙。随后使生产细胞暴露于允许膜重新密封的条件。
在一些方面中，通过洗涤剂处理将一个或多个部分引入生产细胞。在某些方面中，用温和洗涤剂处理生产细胞，所述洗涤剂通过产生孔隙而瞬时损伤生产细胞膜，从而允许负载一个或多个部分。在对生产者细胞进行负载后，洗掉洗涤剂，从而使膜重新密封。
在一些方面中，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分引入生产细胞。在某些方面中，生产细胞具有表面受体，所述表面受体在结合一个或多个部分时诱导受体和相关部分的内化。
在一些方面中，通过过滤将一个或多个部分引入生产细胞。在某些方面中，可迫使生产细胞和一个或多个部分通过孔径小于生产细胞的过滤器，从而引起生产细胞膜瞬时破坏并允许一个或多个部分进入生产细胞。
在一些方面中，使生产细胞经受若干次冻融循环，引起细胞膜破坏，从而允许负载一个或多个部分。
VII.B.修饰EV(例如，外泌体)的方法
在一些方面中，产生EV(例如，外泌体)的方法包括通过将一个或多个部分直接引入EV中来修饰分离的EV。在某些方面中，所述一个或多个部分包含ASO。在一些方面中，所述一个或多个部分包含本文公开的支架部分(例如，支架X或支架Y)。
在某些方面中，通过转染将一个或多个部分引入EV。在一些方面中，可使用合成大分子，诸如阳离子脂质和聚合物，将一个或多个部分引入EV中(Papapetrou等人,GeneTherapy 12:S118-S130(2005))。在某些方面中，诸如磷酸钙、环糊精或聚凝胺的化学物质可用于将一个或多个部分引入EV。
在某些方面中，通过电穿孔将一个或多个部分引入EV。在一些方面中，使EV暴露于电场，这在EV膜中产生瞬时空穴，从而允许负载一个或多个部分。
在某些方面中，通过显微注射将一个或多个部分引入EV。在一些方面中，可使用玻璃微量吸移管将一个或多个部分以微量水平直接注入EV中。
在某些方面中，通过挤出将一个或多个部分引入EV。
在某些方面中，通过超声处理将一个或多个部分引入EV。在一些方面中，使EV暴露于高强度声波，引起EV膜的瞬时破坏，从而允许负载一个或多个部分。
在一些方面中，一个或多个部分可缀合至EV的表面。缀合可通过本领域中已知的方法以化学方式或以酶方式实现。
在一些方面中，EV包含一个或多个化学缀合的部分。化学缀合可通过在使用或不使用接头的情况下共价键合一个或多个部分与另一分子来实现。此类缀合物的形成是在技术人员的技能内并且已知用于实现缀合的各种技术，并且选择由待缀合的材料所导引的特定技术。在某些方面中，使多肽缀合至EV。在一些方面中，使诸如脂质、碳水化合物、核酸和小分子的非多肽缀合至EV。
在一些方面中，通过低渗裂解将一个或多个部分引入EV。在此类方面中，可使EV暴露于低离子强度缓冲液，引起EV破裂，从而允许负载一个或多个部分。在其它方面中，针对低渗溶液的受控透析可用于使EV溶胀并在EV膜中产生孔隙。随后使EV暴露于允许膜重新密封的条件。
在一些方面中，通过洗涤剂处理将一个或多个部分引入EV。在某些方面中，用温和洗涤剂处理细胞外囊泡，所述洗涤剂通过产生孔隙而瞬时损伤EV膜，从而允许负载一个或多个部分。在对EV进行负载后，洗掉洗涤剂，从而使膜重新密封。
在一些方面中，通过受体介导的内吞作用将一个或多个部分引入EV。在某些方面中，EV具有表面受体，所述表面受体在结合一个或多个部分时诱导受体和相关部分的内化。
在一些方面中，通过机械烧制将一个或多个部分引入EV。在某些方面中，可用连接至诸如金微载体的重粒子或带电粒子的一个或多个部分轰击细胞外囊泡。在这些方面中的一些中，可以机械方式或以电气方式加速粒子以使得粒子横穿EV膜。
在一些方面中，使细胞外囊泡经受若干次冻融循环，引起EV膜破坏，从而允许负载一个或多个部分。
VII.C.分离EV(例如，外泌体)的方法
在一些方面中，本文公开的产生EV的方法包括从生产细胞中分离EV。在某些方面中，EV由生产细胞释放至细胞培养基中。预期分离EV的所有已知方式均视为适用于本文中。举例而言，可采用EV的物理性质来将它们与介质或其它源材料分离，所述分离包括基于电荷的分离(例如电泳分离)、基于尺寸的分离(例如过滤、分子筛分等)、基于密度的分离(例如常规离心或梯度离心)、基于Svedberg常数的分离(例如在有或无外力情况下的沉降等)。可替代地或除此之外，分离可基于一种或多种生物特性，并且包括可采用表面标记物的方法(例如用于沉淀、与固相的可逆结合、FACS分离、特异性配体结合、非特异性配体结合、亲和纯化等)。
分离和富集可按通常包括连续离心的一般且非选择性方式进行。可替代地，分离和富集可按诸如使用EV或生产细胞特异性表面标记物的更具特异性和选择性的方式进行。举例而言，特异性表面标记物可用于免疫沉淀、FACS分选、亲和纯化和与珠粒结合配体的磁力分离。
在一些方面中，尺寸排阻色谱法可用于分离EV。尺寸排阻色谱技术是本领域已知的。本文提供了示例性非限制性技术。在一些方面中，空隙体积级分经分离并且包含目标EV。此外，在一些方面中，可在如本领域中公知的通过离心技术(对一种或多种色谱法级分)进行色谱分离之后进一步分离EV。在一些方面中，举例而言，可利用密度梯度离心以进一步分离细胞外囊泡。在某些方面中，进一步分离生产细胞来源的EV与其它起源的EV可以是合乎需要的。举例而言，可通过使用对生产细胞具有特异性的抗原抗体进行免疫吸附捕获来使生产细胞来源的EV与非生产细胞来源的EV分离。
在一些方面中，EV的分离可涉及多种方法的组合，所述方法包括但不限于差速离心、基于尺寸的膜过滤、免疫沉淀、FACS分选和磁力分离。
除非另外指出，否则本公开的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，所述技术处于本领域的技能之内。此类技术在文献中进行了充分解释。参见例如，Sambrook等人,编辑(1989)MolecularCloning ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人,编辑(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold SpringsHarbor Laboratory,NY)；D.N.Glover编辑,(1985)DNA Cloning,第I和II卷；Gait,编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins,编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames和Higgins,编辑(1984)TranscriptionAnd Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(Alan R.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical GuideTo Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos编辑(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(ColdSpring Harbor Laboratory)；Wu等人,编辑,Methods In Enzymology,第154和155卷；Mayer和Walker,编辑(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell,编辑,(1986)Handbook Of ExperimentalImmunology,第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooke,Antisense drugTechnology:Principles,Strategies and Applications,第2版CRC Press(2007)；以及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
VIII.使用方法
在某些方面中，本公开提供了预防和/或治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文公开的EV(例如，外泌体)(例如，包含本公开的ASO)。如本文所述，可用于本公开的ASO可特异性地与CEBP/β转录物(例如，前体mRNA或mRNA)的一个或多个区域杂交，从而引起细胞中的CEBP/β蛋白表达的减少和/或抑制。因此，包含这种ASO的EV(例如，外泌体)(例如本文公开的EV)可用于预防和/或治疗与CEBP/β蛋白的表达增加相关的任何疾病或病症。
在一些方面中，可用本发明方法治疗的疾病或病症包括癌症。在某些方面中，癌症与CEBP/β蛋白的表达增加相关。可用本公开治疗的癌症的非限制性实例包括结肠直肠癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌、白血病、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌、胆管癌、胃癌或它们的任何组合。
当施用于患有癌症的受试者时，在某些方面中，本公开的EV(例如，外泌体)可上调免疫反应并增强受试者免疫系统的肿瘤靶向。在一些方面中，所治疗的癌症的特征在于白细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞)浸润至肿瘤微环境中，或所谓的“热肿瘤(hot tumor)”或“炎性肿瘤(inflammatory tumor)”。在一些方面中，所治疗的癌症的特征在于低水平或不可检测的水平的白细胞浸润至肿瘤微环境中，或所谓的“冷肿瘤(coldtumor)”或“非炎性肿瘤”。在一些方面中，以足以将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”的量和持续时间施用EV，即，所述施用导致白细胞(诸如T细胞)浸润至肿瘤微环境中。在某些方面中，癌症包括膀胱癌、宫颈癌、肾细胞癌、睾丸癌、结肠直肠癌、肺癌、头颈癌和卵巢癌、淋巴瘤、肝癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、胰腺癌或它们的组合。在其它，术语“远端肿瘤(distal tumor)”或“远处肿瘤(distant tumor)”是指从原始(或原发)肿瘤扩散至远处器官或远处组织例如淋巴结的肿瘤。在一些方面中，本公开的EV治疗转移扩散后的肿瘤。
在一些方面中，将EV(例如，外泌体)静脉内施用于受试者的循环系统。在一些方面中，将EV输注在合适的液体中并且施用至受试者的静脉中。
在一些方面中，将EV(例如，外泌体)动脉内施用于受试者的循环系统。在一些方面中，将EV输注在合适的液体中并且施用至受试者的动脉中。
在一些方面中，通过鞘内施用将EV(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，通过鞘内施用来施用EV(例如，外泌体)，然后向躯干施加机械对流力。参见例如，Verma等人,Alzheimer's Dement.12:e12030(2020)；其以引用的方式整体并入本文)。因此，本公开的某些方面涉及向有需要的受试者施用EV(例如，外泌体)的方法，所述方法包括通过鞘内注射向所述受试者施用EV(例如，外泌体)，然后向所述受试者的躯干施加机械对流力。在一些方面中，使用高频胸壁或腰椎-胸廓振荡呼吸清除装置(例如，Smart Vest或Smart Wrap,ELECTROMED INC,New Prague,MN,USA)实现机械对流力。在一些方面中，机械对流力(例如振荡背心)有助于鞘内给药的EV(例如，外泌体)进一步向下传播至神经，从而允许至神经的更佳EV(例如，外泌体)递送。
在一些方面中，可通过在区室递送外泌体后作用于受试者的外源性体外力来操纵外泌体的区室内和跨区室生物分布。这包括施加机械对流，例如通过对身体区室或整个身体施加敲击、振动、摇动或按摩的方式。例如，在鞘内给药后，通过包括振荡机械夹套在内的多种方式施加胸壁振动可使外泌体的生物分布沿着神经轴或沿着颅神经和脊神经扩散，这可有助于通过携带药物的外泌体治疗神经病症。
在一些方面中，通过振荡夹套或其它类似的方式施加外部机械对流力可用于从鞘内空间的脑脊液中除去外泌体和其它物质并进入外周循环。这方面可有助于将内源性有毒外泌体和其它有害大分子如β-淀粉样蛋白、tau、α-突触核蛋白、TDP43、神经丝和过多的脑脊液从鞘内空间除去至外周以消除。
在一些方面中，通过同时合并腰椎穿刺并允许脑室-腰椎灌注，可使通过脑室内途径递送的外泌体在整个神经轴中易位，其中在外泌体给药后将额外的流体输注至脑室中，同时允许CSF的现有神经轴柱退出是腰椎穿刺。脑室-腰椎灌注可使ICV给药的外泌体沿整个神经轴扩散并完全覆盖蛛网膜下腔，以治疗软脑膜癌和其它疾病。
在一些方面中，施加外部体外聚焦超声、热能(热)或冷可用于操纵被工程化为对这些现象敏感的外泌体的区室药代动力学和药物释放特性。
在一些方面中，经工程化以含有顺磁性材料的外泌体的区室内行为和生物分布可通过磁体或磁场的外部施加来操纵。
在一些方面中，将EV经由注射剂施用至椎管中，或施用至蛛网膜下腔中以使其到达脑脊液(CSF)。
在一些方面中，将EV(例如，外泌体)瘤内施用至受试者的一个或多个肿瘤中。
在一些方面中，通过鼻内施用将EV(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，可以局部施用或全身性施用的形式经由鼻吹入EV。在某些方面中，EV作为鼻喷雾剂施用。
在一些方面中，通过腹膜内施用将EV(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，将EV输注在合适的液体中并且注射至受试者的腹膜中。在一些方面中，腹膜内施用使得EV分布至淋巴管。在一些方面中，腹膜内施用使得EV分布至胸腺、脾脏和/或骨髓。在一些方面中，腹膜内施用使得EV分布至一个或多个淋巴结。在一些方面中，腹膜内施用使得EV分布至颈部淋巴结、腹股淋巴结、纵隔淋巴结或胸骨淋巴结中的一者或多者。在一些方面中，腹膜内施用使得EV分布至胰腺。
在一些方面中，通过眼周施用将EV(例如，外泌体)施用于受试者。在一些方面中，将注射至眼周组织中。眼周药物施用包括结膜下、前房眼球筋膜囊下、后房眼球筋膜囊下和眼球后施用途径。
以上引用的所有参考文献，以及本文引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文。
通过说明而不是通过限制的方式提供以下实例。
VIII.A.治疗脑癌的方法
本公开的某些方面涉及治疗有需要的受试者的脑癌的方法。在一些方面中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所公开的包含ASO的EV(例如，外泌体)。在一些方面中，EV(例如，外泌体)能够将如本文公开的治疗剂(例如ASO)靶向递送至CNS以治疗脑癌。在一些方面中，EV(例如外泌体)能够上调受试者的免疫反应，从而增强受试者针对神经免疫病症的免疫反应。在一些方面中，向所述受试者瘤内或鞘内施用所述组合物。
本文还提供了预防受试者的脑肿瘤转移的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文公开的组合物，其中所述组合物能够阻止受试者的一个部位的脑肿瘤促进受试者的另一个部位的一个或多个肿瘤生长。在一些方面中，在一个部位中的第一肿瘤中瘤内或鞘内施用组合物，并且在第一肿瘤中施用的所述组合物阻止第二部位的一个或多个肿瘤转移。
在一些方面中，施用本文公开的EV(例如，外泌体)抑制和/或减少受试者的脑肿瘤的生长。在一些方面中，脑肿瘤的生长(例如，肿瘤体积或重量)与参考(例如，无ASO的EV(例如，外泌体)施用后相应受试者中的肿瘤体积)相比减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
如本文所用，术语“脑肿瘤”是指脑内(例如，脑膜内)细胞的异常生长。脑肿瘤可分类为原发性或继发性脑肿瘤。“原发性脑肿瘤”是指起源于脑内的脑肿瘤。“继发性脑肿瘤”是指由于起源于脑外原发部位的癌细胞已经转移(即扩散)至脑所致的脑肿瘤。除非另有说明，否则术语脑肿瘤可指原发性脑肿瘤和继发性脑肿瘤两者。
在一些方面中，可用本公开治疗的脑肿瘤包括听神经瘤、脉络丛癌、颅咽管瘤、胚胎肿瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、小儿脑肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体瘤或它们的组合。
在某些方面中，可用本公开治疗的脑肿瘤包括神经胶质瘤。如本文所用，术语“神经胶质瘤”是指一种类型的起源于脑或脊柱的神经胶质细胞的肿瘤。在一些方面中，神经胶质瘤可根据与它们共享组织学特征的特定类型的细胞来分类。因此，可用本文公开的EV(例如，外泌体)治疗的神经胶质瘤可分类为室管膜瘤(室管膜细胞)、星形细胞瘤(星形胶质细胞)、少突神经胶质瘤(少突胶质细胞)、脑干神经胶质瘤(例如，弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤)、视神经胶质瘤、混合性胶质瘤、少突星形细胞瘤或它们的任何组合。在某些方面中，星形细胞瘤包括多形性成胶质细胞瘤(GBM)。
本文公开的神经胶质瘤可根据其分级进一步分类，所述分级由肿瘤的病理学评估确定。在一些方面中，脑肿瘤标本的神经病理学评估和诊断是根据WHO中枢神经系统肿瘤分类进行的。在一些方面中，可用本公开治疗的神经胶质瘤包括低级别神经胶质瘤。“低级别神经胶质瘤”[WHO II级]分化良好(非间变性)，并且往往表现出良性倾向且预示着患者的预后较好。然而，在一些方面中，低级别神经胶质瘤可具有均匀复发率，并且随时间推移分级增加，因此应归类为恶性。在一些方面中，可治疗的神经胶质瘤包括高级别神经胶质瘤。“高级别神经胶质瘤”[WHO III-IV级]神经胶质瘤是未分化或间变性的，并且是恶性的且预后较差。在使用的众多分级系统中，最常见的是世界卫生组织(WHO)星形细胞瘤分级系统，根据所述系统，肿瘤被分级为I(最早期疾病-最佳预后)至IV(最晚期疾病-最差预后)。高级别神经胶质瘤的非限制性实例包括间变性星形细胞瘤和多形性成胶质细胞瘤。
在一些方面中，本文公开的EV(例如，外泌体)可用于治疗如根据WHO分级系统确定的I级、II级、III级、IV级神经胶质瘤或它们的组合。在某些方面中，本文公开的EV(例如，外泌体)可用于治疗任何类型的神经胶质瘤。
