CN114667349A - 用于调节腺相关病毒(aav)和aav受体(aavr)之间的相互作用以改变aav生物分布的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了用于改变腺相关病毒(AAV)在受试者中的生物分布的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年9月9日提交的美国临时专利申请第62/897,973号和2019年11月13日提交的美国临时专利申请第62/934,996号的权益，每个专利申请的全部内容通过引用并入本发明。
技术领域
本公开总体上涉及病毒，特别是腺相关病毒(AAV)。
援引并入
本申请包含已通过EFS-Web提交的附录，并在此通过引用而整体并入。该PDF文件创建于2020年9月9日，命名为Sequence Annex.pdf，大小为65.9千字节。
发明背景
腺相关病毒(AAV)在呈现复制缺陷时可用作治疗性基因转移的载体系统。AAV由称为衣壳且包封单链DNA的蛋白质壳组成。实现包封的DNA分子的最低要求是DNA必须是单链的，并且必须包括AAV的侧翼反向末端重复(ITR)。衣壳结构是大型的多蛋白组装体，其形成由三个60种蛋白质单体组成的呈二十面体组装体形式的具有20个面的球状颗粒。这些单体形成衣壳蛋白。存在具有重叠序列的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。VP3是最短的蛋白质，构成了初级颗粒结构，即形成二十面体组件的基本构件。VP2是较长的蛋白质，在其C端完全包含VP3并在N端延伸。类似地，VP1在其C端包含VP2和VP3。尽管在结构上不需要VP1和VP2以形成衣壳，但两者都是AAV感染性所必需的。
一般来说，衣壳被认为是传染性和宿主载体相关特性的主要决定因素，宿主载体相关特性例如为适应性免疫应答、趋向性、特异性、效力和生物分布。事实上，已知这些特性中的一些在天然和工程化AAV血清型和变体之间有所不同。然而，迄今为止，对于衣壳上的这些变化如何在功能上改变这些特性尚无机制理解，因此，没有合理的基础来工程改造AAV以控制这些特性的任何水平。例如，多种治疗方法通过全身注射使用AAV以靶向全身肌肉组织从而治疗例如杜氏肌营养不良症(DMD)的神经肌肉疾病。然而，目前用于这些方法的如AAV9和rh74的载体都需要高剂量以确保肌肉靶向，并且载体天然以肝为主要靶标。然而，肝组织不参与DMD疾病的病理学。
2016年，Jan Carette的研究小组将称为AAVR(也称为KIAA0319L)的蛋白质鉴定为许多AAV的重要进入因子或受体(Pillay等人，2016，Nature，530(7588)：108-12)。2019年，两个独立小组报告了与AAVR受体(本文称为AAVR足迹)交界的AAV颗粒部分的结构分辨率(Meyer等人，2019，Elife，8pii：e44707；Zhang等人,2019,Nat.Microbiol.,4(4):675-682)。
发明概述
本公开至少部分基于以下发现：可以操纵、干扰或破坏各种AAV与AAVR足迹内特定位置处的某些特定氨基酸的结合，以改变AAV在受试者中的生物分布。例如通过调节如降低或增加AAV对肝细胞的转导，而不完全抑制AAV与肝细胞的结合或AAV转导受试者的肝或其他细胞的能力。
在一方面，本公开提供了调节腺相关病毒(AAV)至受试者内的肝细胞的生物分布的方法。此类方法包括在AAV中提供未修饰的AAV衣壳蛋白；并将AAV中衣壳蛋白中以下一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基替换为不同的氨基酸：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706或V708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)，从而以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式修饰AAV衣壳蛋白与肝细胞上的AAV受体(AAVR)之间的结合。
在一些情况下，AAV至肝细胞或在肝细胞中的生物分布增加。在其他情况下，AAV至肝细胞或在肝细胞中的生物分布减少。
在一些实施方案中，至少一个氨基酸残基的替换包括编码AAV衣壳蛋白的核酸的诱变。在一些情况下，替换步骤导致保守氨基酸的取代。
在另一方面，本公开提供了调节腺相关病毒(AAV)至受试者内的肝细胞的生物分布的方法。此类方法包括在AAV中提供未修饰的AAV衣壳蛋白；并用不同的氨基酸替换AAV衣壳蛋白中位置S446、R471或V708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)的一个或多个处的至少一个氨基酸残基，从而以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式修饰AAV衣壳蛋白与肝细胞上的AAV受体(AAVR)之间的结合。
在一些情况下，AAV转导肝细胞的能力增加，而在一些情况下，AAV转导肝细胞的能力降低。
在一些实施方案中，替换的氨基酸残基是S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)中的任意一个或多个。在一些实施方案中，至少一个氨基酸残基的替换包括编码AAV衣壳蛋白的核酸的诱变。
在又一方面，本公开提供了非天然存在的AAV衣壳蛋白，其包括具有在选自位置446、471或708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)的位置处的至少一个氨基酸残基不同于野生型、未修饰的AAV衣壳蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，其中非天然存在的AAV衣壳蛋白氨基酸序列与野生型AAV序列相比，以足以改变但不完全抑制AAV转导肝细胞的能力的方式提供改变的AAV衣壳蛋白与肝细胞的结合。
在一些实施方案中，非天然存在的氨基酸序列包含S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)中的至少一个。
在一些情况下，非天然存在的AAV衣壳蛋白与肝的结合增加，例如当AAV衣壳包括在位置446处的R、在位置471处的A或在位置708处的T(相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)的情况下。在一些情况下，非天然存在的AAV衣壳蛋白与肝的结合降低，例如当AAV衣壳包括在位置446处的S、在位置471处的S或在位置708处的A(相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)的情况下。
在又一方面，本公开提供了改变受试者中AAV的肝靶向的方法。此类方法包括向受试者施用包括如本文所述的非天然存在的AAV衣壳蛋白的AAV。在一些实施方案中，施用是静脉内施用。在一些实施方案中，施用重复多次。
在一方面，本公开的特征在于改变腺相关病毒(AAV)在受试者中的生物分布的方法，该方法包括通过破坏或干扰AAV与肝细胞上的AAV受体(AAVR)的结合来调节AAV对肝细胞的亲和力或亲合力，其中破坏或干扰涉及以下一个或多个位置处的至少一个氨基酸残基：263-265、267、268、271、382-385、446、471、502、503、528-529、589、706和708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1(图1中的顶部序列))编号)。
在一些实施方式中，破坏或干扰包括诱变。在某些实施方案中，破坏或干扰包括小分子结合或AAV衣壳蛋白的化学或肽修饰。
在另一方面，本公开的特征在于非天然存在的AAV衣壳蛋白，其包括具有重组氨基酸序列的AAV衣壳，该重组氨基酸序列与野生型或未修饰序列的不同之处在于选自以下位置的位置处的至少一个氨基酸残基：263-265、267、268、271、382-385、446、471、502、503、528-529、589、706和708(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1(图1中的顶部序列))编号)，其中重组AAV氨基酸序列相较于野生型AAV序列提供衣壳蛋白对肝细胞的改变的亲和力或亲合力。
在一些实施方式中，在重组氨基酸序列和野生型序列之间不同的至少一个氨基酸残基如表1所示。
在某些实施方案中，非天然存在的AAV衣壳蛋白对肝的亲和力或亲合力增加。在一些实施方案中，AAV衣壳包含在位置446处的R或在位置708处的T(相对于AAV2编号)。
在某些实施方案中，非天然存在的AAV衣壳蛋白对肝的亲和力或亲合力降低。在某些实施方案中，AAV衣壳包含在位置446处的S或在位置708处的A(相对于AAV2编号)。
在另一方面，本公开的特征在于改变受试者中AAV的肝靶向的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所述的非天然存在的AAV衣壳蛋白的AAV。
在又一方面，本公开的特征在于改变受试者中AAV的肝靶向的方法，该方法包括向受试者施用包含本文所述的非天然存在的AAV衣壳蛋白的AAV。
在一方面，本公开提供了包括非天然存在的、修饰的AAV VP1衣壳蛋白的病毒。通常，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，如本文所述的病毒包括与未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；其中修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的不同之处在于选自以下氨基酸位置的至少一个氨基酸位置处：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对SEQ ID NO:1和未修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列时，所述位置相对于AAV2 VP1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)进行编号。
在一些实施方案中，BLASTP的默认参数包括：针对短输入序列自动调整的参数；期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配数：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，扩展1；组分调整：条件组分得分矩阵调整；并且没有过滤器或掩码。在一些实施方案中，BLASTN的默认参数为：针对短输入序列自动调整的参数；期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/不匹配分数：1，-2；空位成本：线性；过滤器：低复杂度区域；和掩码：仅用于查找表。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包括至少一个选自446R、471A和708T的氨基酸残基(例如，至少两个氨基酸残基)。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含氨基酸残基446R、471A和708T。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少一个选自446S、471S和708A的氨基酸残基(例如，至少两个氨基酸残基)。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含446S、471S和708A。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列仅在以下的一个或多个氨基酸位置处不同于未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，并且不在未修饰的VP1衣壳蛋白的其他氨基酸位置处不同。
在一些实施方案中，未修饰的VP1衣壳蛋白选自来自以下的VP1衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK-03、AAV5、AAV10、Hu68；Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI；AAV1 vp1；AAV2 vp1；AAV9vp1；Anc80；Anc126；Anc127；AAV3；AAV7；AAV8；rh10；hu37；和hu.68。
在某些实施方案中，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，非天然存在的、修饰的AAV VP1衣壳蛋白包括与未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本公开提供了修饰的、能组装的重组AAV(rAAV)。此类AAV包括VP1、VP2和VP3衣壳蛋白以及重组核酸载体，其中VP1衣壳蛋白为如本文所述的修饰的VP1衣壳蛋白。