在一些方面中，可通过本发明方法治疗的神经胶质瘤是弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)，一种类型的脑干神经胶质瘤。弥漫性内因性脑桥神经胶质瘤主要影响儿童，通常介于5岁与7岁之间。DIPG的中值存活时间低于12个月。对于DIPG，尝试切除肿瘤的手术通常是不可能或不可取的。就其本质而言，这些肿瘤广泛侵入整个脑干，在正常神经细胞之间生长。
在其它方面中，可通过本发明方法治疗的神经胶质瘤是IDH1和IDH2突变的神经胶质瘤。与具有野生型IDH1/2基因的神经胶质瘤患者相比，携带IDH1或IDH2中的突变的神经胶质瘤患者的存活率相对较高。在WHO III级神经胶质瘤中，IDH1/2突变型神经胶质瘤的中值预后为约3.5年，而IDH1/2野生型神经胶质瘤表现较差，中值总体存活期为1.5年。在成胶质细胞瘤中，差异更大。
在一些方面中，可用本公开治疗的神经免疫病症包括肿瘤性脑膜炎。如本文所用，“肿瘤性脑膜炎”是指已从原始肿瘤部位扩散至硬脑膜和软脑膜中的肿瘤，所述硬脑膜和软脑膜是覆盖脑和脊髓的薄组织膜。在一些方面中，从脑膜延伸到神经上和进入神经中的结缔组织神经鞘也可累及。肿瘤性脑膜炎也被称为癌性脑膜炎、软脑膜癌(leptomeningealcarcinoma)、软脑膜癌病、软脑膜转移瘤、软脑膜疾病(LMD)、软脑膜癌(leptomeningealcancer)、脑膜癌病和脑膜转移瘤。在某些方面中，肿瘤性脑膜炎由白血病引起。在一些方面中，肿瘤性脑膜炎由黑素瘤、乳腺癌、肺癌、胃肠癌或它们的组合引起。在某些方面中，肿瘤性脑膜炎由神经胶质瘤引起。
在一些方面中，本文公开的EV(例如，外泌体)可重新活化巨噬细胞(例如，在神经系统内)和/或逆转神经系统无反应性。在某些方面中，重新活化巨噬细胞(例如，神经系统内)和/或逆转神经系统无反应性可有助于治疗神经免疫病症(例如，通过根除神经系统内的肿瘤性或感染性病变)。
实施例
实施例1：mRNA和/或蛋白质减少的体外分析
本文公开的示例性ASO被设计为特异性地靶向CEBP/β转录物(图1)。将测试所公开的ASO在报告细胞系中敲低CEBP/βmRNA和/或CEBP/β蛋白表达的能力，所述报告细胞系在报告基因上游含有人CEBP/β编码序列。CEBP/β特异性siRNA将用作阳性对照。
简言之，表达CEBP/β的报告细胞系将在细胞培养基中生长并接种到96孔板上。然后，将用包含本文公开的一种或多种ASO的不同浓度的EV(例如，外泌体)(“EV-ASO”)处理细胞。在本公开的其它地方提供了用于产生此类EV的方法。EV-ASO处理后大约3天，将收获细胞并且将从细胞中纯化RNA和/或蛋白质。然后，将使用诸如qPCR和蛋白质印迹的测定来定量细胞中的CEBP/βmRNA和/或CEBP/β蛋白表达水平。
首先将通过使用基于可变转录物交叉反应性、物种交叉反应性、对目标基因的特异性、ASO内SNP的存在、ASO的长度、位置多样性、毒性基序和预测的结合亲和力的计算机选择来选择先导ASO。接下来，将针对在用靶序列(CEBP/βmRNA)转染的细胞系中敲低(在2nM下至少50％，并且在20nM下小于20％GAPDH敲低)靶基因表达的能力筛选ASO。然后将测定ASO在来自至少两个供体的原代巨噬细胞中的靶基因敲低效力。还将观察管家基因表达稳定性、序列位置的多样性以及处理后预测的脱靶的表达。在原代巨噬细胞中具有最高重编程活性(基因表达变化、细胞因子产生、T细胞抑制)的最佳ASO将被选择作为先导ASO。
实施例2：外泌体的构建
为了产生本文所述的外泌体，将使用人胚肾(HEK)细胞系(例如，HEK293SF)。细胞将用与目标剂连接的支架X、支架Y和/或锚定部分稳定转染。
在转染后，HEK细胞将在化学成分确定的培养基中生长至高密度持续7天。然后将收集条件细胞培养基，并在室温下以300–800xg离心5分钟，以除去细胞和大碎片。将用1000U/L
Figure BDA0003596121310002161
补充培养基上清液，并在37℃下在水浴中孵育1小时。将收集上清液，并在4℃下以16,000x g离心30分钟，以除去残留的细胞碎片和其它大的污染物。上清液然后将以133,900x g于4℃超速离心3小时，以沉淀出外泌体。将弃去上清液，并且将从管底部吸取任何残留的培养基。沉淀将重悬于200–1000μL PBS(-Ca-Mg)中。
为了进一步富集外泌体群体，将通过密度梯度纯化(蔗糖或OPTIPREPTM)加工沉淀。
梯度将在4℃下以200,000x g在置于SW 41Ti转子中的12mL Ultra-Clear(344059)管中旋转16小时，以分离外泌体级分。
然后将从顶层轻轻取出外泌体层，并将其在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中稀释于约32.5mL PBS中，并在4℃下以133,900x g再次超速离心3小时，以沉淀纯化的外泌体。所得沉淀将重悬于最小体积的PBS(约200μL)中，并在4℃下储存。
对于OPTIPREPTM梯度，将在用于SW 41Ti转子的12mL Ultra-Clear(344059)管中，用等体积的10％、30％和45％OPTIPREPTM制备3层无菌梯度。沉淀将添加至OPTIPREPTM梯度中，并在4℃下以200,000x g超速离心16小时，以分离外泌体级分。然后将从管的顶部约3mL轻轻收集外泌体层。
外泌体级分将在38.5mL Ultra-Clear(344058)管中稀释于约32mL PBS中，并在4℃下以133,900x g超速离心3小时，以沉淀出纯化的外泌体。成团外泌体然后将重悬于最小体积的PBS(约200μL)中并且储存在4℃下直到准备使用。
实施例3：ASO设计
小鼠和人ASO旨在靶向CEBP/β(基因ID号1051)表达。使用人CEBP/β的参考序列NM_001285878.1和小鼠CEBP/β的参考序列NM_009883.4选择靶序列。通过在新生转录物的整个长度上耕种ASO，对于每种基因生成可能的ASO列表。产生了长度为15、16、17、18、19或20个核碱基的ASO。
ASO基于以下性质进行优先级排序：必须命中所有剪接形式；低自二聚化能量(中靶活性)；无GGGG基序(可导致合成问题)；寡核苷酸中少于3个CpG二核苷酸(潜在免疫刺激)；少于8个碱基的回文序列(潜在二聚化和免疫刺激)；在对任何基因的脱靶命中中超过2个错配且不超过17个连续碱基，包括已知的miRNA和lncRNA，以及新生和成熟转录物；不与重复序列重叠；并且与一般群体中大于或等于0.01MAF的SNP没有重叠。另外的标准包括预测的物种交叉反应性(例如，人、食蟹猴、恒河猴、大鼠、小鼠转录物)；以及在成熟转录物中小于或等于3个错配(mm)、在lnc转录物中小于或等于3个mm、在miRNA中小于或等于3个mm以及在新生转录物中小于或等于3个mm的脱靶(OT)过滤器。
实施例4：外泌体上的ASO负载
用单剂量的负载有报告基因ASO的2E11外泌体(“exo ASO”；8μg荧光标记的Cy5exoASO)或用单剂量(8μg)的游离报告基因ASO(“游离ASO”)对携带CT26皮下(sc)肿瘤的BALB/c小鼠进行静脉内处理。施用后一小时，如相对于游离ASO的定位通过MFI所证明，在血液中的CD11b+树突细胞、单核细胞和mMDSC(图2A)；肝脏中的库普弗细胞(图2B)；脾脏中的红髓macs、单核细胞和mMDSC(图2C)；以及肿瘤组织中的树突细胞和mMDSC(图2D-2E)中观察到exo ASO摄取增加。与游离ASO和阴性对照的摄取(图2H-2K)相比，exo ASO的摄取在骨髓中也较高(图2F-2G)。示出在跨五个靶标的各种细胞类型中，成胶质细胞瘤(GBM)中PTGFRN同源受体的表达，其中骨髓细胞中存在最高表达。
将携带CT26皮下肿瘤的BALB/c小鼠用单次瘤内剂量(4μg)的exo ASO或游离ASO进行处理。施用后一小时，解剖肿瘤并进行酶消化，并通过流式细胞术分析肿瘤细胞悬浮液。在肿瘤细胞、巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞和树突细胞中观察到Exo ASO摄取(图2L-2M；MDSC：骨髓源性抑制细胞；mMDSC：单核细胞性MDSC；gMDSC：粒细胞性MDSC；cDC2＝2型常规树突细胞；cDC1＝1型常规树突细胞)。
实施例5：Exo-CEBP/β-ASO能够使M2巨噬细胞复极化
将原代人巨噬细胞用IL4/IL10/TGFβ处理极化，并用递增浓度的Exo-CEBP/β-ASO处理。将人原代M2巨噬细胞与等效剂量的靶向CEBP/β的exoASO和游离ASO以及exoASO乱序对照一起孵育48小时。使用nCounter Human Myeloid Innate Immunity Panel v2通过Nanostring或通过LEGENDPLEX多重流式细胞术进行基因表达分析。用Exo-CEBP/β-ASO体外处理原代人巨噬细胞分别诱导CEBP/β的剂量依赖性敲低(图3A)，以及M2巨噬细胞基因CD163的下调(图3B)。与游离ASO相比，发现使用Exo-ASO的效力略高。在用Exo-CEBP/β-ASO处理后，各种M2基因被下调，并且各种M1基因被上调(图4A-4J和4O)。此外，在脂多糖(LPS)刺激和用Exo-CEBP/β-ASO处理后，细胞因子产生被上调和下调(图4K-4N)。
实施例6：CD11b细胞中的Exo-CEBP/β-ASO靶基因敲低。
在体内，Exo-CEBP/β-ASO的主要受体细胞是CD11b细胞。为了进一步测量Exo-ASO的摄取和敲低效率，将携带CT26肿瘤的小鼠通过瘤内(IT)注射4μg Exo-CEBP/β-ASO或exoASO乱序，3次注射(隔日一次(q.o.d.))进行处理，并处死。然后分离并富集CD11b+细胞(图5A-5F)。将CT26肿瘤用4ug的exoASO C/EBPβ或exoASO乱序，3次注射(隔日一次)进行瘤内(IT)处理。处理后，使用CD11b阳性选择磁珠分离(80％富集)分离肿瘤相关骨髓细胞。使用nCounter Human Myeloid Innate Immunity Panel v2通过Nanostring进行CD11b+富集的肿瘤相关骨髓细胞中的基因表达分析。
尽管不是终点，但相对于用乱序Exo-ASO对照处理的小鼠，在Exo-CEBP/β-ASO处理的小鼠中肿瘤体积显著更低，并且与用游离ASO对照处理的小鼠相比，用Exo-CEBP/β-ASO处理的小鼠倾向于具有更小的肿瘤(图5G)。在用Exo-CEBP/β-ASO(图6A)处理后，在CD11b富集的细胞中，Exo-ASO靶基因敲低比非富集细胞中更明显。此外，如使用qPCR测量的，与非富集细胞相比，Exo-ASO在CD11b富集的细胞中更有效地降低Arg1表达(图6B)。
用Exo-CEBP/β-ASO处理的CD11b富集的细胞也显示出巨噬细胞重编程，如通过各种M1基因的上调和各种M2基因的下调所证明(图7A-7W)。
实施例7：使用Exo-CEBP/β-ASO治疗纤维化。
过度M2巨噬细胞活化导致TGFβ和生长因子的持续产生，所述TGFβ和生长因子促进肌成纤维细胞的增殖、EMT/EndoMT的活化和细胞外基质沉积。M2巨噬细胞代表伤口愈合与促纤维化过程恶化之间的转折点。为了测试Exo-CEBP/β-ASO是否能够用于治疗受试者的纤维化，用IL-13/TGFβ处理使原代人M2巨噬细胞极化，其是纤维化的驱动因素。然后使细胞暴露于递增浓度的游离CEBP/β-ASO(图8A和8B)或Exo-CEBP/β-ASO(图8A和8B)；并测定CEBP/β的表达(图8B)或TGFβ1的表达(图8B)。
为了测试使用鼻内施用在体内递送Exo-ASO的可行性，将6周龄小鼠用博莱霉素处理以诱导肺纤维化。两周后，将小鼠鼻内施用Exo-ASO-Cy5，并且在施用后4小时处死小鼠。相对于施用了Exo-ASO-Cy5的初次接受试验的小鼠(“IN
Figure BDA0003596121310002201
”)和相对于施用了PBS阴性对照(“-C”)初次接受试验和处理的小鼠，施用了Exo-ASO-Cy5的博莱霉素诱导的小鼠显示Cy5的总通量增加(图9)。
在正常肺和诱导的肺纤维化肺组织两者中，肺巨噬细胞和肺毛细血管内皮细胞均观察到外泌体摄取(图10A-10H和11A-11H)。
实施例8：使用Exo-CEBP/β-ASO治疗肝癌小鼠模型。
Hepa1-6小鼠将用于测试Exo-CEBP/β-ASO用于治疗肿瘤的体内功效。Hepa1-6系是肝癌的原位小鼠模型。从CRO获得样品并通过原位杂交分析CEBP/β的表达(图12A-12B)。
实施例9：使用Exo-CEBP/β-ASO治疗结肠癌小鼠模型
将CT26肿瘤细胞皮下植入BALB/c小鼠的侧腹中(每组n＝10)。植入后8天，用exoASO-CEBP/β或游离CEBP/βASO对小鼠进行瘤内处理，或用抗PD1抗体或抗CSF1R抗体进行腹膜内处理(每组n＝10只小鼠)。作为对照，两组小鼠用exoASO-乱序或PBS处理。对肿瘤体积的几何平均值的分析表明，用exoASO-CEBP/β处理的小鼠在植入后30天内几乎没有肿瘤生长(图13B)。与用抗CSF1R抗体处理的小鼠相比，用游离CEBP/βASO处理的小鼠具有减少的肿瘤生长。用exo-ASO CEBP/β处理的10只小鼠中有6只具有完全反应，而其它组中没有一只小鼠具有完全反应(图13C-13H)。
实施例10：使用Exo-CEBP/β治疗小鼠模型中的肝细胞癌(HCC)
将Exo ASO 2和游离ASO 2通过静脉内注射(IV)施用到健康雌性C57BL/6J(C57Bl/6Jrj)小鼠的尾静脉中。处理时间表总结于下表7中：
表7
Figure BDA0003596121310002211
在终止时，收集肝脏，称重并在显微镜下观察，并对可见病灶进行评分。将一个叶收集在RNAlater中(每1体积(g)组织5体积RNAlater)，然后冷冻用于内部基因表达分析，并且每只动物2个叶用于IHC(收集在10％NBF中持续24小时，室温，然后转移至4℃的PBS中)。每天观察动物存活力和行为，并在关键实验期间进行每日临床随访。至少每周两次测量体重。
ExoASO C/EBPβ诱导原代人M2巨噬细胞中靶基因的剂量依赖性敲低(KD)，其效力(IC50)高于游离ASO。评估了exoASO C/EBPβ单独或与抗PD1疗法组合的功效，如图15A-15H所示。ExoASO C/EBPβ与单一疗法一样有效(60％完全反应(CR))，而抗PD1或抗CSFR1 mAb无效(0％CR，图15A-15H)。与exoASO-C/EBPβ单一疗法(第50天50％存活率)相比，ExoASO C/EBPβ与抗PD-1mAb的组合产生了更高的功效(80％CR)，并且提高了存活率(第55天时70％)(图16)。使用exoASO疗法观察到持久的抗肿瘤反应，因为在实现针对原发性肿瘤的CR的小鼠中再激发后没有肿瘤生长。(图17)
使用原位肝细胞癌(HCC)模型评估了抗肿瘤功效。使用以下对小鼠进行IV给药：exoASO-C/EBPβ；游离C/EBPβASO；抗PD1或；抗CSF1R mAb。exoASO-C/EBPβ处理减弱了HCC介导的肝脏与体重比率的增加(≤10％)(图18A-18H)，并且在50％的经处理小鼠中几乎没有或没有可观察到的肿瘤病灶(图19A-19E)。当exoASO-C/EBPβ与抗PD-1抗体组合时，肿瘤减少进一步扩大，使得HCC介导的肝脏大小(图18H)和评分病灶百分比(图19B)的增加进一步减弱。
相比之下，用游离C/EBPβASO或抗CSF1R mAb处理的所有小鼠(100％)中均出现肝脏与体重比率增加(≥10％)和可观察到的肿瘤病灶。当局部或全身施用时，ExoASO CEBPβ在富含TAM的肿瘤中与单一疗法一样有效(图20)。当与检查点抗体组合施用时，ExoASO-CEBPβ的效力增加。
实施例11：使用Exo-C/EBPβ-ASO治疗多形性成胶质细胞瘤小鼠模型
携带多形性成胶质细胞瘤(GBM)的小鼠将用exo-C/EBPβ-ASO或游离C/EBPβASO进行瘤内处理。作为对照，两组小鼠将用exoASO-乱序或PBS处理。将在植入后至少30天内测量肿瘤体积的几何平均值。将监测巨噬细胞定位和标记基因表达，包括肿瘤浸润性巨噬细胞的出现。
实施例12：使用Exo-C/EBPβ-ASO治疗软脑膜癌病(LMD)小鼠模型
软脑膜癌病(LMD)小鼠将用exo-C/EBPβ-ASO或游离C/EBPβASO进行瘤内治疗。作为对照，两组小鼠将用exoASO-乱序或PBS治疗。将在植入后至少30天内测量肿瘤体积的几何平均值。将监测巨噬细胞定位和标记基因表达，包括肿瘤浸润性巨噬细胞的出现。
实施例13：通过
Figure BDA0003596121310002231
施用exoCEBP/β-ASO
将YUMM1.7细胞植入C57bl/6J小鼠的侧腹中，然后使用Presage Biosciences的比较体内肿瘤学
Figure BDA0003596121310002232
平台瘤内显微注射exoCEBP/βASO、游离C/EBPβASO或exoASO乱序(图21A-21G)。一次单剂量后24小时对小鼠实施安乐死(每组n＝6只小鼠)。给药后24小时通过原位杂交(ISH)进行的TNFa、CD11b、iNOS和F4/80的表达显示在图21A-21L中，其中每组是同一肿瘤上的不同注射部位。与游离ASO(图21E-21H)或乱序exoASO对照(图21A-21D)相比，在用CEBPB exoASO处理后观察到M1巨噬细胞标志物TNFa(图21I)和iNOS(图21K)以及单核细胞标志物CD11b(图21J)表达的有效诱导。这些PD读数揭示CEBP/β靶向exoASO对促炎性M1表型的极化。
以引用的方式并入
在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的特此以引用的方式整体并入，其并入程度如同每个单独出版物、专利或专利申请或其它文件被单独地指示出于所有目的以引用的方式并入一般。
等效方案
虽然已经示出和描述了各种具体实施方案，但上述说明书不是限制性的。应当理解，在不脱离一项或多项发明的精神和范围的情况下，可进行各种改变。通过阅读本说明书，许多变化对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
序列表
<110> 科迪亚克生物科学公司(Codiak BioSciences, Inc.)
<120> 靶向CEBP/β的细胞外囊泡-ASO构建体
<130> 4000.058PC07/C-K/BMD
<150> US 62/886,930
<151> 2019-08-14
<150> US 62/900,136
<151> 2019-09-13
<150> US 62/936,220
<151> 2019-11-15
<150> US 62/944,204
<151> 2019-12-05
<150> US 62/989,540
<151> 2020-03-13
<150> US 63/023,065
<151> 2020-05-11
<150> US 63/035,357
<151> 2020-06-05
<160> 632
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBP/B蛋白序列
<400> 2
Met Gln Arg Leu Val Ala Trp Asp Pro Ala Cys Leu Pro Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu
20 25 30
Ala Asp Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly
50 55 60
Ser Ile Gly Asp His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr
85 90 95
Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly
100 105 110
Gln His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly
115 120 125
Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg
130 135 140
Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu
145 150 155 160
His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu
165 170 175
Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala
180 185 190
Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg
195 200 205
Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu
210 215 220
Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp
225 230 235 240
Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp
260 265 270
Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser
275 280 285
Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu
290 295 300
Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu
305 310 315 320
Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu
325 330 335
Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly His Cys
340 345
<210> 3
<211> 2113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBP/B mRNA序列
<400> 3
tcccaatccc ggggcggccg ggcgggggtg ggcagggggc gtgaggccgc ccctgcgtcc 60
cgggggcccc ccgaaaacgc gctccgggtg cccggtccct ccgctgcgcc ctgccgccgt 120
cctcccgggg gtctcgggcg gccgcggccg tgtccttcgc gtcccggcgg cgcggcggga 180
ggggccggcg tgacgcagcg gttgctacgg gccgccctta taaataaccg ggctcaggag 240
aaactttagc gagtcagagc cgcgcacggg actgggaagg ggacccaccc gagggtccag 300
ccaccagccc cctcactaat agcggccacc ccggcagcgg cggcagcagc agcagcgacg 360
cagcggcgac agctcagagc agggaggccg cgccacctgc gggccggccg gagcgggcag 420
ccccaggccc cctccccggg cacccgcgtt catgcaacgc ctggtggcct gggacccagc 480
atgtctcccc ctgccgccgc cgccgcctgc ctttaaatcc atggaagtgg ccaacttcta 540
ctacgaggcg gactgcttgg ctgctgcgta cggcggcaag gcggcccccg cggcgccccc 600
cgcggccaga cccgggccgc gcccccccgc cggcgagctg ggcagcatcg gcgaccacga 660
gcgcgccatc gacttcagcc cgtacctgga gccgctgggc gcgccgcagg ccccggcgcc 720
cgccacggcc acggacacct tcgaggcggc tccgcccgcg cccgcccccg cgcccgcctc 780
ctccgggcag caccacgact tcctctccga cctcttctcc gacgactacg ggggcaagaa 840
ctgcaagaag ccggccgagt acggctacgt gagcctgggg cgcctggggg ccgccaaggg 900
cgcgctgcac cccggctgct tcgcgcccct gcacccaccg cccccgccgc cgccgccgcc 960
cgccgagctc aaggcggagc cgggcttcga gcccgcggac tgcaagcgga aggaggaggc 1020
cggggcgccg ggcggcggcg caggcatggc ggcgggcttc ccgtacgcgc tgcgcgctta 1080
cctcggctac caggcggtgc cgagcggcag cagcgggagc ctctccacgt cctcctcgtc 1140
cagcccgccc ggcacgccga gccccgctga cgccaaggcg cccccgaccg cctgctacgc 1200
gggggccgcg ccggcgccct cgcaggtcaa gagcaaggcc aagaagaccg tggacaagca 1260
cagcgacgag tacaagatcc ggcgcgagcg caacaacatc gccgtgcgca agagccgcga 1320
caaggccaag atgcgcaacc tggagacgca gcacaaggtc ctggagctca cggccgagaa 1380
cgagcggctg cagaagaagg tggagcagct gtcgcgcgag ctcagcaccc tgcggaactt 1440
gttcaagcag ctgcccgagc ccctgctcgc ctcctccggc cactgctagc gcggcccccg 1500
cgcgcgtccc cctgccggcc ggggctgaga ctccggggag cgcccgcgcc cgcgccctcg 1560
cccccgcccc cggcggcgcc ggcaaaactt tggcactggg gcacttggca gcgcggggag 1620
cccgtcggta attttaatat tttattatat atatatatct atatttttgt ccaaaccaac 1680
cgcacatgca gatggggctc ccgcccgtgg tgttatttaa agaagaaacg tctatgtgta 1740
cagatgaatg ataaactctc tgcttctccc tctgcccctc tccaggcgcc ggcgggcggg 1800
ccggtttcga agttgatgca atcggtttaa acatggctga acgcgtgtgt acacgggact 1860
gacgcaaccc acgtgtaact gtcagccggg ccctgagtaa tcgcttaaag atgttcctac 1920
gggcttgttg ctgttgatgt tttgttttgt tttgtttttt ggtctttttt tgtattataa 1980
aaaataatct atttctatga gaaaagaggc gtctgtatat tttgggaatc ttttccgttt 2040
caagcattaa gaacactttt aataaacttt tttttgagaa tggttacaaa gccttttggg 2100
ggcagtaaaa aaa 2113
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<400> 5
000
<210> 6
<400> 6
000
<210> 7
<400> 7
000
<210> 8
<400> 8
000
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<211> 2113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBP/B mRNA序列
<400> 11
tcccaatccc ggggcggccg ggcgggggtg ggcagggggc gtgaggccgc ccctgcgtcc 60
cgggggcccc ccgaaaacgc gctccgggtg cccggtccct ccgctgcgcc ctgccgccgt 120
cctcccgggg gtctcgggcg gccgcggccg tgtccttcgc gtcccggcgg cgcggcggga 180
ggggccggcg tgacgcagcg gttgctacgg gccgccctta taaataaccg ggctcaggag 240
aaactttagc gagtcagagc cgcgcacggg actgggaagg ggacccaccc gagggtccag 300
ccaccagccc cctcactaat agcggccacc ccggcagcgg cggcagcagc agcagcgacg 360
cagcggcgac agctcagagc agggaggccg cgccacctgc gggccggccg gagcgggcag 420
ccccaggccc cctccccggg cacccgcgtt catgcaacgc ctggtggcct gggacccagc 480
atgtctcccc ctgccgccgc cgccgcctgc ctttaaatcc atggaagtgg ccaacttcta 540
ctacgaggcg gactgcttgg ctgctgcgta cggcggcaag gcggcccccg cggcgccccc 600
cgcggccaga cccgggccgc gcccccccgc cggcgagctg ggcagcatcg gcgaccacga 660
gcgcgccatc gacttcagcc cgtacctgga gccgctgggc gcgccgcagg ccccggcgcc 720
cgccacggcc acggacacct tcgaggcggc tccgcccgcg cccgcccccg cgcccgcctc 780
ctccgggcag caccacgact tcctctccga cctcttctcc gacgactacg ggggcaagaa 840
ctgcaagaag ccggccgagt acggctacgt gagcctgggg cgcctggggg ccgccaaggg 900
cgcgctgcac cccggctgct tcgcgcccct gcacccaccg cccccgccgc cgccgccgcc 960
cgccgagctc aaggcggagc cgggcttcga gcccgcggac tgcaagcgga aggaggaggc 1020
cggggcgccg ggcggcggcg caggcatggc ggcgggcttc ccgtacgcgc tgcgcgctta 1080
cctcggctac caggcggtgc cgagcggcag cagcgggagc ctctccacgt cctcctcgtc 1140
cagcccgccc ggcacgccga gccccgctga cgccaaggcg cccccgaccg cctgctacgc 1200
gggggccgcg ccggcgccct cgcaggtcaa gagcaaggcc aagaagaccg tggacaagca 1260
cagcgacgag tacaagatcc ggcgcgagcg caacaacatc gccgtgcgca agagccgcga 1320
caaggccaag atgcgcaacc tggagacgca gcacaaggtc ctggagctca cggccgagaa 1380
cgagcggctg cagaagaagg tggagcagct gtcgcgcgag ctcagcaccc tgcggaactt 1440
gttcaagcag ctgcccgagc ccctgctcgc ctcctccggc cactgctagc gcggcccccg 1500
cgcgcgtccc cctgccggcc ggggctgaga ctccggggag cgcccgcgcc cgcgccctcg 1560
cccccgcccc cggcggcgcc ggcaaaactt tggcactggg gcacttggca gcgcggggag 1620
cccgtcggta attttaatat tttattatat atatatatct atatttttgt ccaaaccaac 1680
cgcacatgca gatggggctc ccgcccgtgg tgttatttaa agaagaaacg tctatgtgta 1740
cagatgaatg ataaactctc tgcttctccc tctgcccctc tccaggcgcc ggcgggcggg 1800
ccggtttcga agttgatgca atcggtttaa acatggctga acgcgtgtgt acacgggact 1860
gacgcaaccc acgtgtaact gtcagccggg ccctgagtaa tcgcttaaag atgttcctac 1920
gggcttgttg ctgttgatgt tttgttttgt tttgtttttt ggtctttttt tgtattataa 1980
aaaataatct atttctatga gaaaagaggc gtctgtatat tttgggaatc ttttccgttt 2040
caagcattaa gaacactttt aataaacttt tttttgagaa tggttacaaa gccttttggg 2100
ggcagtaaaa aaa 2113
<210> 12
<211> 345
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBPn氨基酸
<400> 12
Met Gln Arg Leu Val Ala Trp Asp Pro Ala Cys Leu Pro Leu Pro Pro
1 5 10 15
Pro Pro Pro Ala Phe Lys Ser Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu
20 25 30
Ala Asp Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly
50 55 60
Ser Ile Gly Asp His Glu Arg Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr
85 90 95
Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly
100 105 110
Gln His His Asp Phe Leu Ser Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly
115 120 125
Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg
130 135 140
Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu
145 150 155 160
His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu
165 170 175
Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala
180 185 190
Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg
195 200 205
Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu
210 215 220
Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp
225 230 235 240
Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp
260 265 270
Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser
275 280 285
Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu
290 295 300
Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu
305 310 315 320
Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu
325 330 335
Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly His Cys
340 345
<210> 13
<211> 2113
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人CEBP/B基因
<400> 13
tcccaatccc ggggcggccg ggcgggggtg ggcagggggc gtgaggccgc ccctgcgtcc 60
cgggggcccc ccgaaaacgc gctccgggtg cccggtccct ccgctgcgcc ctgccgccgt 120
cctcccgggg gtctcgggcg gccgcggccg tgtccttcgc gtcccggcgg cgcggcggga 180
ggggccggcg tgacgcagcg gttgctacgg gccgccctta taaataaccg ggctcaggag 240
aaactttagc gagtcagagc cgcgcacggg actgggaagg ggacccaccc gagggtccag 300
ccaccagccc cctcactaat agcggccacc ccggcagcgg cggcagcagc agcagcgacg 360
cagcggcgac agctcagagc agggaggccg cgccacctgc gggccggccg gagcgggcag 420
ccccaggccc cctccccggg cacccgcgtt catgcaacgc ctggtggcct gggacccagc 480
atgtctcccc ctgccgccgc cgccgcctgc ctttaaatcc atggaagtgg ccaacttcta 540
ctacgaggcg gactgcttgg ctgctgcgta cggcggcaag gcggcccccg cggcgccccc 600
cgcggccaga cccgggccgc gcccccccgc cggcgagctg ggcagcatcg gcgaccacga 660
gcgcgccatc gacttcagcc cgtacctgga gccgctgggc gcgccgcagg ccccggcgcc 720
cgccacggcc acggacacct tcgaggcggc tccgcccgcg cccgcccccg cgcccgcctc 780
ctccgggcag caccacgact tcctctccga cctcttctcc gacgactacg ggggcaagaa 840
ctgcaagaag ccggccgagt acggctacgt gagcctgggg cgcctggggg ccgccaaggg 900
cgcgctgcac cccggctgct tcgcgcccct gcacccaccg cccccgccgc cgccgccgcc 960
cgccgagctc aaggcggagc cgggcttcga gcccgcggac tgcaagcgga aggaggaggc 1020
cggggcgccg ggcggcggcg caggcatggc ggcgggcttc ccgtacgcgc tgcgcgctta 1080
cctcggctac caggcggtgc cgagcggcag cagcgggagc ctctccacgt cctcctcgtc 1140
cagcccgccc ggcacgccga gccccgctga cgccaaggcg cccccgaccg cctgctacgc 1200
gggggccgcg ccggcgccct cgcaggtcaa gagcaaggcc aagaagaccg tggacaagca 1260
cagcgacgag tacaagatcc ggcgcgagcg caacaacatc gccgtgcgca agagccgcga 1320
caaggccaag atgcgcaacc tggagacgca gcacaaggtc ctggagctca cggccgagaa 1380
cgagcggctg cagaagaagg tggagcagct gtcgcgcgag ctcagcaccc tgcggaactt 1440
gttcaagcag ctgcccgagc ccctgctcgc ctcctccggc cactgctagc gcggcccccg 1500
cgcgcgtccc cctgccggcc ggggctgaga ctccggggag cgcccgcgcc cgcgccctcg 1560
cccccgcccc cggcggcgcc ggcaaaactt tggcactggg gcacttggca gcgcggggag 1620
cccgtcggta attttaatat tttattatat atatatatct atatttttgt ccaaaccaac 1680
cgcacatgca gatggggctc ccgcccgtgg tgttatttaa agaagaaacg tctatgtgta 1740
cagatgaatg ataaactctc tgcttctccc tctgcccctc tccaggcgcc ggcgggcggg 1800
ccggtttcga agttgatgca atcggtttaa acatggctga acgcgtgtgt acacgggact 1860
gacgcaaccc acgtgtaact gtcagccggg ccctgagtaa tcgcttaaag atgttcctac 1920
gggcttgttg ctgttgatgt tttgttttgt tttgtttttt ggtctttttt tgtattataa 1980
aaaataatct atttctatga gaaaagaggc gtctgtatat tttgggaatc ttttccgttt 2040
caagcattaa gaacactttt aataaacttt tttttgagaa tggttacaaa gccttttggg 2100
ggcagtaaaa aaa 2113
<210> 14
<211> 322
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBPb同种型2
<400> 14
Met Glu Val Ala Asn Phe Tyr Tyr Glu Ala Asp Cys Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Gly Gly Lys Ala Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Arg Pro Gly
20 25 30
Pro Arg Pro Pro Ala Gly Glu Leu Gly Ser Ile Gly Asp His Glu Arg
35 40 45
Ala Ile Asp Phe Ser Pro Tyr Leu Glu Pro Leu Gly Ala Pro Gln Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Thr Ala Thr Asp Thr Phe Glu Ala Ala Pro Pro Ala
65 70 75 80
Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Gly Gln His His Asp Phe Leu Ser
85 90 95
Asp Leu Phe Ser Asp Asp Tyr Gly Gly Lys Asn Cys Lys Lys Pro Ala
100 105 110
Glu Tyr Gly Tyr Val Ser Leu Gly Arg Leu Gly Ala Ala Lys Gly Ala
115 120 125
Leu His Pro Gly Cys Phe Ala Pro Leu His Pro Pro Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Ala Glu Leu Lys Ala Glu Pro Gly Phe Glu Pro Ala Asp
145 150 155 160
Cys Lys Arg Lys Glu Glu Ala Gly Ala Pro Gly Gly Gly Ala Gly Met
165 170 175
Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln Ala
180 185 190
Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser
195 200 205
Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp Ala Lys Ala Pro Pro Thr Ala
210 215 220
Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gln Val Lys Ser Lys Ala
225 230 235 240
Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp Glu Tyr Lys Ile Arg Arg Glu
245 250 255
Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser Arg Asp Lys Ala Lys Met Arg
260 265 270
Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu Glu Leu Thr Ala Glu Asn Glu
275 280 285
Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu Ser Arg Glu Leu Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu Pro Leu Leu Ala Ser Ser Gly
305 310 315 320
His Cys
<210> 15
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CEBPb同种型3
<400> 15
Met Ala Ala Gly Phe Pro Tyr Ala Leu Arg Ala Tyr Leu Gly Tyr Gln
1 5 10 15
Ala Val Pro Ser Gly Ser Ser Gly Ser Leu Ser Thr Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Pro Pro Gly Thr Pro Ser Pro Ala Asp Ala Lys Ala Pro Pro Thr
35 40 45
Ala Cys Tyr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gln Val Lys Ser Lys
50 55 60
Ala Lys Lys Thr Val Asp Lys His Ser Asp Glu Tyr Lys Ile Arg Arg
65 70 75 80
Glu Arg Asn Asn Ile Ala Val Arg Lys Ser Arg Asp Lys Ala Lys Met
85 90 95
Arg Asn Leu Glu Thr Gln His Lys Val Leu Glu Leu Thr Ala Glu Asn
100 105 110
Glu Arg Leu Gln Lys Lys Val Glu Gln Leu Ser Arg Glu Leu Ser Thr
115 120 125
Leu Arg Asn Leu Phe Lys Gln Leu Pro Glu Pro Leu Leu Ala Ser Ser
130 135 140
Gly His Cys
145
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<400> 16
000
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<400> 17
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<400> 35
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<400> 45
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<400> 46
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<400> 48
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<400> 49
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<400> 50
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<400> 51
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<400> 55
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<400> 74
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<400> 78
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<400> 79
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<400> 80
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<400> 81
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<400> 82
000
<210> 83
<400> 83
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<400> 84
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<400> 85
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<400> 86
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<400> 87
000
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<400> 88
000
<210> 89
<400> 89
000
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ASO (CEBP)
<400> 90
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<400> 91
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000
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<400> 101
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<400> 102
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<400> 103
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<400> 104
000
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<400> 105
000
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<400> 106
000
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<400> 107
000
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<400> 108
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<400> 109
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<400> 125
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<400> 161
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<223> 神经生长因子
<400> 162
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1 5 10 15
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys
20 25 30
Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val
35 40 45
Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val
50 55 60
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Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln
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Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu
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<400> 163
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 神经营养蛋白
<400> 164
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Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp
20 25 30
Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp
50 55 60
Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly
65 70 75 80
Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr
85 90 95
Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp
100 105 110
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
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<211> 15
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<220>
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<211> 15
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 224
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<220>
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<400> 225
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 226
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<211> 16
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<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 227
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 228
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<210> 229
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 229
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 230
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 231