在又一方面，本公开提供了修饰的、能组装的重组AAV(rAAV)。此类AAV包括VP1、VP2和VP3衣壳蛋白；以及重组核酸载体，其中至少VP1衣壳蛋白为非天然存在的、修饰的VP1衣壳蛋白，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，所述修饰的VP1衣壳蛋白包含与未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，并且其中修饰的VP1衣壳蛋白与未修饰的VP1衣壳蛋白的不同之处在于：相较于具有未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后未修饰的rAAV的生物分布，所述修饰的VP1衣壳蛋白包含在修饰的rAAV施用于第一哺乳动物受试者后改变修饰的rAAV的生物分布的手段，其中未修饰的rAAV包含具有除所述手段之外与修饰的rAAV的氨基酸序列相同的氨基酸序列的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。
在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后实现了更高的肝细胞转导。在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后可表达多肽在肝细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后在肝细胞中表现出由重组核酸载体编码的可表达多肽的更高表达。
在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后实现了更低的肝细胞转导。在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后可表达多肽在肝细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后在肝细胞中表现出由重组核酸载体编码的可表达多肽的更低表达。
在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用，修饰的rAAV具有改变的与第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用。在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用，修饰的rAAV具有增加的与第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用。在一些实施方案中，相较于包括未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用，修饰的rAAV具有降低的与第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用。
在一些实施方案中，第一和第二哺乳动物受试者是人或非人灵长类动物(NHP)。在一些实施方案中，施用包括例如静脉内输注的全身施用。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径以相同量施用的包含未修饰VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在施用于例如人受试者的哺乳动物受试者时具有更低的肝毒性。
在一些实施方案中，用于改变修饰的rAAV施用于第一哺乳动物受试者后修饰的rAAV的生物分布的手段包括在选自以下位置处的一个或多个氨基酸残基的突变：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对SEQ ID NO:1和未修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列时，所述位置相对于AAV2 VP1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)进行编号。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包括至少一个选自446R、471A和708T的氨基酸残基(例如，至少两个氨基酸残基)。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基446R、471A和708T。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包括至少一个选自446S、471S和708A的氨基酸残基(例如，至少两个氨基酸残基)。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基446S、471S和708A。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列仅在以下的一个或多个氨基酸位置处不同于未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，并且不在未修饰的VP1衣壳蛋白的其他氨基酸位置处不同。
在一些实施方案中，未修饰的VP1衣壳蛋白选自来自以下的VP1衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK-03、AAV5、AAV10、Hu68；Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI；AAV1 vp1；AAV2 vp1；AAV9vp1；Anc80；Anc126；Anc127；AAV3；AAV7；AAV8；rh10；hu37；和hu.68。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列至少96％相同、97％相同、98％相同或99％相同。
在又一方面，提供了包含如本文所述的修饰的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物。在一方面，提供了编码如本文所述的修饰的VP1衣壳蛋白或如本文所述的修饰的rAAV的VP1蛋白的核酸分子。
在另一方面，提供了包含如本文所述的核酸分子的载体。在另一方面，提供了包含如本文所述的核酸分子或如本文所述的载体的分离的宿主细胞。
在又一方面，本公开提供了例如相较于使用具有未修饰的VP1衣壳蛋白的rAAV递送，改变可表达多核苷酸至哺乳动物受试者(例如人患者)的靶器官的递送的方法。此类方法可以包括向人患者施用治疗有效剂量的如本文所述的修饰的rAAV或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，可表达的核酸为转基因。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽至靶器官的细胞的转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由重组核酸载体编码的可表达多肽向靶器官的细胞的转导。
在某些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽至靶器官的细胞的转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由重组核酸载体编码的可表达多肽向靶器官的细胞的转导。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽至靶器官外细胞的转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由重组核酸载体编码的可表达多肽向靶器官外细胞的转导。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽至靶器官外细胞的转导，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由重组核酸载体编码的可表达多肽向靶器官外细胞的转导。
在某些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达。
在一些实施方案中，相较于包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达，修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达。
在一些实施方案中，靶器官是肝。在一些实施方案中，靶器官外的细胞是肌肉细胞。
在一些实施方案中，未修饰的AAV是AAV1、AAV8或AAV9，并且递送被改变的靶器官是心脏；未修饰的AAV是AAV2，并且递送被改变的靶器官是肾；未修饰的AAV是AAV7、AAV8、AAV9，并且递送被改变的靶器官是肝；未修饰的AAV是AAV4、AAV5、AAV6、AAV9，并且递送被改变的靶器官是肺；未修饰的AAV是AAV8，并且递送被改变的靶器官是胰腺；未修饰的AAV是AAV2、AAV5、AAV8，并且递送被改变的靶器官是眼的感光细胞；未修饰的AAV是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8，并且递送被改变的靶器官是视网膜色素上皮(RPE)；未修饰的AAV是AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9，并且递送被改变的靶器官是骨骼肌。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的相同剂量的包含未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者例如人受试者时具有更低的肝毒性。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是人受试者或非人灵长类动物。
在另一方面，本公开提供了用于本文所述的任何方法的组合物。
在一方面，在通过施用重组AAV(rAAV)治疗哺乳动物受试者(例如人患者)的方法中，所述改进包括施用治疗有效剂量的修饰的rAAV，该修饰的rAAV包含具有在施用于哺乳动物受试者后改变rAAV生物分布的手段的衣壳。
在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段降低rAAV的肝清除率。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段增加靶器官的细胞的转导。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段增加由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段减少靶器官的细胞的转导。在一些实施方案中，改变RAAV生物分布的手段降低由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官的细胞中的表达。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段增加靶器官外细胞的转导。
在某些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段增加由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段减少靶器官外细胞的转导。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段减少由重组核酸载体编码的可表达多肽在靶器官外细胞中的表达。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段改变修饰的rAAV与哺乳动物受试者细胞上表达的AAVR的相互作用。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段降低修饰的rAAV与AAVR的相互作用。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段增加修饰的rAAV与AAVR的相互作用。在一些实施方案中，修饰的rAAV比未修饰的rAAV具有更低的肝毒性。
在某些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现向肝细胞的基因转移减少10倍。在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现向肝细胞的基因转移增加10倍。
在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现向肝细胞的基因转移增加100倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现向肝细胞的基因转移减少100倍。
在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现向肝细胞的基因转移增加1000倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现向肝细胞的基因转移减少1000倍。
术语“突变”是指原本或天然序列或核酸或氨基酸的变化或改变。突变可以是自然发生的，也可以是实验室设计的(如人为的)。