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 232
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<210> 233
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 233
acgggaagcc cgccgc 16
<210> 234
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 234
tacgggaagc ccgccg 16
<210> 235
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 235
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 236
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<210> 237
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 237
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 238
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<210> 239
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 239
tcggcaccgc ctggta 16
<210> 240
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 240
cgtcgctgtg cttgtc 16
<210> 241
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 241
cgccggatct tgtact 16
<210> 242
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 242
tcgcgccgga tcttgt 16
<210> 243
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 243
gctcgcgccg gatctt 16
<210> 244
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 244
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 245
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 246
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 247
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 248
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 250
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 251
cccccgtagt cgtcgga 17
<210> 252
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 反义寡核苷酸
<400> 252
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 253
acgtagccgt actcggc 17
<210> 254
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 254
cacgtagccg tactcgg 17
<210> 255
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 255
ggctcacgta gccgtac 17
<210> 256
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 256
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 257
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 258
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 259
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<211> 17
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<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 260
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<211> 17
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 261
gtaagcgcgc agcgcgt 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 262
cggatcttgt actcgtc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 263
cgcgccggat cttgtac 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 264
tcgcgccgga tcttgta 17
<210> 265
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 265
ctcgcgccgg atcttgt 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 266
cgctcgcgcc ggatctt 17
<210> 267
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 267
ttgcgctcgc gccggat 17
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 268
cgccttgccg ccgtacgcag 20
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 269
ccgccttgcc gccgtacgca 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 270
ttgcccccgt agtcgtcgga 20
<210> 271
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 271
taagcgcgca gcgcgtacgg 20
<210> 272
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 272
gtaagcgcgc agcgcgtacg 20
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 273
aggtaagcgc gcagcgcgta 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 274
cgcgccggat cttgtactcg 20
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 275
gcgctcgcgc cggatcttgt 20
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 276
gcgctcgtgg tcgccgatgc 20
<210> 277
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 277
tagccgtact cggccggctt 20
<210> 278
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 278
gtagccgtac tcggccggct 20
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 279
cgtagccgta ctcggccggc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 280
ggtaagcgcg cagcgcgtac 20
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 281
tagccgaggt aagcgcgcag 20
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 282
gtagccgagg taagcgcgca 20
<210> 283
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 283
cggatcttgt actcgtcgct 20
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 284
ttgcgctcgc gccggatctt 20
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 285
gttgcgctcg cgccggatct 20
<210> 286
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 286
cgctcgtggt cgccgatgct 20
<210> 287
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 287
gcgcgctcgt ggtcgccgat 20
<210> 288
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 288
acgtagccgt actcggccgg 20
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 289
gcgccggatc ttgtactcgt 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 290
tcgcgccgga tcttgtactc 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 291
gctcgcgccg gatcttgtac 20
<210> 292
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 292
cgcgctcgtg gtcgccgatg 20
<210> 293
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 293
aagcgcgcag cgcgtacggg 20
<210> 294
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 294
ccggatcttg tactcgtcgc 20
<210> 295
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 295
ctcgcgccgg atcttgtact 20
<210> 296
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反义寡核苷酸
<400> 296
cgctcgcgcc ggatcttgta 20
<210> 297
<400> 297
000
<210> 298
<400> 298
000
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<400> 299
000
<210> 300
<400> 300
000
<210> 301
<211> 879
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PrX - PTGFRN (1)
<400> 301
Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val
20 25 30
Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr
35 40 45
Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly
50 55 60
Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala
65 70 75 80
Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg
85 90 95
Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser
100 105 110
Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val
115 120 125
Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser
130 135 140
Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro
165 170 175
Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala
180 185 190
Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly
195 200 205
Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr
210 215 220
Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala
225 230 235 240
Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln
245 250 255
Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val
260 265 270
Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser
275 280 285
Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp
290 295 300
Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met
305 310 315 320
Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg
325 330 335
Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp
340 345 350
Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser
355 360 365
Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg
370 375 380
Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly
385 390 395 400
Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys
405 410 415
Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val
420 425 430
Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr
435 440 445
Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu
450 455 460
Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys
465 470 475 480
Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp
485 490 495
Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn
500 505 510
Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp
515 520 525
Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala
530 535 540
Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe
545 550 555 560
Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys
565 570 575
Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro
580 585 590
Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu
595 600 605
Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg
610 615 620
Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr
625 630 635 640
Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met
645 650 655
Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala
660 665 670
Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro
675 680 685
Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly
690 695 700
Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu
705 710 715 720
Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser
725 730 735
Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys
740 745 750
Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu
755 760 765
Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu
770 775 780
Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys
785 790 795 800
Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro
805 810 815
Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro
820 825 830
Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys
835 840 845
Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln
850 855 860
Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
865 870 875
<210> 302
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PrX - PTGFRN片段(33)
<400> 302
Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile
1 5 10 15
Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala
20 25 30
Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val
35 40 45
His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp
50 55 60
Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu
65 70 75 80
Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly
85 90 95
Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp
100 105 110
Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser
115 120 125
Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys
130 135 140
Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu
165 170 175
Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met
180 185 190
<210> 303
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BSG蛋白(9)
<400> 303
Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
His Gly Ala Ser Gly Ala Ala Gly Phe Val Gln Ala Pro Leu Ser Gln
20 25 30
Gln Arg Trp Val Gly Gly Ser Val Glu Leu His Cys Glu Ala Val Gly
35 40 45
Ser Pro Val Pro Glu Ile Gln Trp Trp Phe Glu Gly Gln Gly Pro Asn
50 55 60
Asp Thr Cys Ser Gln Leu Trp Asp Gly Ala Arg Leu Asp Arg Val His
65 70 75 80
Ile His Ala Thr Tyr His Gln His Ala Ala Ser Thr Ile Ser Ile Asp
85 90 95
Thr Leu Val Glu Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Glu Cys Arg Ala Ser Asn
100 105 110
Asp Pro Asp Arg Asn His Leu Thr Arg Ala Pro Arg Val Lys Trp Val
115 120 125
Arg Ala Gln Ala Val Val Leu Val Leu Glu Pro Gly Thr Val Phe Thr
130 135 140
Thr Val Glu Asp Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn
145 150 155 160
Asp Ser Ala Thr Glu Val Thr Gly His Arg Trp Leu Lys Gly Gly Val
165 170 175
Val Leu Lys Glu Asp Ala Leu Pro Gly Gln Lys Thr Glu Phe Lys Val
180 185 190
Asp Ser Asp Asp Gln Trp Gly Glu Tyr Ser Cys Val Phe Leu Pro Glu
195 200 205
Pro Met Gly Thr Ala Asn Ile Gln Leu His Gly Pro Pro Arg Val Lys
210 215 220
Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu
225 230 235 240
Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr
245 250 255
Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser
260 265 270
Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly Arg Ser Glu Leu His Ile Glu
275 280 285
Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr
290 295 300
Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser
305 310 315 320
His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val Ala Glu Val Leu
325 330 335
Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu
340 345 350
Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser
355 360 365
Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser
370 375 380
Ser
385
<210> 304
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白(14)
<400> 304
Met Gly Ala Leu Arg Pro Thr Leu Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Met Leu Gly Met Gly Cys Trp Ala Arg Glu Val Leu Val
20 25 30
Pro Glu Gly Pro Leu Tyr Arg Val Ala Gly Thr Ala Val Ser Ile Ser
35 40 45
Cys Asn Val Thr Gly Tyr Glu Gly Pro Ala Gln Gln Asn Phe Glu Trp
50 55 60
Phe Leu Tyr Arg Pro Glu Ala Pro Asp Thr Ala Leu Gly Ile Val Ser
65 70 75 80
Thr Lys Asp Thr Gln Phe Ser Tyr Ala Val Phe Lys Ser Arg Val Val
85 90 95
Ala Gly Glu Val Gln Val Gln Arg Leu Gln Gly Asp Ala Val Val Leu
100 105 110
Lys Ile Ala Arg Leu Gln Ala Gln Asp Ala Gly Ile Tyr Glu Cys His
115 120 125
Thr Pro Ser Thr Asp Thr Arg Tyr Leu Gly Ser Tyr Ser Gly Lys Val
130 135 140
Glu Leu Arg Val Leu Pro Asp Val Leu Gln Val Ser Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Pro Arg Gly Arg Gln Ala Pro Thr Ser Pro Pro Arg Met Thr Val
165 170 175
His Glu Gly Gln Glu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg Thr Ser Thr
180 185 190
Gln Lys His Thr His Leu Ala Val Ser Phe Gly Arg Ser Val Pro Glu
195 200 205
Ala Pro Val Gly Arg Ser Thr Leu Gln Glu Val Val Gly Ile Arg Ser
210 215 220
Asp Leu Ala Val Glu Ala Gly Ala Pro Tyr Ala Glu Arg Leu Ala Ala
225 230 235 240
Gly Glu Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Thr Asp Arg Tyr Arg Met Val
245 250 255
Val Gly Gly Ala Gln Ala Gly Asp Ala Gly Thr Tyr His Cys Thr Ala
260 265 270
Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp Gly Ser Trp Ala Gln Ile Ala Glu
275 280 285
Lys Arg Ala Val Leu Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu Ser Ser Gln
290 295 300
Leu Ala Val Thr Val Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly Pro Gly Glu
305 310 315 320
Pro Leu Glu Leu Leu Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly
325 330 335
Arg His Ala Ala Tyr Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro Ala Gly Ala
340 345 350
Pro Gly Pro Gly Arg Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu Gly Val Gly
355 360 365
Ser Leu Gly Pro Gly Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met Glu Lys Val
370 375 380
Ala Ser Arg Thr Tyr Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg Pro Gly Asp
385 390 395 400
Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg Gly Ser Gly
405 410 415
Thr Arg Leu Arg Glu Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro Leu Pro Val
420 425 430
His Val Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala
435 440 445
Gly Gly Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile
450 455 460
Ser Val Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp
465 470 475 480
Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu
485 490 495
Val Gly Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro
500 505 510
Gly Gly Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg
515 520 525
Leu Arg Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys
530 535 540
Ala Pro Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala
545 550 555 560
Gly Ser Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala
565 570 575
Leu Asp Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu
580 585 590
Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys
595 600 605
Arg Leu Arg Lys Arg
610
<210> 305
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGB1蛋白(21)
<400> 305
Met Asn Leu Gln Pro Ile Phe Trp Ile Gly Leu Ile Ser Ser Val Cys
1 5 10 15
Cys Val Phe Ala Gln Thr Asp Glu Asn Arg Cys Leu Lys Ala Asn Ala
20 25 30
Lys Ser Cys Gly Glu Cys Ile Gln Ala Gly Pro Asn Cys Gly Trp Cys
35 40 45
Thr Asn Ser Thr Phe Leu Gln Glu Gly Met Pro Thr Ser Ala Arg Cys
50 55 60
Asp Asp Leu Glu Ala Leu Lys Lys Lys Gly Cys Pro Pro Asp Asp Ile
65 70 75 80
Glu Asn Pro Arg Gly Ser Lys Asp Ile Lys Lys Asn Lys Asn Val Thr
85 90 95
Asn Arg Ser Lys Gly Thr Ala Glu Lys Leu Lys Pro Glu Asp Ile Thr
100 105 110
Gln Ile Gln Pro Gln Gln Leu Val Leu Arg Leu Arg Ser Gly Glu Pro
115 120 125
Gln Thr Phe Thr Leu Lys Phe Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Pro Ile Asp
130 135 140
Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Lys Asp Asp Leu Glu
145 150 155 160
Asn Val Lys Ser Leu Gly Thr Asp Leu Met Asn Glu Met Arg Arg Ile
165 170 175
Thr Ser Asp Phe Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Glu Lys Thr Val
180 185 190
Met Pro Tyr Ile Ser Thr Thr Pro Ala Lys Leu Arg Asn Pro Cys Thr
195 200 205
Ser Glu Gln Asn Cys Thr Ser Pro Phe Ser Tyr Lys Asn Val Leu Ser
210 215 220
Leu Thr Asn Lys Gly Glu Val Phe Asn Glu Leu Val Gly Lys Gln Arg
225 230 235 240
Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ser Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Met
245 250 255
Gln Val Ala Val Cys Gly Ser Leu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr Arg
260 265 270
Leu Leu Val Phe Ser Thr Asp Ala Gly Phe His Phe Ala Gly Asp Gly
275 280 285
Lys Leu Gly Gly Ile Val Leu Pro Asn Asp Gly Gln Cys His Leu Glu
290 295 300
Asn Asn Met Tyr Thr Met Ser His Tyr Tyr Asp Tyr Pro Ser Ile Ala
305 310 315 320
His Leu Val Gln Lys Leu Ser Glu Asn Asn Ile Gln Thr Ile Phe Ala
325 330 335
Val Thr Glu Glu Phe Gln Pro Val Tyr Lys Glu Leu Lys Asn Leu Ile
340 345 350
Pro Lys Ser Ala Val Gly Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Asn Val Ile
355 360 365
Gln Leu Ile Ile Asp Ala Tyr Asn Ser Leu Ser Ser Glu Val Ile Leu
370 375 380
Glu Asn Gly Lys Leu Ser Glu Gly Val Thr Ile Ser Tyr Lys Ser Tyr
385 390 395 400
Cys Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Gly Glu Asn Gly Arg Lys Cys Ser
405 410 415
Asn Ile Ser Ile Gly Asp Glu Val Gln Phe Glu Ile Ser Ile Thr Ser
420 425 430
Asn Lys Cys Pro Lys Lys Asp Ser Asp Ser Phe Lys Ile Arg Pro Leu
435 440 445
Gly Phe Thr Glu Glu Val Glu Val Ile Leu Gln Tyr Ile Cys Glu Cys
450 455 460
Glu Cys Gln Ser Glu Gly Ile Pro Glu Ser Pro Lys Cys His Glu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Thr Phe Glu Cys Gly Ala Cys Arg Cys Asn Glu Gly Arg Val
485 490 495
Gly Arg His Cys Glu Cys Ser Thr Asp Glu Val Asn Ser Glu Asp Met
500 505 510