如本文所用，术语“未修饰的AAV衣壳蛋白”是指本领域可获得或已知的天然存在的AAV血清型的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白或非天然存在的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白。非天然存在的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白包括由天然存在的AAV衣壳蛋白的生物或化学改变或变异产生的衣壳蛋白。因此，未修饰的AAV衣壳蛋白包括但不限于各种AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9)的衣壳蛋白或其变体。如本文所用，“变体”是指本领域可获得的或已知的指示血清型的天然存在的或人工产生的同类。非天然存在的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白还包括通过计算机设计或合成产生的人工衣壳蛋白。人工衣壳蛋白包括但不限于PCT/US2014/060163、USP9695220、PCT/US2016/044819、PCT/US2018/032166、PCT/US2019/031851和PCT/US2019/047546中公开的AAV衣壳蛋白，其通过整体引用并入本发明。
代表性的未修饰的AAV衣壳蛋白可以是AAV的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白，AAV选自但不限于AAV2(SEQ ID NO:1)；AAV1(SEQ ID NO:4)；AAV6(SEQ ID NO:5)；AAV3(SEQ ID NO:6)；AAV LK03(SEQ ID NO:7)；AAV7(SEQ ID NO:8)；AAV8(SEQ ID NO:9)；AAV hu.37(SEQ IDNO:10)；AAV rh.10(SEQ ID NO:11)；AAV9(SEQ ID NO:12)；AAV hu.68(SEQ ID NO:13)；AAV10(SEQ ID NO:14)；AAV5(SEQ ID NO:15)；AAV3-3(SEQ ID NO:16)；AAV4-4(SEQ ID NO:17)；AAV1-A(SEQ ID NO:18)；hu.46-A(SEQ ID NO:19)；hu.48-A(SEQ ID NO:20)；hu.44-A(SEQ ID NO:21)；hu.43-A(SEQ ID NO:22),AAV6-A(SEQ ID NO:23)；hu.34-B(SEQ ID NO:24),hu.47-B(SEQ ID NO:25),hu.29-B(SEQ ID NO:26),rh.63-B(SEQ ID NO:27),hu.56-B(SEQ ID NO:28),hu.45-B(SEQ ID NO:29),rh.57-B(SEQ ID NO:30),rh.35-B(SEQ ID NO:31)；rh.58-B(SEQ ID NO:32)；rh.28-B(SEQ ID NO:33)；rh.51-B(SEQ ID NO:34)；rh.19-B(SEQ ID NO:35)；rh.49-B(SEQ ID NO:36),rh.52-B(SEQ ID NO:37)；rh.13-B(SEQ ID NO:38)；AAV2-B(SEQ ID NO:39)；rh.20-B(SEQ ID NO:40)；rh.24-B(SEQ ID NO:41)；rh.64-B(SEQ ID NO:42)；hu.27-B(SEQ ID NO:43)；hu.21-B(SEQ ID NO:44)；hu.22-B(SEQ ID NO:45)；hu.23-B(SEQ ID NO:46)；hu.7-C(SEQ ID NO:47)；hu.61-C(SEQ ID NO:48)；rh.56-C(SEQ ID NO:49)；hu.9-C(SEQ ID NO:59)；hu.54-C(SEQ ID NO:51)；hu.53-C(SEQ ID NO:52)；hu.60-C(SEQ ID NO:53)；hu.55-C(SEQ ID NO:54)；hu.2-C(SEQ ID NO:55)；hu.1-C(SEQ ID NO:56)；hu.18-C(SEQ ID NO:57)；hu.3-C(SEQ ID NO:58)；hu.25-C(SEQ ID NO:59)；hu.15-C(SEQ ID NO:60)；hu.16-C(SEQ ID NO:61)；hu.11-C(SEQ ID NO:62)；hu.10-C(SEQ ID NO:63)；hu.4-C(SEQ ID NO:64)；rh.54-D(SEQ ID NO:65)；rh.48-D(SEQ ID NO:66)；rh.55-D(SEQ ID NO:67)；rh.62-D(SEQ ID NO:68)；AAV7-D(SEQ ID NO:69)；rh.52-E(SEQ ID NO:70)；rh.51-E(SEQ ID NO:71)；hu.39-E(SEQ ID NO:72)；rh.53-E(SEQ ID NO:73)；hu.37-E(SEQ ID NO:74)；rh.43-E(SEQ ID NO:75)；rh.50-E(SEQ ID NO:76)；rh.49-E(SEQ ID NO:77)；rh.61-E(SEQ ID NO:78)；hu.41-E(SEQ ID NO:79)；rh.64-E(SEQ ID NO:80)；hu.42-E(SEQ ID NO:81)；rh.57-E(SEQ ID NO:82)；rh.40-E(SEQ ID NO:83)；hu.67-E(SEQ ID NO:84)；hu.17-E(SEQ ID NO:85)；hu.6-E(SEQ ID NO:86)；hu.66-E(SEQ ID NO:87)；rh.38-E(SEQ ID NO:88)；hu.32-F(SEQ ID NO:89)；AAV9/hu(SEQ ID NO:90)；hu.31-F(SEQ ID NO:91)；Anc80(SEQ ID NO:92)；Anc81(SEQ ID NO:93)；Anc82(SEQ ID NO:94)；Anc83(SEQ ID NO:95)；Anc84(SEQ ID NO:96)；Anc94(SEQ ID NO:97)；Anc113(SEQ ID NO:98)；Anc126(SEQ ID NO:99)；Anc127(SEQ ID NO:100)；Anc80L27(SEQ ID NO:101)；Anc80L59(SEQ ID NO:102)；Anc80L60(SEQ ID NO:103)；Anc80L62(SEQ ID NO:104)；Anc80L65(SEQ ID NO:105)；Anc80L33(SEQ ID NO:106)；Anc80L36(SEQ ID NO:107)；Anc80L44(SEQ ID NO:108)；Anc80L1(SEQ ID NO:109)；Anc110(SEQ ID NO:110)；和Anc80DI(SEQ ID NO:111)。
如本文所用，术语“未修饰的rAAV”是指仅包含未修饰的AAV衣壳蛋白的重组AAV(rAAV)。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与方法和物质组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于方法和物质组合物的实践或测试，下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和示例仅是说明性的而非意在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过整体引用并入。
附图说明
图1是显示了针对合并的条形码文库中的AAV变体的文库构建体的最小设计的示意图。ITR，反向终端重复；polyA，多聚腺苷酸化信号；ORF，开放阅读框。
图2是Anc126(SEQ ID NO:99)和Anc127(SEQ ID NO:100)VP1衣壳蛋白序列相对于AAV2衣壳蛋白序列(SEQ ID NO:1)的比对。预测与AAVR足迹(AAV衣壳蛋白序列的AAVR结合结构域)相互作用的AAV2衣壳序列中的残基被加框。
图3是说明Anc126变体在鼠肝靶向方面的相对排序的指纹图。在静脉(I V)施用多重Anc126文库后，将每个Anc126变体基于肝摄取从上到下排序。列显示了构成Anc126内的多样性的九个变异位置。每个变异位置都有两个可能的残基，在此表示为黑色或白色。在上半部分或下半部分排序中具有该特定残基(即黑色)的变体百分比显示在随附的表中。
图4是说明Anc127变体在鼠肝靶向方面的相对排序的指纹图。在静脉施用多重Anc127文库后，将每个Anc127基于肝摄取从上到下排序。列显示了构成Anc127内的多样性的十个变异位置。每个变异位置都有两个可能的残基，在此表示为黑色或白色。在上半部分或下半部分排序中具有该特定残基(即黑色)的变体百分比显示在随附的表中。
图5A-5B是说明Anc126(5A)和Anc127(5B)变体在鼠肝靶向方面的相对排列顺序的指纹图。在静脉施用多重Anc126和Anc127文库后，根据肝摄取从上到下排列每个Anc126和Anc127变体。列显示了构成Anc126和A nc127文库内的多样性的变异位置。每个变异位置都有两个可能的残基，在此表示为黑色或白色。在上半部分或下半部分排序中具有该特定残基(即黑色)的变体百分比显示在随附的表中。
图6A-6B是在残基266处具有甘氨酸(黑色)或丙氨酸(白色)的Anc80文库施用于两种不同的非人灵长类动物的指纹图。
图7-1至7-3表示可用于本文所述方法的VP1衣壳蛋白的比对(AAV2(SEQ ID NO:1)；AAV1(SEQ ID NO:4)；AAV6(SEQ ID NO:5)；AAV3(SEQ ID NO:6)；AAV LK03(SEQ ID NO:7)；AAV7(SEQ ID NO:8)；AAV8(SEQ ID NO:9)；AAV hu.37(SEQ ID NO:10)；AAV rh.10(SEQID NO:11)；AAV9(SEQ ID NO:12)；AAV hu.68(SEQ ID NO:13)；AAV10(SEQ ID NO:14)；和AAV5(SEQ ID NO:15))。本文所述的可变切换残基的位置加框。
图8-1至8-31表示可用于本文所述方法的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列的比对(AAV5(SEQ ID NO:15)；AAV3-3(SEQ ID NO:16)；AAV4-4(SEQ ID NO:17)；AAV1-A(SEQ IDNO:18)；hu.46-A(SEQ ID NO:19)；hu.48-A(SEQ ID NO:20)；hu.44-A(SEQ ID NO:21)；hu.43-A(SEQ ID NO:22),AAV6-A(SEQ ID NO:23)；hu.34-B(SEQ ID NO:24),hu.47-B(SEQID NO:25),hu.29-B(SEQ ID NO:26),rh.63-B(SEQ ID NO:27),hu.56-B(SEQ ID NO:28),hu.45-B(SEQ ID NO:29),rh.57-B(SEQ ID NO:30),rh.35-B(SEQ ID NO:31)；rh.58-B(SEQID NO:32)；rh.28-B(SEQ ID NO:33)；rh.51-B(SEQ ID NO:34)；rh.19-B(SEQ ID NO:35)；rh.49-B(SEQ ID NO:36),rh.52-B(SEQ ID NO:37)；rh.13-B(SEQ ID NO:38)；AAV2-B(SEQID NO:39)；rh.20-B(SEQ ID NO:40)；rh.24-B(SEQ ID NO:41)；rh.64-B(SEQ ID NO:42)；hu.27-B(SEQ ID NO:43)；hu.21-B(SEQ ID NO:44)；hu.22-B(SEQ ID NO:45)；hu.23-B(SEQID NO:46)；hu.7-C(SEQ ID NO:47)；hu.61-C(SEQ ID NO:48)；rh.56-C(SEQ ID NO:49)；hu.9-C(SEQ ID NO:59)；hu.54-C(SEQ ID NO:51)；hu.53-C(SEQ ID NO:52)；hu.60-C(SEQID NO:53)；hu.55-C(SEQ ID NO:54)；hu.2-C(SEQ ID NO:55)；hu.1-C(SEQ ID NO:56)；hu.18-C(SEQ ID NO:57)；hu.3-C(SEQ ID NO:58)；hu.25-C(SEQ ID NO:59)；hu.15-C(SEQID NO:60)；hu.16-C(SEQ ID NO:61)；hu.11-C(SEQ ID NO:62)；hu.10-C(SEQ ID NO:63)；hu.4-C(SEQ ID NO:64)；rh.54-D(SEQ ID NO:65)；rh.48-D(SEQ ID NO:66)；rh.55-D(SEQID NO:67)；rh.62-D(SEQ ID NO:68)；AAV7-D(SEQ ID NO:69)；rh.52-E(SEQ ID NO:70)；rh.51-E(SEQ ID NO:71)；hu.39-E(SEQ ID NO:72)；rh.53-E(SEQ ID NO:73)；hu.37-E(SEQID NO:74)；rh.43-E(SEQ ID NO:75)；rh.50-E(SEQ ID NO:76)；rh.49-E(SEQ ID NO:77)；rh.61-E(SEQ ID NO:78)；hu.41-E(SEQ ID NO:79)；rh.64-E(SEQ ID NO:80)；hu.42-E(SEQID NO:81)；rh.57-E(SEQ ID NO:82)；rh.40-E(SEQ ID NO:83)；hu.67-E(SEQ ID NO:84)；hu.17-E(SEQ ID NO:85)；hu.6-E(SEQ ID NO:86)；hu.66-E(SEQ ID NO:87)；rh.38-E(SEQID NO:88)；hu.32-F(SEQ ID NO:89)；AAV9/hu(SEQ ID NO:90)；和hu.31-F(SEQ ID NO:91))。本文所述的可变切换残基的位置加框。