Asp Ala Tyr Cys Arg Lys Glu Asn Ser Ser Glu Ile Cys Ser Asn Asn
515 520 525
Gly Glu Cys Val Cys Gly Gln Cys Val Cys Arg Lys Arg Asp Asn Thr
530 535 540
Asn Glu Ile Tyr Ser Gly Ala Ser Asn Gly Gln Ile Cys Asn Gly Arg
545 550 555 560
Gly Ile Cys Glu Cys Gly Val Cys Lys Cys Thr Asp Pro Lys Phe Gln
565 570 575
Gly Gln Thr Cys Glu Met Cys Gln Thr Cys Leu Gly Val Cys Ala Glu
580 585 590
His Lys Glu Cys Val Gln Cys Arg Ala Phe Asn Lys Gly Glu Lys Lys
595 600 605
Asp Thr Cys Thr Gln Glu Cys Ser Tyr Phe Asn Ile Thr Lys Val Glu
610 615 620
Ser Arg Asp Lys Leu Pro Gln Pro Val Gln Pro Asp Pro Val Ser His
625 630 635 640
Cys Lys Glu Lys Asp Val Asp Asp Cys Trp Phe Tyr Phe Thr Tyr Ser
645 650 655
Val Asn Gly Asn Asn Glu Val Met Val His Val Val Glu Asn Pro Glu
660 665 670
Cys Pro Thr Gly Pro Asp Ile Ile Pro Ile Val Ala Gly Val Val Ala
675 680 685
Gly Ile Val Leu Ile Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ile Trp Lys Leu Leu
690 695 700
Met Ile Ile His Asp Arg Arg Glu Phe Ala Lys Phe Glu Lys Glu Lys
705 710 715 720
Met Asn Ala Lys Trp Asp Thr Gly Glu Asn Pro Ile Tyr Lys Ser Ala
725 730 735
Val Thr Thr Val Val Asn Pro Lys Tyr Glu Gly Lys
740 745
<210> 306
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ITGA4蛋白(22)
<400> 306
Met Ala Trp Glu Ala Arg Arg Glu Pro Gly Pro Arg Arg Ala Ala Val
1 5 10 15
Arg Glu Thr Val Met Leu Leu Leu Cys Leu Gly Val Pro Thr Gly Arg
20 25 30
Pro Tyr Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His
35 40 45
Asn Thr Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn
50 55 60
Arg Trp Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala
65 70 75 80
Ser Val Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn
85 90 95
Pro Gly Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu
100 105 110
Pro Cys Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly
115 120 125
Val Thr Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys
130 135 140
Gly His Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu
145 150 155 160
Pro Thr Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu
165 170 175
Ser Lys Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly
180 185 190
Glu Asn Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys
195 200 205
Asp Leu Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser
210 215 220
Leu Phe Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp
225 230 235 240
Lys Gln Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly
245 250 255
Ala Gly His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala
260 265 270
Pro Gln His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu
275 280 285
Lys Glu Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser
290 295 300
Tyr Phe Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe
305 310 315 320
Ser Asp Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu
325 330 335
Gly Arg Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn
340 345 350
Ala Met Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe
355 360 365
Gly Glu Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu
370 375 380
Asp Val Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile
385 390 395 400
Tyr Ile Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln
405 410 415
Arg Ile Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln
420 425 430
Ser Ile Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val
435 440 445
Ala Val Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg
450 455 460
Pro Val Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn
465 470 475 480
Arg Thr Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile
485 490 495
Asp Leu Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr
500 505 510
Ile Val Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu
515 520 525
Ser Pro Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile
530 535 540
Thr Gly Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His
545 550 555 560
Gln Ala Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln
565 570 575
Ile Glu Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile Ser Lys Arg Ser
580 585 590
Thr Glu Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu
595 600 605
Lys Asp Ile Met Lys Lys Thr Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala His
610 615 620
Glu Asn Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Ile Gly Phe Leu
625 630 635 640
Lys Pro His Glu Asn Lys Thr Tyr Leu Ala Val Gly Ser Met Lys Thr
645 650 655
Leu Met Leu Asn Val Ser Leu Phe Asn Ala Gly Asp Asp Ala Tyr Glu
660 665 670
Thr Thr Leu His Val Lys Leu Pro Val Gly Leu Tyr Phe Ile Lys Ile
675 680 685
Leu Glu Leu Glu Glu Lys Gln Ile Asn Cys Glu Val Thr Asp Asn Ser
690 695 700
Gly Val Val Gln Leu Asp Cys Ser Ile Gly Tyr Ile Tyr Val Asp His
705 710 715 720
Leu Ser Arg Ile Asp Ile Ser Phe Leu Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser
725 730 735
Arg Ala Glu Glu Asp Leu Ser Ile Thr Val His Ala Thr Cys Glu Asn
740 745 750
Glu Glu Glu Met Asp Asn Leu Lys His Ser Arg Val Thr Val Ala Ile
755 760 765
Pro Leu Lys Tyr Glu Val Lys Leu Thr Val His Gly Phe Val Asn Pro
770 775 780
Thr Ser Phe Val Tyr Gly Ser Asn Asp Glu Asn Glu Pro Glu Thr Cys
785 790 795 800
Met Val Glu Lys Met Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Asn
805 810 815
Ser Met Ala Pro Asn Val Ser Val Glu Ile Met Val Pro Asn Ser Phe
820 825 830
Ser Pro Gln Thr Asp Lys Leu Phe Asn Ile Leu Asp Val Gln Thr Thr
835 840 845
Thr Gly Glu Cys His Phe Glu Asn Tyr Gln Arg Val Cys Ala Leu Glu
850 855 860
Gln Gln Lys Ser Ala Met Gln Thr Leu Lys Gly Ile Val Arg Phe Leu
865 870 875 880
Ser Lys Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His
885 890 895
Cys Leu Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu
900 905 910
Ala Ser Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met
915 920 925
Asp Glu Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro
930 935 940
Glu Pro Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala
945 950 955 960
His Val Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe
965 970 975
Thr Ile Val Ile Ile Ser Ser Ser Leu Leu Leu Gly Leu Ile Val Leu
980 985 990
Leu Leu Ile Ser Tyr Val Met Trp Lys Ala Gly Phe Phe Lys Arg Gln
995 1000 1005
Tyr Lys Ser Ile Leu Gln Glu Glu Asn Arg Arg Asp Ser Trp Ser
1010 1015 1020
Tyr Ile Asn Ser Lys Ser Asn Asp Asp
1025 1030
<210> 307
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SLC3A2蛋白，(23)其中第一Met进行了加工
<400> 307
Met Glu Leu Gln Pro Pro Glu Ala Ser Ile Ala Val Val Ser Ile Pro
1 5 10 15
Arg Gln Leu Pro Gly Ser His Ser Glu Ala Gly Val Gln Gly Leu Ser
20 25 30
Ala Gly Asp Asp Ser Glu Leu Gly Ser His Cys Val Ala Gln Thr Gly
35 40 45
Leu Glu Leu Leu Ala Ser Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gln Asn
50 55 60
Ala Glu Met Ile Glu Thr Gly Ser Asp Cys Val Thr Gln Ala Gly Leu
65 70 75 80
Gln Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Ala Leu Ala Ser Lys Asn Ala
85 90 95
Glu Val Thr Gly Thr Met Ser Gln Asp Thr Glu Val Asp Met Lys Glu
100 105 110
Val Glu Leu Asn Glu Leu Glu Pro Glu Lys Gln Pro Met Asn Ala Ala
115 120 125
Ser Gly Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Ala Glu Lys Asn Gly Leu Val
130 135 140
Lys Ile Lys Val Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Phe Thr Gly Leu Ser Lys Glu Glu Leu Leu Lys Val Ala Gly Ser Pro
165 170 175
Gly Trp Val Arg Thr Arg Trp Ala Leu Leu Leu Leu Phe Trp Leu Gly
180 185 190
Trp Leu Gly Met Leu Ala Gly Ala Val Val Ile Ile Val Arg Ala Pro
195 200 205
Arg Cys Arg Glu Leu Pro Ala Gln Lys Trp Trp His Thr Gly Ala Leu
210 215 220
Tyr Arg Ile Gly Asp Leu Gln Ala Phe Gln Gly His Gly Ala Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ala Gly Leu Lys Gly Arg Leu Asp Tyr Leu Ser Ser Leu Lys Val
245 250 255
Lys Gly Leu Val Leu Gly Pro Ile His Lys Asn Gln Lys Asp Asp Val
260 265 270
Ala Gln Thr Asp Leu Leu Gln Ile Asp Pro Asn Phe Gly Ser Lys Glu
275 280 285
Asp Phe Asp Ser Leu Leu Gln Ser Ala Lys Lys Lys Ser Ile Arg Val
290 295 300
Ile Leu Asp Leu Thr Pro Asn Tyr Arg Gly Glu Asn Ser Trp Phe Ser
305 310 315 320
Thr Gln Val Asp Thr Val Ala Thr Lys Val Lys Asp Ala Leu Glu Phe
325 330 335
Trp Leu Gln Ala Gly Val Asp Gly Phe Gln Val Arg Asp Ile Glu Asn
340 345 350
Leu Lys Asp Ala Ser Ser Phe Leu Ala Glu Trp Gln Asn Ile Thr Lys
355 360 365
Gly Phe Ser Glu Asp Arg Leu Leu Ile Ala Gly Thr Asn Ser Ser Asp
370 375 380
Leu Gln Gln Ile Leu Ser Leu Leu Glu Ser Asn Lys Asp Leu Leu Leu
385 390 395 400
Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Asp Ser Gly Ser Thr Gly Glu His Thr Lys
405 410 415
Ser Leu Val Thr Gln Tyr Leu Asn Ala Thr Gly Asn Arg Trp Cys Ser
420 425 430
Trp Ser Leu Ser Gln Ala Arg Leu Leu Thr Ser Phe Leu Pro Ala Gln
435 440 445
Leu Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Met Leu Phe Thr Leu Pro Gly Thr Pro
450 455 460
Val Phe Ser Tyr Gly Asp Glu Ile Gly Leu Asp Ala Ala Ala Leu Pro
465 470 475 480
Gly Gln Pro Met Glu Ala Pro Val Met Leu Trp Asp Glu Ser Ser Phe
485 490 495
Pro Asp Ile Pro Gly Ala Val Ser Ala Asn Met Thr Val Lys Gly Gln
500 505 510
Ser Glu Asp Pro Gly Ser Leu Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Ser Asp
515 520 525
Gln Arg Ser Lys Glu Arg Ser Leu Leu His Gly Asp Phe His Ala Phe
530 535 540
Ser Ala Gly Pro Gly Leu Phe Ser Tyr Ile Arg His Trp Asp Gln Asn
545 550 555 560
Glu Arg Phe Leu Val Val Leu Asn Phe Gly Asp Val Gly Leu Ser Ala
565 570 575
Gly Leu Gln Ala Ser Asp Leu Pro Ala Ser Ala Ser Leu Pro Ala Lys
580 585 590
Ala Asp Leu Leu Leu Ser Thr Gln Pro Gly Arg Glu Glu Gly Ser Pro
595 600 605
Leu Glu Leu Glu Arg Leu Lys Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Leu Leu
610 615 620
Arg Phe Pro Tyr Ala Ala
625 630
<210> 308
<211> 1021
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF2
<400> 308
Met Ala Gly Ile Ser Tyr Val Ala Ser Phe Phe Leu Leu Leu Thr Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ile Gly Gln Arg Glu Val Thr Val Gln Lys Gly Pro Leu Phe
20 25 30
Arg Ala Glu Gly Tyr Pro Val Ser Ile Gly Cys Asn Val Thr Gly His
35 40 45
Gln Gly Pro Ser Glu Gln His Phe Gln Trp Ser Val Tyr Leu Pro Thr
50 55 60
Asn Pro Thr Gln Glu Val Gln Ile Ile Ser Thr Lys Asp Ala Ala Phe
65 70 75 80
Ser Tyr Ala Val Tyr Thr Gln Arg Val Arg Ser Gly Asp Val Tyr Val
85 90 95
Glu Arg Val Gln Gly Asn Ser Val Leu Leu His Ile Ser Lys Leu Gln
100 105 110
Met Lys Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Thr Pro Asn Thr Asp Glu
115 120 125
Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Thr Asn Leu Ile Val Ile Pro
130 135 140
Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser Ser Gln Thr Leu Gly Lys Glu Glu
145 150 155 160
Gly Glu Pro Leu Ala Leu Thr Cys Glu Ala Ser Lys Ala Thr Ala Gln
165 170 175
His Thr His Leu Ser Val Thr Trp Tyr Leu Thr Gln Asp Gly Gly Gly
180 185 190
Ser Gln Ala Thr Glu Ile Ile Ser Leu Ser Lys Asp Phe Ile Leu Val
195 200 205
Pro Gly Pro Leu Tyr Thr Glu Arg Phe Ala Ala Ser Asp Val Gln Leu
210 215 220
Asn Lys Leu Gly Pro Thr Thr Phe Arg Leu Ser Ile Glu Arg Leu Gln
225 230 235 240
Ser Ser Asp Gln Gly Gln Leu Phe Cys Glu Ala Thr Glu Trp Ile Gln
245 250 255
Asp Pro Asp Glu Thr Trp Met Phe Ile Thr Lys Lys Gln Thr Asp Gln
260 265 270
Thr Thr Leu Arg Ile Gln Pro Ala Val Lys Asp Phe Gln Val Asn Ile
275 280 285
Thr Ala Asp Ser Leu Phe Ala Glu Gly Lys Pro Leu Glu Leu Val Cys
290 295 300
Leu Val Val Ser Ser Gly Arg Asp Pro Gln Leu Gln Gly Ile Trp Phe
305 310 315 320
Phe Asn Gly Thr Glu Ile Ala His Ile Asp Ala Gly Gly Val Leu Gly
325 330 335
Leu Lys Asn Asp Tyr Lys Glu Arg Ala Ser Gln Gly Glu Leu Gln Val
340 345 350
Ser Lys Leu Gly Pro Lys Ala Phe Ser Leu Lys Ile Phe Ser Leu Gly
355 360 365
Pro Glu Asp Glu Gly Ala Tyr Arg Cys Val Val Ala Glu Val Met Lys
370 375 380
Thr Arg Thr Gly Ser Trp Gln Val Leu Gln Arg Lys Gln Ser Pro Asp
385 390 395 400
Ser His Val His Leu Arg Lys Pro Ala Ala Arg Ser Val Val Met Ser
405 410 415
Thr Lys Asn Lys Gln Gln Val Val Trp Glu Gly Glu Thr Leu Ala Phe
420 425 430
Leu Cys Lys Ala Gly Gly Ala Glu Ser Pro Leu Ser Val Ser Trp Trp
435 440 445
His Ile Pro Arg Asp Gln Thr Gln Pro Glu Phe Val Ala Gly Met Gly
450 455 460
Gln Asp Gly Ile Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Gly Val Pro Ser Tyr
465 470 475 480
His Gly Asn Thr Arg Leu Glu Lys Met Asp Trp Ala Thr Phe Gln Leu
485 490 495
Glu Ile Thr Phe Thr Ala Ile Thr Asp Ser Gly Thr Tyr Glu Cys Arg
500 505 510
Val Ser Glu Lys Ser Arg Asn Gln Ala Arg Asp Leu Ser Trp Thr Gln
515 520 525
Lys Ile Ser Val Thr Val Lys Ser Leu Glu Ser Ser Leu Gln Val Ser
530 535 540
Leu Met Ser Arg Gln Pro Gln Val Met Leu Thr Asn Thr Phe Asp Leu
545 550 555 560
Ser Cys Val Val Arg Ala Gly Tyr Ser Asp Leu Lys Val Pro Leu Thr
565 570 575
Val Thr Trp Gln Phe Gln Pro Ala Ser Ser His Ile Phe His Gln Leu
580 585 590
Ile Arg Ile Thr His Asn Gly Thr Ile Glu Trp Gly Asn Phe Leu Ser
595 600 605
Arg Phe Gln Lys Lys Thr Lys Val Ser Gln Ser Leu Phe Arg Ser Gln
610 615 620
Leu Leu Val His Asp Ala Thr Glu Glu Glu Thr Gly Val Tyr Gln Cys
625 630 635 640
Glu Val Glu Val Tyr Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Asn Asn Arg Pro Pro
645 650 655
Arg Ala Ser Ala Ile Ser His Pro Leu Arg Ile Ala Val Thr Leu Pro
660 665 670
Glu Ser Lys Leu Lys Val Asn Ser Arg Ser Gln Val Gln Glu Leu Ser
675 680 685
Ile Asn Ser Asn Thr Asp Ile Glu Cys Ser Ile Leu Ser Arg Ser Asn
690 695 700
Gly Asn Leu Gln Leu Ala Ile Ile Trp Tyr Phe Ser Pro Val Ser Thr
705 710 715 720
Asn Ala Ser Trp Leu Lys Ile Leu Glu Met Asp Gln Thr Asn Val Ile
725 730 735
Lys Thr Gly Asp Glu Phe His Thr Pro Gln Arg Lys Gln Lys Phe His
740 745 750
Thr Glu Lys Val Ser Gln Asp Leu Phe Gln Leu His Ile Leu Asn Val
755 760 765
Glu Asp Ser Asp Arg Gly Lys Tyr His Cys Ala Val Glu Glu Trp Leu
770 775 780
Leu Ser Thr Asn Gly Thr Trp His Lys Leu Gly Glu Lys Lys Ser Gly
785 790 795 800
Leu Thr Glu Leu Lys Leu Lys Pro Thr Gly Ser Lys Val Arg Val Ser
805 810 815
Lys Val Tyr Trp Thr Glu Asn Val Thr Glu His Arg Glu Val Ala Ile
820 825 830
Arg Cys Ser Leu Glu Ser Val Gly Ser Ser Ala Thr Leu Tyr Ser Val
835 840 845
Met Trp Tyr Trp Asn Arg Glu Asn Ser Gly Ser Lys Leu Leu Val His
850 855 860
Leu Gln His Asp Gly Leu Leu Glu Tyr Gly Glu Glu Gly Leu Arg Arg
865 870 875 880
His Leu His Cys Tyr Arg Ser Ser Ser Thr Asp Phe Val Leu Lys Leu
885 890 895
His Gln Val Glu Met Glu Asp Ala Gly Met Tyr Trp Cys Arg Val Ala
900 905 910
Glu Trp Gln Leu His Gly His Pro Ser Lys Trp Ile Asn Gln Ala Ser
915 920 925
Asp Glu Ser Gln Arg Met Val Leu Thr Val Leu Pro Ser Glu Pro Thr
930 935 940
Leu Pro Ser Arg Ile Cys Ser Ser Ala Pro Leu Leu Tyr Phe Leu Phe
945 950 955 960
Ile Cys Pro Phe Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ser Leu Leu Cys
965 970 975
Leu Tyr Trp Lys Ala Arg Lys Leu Ser Thr Leu Arg Ser Asn Thr Arg
980 985 990
Lys Glu Lys Ala Leu Trp Val Asp Leu Lys Glu Ala Gly Gly Val Thr
995 1000 1005
Thr Asn Arg Arg Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Gly Asn
1010 1015 1020
<210> 309
<211> 1195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF3
<400> 309
Met Lys Cys Phe Phe Pro Val Leu Ser Cys Leu Ala Val Leu Gly Val
1 5 10 15
Val Ser Ala Gln Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Gly Pro Leu Tyr Arg
20 25 30
Thr Glu Gly Ser His Ile Thr Ile Trp Cys Asn Val Ser Gly Tyr Gln
35 40 45
Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Gln Trp Ser Ile Tyr Leu Pro Ser Ser
50 55 60
Pro Glu Arg Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Met Asp Ser Ser Phe Pro
65 70 75 80
Tyr Ala Ile Tyr Thr Gln Arg Val Arg Gly Gly Lys Ile Phe Ile Glu
85 90 95
Arg Val Gln Gly Asn Ser Thr Leu Leu His Ile Thr Asp Leu Gln Ala
100 105 110
Arg Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Thr Pro Ser Thr Asp Lys Gln
115 120 125
Tyr Phe Gly Ser Tyr Ser Ala Lys Met Asn Leu Val Val Ile Pro Asp
130 135 140
Ser Leu Gln Thr Thr Ala Met Pro Gln Thr Leu His Arg Val Glu Gln
145 150 155 160
Asp Pro Leu Glu Leu Thr Cys Glu Val Ala Ser Glu Thr Ile Gln His
165 170 175
Ser His Leu Ser Val Ala Trp Leu Arg Gln Lys Val Gly Glu Lys Pro
180 185 190
Val Glu Val Ile Ser Leu Ser Arg Asp Phe Met Leu His Ser Ser Ser
195 200 205
Glu Tyr Ala Gln Arg Gln Ser Leu Gly Glu Val Arg Leu Asp Lys Leu
210 215 220
Gly Arg Thr Thr Phe Arg Leu Thr Ile Phe His Leu Gln Pro Ser Asp
225 230 235 240
Gln Gly Glu Phe Tyr Cys Glu Ala Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp
245 250 255
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Asn Ser Ser Leu Ile Ala Thr Met Gly Pro Asn Ala Val Pro Val Leu
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Asn Ser Glu Phe Ala His Arg Glu Ala Arg Gly Gln Leu Lys Val Ala
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805 810 815
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Asp Ile Met Lys Arg Gln Pro Arg Asn Pro Arg Thr Asp Lys Leu Val
835 840 845
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1085 1090 1095
Thr Gln Lys Glu Glu Ile Pro Glu Glu Glu Leu Asn Glu Asp Val
1100 1105 1110
Glu Glu Ile Asp His Ala Glu Arg Glu Leu Arg Arg Gly Gln Ile
1115 1120 1125
Leu Trp Phe Arg Gly Leu Asn Arg Ile Gln Thr Gln Ile Glu Val
1130 1135 1140
Val Asn Thr Phe Lys Ser Gly Ala Ser Phe Gln Gly Ala Leu Arg
1145 1150 1155
Arg Gln Ser Ser Val Thr Ser Gln Ser Gln Asp Ile Arg Val Val
1160 1165 1170
Lys Ala Phe Arg Ser Ser Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Lys Pro Glu
1175 1180 1185
Ser Arg Thr Ser Ile His Asn Phe Met Ala His Pro Glu Phe Arg
1190 1195 1200
Ile Glu Asp Ser Gln Pro His Ile Pro Leu Ile Asp Asp Thr Asp
1205 1210 1215
Leu Glu Glu Asp Ala Ala Leu Lys Gln Asn Ser Ser Pro Pro Ser
1220 1225 1230
Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ser Ala Ile Asp Ser Gly Ile Asn Leu
1235 1240 1245
Thr Thr Asp Thr Ser Lys Ser Ala Thr Ser Ser Ser Pro Gly Ser
1250 1255 1260
Pro Ile His Ser Leu Glu Thr Ser Leu
1265 1270
<210> 318
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ATP2B4
<400> 318
Met Gly Asp Met Ala Asn Ser Ser Ile Glu Phe His Pro Lys Pro Gln
1 5 10 15
Gln Gln Arg Asp Val Pro Gln Ala Gly Gly Phe Gly Cys Thr Leu Ala
20 25 30
Glu Leu Arg Thr Leu Met Glu Leu Arg Gly Ala Glu Ala Leu Gln Lys
35 40 45
Ile Glu Glu Ala Tyr Gly Asp Val Ser Gly Leu Cys Arg Arg Leu Lys
50 55 60
Thr Ser Pro Thr Glu Gly Leu Ala Asp Asn Thr Asn Asp Leu Glu Lys
65 70 75 80
Arg Arg Gln Ile Tyr Gly Gln Asn Phe Ile Pro Pro Lys Gln Pro Lys