图9-1至9-4表示可用于本文所述方法的AAV Anc衣壳蛋白的氨基酸序列的比对(Anc80(SEQ ID NO:92)、Anc81(SEQ ID NO:93)、Anc82(SEQ ID NO:94)、Anc83(SEQ ID NO:95)、Anc84(SEQ ID NO:96)、Anc94(SEQ ID NO:97)、Anc113(SEQ ID NO:98)、Anc126(SEQID NO:99))、Anc127(SEQ ID NO:100)、Anc80L27(SEQ ID NO:101)、Anc80L59(SEQ ID NO:102)、Anc80L60(SEQ ID NO:103)、Anc80L62(SEQ ID NO:104)、Anc80L65(SEQ ID NO:105)、Anc80L33(SEQ ID NO:106)、Anc80L36(SEQ ID NO:107)、Anc80L44(SEQ ID NO:108)；Anc80L1(SEQ ID NO:109)；Anc110(SEQ ID NO:110)、Anc80DI(SEQ ID NO:111))。
在这些序列中，SEQ ID NO:92-100是美国专利号9,695,220中公开的原始AAV衣壳文库的序列，该专利通过整体引用并入本发明。文库包括Anc80(SEQ ID NO:92)、Anc81(SEQID NO:93)、Anc82(SEQ ID NO:94)、Anc83(SEQ ID NO:95)、Anc84(SEQ ID NO:96)、Anc94(SEQ ID NO:97)、Anc113(SEQ ID NO:98)、Anc126(SEQ ID NO:99)、Anc127(SEQ ID NO:100)。图9-1、9-2、9-3和9-4使用每个文库的单个成员序列(SEQ ID NO 92-100)生成，但可以对文库的任何其他成员进行相同的分析和比对以鉴别可变切换残基的位置。
本文所述的可变切换残基的位置加框。切换位点中的一个或多个氨基酸可以如本文所述取代、插入和/或缺失以实现期望的AAV生物分布。
发明详述
本公开表明，通过AAV和AAVR之间的各种相互作用点，可以调节(例如，减少或增加)AAV至或在肝细胞中的生物分布(例如，载体摄取和转导的量)以及可表达核酸例如转基因在靶细胞中的表达，同时维持或甚至增加其他器官和例如肌肉的外周组织中的细胞的转导。本公开提供了关于如何通过以下方式改变AAV衣壳蛋白序列以调节AAVR-AAV相互作用的指导：保留AAV接合和结合AAV受体以使其功能性进入和转导细胞的能力，但通过足以修饰转导的方式改变其亲和力、亲和力、结合和解离常数、和/或受体-配体动力学，从而在体内施用后在体内改变AAV在肝和其他器官和组织如肌肉组织中的细胞的生物分布。基于本公开，可以改变AAV的序列以调节AAV的生物分布，例如，通过在患者或受试者中调节AAV对肝细胞的转导，而不抑制AAV与肝细胞和其他细胞的结合。
腺相关病毒(AAV)
用于实验或治疗目的的基因转移依赖于载体或载体系统将遗传信息运送到靶细胞中。载体或载体系统被认为是基因转移反应的效率、特异性、宿主反应、药理学和寿命的主要决定因素。目前，实现基因转移的最高效和最有效的方法是通过使用基于复制缺陷病毒的载体或载体系统。一些已显示成功作为基因治疗载剂的载体是基于腺相关病毒(AAV)的。
可以使用例如包装宿主细胞将病毒多肽组装成病毒颗粒。可以使用如本文所述的一种或多种病毒载体将病毒颗粒的组分(例如rep序列、帽序列、反向末端重复(ITR)序列)引入包装宿主细胞。一旦组装好，就可以筛选病毒颗粒靶向肝的能力。本文描述了确定AAV靶向肝的能力的方法(参见例如，实施例3)。
此外，可以针对任何数量的其他特征或表型(例如，复制能力；基因转移特性；受体结合能力；和/或群体中的血清阳性率)筛选如本文所述的病毒颗粒。此外，确定病毒颗粒是否与其受体结合的方法是本领域已知的，并且这些方法可以在体外或体内进行。
如若期望，可以使用常规方法纯化病毒颗粒。如本文所用，“纯化的”病毒颗粒是指从制备它们的混合物中的组分中移出的病毒颗粒，混合物中的组分例如但不限于病毒组分(例如rep序列、帽序列)、包装宿主细胞、和部分或不完全组装的病毒颗粒。
AAV肝切换
以往，AAV VP1衣壳蛋白中的特定位置如下鉴别：当在该位置的两种不同氨基酸(甘氨酸和丙氨酸)之间切换时，在小鼠、非人灵长类动物和具有人源化肝的小鼠以及具有人肝细胞共培养物的小鼠中静脉注射AAV后，肝摄取和表达发生定量改变(参见例如，WO2019/217911，通过整体引用并入本发明)。该发现最初是使用Anc80 AAV变体库进行的；Anc80是预测的原始AAV支架序列(参见例如，WO 2015/054653，通过整体引用并入本发明)。该发现意义重大，因为这种特定的残基变化(G到A，或A到G)是可能的最保守的氨基酸取代之一，但这种保守的变化仍然产生了非常明显的肝开启/肝关闭切换。
进一步的工作将这种保守切换的相关性扩展到其他AAV病毒，包括天然AAV变体AAV3B和AAV9，其中天然变体分别处于“肝关闭”或“肝开启”状态。基于这项工作，可以通过进行指定的氨基酸取代将每种肝状态转化为相反的状态(参见例如，WO 2019/217911)。此外，Anc80和AAV9的肝切换“关闭”变体的数据表明，虽然肝靶向性显著降低，但肌肉等非肝组织的摄取得到了定量保留或者在某些情况下得到增加。
本领域技术人员将理解，鉴别和改变本文所述的一个或多个“肝切换”序列(例如，将AAV从肝开启变为肝关闭，或反之亦然)需要序列的上下文得到保留，这有时是由于所产生的结构特征的上下文。至少出于此原因，本文所涉及的位置的编号是相对于AAV2 VP1蛋白的序列而言的，其显示在SEQ ID NO:1中。然而，应当理解，任何AAV，无论是天然存在的，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK-03、AAV5、AAV10和Hu68；或者修饰的或变体，例如AAV ShH10和AAV-DJ；以及变体例如Anc80 AAV变体文库(参见例如，WO 2015/054653)Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI均可用作未修饰的序列，即参考序列，但如果使用不同的参考序列，编号位置可能与本文所涉及的位置不同。
序列的上下文或一条序列中一个或多个氨基酸相对于另一个的位置通常使用序列比对算法(例如，Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.，25:33893402中纳入BLAST(基本局部比对搜索工具)程序，程序可在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov上获得)来确定。BLAST或类似算法可用于比对两条序列(例如，鉴别“相应”位置的残基，即使两条序列不同，例如长度不同)、识别基序或共有序列、和/或确定两条或多条序列(核酸或氨基酸)之间的序列同一性百分比。
如本文所用，比较两条序列时使用的“默认参数”是使用BLAST算法(版本BLAST+2.10.1)的默认参数，如2020年9月9日在万维网上的blast.ncbi.nlm.nih.gov所应用的。对于比对蛋白质序列，默认参数为BLASTP：针对短输入序列自动调整的参数；期望阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配数：0；矩阵：BLOSUM62；空位成本：存在11，扩展1；组分调整：条件组分得分矩阵调整；并且没有过滤器或掩码)。对于比对核酸序列，默认参数为BLASTN：针对短输入序列自动调整的参数；期望阈值：10；字长：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/不匹配分数：1，-2；空位成本：线性；过滤器：低复杂度区域；和掩码：仅用于查找表。
例如，图7和图8中所示的来自许多不同AAV血清型的VP1衣壳蛋白的比对，或类似产生的比对，有时称为“堆积(pile-up)”，是一种可用于鉴别氨基酸相对于例如AAV2或任何其他未修饰的AAV序列的位置的方法。
AAV-AAVR相互作用
先前已经表明，除AAV4和rh.32.33外，大多数AAV血清型需要并因此依赖于AAV受体(AAVR)进行细胞转导(Dudek等人，2018年，J.Virol.，92(7)pii:e02213-17)。本公开描述了可以对AAV衣壳蛋白序列进行的特定改变，以通过改变结合(例如，亲和力和/或亲合力)来调节AAVR-AAV相互作用，从而为这种相互作用提供修饰的“关闭”速率。当在体内使用时，AAV衣壳蛋白序列的这些特定变化显著改变了“肝开启”载体与“肝关闭”载体的肝摄取，表明降低的AAVR-AAV相互作用亲和力在载体在血液中循环并通过肝的情况下限制了肝切换关闭载体的结合和最终摄取。
本文所述的数据进一步表明，在非肝组织特别是从脉管系统(例如肌肉系统)分离的那些组织中，AAV的摄取和转导得以保留，并且在某些实施方案中，对于肝去靶向载体而言，AAV的摄取和转导增加。虽然不希望受理论限制，但据信这可能是因为在那些非肝组织中，AAVR-AAV结合亲和力对转导的影响小于没有循环的情况，因此AAV靠近组织存在以持续更长时间，从而减少结合动力学对最终组织靶向的影响。同样，虽然不希望受理论限制，但在某些非肝组织中观察到的肝去靶向AAV的转导水平增加可能另外和/或替代地是由于生物分布的增加，因为较少的AAV会由肝摄取耗尽。
AAVR似乎在大多数组织中大量表达，并且这些水平在大多数组织中似乎相对近似。因此，与早期预测相反，AAVR表达的丰度并不能直接预测AAV的组织趋向性。相反，基于本文公开的数据，AAV组织趋向性主要受改变的AAV序列变体的影响，AAV序列变体包括保留对AAVR的依赖性的AAV序列变体。这进一步表明AAV的结构可以影响与AAVR的结合和/或涉及AAVR结合的细胞辅助因子的招募。
修饰AAV生物分布的方法
可以在AAV核酸分子中引入变化，从而导致所编码的多肽的氨基酸序列发生变化。例如，可以使用诱变(例如，定点诱变、PCR介导的诱变、CRISPR/Cas9或其他位点特异性核酸内切酶介导的诱变)将变化引入核酸编码序列或通过化学合成具有此类变化的核酸分子。此类核酸变化可导致一个或多个氨基酸残基处的保守和/或非保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的不同氨基酸残基取代(参见例如，Dayhoff等人(1978,in Atlas of Protein Sequence and Structure,5(Suppl.3):345-352)，其提供了氨基酸取代的频率表)，非保守取代是一种氨基酸残基被不具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。
如本文所述，衣壳蛋白中的以下位置参与与AAVR的结合：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706或V708(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)，并且这些位置中的任何一个或多个可以相对于其原始氨基酸(例如在该位置的野生型或天然存在的氨基酸，或存在于变体AAV中该位置的氨基酸)发生改变，以通过改变AAV转导肝细胞的能力的方式改变(但不抑制)修饰的AAV衣壳蛋白与肝细胞上的AAV受体(AAVR)之间的结合，从而在将AAV施用于受试者或患者并进入循环系统时改变肝细胞的趋向性或生物分布。因此，以导致修饰的(例如，非天然存在的)AAV的趋向性改变但不抑制该AAV与给定细胞的AAVR结合的方式对指定位置处的一个或多个残基进行改变，从而允许肝去靶向的AAV结合并转导体内其他类型的细胞。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置446、471和/或708(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。如以下实施例所示，当AAV衣壳在位置446处包含R、在位置471处包含A、和/或在位置708处包含T时，可增加对肝细胞的生物分布，而当AAV衣壳在位置446处包含S、在位置471处包含S、和/或在位置708处包含A(均相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)时，可减少对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置446、471和/或708(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。