85 90 95
Thr Phe Leu Gln Leu Val Trp Glu Ala Leu Gln Asp Val Thr Leu Ile
100 105 110
Ile Leu Glu Val Ala Ala Ile Val Ser Leu Gly Leu Ser Phe Tyr Ala
115 120 125
Pro Pro Gly Glu Glu Ser Glu Ala Cys Gly Asn Val Ser Gly Gly Ala
130 135 140
Glu Asp Glu Gly Glu Ala Glu Ala Gly Trp Ile Glu Gly Ala Ala Ile
145 150 155 160
Leu Leu Ser Val Ile Cys Val Val Leu Val Thr Ala Phe Asn Asp Trp
165 170 175
Ser Lys Glu Lys Gln Phe Arg Gly Leu Gln Ser Arg Ile Glu Gln Glu
180 185 190
Gln Lys Phe Thr Val Ile Arg Asn Gly Gln Leu Leu Gln Val Pro Val
195 200 205
Ala Ala Leu Val Val Gly Asp Ile Ala Gln Val Lys Tyr Gly Asp Leu
210 215 220
Leu Pro Ala Asp Gly Val Leu Ile Gln Ala Asn Asp Leu Lys Ile Asp
225 230 235 240
Glu Ser Ser Leu Thr Gly Glu Ser Asp His Val Arg Lys Ser Ala Asp
245 250 255
Lys Asp Pro Met Leu Leu Ser Gly Thr His Val Met Glu Gly Ser Gly
260 265 270
Arg Met Val Val Thr Ala Val Gly Val Asn Ser Gln Thr Gly Ile Ile
275 280 285
Phe Thr Leu Leu Gly Ala Gly Gly Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Lys
290 295 300
Lys Gly Lys Gln Gln Asp Gly Ala Met Glu Ser Ser Gln Thr Lys Ala
305 310 315 320
Lys Lys Gln Asp Gly Ala Val Ala Met Glu Met Gln Pro Leu Lys Ser
325 330 335
Ala Glu Gly Gly Glu Met Glu Glu Arg Glu Lys Lys Lys Ala Asn Ala
340 345 350
Pro Lys Lys Glu Lys Ser Val Leu Gln Gly Lys Leu Thr Lys Leu Ala
355 360 365
Val Gln Ile Gly Lys Ala Gly Leu Val Met Ser Ala Ile Thr Val Ile
370 375 380
Ile Leu Val Leu Tyr Phe Val Ile Glu Thr Phe Val Val Glu Gly Arg
385 390 395 400
Thr Trp Leu Ala Glu Cys Thr Pro Val Tyr Val Gln Tyr Phe Val Lys
405 410 415
Phe Phe Ile Ile Gly Val Thr Val Leu Val Val Ala Val Pro Glu Gly
420 425 430
Leu Pro Leu Ala Val Thr Ile Ser Leu Ala Tyr Ser Val Lys Lys Met
435 440 445
Met Lys Asp Asn Asn Leu Val Arg His Leu Asp Ala Cys Glu Thr Met
450 455 460
Gly Asn Ala Thr Ala Ile Cys Ser Asp Lys Thr Gly Thr Leu Thr Thr
465 470 475 480
Asn Arg Met Thr Val Val Gln Ser Tyr Leu Gly Asp Thr His Tyr Lys
485 490 495
Glu Ile Pro Ala Pro Ser Ala Leu Thr Pro Lys Ile Leu Asp Leu Leu
500 505 510
Val His Ala Ile Ser Ile Asn Ser Ala Tyr Thr Thr Lys Ile Leu Pro
515 520 525
Pro Glu Lys Glu Gly Ala Leu Pro Arg Gln Val Gly Asn Lys Thr Glu
530 535 540
Cys Ala Leu Leu Gly Phe Val Leu Asp Leu Lys Arg Asp Phe Gln Pro
545 550 555 560
Val Arg Glu Gln Ile Pro Glu Asp Lys Leu Tyr Lys Val Tyr Thr Phe
565 570 575
Asn Ser Val Arg Lys Ser Met Ser Thr Val Ile Arg Met Pro Asp Gly
580 585 590
Gly Phe Arg Leu Phe Ser Lys Gly Ala Ser Glu Ile Leu Leu Lys Lys
595 600 605
Cys Thr Asn Ile Leu Asn Ser Asn Gly Glu Leu Arg Gly Phe Arg Pro
610 615 620
Arg Asp Arg Asp Asp Met Val Arg Lys Ile Ile Glu Pro Met Ala Cys
625 630 635 640
Asp Gly Leu Arg Thr Ile Cys Ile Ala Tyr Arg Asp Phe Ser Ala Gly
645 650 655
Gln Glu Pro Asp Trp Asp Asn Glu Asn Glu Val Val Gly Asp Leu Thr
660 665 670
Cys Ile Ala Val Val Gly Ile Glu Asp Pro Val Arg Pro Glu Val Pro
675 680 685
Glu Ala Ile Arg Lys Cys Gln Arg Ala Gly Ile Thr Val Arg Met Val
690 695 700
Thr Gly Asp Asn Ile Asn Thr Ala Arg Ala Ile Ala Ala Lys Cys Gly
705 710 715 720
Ile Ile Gln Pro Gly Glu Asp Phe Leu Cys Leu Glu Gly Lys Glu Phe
725 730 735
Asn Arg Arg Ile Arg Asn Glu Lys Gly Glu Ile Glu Gln Glu Arg Leu
740 745 750
Asp Lys Val Trp Pro Lys Leu Arg Val Leu Ala Arg Ser Ser Pro Thr
755 760 765
Asp Lys His Thr Leu Val Lys Gly Ile Ile Asp Ser Thr Thr Gly Glu
770 775 780
Gln Arg Gln Val Val Ala Val Thr Gly Asp Gly Thr Asn Asp Gly Pro
785 790 795 800
Ala Leu Lys Lys Ala Asp Val Gly Phe Ala Met Gly Ile Ala Gly Thr
805 810 815
Asp Val Ala Lys Glu Ala Ser Asp Ile Ile Leu Thr Asp Asp Asn Phe
820 825 830
Thr Ser Ile Val Lys Ala Val Met Trp Gly Arg Asn Val Tyr Asp Ser
835 840 845
Ile Ser Lys Phe Leu Gln Phe Gln Leu Thr Val Asn Val Val Ala Val
850 855 860
Ile Val Ala Phe Thr Gly Ala Cys Ile Thr
865 870
<210> 319
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#1
<400> 319
Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg Glu Gly Glu Pro
1 5 10 15
Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Thr His
20 25 30
Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala Arg Arg Ser Val
35 40 45
Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly Leu Gly Tyr Glu
50 55 60
Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr Val Gly Ser Asp
65 70 75 80
Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala Asp Gln Gly Ser
85 90 95
Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln Gly Asn Trp Gln
100 105 110
Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val Val Ile Gln Pro
115 120 125
Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser Val Ala Glu Gly
130 135 140
Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp Arg Ala Asp Asp
145 150 155 160
Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met Pro Asp Ser Thr
165 170 175
Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg Asp Ser Leu Val
180 185 190
His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp Ala Arg Ser Tyr
195 200 205
His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr
210 215 220
Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg Ser Trp His Lys
225 230 235 240
Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe
260 265 270
Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser
275 280 285
Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn
290 295 300
Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp
305 310 315 320
Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln
325 330 335
Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe
340 345 350
Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val
355 360 365
Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys
370 375 380
Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser
385 390 395 400
Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly
405 410 415
Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser
420 425 430
Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu
435 440 445
Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser
450 455 460
Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val
465 470 475 480
Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln
485 490 495
Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp
500 505 510
Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser
515 520 525
Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala
530 535 540
Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys
545 550 555 560
Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp
565 570 575
Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp
580 585 590
Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr
595 600 605
Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser
610 615 620
Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe
625 630 635 640
Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly
645 650 655
Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr
660 665 670
Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly
675 680 685
Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr
690 695 700
Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg
705 710 715 720
Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
725 730
<210> 320
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#2
<400> 320
Val Ala Thr Val Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro
1 5 10 15
Lys Asn Val Ser Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn
20 25 30
Ile Thr Thr Asp Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser
35 40 45
Phe Ser Arg Met Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala
50 55 60
Arg Leu Asp Arg Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu
65 70 75 80
Ser His Val Asp Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser
85 90 95
Lys Glu Asn Ser Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro
100 105 110
Gly His Asn Arg Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro
115 120 125
Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu
130 135 140
Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr
165 170 175
Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr
180 185 190
Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly
195 200 205
Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys
210 215 220
Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu
225 230 235 240
Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg
245 250 255
Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn
260 265 270
Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln
275 280 285
Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys
290 295 300
Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met
305 310 315 320
Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr
325 330 335
Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr
340 345 350
Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp
355 360 365
Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu
370 375 380
Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp
385 390 395 400
Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln
405 410 415
Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser
420 425 430
Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu
435 440 445
Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe
450 455 460
Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser
465 470 475 480
Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser
485 490 495
Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val
500 505 510
His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr
515 520 525
Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile
530 535 540
His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala
545 550 555 560
Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly
565 570 575
Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys
580 585 590
Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met
595 600 605
Glu Met Asp
610
<210> 321
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#3
<400> 321
Ser Pro Ala Gly Val Gly Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Ala Ser Lys Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu
20 25 30
Leu Ala Cys Arg Val Val Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg
35 40 45
Phe Thr Val Ser Trp Tyr Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val
50 55 60
Val Thr Ser Glu Leu Leu Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Glu Arg Ser Lys Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe
85 90 95
Ser Lys Glu His Thr Asp Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr
100 105 110
Glu Glu Asp Arg Gly Asn Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys
115 120 125
Gln Arg Asn Asn Ser Trp Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro
130 135 140
Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala
145 150 155 160
Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr
165 170 175
Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu
180 185 190
Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr
195 200 205
Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn
210 215 220
Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln
225 230 235 240
Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala
245 250 255
Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser
260 265 270
Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp
275 280 285
Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr
290 295 300
Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr
305 310 315 320
Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser
325 330 335
Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu
340 345 350
Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp
355 360 365
Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu
370 375 380
Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser
385 390 395 400
Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala
405 410 415
Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu
420 425 430
Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val
435 440 445
Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys
450 455 460
Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met
465 470 475 480
Ser Met Glu Met Asp
485
<210> 322
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#4
<400> 322
Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val
1 5 10 15
Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu
20 25 30
Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn
50 55 60
Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu
65 70 75 80
Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys
85 90 95
Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser
100 105 110
Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg
115 120 125
Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu
130 135 140
Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser
145 150 155 160
Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile
165 170 175
Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp
180 185 190
Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val
195 200 205
Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg
210 215 220
Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe
225 230 235 240
Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys
260 265 270
Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp
275 280 285
Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser
290 295 300
Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His
305 310 315 320
Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg
325 330 335
Leu Met Ser Met Glu Met Asp
340
<210> 323
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#5
<400> 323
Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala Thr Ser Leu Ser Asn Pro
1 5 10 15
Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro Ile Phe Asn Ala Ser Val
20 25 30
His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly Asp Leu Ile Lys Leu Phe
35 40 45
Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu Asp Pro Asp Asp Met Ala
50 55 60
Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser Phe Gly Leu Asp Lys Ala
65 70 75 80
Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys Gly Ile Val Thr Thr Ser
85 90 95
Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu Glu Arg Val Ser Val Leu
100 105 110
Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu Asp Gln Asp Phe Gly Asn
115 120 125
Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys Ser Pro Thr Gly Ser Trp
130 135 140
Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys
145 150 155 160
Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly
165 170 175
Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser
180 185 190
Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg
195 200 205
Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp
210 215
<210> 324
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白片段#6
<400> 324
Ser Lys Pro Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe
1 5 10 15
Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu
20 25 30
Leu Ser Cys Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys
35 40 45
Glu Val Gln Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu
50 55 60
Met Asp
65
<210> 325
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PTGFRN蛋白- 信号肽
<400> 325
Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ala Leu Cys Arg Gly
20
<210> 326
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BSG蛋白片段#1
<400> 326
Pro Gly Thr Val Phe Thr Thr Val Glu Asp Leu Gly Ser Lys Ile Leu
1 5 10 15
Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala Thr Glu Val Thr Gly His Arg
20 25 30
Trp Leu Lys Gly Gly Val Val Leu Lys Glu Asp Ala Leu Pro Gly Gln
35 40 45
Lys Thr Glu Phe Lys Val Asp Ser Asp Asp Gln Trp Gly Glu Tyr Ser
50 55 60
Cys Val Phe Leu Pro Glu Pro Met Gly Thr Ala Asn Ile Gln Leu His
65 70 75 80
Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn Glu
85 90 95
Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro Val
100 105 110
Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala Leu
115 120 125
Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly Arg
130 135 140
Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly Gln
145 150 155 160
Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile Ile
165 170 175
Thr Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu
195 200 205
Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser
210 215 220
Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn
225 230 235 240
Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser
245
<210> 327
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BSG蛋白片段#2
<400> 327
His Gly Pro Pro Arg Val Lys Ala Val Lys Ser Ser Glu His Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gly Glu Thr Ala Met Leu Val Cys Lys Ser Glu Ser Val Pro Pro
20 25 30
Val Thr Asp Trp Ala Trp Tyr Lys Ile Thr Asp Ser Glu Asp Lys Ala
35 40 45
Leu Met Asn Gly Ser Glu Ser Arg Phe Phe Val Ser Ser Ser Gln Gly
50 55 60
Arg Ser Glu Leu His Ile Glu Asn Leu Asn Met Glu Ala Asp Pro Gly
65 70 75 80
Gln Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Ser Ser Lys Gly Ser Asp Gln Ala Ile
85 90 95
Ile Thr Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu
100 105 110
Gly Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr
115 120 125
Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly
130 135 140
Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys
145 150 155 160
Asn Val Arg Gln Arg Asn Ser Ser
165
<210> 328
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BSG蛋白片段#3
<400> 328
Ser His Leu Ala Ala Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val Ala Glu Val
1 5 10 15
Leu Val Leu Val Thr Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro
20 25 30
Glu Asp Val Leu Asp Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser
35 40 45
Ser Gly Gln His Gln Asn Asp Lys Gly Lys Asn Val Arg Gln Arg Asn
50 55 60
Ser Ser
65
<210> 329
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BSG蛋白- 信号肽
<400> 329
Met Ala Ala Ala Leu Phe Val Leu Leu Gly Phe Ala Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
His Gly
<210> 330
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白片段#1
<400> 330
Ala Pro Pro Gly Pro Arg Gly Arg Gln Ala Pro Thr Ser Pro Pro Arg
1 5 10 15
Met Thr Val His Glu Gly Gln Glu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Arg
20 25 30
Thr Ser Thr Gln Lys His Thr His Leu Ala Val Ser Phe Gly Arg Ser
35 40 45
Val Pro Glu Ala Pro Val Gly Arg Ser Thr Leu Gln Glu Val Val Gly
50 55 60
Ile Arg Ser Asp Leu Ala Val Glu Ala Gly Ala Pro Tyr Ala Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ala Ala Gly Glu Leu Arg Leu Gly Lys Glu Gly Thr Asp Arg Tyr
85 90 95
Arg Met Val Val Gly Gly Ala Gln Ala Gly Asp Ala Gly Thr Tyr His
100 105 110
Cys Thr Ala Ala Glu Trp Ile Gln Asp Pro Asp Gly Ser Trp Ala Gln
115 120 125
Ile Ala Glu Lys Arg Ala Val Leu Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu
130 135 140
Ser Ser Gln Leu Ala Val Thr Val Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly
145 150 155 160
Pro Gly Glu Pro Leu Glu Leu Leu Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro
165 170 175
Pro Ala Gly Arg His Ala Ala Tyr Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro
180 185 190
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gly Arg Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu
195 200 205
Gly Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met
210 215 220
Glu Lys Val Ala Ser Arg Thr Tyr Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg
225 230 235 240
Pro Gly Asp Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg
245 250 255
Gly Ser Gly Thr Arg Leu Arg Glu Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro
260 265 270
Leu Pro Val His Val Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala
275 280 285
Trp Leu Ala Gly Gly Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu
290 295 300
Cys Asn Ile Ser Val Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala
305 310 315 320
Ser Trp Trp Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro
325 330 335
Ala Gln Leu Val Gly Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly
340 345 350
Val Arg Pro Gly Gly Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg
355 360 365
Ser His Arg Leu Arg Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val
370 375 380
Tyr His Cys Ala Pro Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp
385 390 395 400
Tyr Gln Ala Gly Ser Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr
405 410 415
Met His Ala Leu Asp Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly
420 425 430
Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys
435 440 445
Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
450 455
<210> 331
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白片段#2
<400> 331
Ala His Val Asp Val Gln Thr Leu Ser Ser Gln Leu Ala Val Thr Val
1 5 10 15
Gly Pro Gly Glu Arg Arg Ile Gly Pro Gly Glu Pro Leu Glu Leu Leu
20 25 30
Cys Asn Val Ser Gly Ala Leu Pro Pro Ala Gly Arg His Ala Ala Tyr
35 40 45
Ser Val Gly Trp Glu Met Ala Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Gly Arg
50 55 60
Leu Val Ala Gln Leu Asp Thr Glu Gly Val Gly Ser Leu Gly Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Glu Gly Arg His Ile Ala Met Glu Lys Val Ala Ser Arg Thr Tyr
85 90 95
Arg Leu Arg Leu Glu Ala Ala Arg Pro Gly Asp Ala Gly Thr Tyr Arg
100 105 110
Cys Leu Ala Lys Ala Tyr Val Arg Gly Ser Gly Thr Arg Leu Arg Glu
115 120 125
Ala Ala Ser Ala Arg Ser Arg Pro Leu Pro Val His Val Arg Glu Glu
130 135 140
Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala Gly Gly Thr Val Tyr
145 150 155 160
Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile Ser Val Arg Gly Gly
165 170 175
Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp Val Glu Arg Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu Val Gly Gly Val Gly
195 200 205
Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro Gly Gly Gly Pro Val
210 215 220
Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg Leu Arg Leu His Ser
225 230 235 240
Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Ala Pro Ser Ala Trp
245 250 255
Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala Gly Ser Ala Arg Ser
260 265 270
Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala Leu Asp Thr Leu Phe
275 280 285
Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr
290 295 300
Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
305 310 315 320
<210> 332
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白片段#3
<400> 332
Arg Glu Glu Gly Val Val Leu Glu Ala Val Ala Trp Leu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Tyr Arg Gly Glu Thr Ala Ser Leu Leu Cys Asn Ile Ser Val
20 25 30
Arg Gly Gly Pro Pro Gly Leu Arg Leu Ala Ala Ser Trp Trp Val Glu
35 40 45
Arg Pro Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Val Pro Ala Gln Leu Val Gly
50 55 60
Gly Val Gly Gln Asp Gly Val Ala Glu Leu Gly Val Arg Pro Gly Gly
65 70 75 80
Gly Pro Val Ser Val Glu Leu Val Gly Pro Arg Ser His Arg Leu Arg
85 90 95
Leu His Ser Leu Gly Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Ala Pro
100 105 110
Ser Ala Trp Val Gln His Ala Asp Tyr Ser Trp Tyr Gln Ala Gly Ser
115 120 125
Ala Arg Ser Gly Pro Val Thr Val Tyr Pro Tyr Met His Ala Leu Asp
130 135 140
Thr Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Gly Thr Gly Val Ala Leu Val Thr
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys Phe Met Lys Arg Leu
165 170 175
Arg Lys Arg
<210> 333
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白片段#4
<400> 333
Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr Val Leu Gly Thr Ile Thr Cys Cys
1 5 10 15
Phe Met Lys Arg Leu Arg Lys Arg
20
<210> 334
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IGSF8蛋白- 信号肽
<400> 334
Met Gly Ala Leu Arg Pro Thr Leu Leu Pro Pro Ser Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Met Leu Gly Met Gly Cys Trp Ala
20 25
<210> 335
<400> 335
000
<210> 336
<400> 336
000
<210> 337
<400> 337
000
<210> 338
<400> 338
000
<210> 339
<400> 339
000
<210> 340
<400> 340
000
<210> 341
<400> 341
000
<210> 342
<400> 342
000
<210> 343
<400> 343
000
<210> 344
<400> 344
000
<210> 345
<400> 345
000
<210> 346
<400> 346
000
<210> 347
<400> 347
000
<210> 348
<400> 348
000
<210> 349
<400> 349
000
<210> 350
<400> 350
000
<210> 351
<400> 351
000
<210> 352
<400> 352
000
<210> 353
<400> 353
000
<210> 354
<400> 354
000
<210> 355
<400> 355
000
<210> 356
<400> 356
000
<210> 357
<400> 357
000
<210> 358
<400> 358
000
<210> 359
<400> 359
000
<210> 360
<400> 360
000
<210> 361
<400> 361
000
<210> 362
<400> 362
000
<210> 363
<400> 363
000
<210> 364
<400> 364
000
<210> 365
<400> 365
000
<210> 366
<400> 366
000
<210> 367
<400> 367
000
<210> 368
<400> 368
000
<210> 369
<400> 369
000
<210> 370
<400> 370
000
<210> 371
<400> 371
000
<210> 372
<400> 372
000
<210> 373
<400> 373
000
<210> 374
<400> 374
000
<210> 375
<400> 375
000
<210> 376
<400> 376
000
<210> 377
<400> 377
000
<210> 378
<400> 378
000
<210> 379
<400> 379
000
<210> 380
<400> 380
000
<210> 381
<400> 381
000
<210> 382
<400> 382
000
<210> 383
<400> 383
000
<210> 384
<400> 384
000
<210> 385
<400> 385
000
<210> 386
<400> 386
000
<210> 387
<400> 387
000
<210> 388
<400> 388
000
<210> 389
<400> 389
000
<210> 390
<400> 390
000
<210> 391
<400> 391
000
<210> 392
<400> 392
000
<210> 393
<400> 393
000
<210> 394
<400> 394
000
<210> 395
<400> 395
000
<210> 396
<400> 396
000
<210> 397
<400> 397
000
<210> 398
<400> 398
000
<210> 399
<400> 399
000
<210> 400
<400> 400
000
<210> 401
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MARCKS蛋白
<400> 401
Met Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala Ser Ser Pro Ser Lys Ala Asn
20 25 30
Gly Gln Glu Asn Gly His Val Lys Val Asn Gly Asp Ala Ser Pro Ala
35 40 45
Ala Ala Glu Ser Gly Ala Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Gly Ser Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Asp Lys Glu Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ala Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ser Ala Ala Glu Lys Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro
85 90 95
Glu Ala Gly Ala Ser Pro Val Glu Lys Glu Ala Pro Ala Glu Gly Glu
100 105 110
Ala Ala Glu Pro Gly Ser Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ala Ser
115 120 125
Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Pro Lys Ala Glu Asp Gly Ala Thr Pro
130 135 140
Ser Pro Ser Asn Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Arg Phe Ser Phe
145 150 155 160
Lys Lys Ser Phe Lys Leu Ser Gly Phe Ser Phe Lys Lys Asn Lys Lys
165 170 175
Glu Ala Gly Glu Gly Gly Glu Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gly
180 185 190
Lys Asp Glu Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Gly
195 200 205
Ala Ala Ser Gly Glu Gln Ala Ala Ala Pro Gly Glu Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Gly Glu Glu Gly Ala Ala Gly Gly Asp Pro Gln Glu Ala Lys Pro Gln
225 230 235 240
Glu Ala Ala Val Ala Pro Glu Lys Pro Pro Ala Ser Asp Glu Thr Lys
245 250 255
Ala Ala Glu Glu Pro Ser Lys Val Glu Glu Lys Lys Ala Glu Glu Ala
260 265 270
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Cys Glu Ala Pro Ser Ala Ala Gly Pro Gly
275 280 285
Ala Pro Pro Glu Gln Glu Ala Ala Pro Ala Glu Glu Pro Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Ser Ser Ala Cys Ala Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gln Pro Glu
305 310 315 320
Cys Ser Pro Glu Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ala Glu
325 330
<210> 402
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MARCKSL1蛋白
<400> 402
Met Gly Ser Gln Ser Ser Lys Ala Pro Arg Gly Asp Val Thr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Ala Ala Gly Ala Ser Pro Ala Lys Ala Asn Gly Gln Glu Asn Gly
20 25 30
His Val Lys Ser Asn Gly Asp Leu Ser Pro Lys Gly Glu Gly Glu Ser
35 40 45
Pro Pro Val Asn Gly Thr Asp Glu Ala Ala Gly Ala Thr Gly Asp Ala
50 55 60
Ile Glu Pro Ala Pro Pro Ser Gln Gly Ala Glu Ala Lys Gly Glu Val
65 70 75 80
Pro Pro Lys Glu Thr Pro Lys Lys Lys Lys Lys Phe Ser Phe Lys Lys
85 90 95
Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys Arg Asn Arg Lys Glu Gly
100 105 110
Gly Gly Asp Ser Ser Ala Ser Ser Pro Thr Glu Glu Glu Gln Glu Gln
115 120 125
Gly Glu Ile Gly Ala Cys Ser Asp Glu Gly Thr Ala Gln Glu Gly Lys
130 135 140
Ala Ala Ala Thr Pro Glu Ser Gln Glu Pro Gln Ala Lys Gly Ala Glu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Ala Ser Glu Glu Glu Ala Gly Pro Gln Ala Thr Glu Pro
165 170 175
Ser Thr Pro Ser Gly Pro Glu Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ser Ala Glu
180 185 190
Gln Asn Glu
195
<210> 403
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BASP1蛋白
<400> 403
Met Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys Lys Lys Gly Tyr Asn Val Asn Asp
1 5 10 15
Glu Lys Ala Lys Glu Lys Asp Lys Lys Ala Glu Gly Ala Ala Thr Glu
20 25 30
Glu Glu Gly Thr Pro Lys Glu Ser Glu Pro Gln Ala Ala Ala Glu Pro
35 40 45
Ala Glu Ala Lys Glu Gly Lys Glu Lys Pro Asp Gln Asp Ala Glu Gly
50 55 60
Lys Ala Glu Glu Lys Glu Gly Glu Lys Asp Ala Ala Ala Ala Lys Glu
65 70 75 80
Glu Ala Pro Lys Ala Glu Pro Glu Lys Thr Glu Gly Ala Ala Glu Ala
85 90 95
Lys Ala Glu Pro Pro Lys Ala Pro Glu Gln Glu Gln Ala Ala Pro Gly
100 105 110
Pro Ala Ala Gly Gly Glu Ala Pro Lys Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Pro Ala Glu Ser Ala Ala Pro Ala Ala Gly Glu Glu Pro Ser Lys Glu
130 135 140
Glu Gly Glu Pro Lys Lys Thr Glu Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gln
145 150 155 160
Glu Thr Lys Ser Asp Gly Ala Pro Ala Ser Asp Ser Lys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Glu Ala Ala Pro Ser Ser Lys Glu Thr Pro Ala Ala Thr Glu Ala
180 185 190
Pro Ser Ser Thr Pro Lys Ala Gln Gly Pro Ala Ala Ser Ala Glu Glu
195 200 205
Pro Lys Pro Val Glu Ala Pro Ala Ala Asn Ser Asp Gln Thr Val Thr
210 215 220
Val Lys Glu
225
<210> 404
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 其中Xaa是丙氨酸或任何其它氨基酸
<400> 404
Gly Xaa Lys Leu Ser Lys Lys Lys
1 5
<210> 405
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 405
Lys Lys Lys Lys
1
<210> 406
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 406
Lys Lys Lys Lys Lys
1 5
<210> 407
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 407
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 408
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 408
Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 409
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<400> 409
Xaa Xaa Xaa Xaa
1
<210> 410
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> Misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> Misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> Misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<220>
<221> Misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 其中Xaa可以是Lys或Arg
<400> 410
Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg Lys Arg
1 5 10
<210> 411
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 411
Gly Gly Lys Leu Ser Lys Lys
1 5
<210> 412
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 412
Gly Ala Lys Leu Ser Lys Lys
1 5
<210> 413
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 413
Gly Gly Lys Gln Ser Lys Lys
1 5
<210> 414
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<212> PRT
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<400> 597
000
<210> 598
<400> 598
000
<210> 599
<400> 599
000
<210> 600
<400> 600
000
<210> 601
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 601
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
<210> 602
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向轴突输入(TAxI)肽
<400> 602
Ser Ala Cys Gln Ser Gln Ser Gln Met Arg Cys Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 603
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向轴突输入(TAxI)肽
<400> 603
Gln Ser Gln Ser Gln Met Arg
1 5
<210> 604
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向轴突输入(TAxI)肽
<400> 604
Ala Ser Gly Ala Gln Ala Arg
1 5
<210> 605
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶向轴突输入(TAxI)肽
<400> 605
Thr Ser Thr Ala Pro His Leu Arg Leu Arg Leu Thr Ser Arg
1 5 10
<210> 606
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核定位信号(NLS)
<400> 606
Pro Pro Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 607
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 核定位信号(NLS)
<400> 607
Pro Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 608
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Angiopep-2
<400> 608
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 609
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoB
<400> 609
Ser Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg
1 5 10 15
Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser
20 25 30
Asn Lys Phe Val Glu Gly Ser
35
<210> 610
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ApoE
<400> 610
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu
1 5
<210> 611
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 肽-22
<400> 611
Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys
1 5
<210> 612
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRT
<400> 612
Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro
1 5 10
<210> 613
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> THR逆向-对映
<400> 613
Pro Trp Val Pro Ser Trp Met Pro Pro Arg His Thr
1 5 10
<210> 614
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CRT
<400> 614
Cys Arg Thr Ile Gly Pro Ser Val Cys
1 5
<210> 615
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 瘦蛋白30
<400> 615
Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu
20 25 30
<210> 616
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RVG29
<400> 616
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
<210> 617
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CDX
<400> 617
Gly Arg Glu Ile Arg Thr Gly Arg Ala Glu Arg Trp Ser Glu Lys Phe
1 5 10 15
<210> 618
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 蜂毒明肽
<400> 618
Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln
1 5 10 15
Gln His
<210> 619
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MiniAp-4
<400> 619
Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp
1 5
<210> 620
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GSH
<400> 620
Cys Gly
1
<210> 621
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> G23
<400> 621
His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg Cys
1 5 10
<210> 622
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> g7
<400> 622
Gly Phe Thr Gly Phe Leu Ser
1 5
<210> 623
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGN
<400> 623
Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly
1 5 10
<210> 624
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HIV反式激活因子蛋白
<400> 624
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 625
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SynB1
<400> 625
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 626
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 二酮哌嗪
<400> 626
Asn Met Phe Asn Met Phe
1 5
<210> 627
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PhPro
<400> 627
Pro Pro Pro Pro
1
<210> 628
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 自身肽
<400> 628
Gly Asn Tyr Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr
1 5 10 15
Ile Ile Glu Leu Lys
20
<210> 629
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 规范CD47
<400> 629
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met
305 310 315 320
Asn Asp Glu
<210> 630
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD47人同种型OA3-293
<400> 630
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val
290
<210> 631
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD47人同种型OA3-305
<400> 631
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Asn
290 295 300
Asn
305
<210> 632
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD47人同种型OA3-312
<400> 632
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn
305 310
<210> 632
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成肽
<400> 632
Gly Gly Gly Gly
1

Claims (142)

1.一种包含反义寡核苷酸(ASO)的细胞外囊泡，所述反义寡核苷酸(ASO)包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13)内的核酸序列互补。
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡，其中所述ASO不是TGGATTTAAAGGCAGGCGGC(SEQ IDNO:90)。