如以下实施例所示，当AAV衣壳在位置446处包含R、在位置471处包含A、和/或在位置708处包含T时，可增加对肝细胞的生物分布，而当AAV衣壳在位置446处包含S、在位置471处包含S、和/或在位置708处包含A(均相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)时，可减少对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：S446N、S446R、R471A、R471S、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置266、271和/或446(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。当AAV衣壳在位置266处包含例如A或G、在位置271处包含H或T、和/或在位置446处包含S、N或R(均相对于AAV2(SEQID NO:1)编号)时，可改变对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：A266G、H271T、R446A或R446S(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置471、589和/或708(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。当AAV衣壳在位置471处包含例如R、A或S、在位置589处包含Q或A、和/或在位置708处包含V、T或A(均相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)时，可改变对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：R471A、R471S、Q589A、V708T或V708A(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置266、446和/或589(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。如以下实施例所示，当AAV衣壳在位置266处包含A或G、在位置446处包含S、N或R、和/或在位置589处包含Q或A(均相对于AAV2(SEQ ID NO:1)编号)时，可改变对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：A266G、S446N、S446R或Q589R(相对于AAV2衣壳序列(SEQ IDNO:1)编号)。
具体地，至少AAV的VP1衣壳蛋白的位置271、446和/或471(相对于AAV2 VP1衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)可以相对于其原始或野生型序列发生改变。当AAV衣壳在位置271处包含H或T、在位置446处包含S、N或R、和/或在位置471处包含R、A或S(均相对于AAV2(SEQ IDNO:1)编号)时，可改变对肝细胞的生物分布。在一些实施方案中，VP1蛋白含有一种或多种以下变化：H271T、S446N、S446R、R471A或R471S(相对于AAV2衣壳序列(SEQ ID NO:1)编号)。
可以使用多种方法获得或产生核酸，该方法包括但不限于化学合成、重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)。通用PCR技术描述于例如PCR Primer中：实验室手册(Dieffenbach&Dveksler,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995)，以及重组核酸技术包括例如限制性内切酶消化和连接。参见例如,Sambrook等人(1989,MolecularCloning；a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,纽约)。
还提供了含有编码多肽的核酸分子的载体。载体，包括表达载体，是可商购的或可以通过重组技术产生。含有核酸分子的载体可以具有与此核酸分子可操作地连接的一个或多个用于表达的元件，并且还可以包括例如那些编码选择性标志物(例如抗生素抗性基因)和/或那些可用于多肽纯化(例如，6xHis标签)的序列。用于表达的元件包括指导和调节核酸编码序列表达的核酸序列。表达元件的一个实例是启动子序列(例如，CMV或其他合适的病毒启动子，例如但不限于p5、p19和p40)。表达元件还可以包括调节核酸分子表达的内含子、增强子序列、响应元件或诱导元件中的一种或多种。表达元件可以是细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或病毒来源的，并且载体可以包含来自不同来源的表达元件的组合。如本文所用，可操作地连接是指用于表达的元件相对于编码序列以指导或调节编码序列表达的方式定位在载体中。
可以将核酸分子，例如载体(例如，表达载体或病毒载体)中的核酸分子引入宿主细胞。术语“宿主细胞”不仅指已引入核酸分子的特定细胞，还指此类细胞的后代或潜在后代。许多合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的；宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞)。代表性的宿主细胞可以包括但不限于A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、293细胞、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和源自哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。将核酸分子引入宿主细胞的方法在本领域中是众所周知的并且包括但不限于磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移(例如，转导)。
切换位点
本公开提供了AAV衣壳蛋白的特定残基，该残基可以被修饰以在rAAV施用于哺乳动物受试者时改变体内靶向。特定残基的修饰可以改变靶细胞的转导和/或靶细胞中的转基因表达。特定的残基称为切换位点(toggle site)。
切换位点包含参与AAV衣壳蛋白和AAVR之间相互作用的氨基酸残基，特别是在位置Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708处的氨基酸残基，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2VP1)编号。图7-1至7-3，图8-1至8-31和图9-1至9-4显示了在各种未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列上突出显示的各个切换位点。
可以通过改变切换位点的一个或多个氨基酸来改变AAV的靶标特异性趋向性。本文提供的修饰的衣壳蛋白(例如，修饰的VP1衣壳)相较于未修饰的衣壳蛋白在以下切换位点包括一个或多个氨基酸差异：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708。
在一些实施方案中，在由S446、R471和V708组成的选定切换位点处引入修饰。在一些实施方案中，修饰不在A266处。
切换位点的修饰可以改变修饰的rAAV的生物分布。在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰增加了靶细胞的转导。在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰增加了由修饰的rAAV递送的可表达多核苷酸在靶细胞中的表达。在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰降低了靶细胞的转导。在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰降低了由修饰的rAAV递送的可表达多核苷酸在靶细胞中的表达。在一些实施方案中，靶标是肝且靶细胞是肝细胞。在一些实施方案中，靶标不是肝。
修饰的AAV衣壳蛋白
相较于未修饰的rAAV的生物分布，本公开的修饰的衣壳蛋白包含在施用于哺乳动物受试者后改变rAAV生物分布的手段，所述未修饰的rAAV包含具有除所述手段之外与修饰的rAAV的氨基酸序列相同的氨基酸序列的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。包含修饰的衣壳蛋白的rAAV被称为修饰的rAAV。
当局部或全身施用时，所述手段可以改变生物分布。在一些实施方案中，所述手段在静脉内输注时改变生物分布。
在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段改变了修饰的rAAV与哺乳动物受试者细胞上表达的AAVR的相互作用。例如，改变rAAV生物分布的手段减少或增加修饰的rAAV与AAVR的相互作用。在一些实施方案中，相较于未修饰的AAV衣壳蛋白和AAVR之间的结合亲和力或结合稳定性，所述手段改变修饰的AAV衣壳蛋白和AAVR之间的结合亲和力或结合稳定性。在一些实施方案中，所述手段包含AAV衣壳蛋白(VP1、VP2或VP3衣壳蛋白)和AAVR之间相互作用界面的变化。
在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包含在一个或多个选自以下的位置处存在或不存在某些氨基酸残基：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2 VP1)编号。在一些实施方案中，可以在一个或多个选自以下的位置处取代、插入和/或缺失一个以上氨基酸：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，以引入改变rAAV生物分布的手段。
在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在一个或多个以下切换位点处的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708。氨基酸取代、插入和/或缺失可以将切换位点处的一个或多个原始氨基酸残基更改为如表1A、1B、1C和2中提供的存在于不同AAV衣壳的相同切换位点处的一个或多个不同氨基酸残基。例如，Q263切换位点(相对于AAV2)可以从Q更改为A、E、T或G中的任何一个。AAV1的Q264切换位点可以从S更改为G、T、A或V中的任何一个。可以引入一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的切换位点在图7-1至7-3和图8-1至8-31中用方框突出显示。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白具有SEQ ID NO:112-137中所示的序列。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白具有与SEQ ID NO:112-137中所示的序列之一具有至少95％、96％、97％、98％、99％或95.5％同一性的序列。
在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白具有SEQ ID NO:1-100中所示的序列之一，其中在以下切换位点之一处具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2 VP1)编号。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白具有SEQ ID NO:1-100中所示的序列之一，其中在选定的以下切换位点之一处具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失：S446、R471和V708，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2 VP1)编号。
在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在一个以上切换位点处的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在两个切换位点的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在三个切换位点的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十个切换位点的一个或多个氨基酸的取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，用于改变rAAV生物分布的手段包括在A2666处的一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失以及在以下其他切换位点处的一个或多个额外氨基酸取代、插入和/或缺失：Q263、S264、G265、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段不包括在A266处的氨基酸取代。
在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段包括在以下选定的切换位点处的一个或多个氨基酸取代：S446、R471和V708。在一些实施方案中，改变rAAV生物分布的手段包括在选定的切换位点处的两个氨基酸取代或三个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包含一个、两个或三个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰的VP1衣壳蛋白包含一个、两个或三个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。
在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白与未修饰的AAV衣壳蛋白的不同之处在于VP1蛋白，该未修饰的AAV衣壳蛋白与修饰的AAV衣壳蛋白具有最大序列同一性，如使用默认参数所比对的。在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白与具有最大序列同一性的未修饰的AAV衣壳蛋白仅在以下切换位点处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2 VP1)编号。在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白与具有最大序列同一性的未修饰的AAV衣壳蛋白仅在选定的切换位点S446、R471和V708处不同，其中氨基酸位置相对于SEQ ID NO:1(AAV2 VP1)编号。
在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白与具有最大序列同一性的未修饰的AAV衣壳蛋白在切换位点以及切换位点外不同。在一些实施方案中，修饰的AAV衣壳蛋白与具有最大序列同一性的未修饰的AAV衣壳蛋白具有95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性。
在一方面，本公开提供了编码修饰的AAV衣壳蛋白的修饰的多核苷酸。相较于编码未修饰的AAV衣壳的未修饰的多核苷酸，编码修饰的AAV衣壳蛋白的修饰的多核苷酸可以在选自以下的一个或多个位置处具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失：(787-789)、(790-792)、(793-795)、(796-798)、(799-801)、(802-804)、(811-813)、(1144-1146)、(1150-1152)、(1153-1155)、(1336-1338)、(1411-1413)、(1504-1506)、(1507-1509)、(1582-1584)、(1585-1587)、(1765-1767)、(2116-2118)或(2122-2124)，其中核苷酸位置相对于SEQ ID NO:141(AAV2 VP1)编号。核苷酸取代、插入或缺失可以在以下一个或多个切换位点处将一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失引入多核苷酸编码的衣壳蛋白中：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708。
在一些实施方案中，修饰的多核苷酸包含SEQ ID NO:136-141所示的序列之一，其中在选自以下的一个或多个位置处具有一个或多个核苷酸取代、插入或缺失：(787-789)、(790-792)、(793-795)、(796-798)、(799-801)、(802-804)、(811-813)、(1144-1146)、(1150-1152)、(1153-1155)、(1336-1338)、(1411-1413)、(1504-1506)、(1507-1509)、(1582-1584)、(1585-1587)、(1765-1767)、(2116-2118)或(2122-2124)，其中核苷酸位置相对于SEQ ID NO:141(AAV2 VP1)编号。
在一方面，本公开提供了编码修饰的AAV衣壳蛋白的修饰的多核苷酸。与编码未修饰AAV衣壳的未修饰多核苷酸相比，编码修饰的AAV衣壳蛋白的修饰的多核苷酸可以在选自(1336-1338)、(1411-1413)或(2122-2124)的一个或多个位置处具有一个或多个核苷酸取代、插入或缺失，其中核苷酸位置相对于SEQ ID NO:141(AAV2 VP1)编号。核苷酸取代、插入或缺失可以在一个或多个以下选定切换位点处将一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失引入多核苷酸编码的衣壳蛋白中：S446、R471和V708。核苷酸取代、插入或缺失可以在一个或多个以下选定的切换位点处引入一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失：A266、S446、R471和V708。
在一些实施方案中，修饰的多核苷酸包含SEQ ID NO:147-151所示的序列之一，其中在选自(1336-1338)、(1411-1413)或(2122-2124)的一个或多个位置处具有一个或多个核苷酸取代、插入或缺失，其中核苷酸位置相对于SEQ ID NO:141(AAV2 VP1)编号。
在另一方面，本公开提供了包含编码本文所述的修饰的AAV衣壳蛋白的修饰的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒。
修饰的重组AAV(修饰的rAAV)
本公开进一步提供了包含本文公开的修饰的AAV衣壳蛋白(VP1、VP2或VP3衣壳蛋白)和重组核酸载体的修饰的rAAV。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后实现更高的肝转导。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中施用的可表达多核苷酸的表达，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后实现了肝重组核酸基因组内的可表达多核苷酸在肝中的更高表达。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后实现更低的肝转导。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中施用的可表达多核苷酸的表达，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后实现了肝重组核酸基因组内的可表达多核苷酸在肝中的更低表达。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在向哺乳动物受试者施用后实现了更高的肝外器官的转导。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中递送的可表达多核苷酸，修饰的rAAV实现了重组核酸基因组内可表达多核苷酸在肝外器官中的更高表达。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中递送的可表达多核苷酸，修饰的rAAV实现了重组核酸基因组内可表达多核苷酸在肝外器官中的更低转导。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中递送的可表达多核苷酸，修饰的rAAV实现了重组核酸基因组内可表达多核苷酸在肝外器官中的更低表达。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VPl具有最大序列同一性的未修饰的VPl衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV具有与哺乳动物受试者细胞上表达的AAVR减少的相互作用。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV具有与哺乳动物受试者细胞上表达的AAVR更高的相互作用。
在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径和相同剂量施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV具有更小的肝毒性。
包含修饰的rAAV的药物组合物
在一方面，本公开提供了包含本公开的修饰的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物。修饰的rAAV包含如本文所述的修饰的AAV衣壳蛋白和含有可表达多核苷酸的重组核酸载体。
药物组合物可用于将重组核酸载体递送至哺乳动物受试者内的靶标。当施用药物组合物时，相较于通过相同施用途径和相同剂量施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后可以实现更高的靶细胞转导。在一些实施方案中，相较于通过相同施用途径和相同剂量施用的包含与修饰的VP1具有最大序列同一性的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV中施用的可表达多核苷酸的表达，修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者后实现了重组核酸基因组内的可表达多核苷酸在靶细胞中的更高表达。
通过测量rAAV的转导或可表达多核苷酸的表达，可以在实验动物中测试修饰的rAAV的靶向性。在一些实施方案中，在非人灵长类动物(NHP)、小鼠、大鼠、鸟、兔、豚鼠、仓鼠、农场动物(包括猪和羊)、狗或猫中测量靶向性。
可以在全身或局部施用rAAV后测量修饰的rAAV的靶向性。在一些实施方案中，在静脉输注rAAV之后测量修饰的rAAV的靶向性。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、750倍、1000倍或2500倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、750倍、1000倍或2500倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少10倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少10倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少10倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少10倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少10倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少10倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少100倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少100倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少100倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少100倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少1000倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达减少至少1000倍。
在一些实施方案中，相较于未修饰的rAAV，修饰的rAAV在第一次施用于哺乳动物受试者后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少1000倍。在一些实施方案中，修饰的rAAV在第一次施用于恒河猴后实现基因向肝的转移或病毒感染或肝细胞中的转基因表达增加至少1000倍。
使用肝切换病毒的方法
如本文所述的非天然存在的修饰的AAV病毒(例如，其中VP1衣壳蛋白序列被改变或工程化以表现出所需的生物分布(例如，肝开启或肝关闭))可用于大量研究和/或治疗应用。例如，肝开启或肝关闭病毒可在人或动物医学中用于基因治疗(例如，在载体或载体系统中用于基因转移)或用于疫苗接种(例如，用于抗原呈递)。更具体地，肝开启或肝关闭病毒可用于基因添加、基因增强、多肽治疗剂的遗传递送、基因疫苗接种、基因沉默、基因组编辑、基因治疗、RNAi递送、cDNA递送、mRNA递送、miRNA递送、miRNA海绵化(miRNA sponging)、基因免疫、光遗传学基因治疗、转基因、DNA疫苗接种、或肝细胞或非肝细胞的DNA免疫。
其中衣壳蛋白的序列已经改变以改变AAV的生物分布(例如，肝的生物分布)的非天然存在的修饰的AAV可以包括转基因(与其他病毒序列呈顺式或反式构型)。转基因可以是例如，报告基因(例如，β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光多肽(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)或荧光素酶，或包括抗原标签结构域如血凝素或Myc的融合多肽、或治疗性基因(例如，编码激素或其受体、生长因子或其受体、分化因子或其受体、免疫系统调节剂(例如细胞因子和白介素)或其受体的基因、酶、RNA(例如，抑制性RNA或催化性RNA)或靶抗原(例如，致癌抗原、自身免疫抗原))。