3.如权利要求1或2所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡靶向选自由以下组成的组的细胞：巨噬细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞以及它们的任何组合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸1至518或对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸521至2113内的核酸序列互补。
5.如权利要求4所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的所述核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。
6.如权利要求1至5中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/β蛋白表达，其中所述人细胞表达所述CEBP/β蛋白。
7.如权利要求6所述的细胞外囊泡，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/β蛋白表达相比，所述CEBP/β蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
8.如权利要求1至7中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/βmRNA的水平，其中所述人细胞表达所述CEBP/βmRNA。
9.如权利要求8所述的细胞外囊泡，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的所述CEBP/βmRNA的水平相比，CEBP/βmRNA的所述水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
10.如权利要求1至9中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO是间隙聚体、混合聚体或全聚体。
11.如权利要求1至10中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含一种或多种核苷类似物。
12.如权利要求11所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2'-氨基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA；或双环核苷类似物。
13.如权利要求11或12所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者是糖修饰的核苷。
14.如权利要求13所述的细胞外囊泡，其中所述糖修饰的核苷是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。
15.如权利要求11至14中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括包含双环糖的核苷。
16.如权利要求11至14中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括LNA。
17.如权利要求11至16中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核苷酸类似物中的一者或多者选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'-限制性2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)、氨基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。
18.如权利要求1至17中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
19.如权利要求10至18中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物的(i)5'非翻译区(UTR)；(ii)编码区；或(iii)3'UTR内的核酸序列互补。
20.如权利要求1至19中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与包含(i)SEQ ID NO:13的核苷酸1–600；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸100–600；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸200–600；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸300–600；(v)SEQ ID NO:13的400–600；(vi)SEQ ID NO:13的核苷酸500–1000；(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸900–1200；(viii)SEQID NO:13的核苷酸1000–1300；(ix)SEQ ID NO:13的核苷酸1300–1500；(x)SEQ ID NO:13的489–649；(xi)SEQ ID NO:13的核苷酸594–728；(xii)SEQ ID NO:13的核苷酸765–700；(xiii)SEQ ID NO:13的核苷酸936–1076；(xiv)SEQ ID NO:13的核苷酸999–2068；(xv)SEQID NO:13的1203–1357；(xvi)SEQ ID NO:13的核苷酸1355–1487；(xvii)SEQ ID NO:13的529–609；(xviii)SEQ ID NO:13的核苷酸634–688；(xix)SEQ ID NO:13的核苷酸805-700；(xx)SEQ ID NO:13的核苷酸976–1036；(xxi)SEQ ID NO:13的核苷酸1039–2028；(xxii)SEQID NO:13的1243–1317；或(xxiii)SEQ ID NO:13的核苷酸1395–1447的核酸序列互补。
21.如权利要求1至20中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与(i)SEQID NO:13的539–599；(ii)SEQ ID NO:13的核苷酸644–678；(iii)SEQ ID NO:13的核苷酸815–690；(iv)SEQ ID NO:13的核苷酸986–1026；(v)SEQ ID NO:13的核苷酸1049–2018；(vi)SEQ ID NO:13的1253–1307；或(vii)SEQ ID NO:13的核苷酸1405–1437内的核酸序列互补。
22.如权利要求1至21中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列包含与选自图1中的序列的序列互补的核苷酸序列。
23.如权利要求14至22中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的核苷酸序列完全互补。
24.如权利要求13至31中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO包含选自SEQ ID NO:194-296的核苷酸序列，具有一个或两个错配。
25.如权利要求1至24中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO具有选自由图1中的设计组成的组中的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是DNA。
26.如权利要求1至25中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO的长度是14至20个核苷酸。
27.如权利要求4至26中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。
28.如权利要求35所述的细胞外囊泡，其中所述一个或多个经修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。
29.如权利要求27或28所述的细胞外囊泡，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间键联经修饰。
30.如权利要求29所述的细胞外囊泡，其中所述ASO中的所述核苷间键联中的每一者是硫代磷酸酯键联。
31.如权利要求1至30中任一项所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡还包含锚定部分。
32.如权利要求31所述的细胞外囊泡，其中所述ASO连接至所述锚定部分。
33.如权利要求1至32中任一项所述的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡还包含外源靶向部分。
34.如权利要求33所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含肽、抗体或其抗原结合片段、化学化合物、RNA适体或它们的任何组合。
35.如权利要求33或34所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含肽。
36.如权利要求33至35中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含微蛋白、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、抗运载蛋白、adnectin、适体、肽模拟物分子、受体的天然配体、骆驼科动物纳米抗体或它们的任何组合。
37.如权利要求33至36中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分包含全长抗体、单结构域抗体、仅重链抗体(VHH)、单链抗体、仅鲨鱼重链抗体(VNAR)、scFv、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或它们的任何组合。
38.如权利要求37所述的细胞外囊泡，其中所述抗体是单链抗体。
39.如权利要求33至38中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分使外泌体靶向肝脏、心脏、肺、脑、肾脏、中枢神经系统、周围神经系统、肌肉、骨、关节、皮肤、肠、膀胱、胰腺、淋巴结、脾脏、血液、骨髓或它们的任何组合。
40.如权利要求33至39中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外源靶向部分使所述外泌体靶向肿瘤细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、神经元、肝细胞、库普弗细胞、髓系细胞(例如，嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞、MDSC(例如，单核细胞性MDSC或粒细胞性MDSC))或它们的任何组合。
41.如权利要求33至40中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述EV包含将所述外源靶向部分连接至所述EV的支架部分。
42.如权利要求33至41中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是支架X。
43.如权利要求33至41中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是支架Y。
44.如权利要求42所述的细胞外囊泡，其中所述支架X是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。
45.如权利要求42或44所述的细胞外囊泡，其中所述支架X选自由以下组成的组：前列腺素F2受体负调控因子(PTGFRN蛋白)；basigin(BSG蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(IGSF2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(IGSF3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(IGSF8蛋白)；整联蛋白β-1(ITGB1蛋白)；整联蛋白α-4(ITGA4蛋白)；4F2细胞表面抗原重链(SLC3A2蛋白)；一类ATP转运蛋白(ATP1A1、ATP1A2、ATP1A3、ATP1A4、ATP1B3、ATP2B1、ATP2B2、ATP2B3、ATP2B4蛋白)；它们的功能片段；以及它们的任何组合。
46.如权利要求31至45中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分是PTGFRN蛋白或其功能片段。
47.如权利要求31至46中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分包含如SEQ ID NO:302中列出的氨基酸序列。
48.如权利要求31至47中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分和/或所述支架部分包含与SEQ ID NO:301至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。
49.如权利要求43所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y是能够将所述ASO锚定在所述EV的腔表面上和/或所述EV的外表面上的支架蛋白。
50.如权利要求43或49所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y选自由以下组成的组：富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物(MARCKS蛋白)、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶C底物样1(MARCKSL1蛋白)、脑酸溶性蛋白1(BASP1蛋白)、它们的功能片段以及它们的任何组合。
51.如权利要求43、49和50中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y是BASP1蛋白或其功能片段。
52.如权利要求43和49至51中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y包含N末端结构域(ND)和效应结构域(ED)，其中所述ND和/或所述ED与所述EV的所述腔表面缔合。
53.如权利要求52所述的细胞外囊泡，其中所述ND通过肉豆蔻酰化与所述外泌体的所述腔表面缔合。
54.如权利要求52或53所述的细胞外囊泡，其中所述ED通过离子相互作用与所述外泌体的所述腔表面缔合。
55.如权利要求52至53中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ED包含(i)碱性氨基酸或(ii)按顺序的两个或更多个碱性氨基酸，其中所述碱性氨基酸选自由以下组成的组：Lys、Arg、His以及它们的任何组合。
56.如权利要求55所述的细胞外囊泡，其中所述碱性氨基酸是(Lys)n，其中n是介于1与10之间的整数。
57.如权利要求52至56中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ED包含Lys(K)、KK、KKK、KKKK(SEQ ID NO:405)、KKKKK(SEQ ID NO:406)、Arg(R)、RR、RRR、RRRR(SEQ ID NO:407)、RRRRR(SEQ ID NO:408)、KR、RK、KKR、KRK、RKK、KRR、RRK、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ IDNO:409)、(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(K/R)(SEQ ID NO:410)或它们的任何组合。
58.如权利要求52至57中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含如G:X2:X3:X4:X5:X6中列出的氨基酸序列，其中G表示Gly；其中“:”表示肽键，其中所述X2至所述X6中的每一者独立地是氨基酸，并且其中所述X6包含碱性氨基酸。
59.如权利要求58所述的细胞外囊泡，其中：
(i)所述X2选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser；
(ii)所述X4选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；
(iii)所述X5选自由以下组成的组：Pro、Gly、Ala和Ser；
(iv)所述X6选自由以下组成的组：Lys、Arg和His；或
(v)(i)-(iv)的任何组合。
60.如权利要求52至59中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含G:X2:X3:X4:X5:X6的氨基酸序列，其中
(i)G代表Gly；
(ii)“:”表示肽键；
(iii)所述X2是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；
(iv)所述X3是氨基酸；
(v)所述X4是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala、Ser、Val、Ile、Leu、Phe、Trp、Tyr、Gln和Met；
(vi)所述X5是选自由以下组成的组的氨基酸：Pro、Gly、Ala和Ser；并且
(vii)所述X6是选自由以下组成的组的氨基酸：Lys、Arg和His。
61.如权利要求58至60中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述X3选自由以下组成的组：Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、His和Arg。
62.如权利要求52至61中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND和所述ED通过接头连接。
63.如权利要求62所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含一个或多个氨基酸。
64.如权利要求52至63中任一项所述的方法，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKK(SEQ ID NO:411)、(ii)GAKLSKK(SEQ ID NO:412)、(iii)GGKQSKK(SEQ ID NO:413)、(iv)GGKLAKK(SEQ ID NO:414)、(v)GGKLSK(SEQ ID NO:415)或(vi)它们的任何组合。
65.如权利要求64所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(i)GGKLSKKK(SEQ ID NO:438)、(ii)GGKLSKKS(SEQ ID NO:439)、(iii)GAKLSKKK(SEQID NO:440)、(iv)GAKLSKKS(SEQ ID NO:441)、(v)GGKQSKKK(SEQ ID NO:442)、(vi)GGKQSKKS(SEQ ID NO:443)、(vii)GGKLAKKK(SEQ ID NO:444)、(viii)GGKLAKKS(SEQ IDNO:445)和(ix)它们的任何组合。
66.如权利要求52至65中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ND包含氨基酸序列GGKLSKK(SEQ ID NO:411)。
67.如权利要求43和49至66中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y的长度是至少约8、至少约9、至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95、至少约100、至少约105、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200个氨基酸。
68.如权利要求43和49至67所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y包含(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:446)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:447)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:448)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:449)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:450)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:451)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:452)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:453)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:454)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:455)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:456)。
69.如权利要求43和49至68所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y由以下组成：(i)GGKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:446)、(ii)GAKLSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:447)、(iii)GGKQSKKKKGYNVN(SEQ ID NO:448)、(iv)GGKLAKKKKGYNVN(SEQ ID NO:449)、(v)GGKLSKKKKGYSGG(SEQ ID NO:450)、(vi)GGKLSKKKKGSGGS(SEQ ID NO:451)、(vii)GGKLSKKKKSGGSG(SEQ ID NO:452)、(viii)GGKLSKKKSGGSGG(SEQ ID NO:453)、(ix)GGKLSKKSGGSGGS(SEQ ID NO:454)、(x)GGKLSKSGGSGGSV(SEQ ID NO:455)或(xi)GAKKSKKRFSFKKS(SEQ ID NO:456)。
70.如权利要求43和49至69所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y在N末端不包含Met。
71.如权利要求43和49至70中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y在所述支架蛋白的N末端包含肉豆蔻酰化氨基酸残基。
72.如权利要求71所述的细胞外囊泡，其中所述支架Y的N末端的所述氨基酸残基是Gly。
73.如权利要求31至72中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO与所述EV的所述外表面上的所述锚定部分和/或所述支架部分连接。
74.如权利要求31至73中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO与所述EV的所述腔表面上的所述锚定部分和/或所述支架部分连接。
75.如权利要求31至74中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分包含固醇、GM1、脂质、维生素、小分子、肽或它们的组合。
76.如权利要求31至74中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分包含胆固醇。
77.如权利要求31至74中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述锚定部分包含磷脂、溶血磷脂、脂肪酸、维生素(例如，维生素D和/或维生素E)或它们的任何组合。
78.如权利要求31至77中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO通过接头与所述锚定部分和/或所述支架部分连接。
79.如权利要求1至78中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述ASO通过接头与所述EV连接。
80.如权利要求78或79所述的细胞外囊泡，其中所述接头是多肽。
81.如权利要求78或79所述的细胞外囊泡，其中所述接头是非多肽部分。
82.如权利要求78或79所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含乙二醇。
83.如权利要求82所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含HEG、TEG、PEG或它们的任何组合。
84.如权利要求78或79所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含丙烯酸亚磷酰胺(例如，ACRYDITETM)、腺苷酸化、叠氮化物(NHS酯)、地高辛(NHS酯)、胆固醇-TEG、I-LINKERTM、氨基修饰剂(例如，氨基修饰剂C6、氨基修饰剂C12、氨基修饰剂C6 dT或Uni-LinkTM氨基修饰剂)、炔烃、5'己炔基、5-辛二炔基dU、生物素化(例如，生物素、生物素(叠氮化物)、生物素dT、生物素-TEG、双重生物素、PC生物素或脱硫生物素)、硫醇修饰(硫醇修饰剂C3 S-S、二硫醇或硫醇修饰剂C6 S-S)或它们的任何组合。
85.如权利要求78至84中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述接头是可裂解接头。
86.如权利要求85所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
87.如权利要求78至86中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述接头包含(i)马来酰亚胺部分和(ii)缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。
88.如权利要求1至87中任一项所述的胞外囊泡，其中所述EV是外泌体。
89.一种反义寡核苷酸(ASO)，所述反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与CEBP/β转录物(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13)内的核酸序列互补。
90.如权利要求89所述的ASO，所述ASO不是TGGATTTAAAGGCAGGCGGC(SEQ ID NO:90)。
91.如权利要求89或90所述的ASO，所述ASO包含长度为10至30个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸1至518或对应于如SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列的CEBP/β转录物的核苷酸521至2113内的核酸序列互补。
92.如权利要求91所述的ASO，其中其所述连续核苷酸序列与所述CEBP/β转录物内的所述核酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％互补。
93.如权利要求89至92中任一项所述的ASO，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/β蛋白表达，其中所述人细胞表达所述CEBP/β蛋白。
94.如权利要求93所述的ASO，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的CEBP/β蛋白表达相比，所述CEBP/β蛋白表达降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
95.如权利要求89至94中任一项所述的ASO，所述ASO能够降低人细胞(例如，免疫细胞)中的CEBP/βmRNA的水平，其中所述人细胞表达所述CEBP/βmRNA。
96.如权利要求95所述的ASO，其中与未暴露于所述ASO的人细胞中的所述CEBP/βmRNA的水平相比，CEBP/βmRNA的所述水平降低至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。
97.如权利要求91至96中任一项所述的ASO，所述ASO是间隙聚体、混合聚体或全聚体。
98.如权利要求91至97中任一项所述的ASO，所述ASO包含一种或多种核苷类似物。
99.如权利要求98所述的ASO，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括2'-O-烷基-RNA；2'-O-甲基RNA(2'-OMe)；2'-烷氧基-RNA；2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'-MOE)；2'-氨基-DNA；2'-氟-RNA；2'-氟-DNA；阿拉伯核酸(ANA)；2'-氟-ANA；或双环核苷类似物(LNA)。
100.如权利要求98或99所述的ASO，其中所述核苷类似物中的一者或多者是糖修饰的核苷。
101.如权利要求100所述的ASO，其中所述糖修饰的核苷是增强亲和力的2'糖修饰的核苷。
102.如权利要求97至101中任一项所述的ASO，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括包含双环糖的核苷。
103.如权利要求97至102中任一项所述的ASO，其中所述核苷类似物中的一者或多者包括LNA。
104.如权利要求103所述的ASO，其中所述LNA选自由以下组成的组：限制性乙基核苷(cEt)、2',4'-限制性2'-O-甲氧基乙基(cMOE)、α-L-LNA、β-D-LNA、2'-O,4'-C-亚乙基-桥联核酸(ENA)、氨基-LNA、氧基-LNA、硫代-LNA以及它们的任何组合。
105.如权利要求89至104中任一项所述的ASO，所述ASO包含一个或多个5'-甲基-胞嘧啶核碱基。
106.如权利要求89至105中任一项所述的ASO，其中所述ASO包含SEQ ID NO:194至SEQID NO:206中的任一个。
107.如权利要求89至106中任一项所述的ASO，其中所述ASO具有选自由图1中的设计组成的组的设计，其中大写字母是糖修饰的核苷，并且小写字母是DNA。
108.如权利要求89至107中任一项所述的ASO，其中所述ASO的长度是14至20个核苷酸。
109.如权利要求89至108中任一项所述的ASO，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键联。
110.如权利要求109所述的ASO，其中所述一个或多个经修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。
111.如权利要求109或110所述的ASO，其中至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的核苷间键联经修饰。
112.如权利要求111所述的ASO，其中所述ASO中的所述核苷间键联中的每一者是硫代磷酸酯键联。
113.一种缀合物，所述缀合物包含权利要求89至112中任一项所述的ASO，其中所述ASO与至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分共价连接。
114.如权利要求113所述的缀合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分包含蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或它们的任何组合。
115.一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡包含权利要求89至112中任一项所述的ASO或权利要求113或114所述的缀合物。
116.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO或权利要求113或114所述的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
117.如权利要求116所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的盐包括钠盐、钾盐、铵盐或它们的任何组合。
118.如权利要求116或117所述的药物组合物，所述药物组合物还包含至少一种另外的治疗剂。
119.如权利要求118所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂是CEBP/β拮抗剂。
120.如权利要求119所述的药物组合物，其中所述CEBP/β拮抗剂是化学化合物、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、蛋白质或它们的任何组合。
121.如权利要求119或120所述的药物组合物，其中所述CEBP/β拮抗剂是抗CEBP/β抗体或其片段。
122.如权利要求119或120所述的药物组合物，其中所述CEBP/β拮抗剂包含反义寡核苷酸(ASO)。
123.一种药盒，所述药盒包括权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物以及使用说明书。
124.一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物以及使用说明书。
125.一种抑制或降低细胞中的CEBP/β蛋白表达的方法，所述方法包括向表达CEBP/β蛋白的所述细胞施用权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞中的所述CEBP/β蛋白表达在所述施用后受到抑制或降低。
126.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物。
127.权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗有需要的受试者的癌症的药物中的用途。
128.如权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、如权利要求89至112中任一项所述的ASO、如权利要求113或114所述的缀合物或如权利要求116至122中任一项所述的药物组合物，它们用于治疗有需要的受试者的癌症。
129.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或病症选自纤维化、炎症、神经变性疾病、代谢病症/CVD以及它们的任何组合。
130.权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物在制造用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自纤维化、炎症、神经变性疾病、代谢病症/CVD以及它们的任何组合。
131.如权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、如权利要求89至112中任一项所述的ASO、如权利要求113或114所述的缀合物或如权利要求116至122中任一项所述的药物组合物，它们用于治疗有需要的受试者的疾病或病症，其中所述疾病或病症选自纤维化、炎症、神经变性疾病、代谢病症/CVD以及它们的任何组合。
132.如权利要求125、126和129中任一项所述的方法、如权利要求127或130所述的用途或如权利要求128或131所述使用的组合物，其中在所述施用后，所述ASO抑制或降低所述细胞中CEBP/βmRNA的表达。
133.如权利要求132所述的方法、用途或使用的组合物，其中与未暴露于所述ASO的细胞中CEBP/βmRNA的水平相比，在所述施用后，CEBP/βmRNA的水平降低至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。
134.如权利要求125、126和129中任一项所述的方法、如权利要求127或130所述的用途或如权利要求128或131所述使用的组合物，其中与未暴露于所述ASO的细胞中CEBP/β蛋白的表达相比，在所述施用后，CEBP/β蛋白的所述表达降低至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。
135.如权利要求125、126和129中任一项所述的方法、如权利要求127或130所述的用途或如权利要求128或131所述使用的组合物，其中所述细胞外囊泡、所述ASO、所述缀合物或所述药物组合物心内、经口、胃肠外、鞘内、脑室内、经肺、局部或心室内施用。
136.如权利要求126所述的方法、如权利要求127所述的用途或如权利要求128所述使用的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、淋巴瘤、白血病、肝癌、成胶质细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤以及它们的任何组合。
137.如权利要求129所述的方法、如权利要求130所述的用途或如权利要求131所述使用的组合物，其中所述疾病或病症包括纤维化。
138.如权利要求129所述的方法、如权利要求130所述的用途或如权利要求131所述使用的组合物，其中所述疾病或病症包括选自由以下组成的组的纤维化：肝纤维化(NASH)、肝硬化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性溃疡性结肠炎/IBD、膀胱纤维化、肾纤维化、CAPS(穆-韦二氏综合征)、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、陈旧性心肌梗死、胶质瘢痕、动脉僵硬、关节纤维化、克罗恩氏病、杜普伊特伦挛缩、瘢痕疙瘩纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、佩罗尼氏病、肾原性系统性纤维化、进行性大块纤维化、腹膜后纤维化、硬皮病/系统性硬化症、粘连性关节囊炎以及它们的任何组合。
139.一种活化有需要的受试者中的脑膜巨噬细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物。
140.一种治疗有需要的受试者的中枢神经系统的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物。
141.一种诱导有需要的受试者中的脑膜巨噬细胞的M1极化的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物。
142.一种诱导有需要的受试者的肿瘤的脑膜巨噬细胞浸润的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至88和115中任一项所述的细胞外囊泡、权利要求89至112中任一项所述的ASO、权利要求113或114所述的缀合物或权利要求116至122中任一项所述的药物组合物。
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