将至少部分地根据所治疗的特定疾病或缺陷来选择特定的转基因。仅举例而言，基因转移或基因治疗可应用于血友病、色素性视网膜炎、囊性纤维化、莱伯先天性黑内障、溶酶体贮积症、先天性代谢异常(例如氨基酸代谢先天性异常包括苯丙酮尿症、有机酸代谢的先天性错误包括丙酸血症、脂肪酸代谢的先天性错误包括中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、癌症、色盲、视椎杆营养不良、黄斑变性(例如年龄相关性黄斑变性)、脂多肽脂肪酶缺乏症、家族性高胆固醇血症、脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良症、阿尔茨海默病、帕金森病、肥胖症、炎症性肠病、糖尿病、充血性心力衰竭、高胆固醇血症、听力丧失、冠心病、家族性肾淀粉样变性、马凡氏综合征、致命性家族性失眠症、克雅氏病、镰状细胞病、亨廷顿病、额颞叶变性、乌谢尔综合征、乳糖不耐症、脂质贮积症(例如，尼曼-匹克病C型)、巴顿病、无脉络膜症、糖原贮积病II型(庞贝病)、共济失调毛细血管扩张症(路易斯-巴尔综合征)、先天性甲状腺功能减退症、严重联合免疫缺陷(SCID)、和/或肌萎缩侧索硬化症(ALS)。转基因也可以是例如用于免疫受试者(例如人、动物(例如宠物、农场动物、濒危动物))的免疫原。例如，免疫原可以从生物体(例如，病原生物体)或其免疫原性部分或其组分(例如，毒素多肽或其副产物)中获得。例如，可从中获得免疫原性多肽的病原生物包括病毒(例如，小核糖核酸病毒、肠道病毒、正粘病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒)、原核生物(例如，肺炎双球菌、葡萄球菌、李斯特菌、假单胞菌)和真核生物(例如，阿米巴病、疟疾、利什曼病、线虫病)。应当理解，本文所述的方法和由这些方法产生的组合物不受任何特定转基因的限制。
AAV的施用
可以将通常悬浮在生理相容性载体中的肝开启或肝关闭AAV载体施用于受试者(例如，人或非人哺乳动物)。合适的载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、和水一起配制。通常以足够量施用病毒载体以转导或感染期望的细胞并提供足够水平的基因转移和表达以提供没有过度副作用的治疗益处。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至器官例如肝或肺、经口、鼻内、气管内、鞘内、通过吸入、静脉内、肌内、眼内、皮下、皮内、经粘膜、或通过其他施用途径。如若期望，可以组合施用途径。
施用于受试者的病毒载体的剂量将主要取决于例如所治疗的病症以及受试者的年龄、体重和健康等因素。例如，待施用于人受试者的病毒载体的治疗有效剂量通常为在约0.1ml至约10ml的范围内的溶液，该溶液含有浓度约1×10e1至1×10e12的病毒基因组拷贝(GC)(例如，约1x 10e3至1x10e9 GC)。转基因的转导和/或表达可以在施用后的不同时间点通过DNA、RNA或蛋白质测定来监测。在一些情况下，可以监测转基因的表达水平以确定给药的频率和/或量。与所述用于治疗目的的那些相似的给药方案也可用于免疫。
如本文所用，第二“对应”受试者(例如哺乳动物受试者)是指在AAV转导中与第一受试者类型(例如，物种和品种或品系(如若适用))相同、并且与第一受试者没有实质上不同的受试者。
根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求中描述的方法和物质组合物的范围。
实施例
实施例1—Anc AAV衣壳文库
AAV衣壳文库是基于原始序列重建先前生成的(称为Anc AAV)。Anc AAV近似于AAV系统发育的推定原始状态。这项工作基于沿着大多数已知灵长类AAV的推定系统发育的重建祖先，AAV包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(但不包括AAV4或AAV5)。该过程推论出沿AAV衣壳蛋白VP1的每个位置处的20种氨基酸中的每种的概率得分(后验概率)。这些方法描述于Zinn等人(2015,Cell Reports,12(6):1056-68)和WO 2015/054653中，并用于生成称为Anc126和Anc127的两个Anc文库。
这些Anc126和Anc127变体文库是使用分子克隆和DNA合成以合并格式构建的，即特定文库的所有变体在同一容器中平行合成。该文库质粒的设计使其编码AAV载体基因组内的病毒衣壳序列。此外，这些文库的设计包括短DNA标识符或条形码，以允许使用短读长NGS平台(例如Illumina出售的那些)进行高效和高通量的下一代测序(NGS)。在本文概述的实验中，每个条形码鉴别单个AAV衣壳变体，每个衣壳变体由独特的条形码鉴别。
图1说明了针对合并的条形码文库内的AAV变体的文库构建体的最小设计。AAV文库质粒构建体的元件是AAV反向末端重复(ITR)、可以来自AAV或与AAV异源的一个或多个启动子或多聚腺苷酸化信号(polyA)、AAV衣壳变体开放阅读框(ORF)、以及衣壳的条形码标识符。应当理解，图1中所示的构建体的变体是可能的，例如存在在表达盒之外但在ITR之内的条形码、一个驱动衣壳基因的启动子和另一个具有条形码的转录本、和/或启动子和polyA信号的各种元件。
该合并的质粒文库用于通过将腺病毒辅助基因质粒构建体和含有AAV rep表达盒的质粒转染到HEK293细胞中来生成病毒载体文库。重要的是，这种转染是在低质粒浓度条件下进行的，以最大化“自我包装”的程度，“自我包装”即在衣壳内的特定衣壳的病毒基因组包装。接下来使用Illumina NGS评估病毒文库的多样性，并对条形码区域进行重点测序。该数据提供了在病毒文库制备的NGS样品中鉴别的每个条形码的计数，从而给出了条形码(以及因此的衣壳变体)多样性的相对表示。条形码的NGS测序表明，Anc126和Anc127文库在序列变异的相关位置上都具有足够的多样性和代表性。
实施例2—AAVR足迹的序列多样性概述
图2是使用MUSCLE算法(Edgar,R.C.(2004)MUSCLE:multiple sequencealignment with high accuracy and high throughput Nucleic Acids Res.32(5):1792-1797)进行的Anc126(SEQ ID NO:99)和Anc127(SEQ ID NO:100)衣壳蛋白序列相对于AAV2 VP1衣壳蛋白序列(SEQ ID NO:1)的比对，该算法使用以下参数：距离测量kmer6_6、聚类方法UPGMB、树根算法伪代码、距离加权CLUSTALW、锚间距32、开放空位罚分-1。预测位于AAVR足迹内的残基加框。此外，下表2提供了AAV2中每个预测的AAVR足迹残基和Anc80、Anc126和Anc127中的相应残基，其中点(“.”)代表保守氨基酸。观察到的替代残基的位置如表2所示，表明这些变异位点在Anc文库中是不明确的。
表2.预测参与AAVR-AAV结合的AAV VP1衣壳蛋白上的残基和位置
| 位置 | AAV2 | Anc80 | Anc126 | Anc127 |
| 263 | Q | . | . | . |
| 264 | S | . | . | . |
| 265 | G | . | . | . |
| 266 | A | A/G | . | . |
| 267 | S | . | . | . |
| 268 | N | . | . | . |
| 271 | H | T | . | . |
| 382 | N | . | . | . |
| 383 | G | . | . | . |
| 384 | S | . | . | . |
| 385 | Q | . | . | . |
| 446 | S | . | N/S | R/S |
| 471 | R | A | A/S | A/S |
| 502 | W | . | . | . |
| 503 | T | . | . | . |
| 528 | D | . | . | . |
| 529 | D | . | . | . |
| 589 | Q | A | A | A |
| 706 | K | . | . | . |
| 708 | V | T | T/A | . |
实施例3—鉴别与肝摄取相关的序列
将AAV126和AAV127变体文库通过静脉内途径以总剂量6.2e10 GC注射到C57Bl/6小鼠中，以探究文库内的变体位点对肝趋向性的影响，尤其是表2中鉴别的那些与AAVR足迹对应的位点。在注射后28天处死动物并收获组织。对组织进行DNA分离，然后使用PCR通过侧接条形码序列的引物扩增DNA样品。PCR扩增子经过第二次扩增以引入Illumina NGS索引。随后使用Illumina NGS仪器
或
对这些NGS样品进行测序。随后使用肝的条形码计数与输入病毒制剂中的条形码计数对每个变体的数据进行分析，以表示相较于输入的注射病毒，肝中条形码的富集。获得了肝组织的定量读数，其表明各个文库中每个成员的肝分布程度。
图3和图4分别代表Anc126和Anc127成员在肝中的相对表现数据，如图5A和5B所代表。此处以称为“指纹图”的图表形式提供的分析按从上到下的顺序排列说明了Anc126或Anc127载体库的所有成员的表现。此外，列代表Anc126或Anc127文库设计中的变异位点。每个位点的变异是不明确的，即存在可以在该位置编码的两个不同的残基。
图3中的数据表明对应于AAV2(SEQ ID NO:1)中的残基708的位置P9是该列表中与AAVR足迹重叠并且证明肝中白色变体(位置708处的T)相对于黑色变体(位置708处的A)富集的唯一位置。黑色变体在肝中的代表性不足(占前256个表现变体的34.8％)，这表明Anc126的位置708处的T增强了肝靶向性，而同一位置的A降低了肝靶向性。因此与T708变体相比，A708变体在肝摄取方面的效率更低。
类似地，图4中的数据表明对应于AAV2(SEQ ID NO:1)中的残基446的位置P5邻接AAVR足迹并且是该列表中显示肝中白色变体(R446)相对于黑色变体(S446)富集的两个位置之一。白色变体在肝中的代表性不足(占前512个表现变体的23.6％)，这表明Anc127的位置446处的R增强了肝靶向性，而同一位置的S降低了肝靶向性。
图5中的数据表明Anc126中的位置P8和Anc127中的位置P7都与AAV2(SEQ ID NO:1)的残基471对齐，它们仅表现出位置471处的变化的微弱影响，其中具有A471序列的病毒相较于具有S471序列的病毒略微更有可能是肝靶向的。由于白色变体(A471)和黑色变体(S471)都不能强烈决定肝富集，因此并非预测的AAVR足迹的每个残基在保守改变时都会显著调节AAVR-AAV相互作用。此外，从A到S的变化是相对温和的变化，这也可能导致不太明显的影响。
总的来说，这些数据支持AAV-AAVR结合的调节改变肝的摄取，进而改变其他组织的摄取。具体而言，该分析表明AAVR足迹内的位置446、471和708似乎参与了AAV向肝或远离肝的生物分布。
实施例4-在非人灵长类动物中使用示例性肝切换
将AAVAnc80、Anc81、Anc110和Anc126变体文库通过脑池内途径以7.75e10 GC/kg的剂量注射到两只雌性恒河猴(m.mulatta)的脑脊液中，以探究文库内变体位点对CNS、系统性逃逸和肝趋向性的影响。在注射后7天处死动物并收获组织。对组织进行DNA分离，然后使用PCR通过侧接条形码序列的引物扩增DNA样品。PCR扩增子经过第二次扩增以引入Illumina NGS索引。Illumina NGS仪器
或
对这些NGS样品进行测序。随后使用肝的条形码计数与输入病毒制剂中的条形码计数对每种变体的数据进行分析，以表示相较于输入的注射病毒，肝中条形码的富集。获得了肝组织的定量读数，其表明各个文库中每个成员的肝分布程度。
图6代表Anc80文库在肝中的相对表现数据。此处以称为“指纹图”的图表形式提供的分析按从上到下的排列顺序说明了Anc80载体库的所有成员的表现。此外，列代表Anc80文库设计中的变异位点。每个位点的变异是不明确的，即存在可以在该位置编码的两个不同的残基。
图6中的数据表明对应于AAV2(SEQ ID NO:1)中的残基266的位置P3是该列表中与AAVR足迹重叠并且证明肝中黑色变体(位置266处的G)相对于白色变体(位置266处的A)富集的唯一位置。白色变体在肝中的代表性不足(占前1024个表现变体的6.7％)，这表明Anc80位置266处的G增强了肝靶向性，而同一位置的A降低了肝靶向性。因此与G266变体相比，A266变体在肝摄取方面的效率更低。
总的来说，这些数据支持AAV-AAVR结合的调节改变肝的摄取，进而改变其他组织的摄取。具体而言，该分析表明AAVR足迹内的位置266、446、471和708似乎参与了AAV向肝或远离肝的生物分布。
其他实施方案
应当理解，虽然本文已经结合多个不同方面描述了方法和物质组合物，但是各个方面的前述描述旨在说明而非限制方法和物质组合物的范围。其他方面、优点和修饰在以下权利要求的范围内。
公开了可以用于、可以结合使用、可以用于制备、或者是公开的方法和组合物的产物的方法和组合物。这些和其他材料在本文中公开，并且应当理解为公开了这些方法和组合物的组合、子集、相互作用、组等。即，虽然可能未明确公开对这些组合物和方法的每个不同单独和集体组合和排列的具体引用，但每一个都在本文中具体地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了特定的物质组合物或特定方法，并且讨论了许多组合物或方法，则特别考虑组合物和方法的每一种组合和排列，除非有相反的特别指示。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。
Claims (52)
1.包含非天然存在的修饰的AAV VP1衣壳蛋白的病毒，其包含
当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对所述修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，与所述未修饰的AAVVP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列；
其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列在至少一个选自下组氨基酸位置的氨基酸位置处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，当使用所述具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对SEQ ID NO:1和所述未修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列时，这些氨基酸位置相对于AAV2 VP1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)进行编号。
2.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少一个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。
3.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少两个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。
4.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含氨基酸残基446R、471A和708T。
5.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少一个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。
6.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含至少两个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。
7.权利要求1的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列包含446S、471S和708A。
8.权利要求1至7中任一项的病毒，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列仅在以下氨基酸位置的一个或多个处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，并且不在所述未修饰的VP1衣壳蛋白的其他氨基酸位置处不同。
9.权利要求1至8中任一项的病毒，其中所述未修饰的VP1衣壳蛋白选自来自以下的VP1衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK-03、AAV5、AAV10、Hu68；Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI；AAV1 vp1；AAV2 vp1；AAV9vp1；Anc80；Anc126；Anc127；AAV3；AAV7；AAV8；rh10；hu37；和hu.68。
10.权利要求1至9中任一项的病毒，其中当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对所述修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列和所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，所述非天然存在的修饰的AAV VP1衣壳蛋白包含与所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
11.修饰的可组装的重组AAV(rAAV)，其包含：
VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，以及
重组核酸载体，
其中所述VPl衣壳蛋白是权利要求1至10中任一项的修饰的VPl衣壳蛋白。
12.修饰的可组装的重组AAV(rAAV)，其包含：
VP1、VP2和VP3衣壳蛋白；以及
重组核酸载体，
其中当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对修饰的AAVVP1衣壳蛋白的氨基酸序列与未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列时，至少所述VP1衣壳蛋白是包含与所述未修饰的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的非天然存在的修饰的VP1衣壳蛋白，并且
其中所述修饰的VP1衣壳蛋白与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的不同之处在于，相较于具有所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的所述未修饰的rAAV的生物分布，所述修饰的VP1衣壳蛋白包含所述修饰的rAAV施用于所述第一哺乳动物受试者后改变所述修饰的rAAV的生物分布的手段，其中所述未修饰的rAAV包含具有除所述手段外与所述修饰的rAAV的氨基酸序列相同的氨基酸序列的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白。
13.权利要求11或权利要求12的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的所述未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后实现了更高的肝细胞转导。
14.权利要求11至13中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的可表达多肽在肝细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在肝细胞中的表达。
15.权利要求11或权利要求12的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的肝细胞转导，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后实现了更低的肝细胞转导。
16.权利要求11、12或15中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于与第一哺乳动物受试者相同类型的第二哺乳动物受试者后的可表达多肽在肝细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于所述第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在肝细胞中的表达。
17.权利要求11至16中任一项的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有改变的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。
18.权利要求17的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有增加的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。
19.权利要求17的修饰的rAAV，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV与所述第二哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAV受体(AAVR)的相互作用，所述修饰的rAAV具有降低的与所述第一哺乳动物受试者的肝细胞上表达的AAVR的相互作用。
20.权利要求11至19中任一项的修饰的rAAV，其中所述第一哺乳动物受试者和所述第二哺乳动物受试者是人或非人灵长类动物(NHP)。
21.权利要求11至20中任一项的修饰的rAAV，其中所述施用包含全身施用，例如静脉内输注。
22.权利要求11至21中任一项的修饰的rAAV，其中相较于通过相同施用途径以相同量施用的包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，所述修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者例如人受试者时具有更低的肝毒性。
23.权利要求11至22中任一项的修饰的rAAV，其中所述修饰的rAAV施用于所述第一哺乳动物受试者后改变所述修饰的rAAV的生物分布的手段包括在选自下组的位置处的一个或多个氨基酸残基处的突变：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，当使用具有默认算法参数的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序比对SEQ ID NO:1和未修饰的AAV衣壳蛋白的氨基酸序列时，这些位置相对于AAV2 VP1衣壳蛋白(SEQ ID NO:1)进行编号。
24.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含至少一个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。
25.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含至少两个选自446R、471A和708T的氨基酸残基。
26.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基446R、471A和708T。
27.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含至少一个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。
28.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含至少两个选自446S、471S和708A的氨基酸残基。
29.权利要求23的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白包含氨基酸残基446S、471S和708A。
30.权利要求23至29中任一项的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列仅在以下氨基酸位置的一个或多个处不同：Q263、S264、G265、A266、S267、N268、H271、N382、G383、S384、Q385、S446、R471、W502、T503、D528、D529、Q589、K706和V708，并且不在所述未修饰的VP1衣壳蛋白的其他氨基酸位置处不同。
31.权利要求11至30中任一项的修饰的rAAV，其中所述未修饰的VP1衣壳蛋白选自来自以下的VP1衣壳蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、hu.37、LK-03、AAV5、AAV10、Hu68；Anc80；Anc81；Anc82；Anc83；Anc84；Anc94；Anc113；Anc126；Anc127；Anc80L27；Anc80L59；Anc80L60；Anc80L62；Anc80L65；Anc80L33；Anc80L36；Anc80L44；Anc80L1；Anc110；Anc80DI；AAV1 vp1；AAV2 vp1；AAV9vp1；Anc80；Anc126；Anc127；AAV3；AAV7；AAV8；rh10；hu37；和hu.68。
32.权利要求11至31中任一项的修饰的rAAV，其中所述修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列与所述未修饰的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列至少96％相同、97％相同、98％相同或99％相同。
33.药物组合物，其包含：
权利要求11至32中任一项的修饰的rAAV，以及
药学上可接受的载体。
34.核酸分子，其编码权利要求1至10中任一项的修饰的VP1衣壳蛋白，或权利要求11至32中任一项的修饰的rAAV的VP1蛋白。
35.载体，其包含权利要求34的核酸分子。
36.分离的宿主细胞，其包含权利要求34的核酸分子或权利要求35的载体。
37.相较于使用具有未修饰的VP1衣壳蛋白的rAAV的递送，改变可表达多核苷酸至哺乳动物受试者例如人患者的靶器官的递送的方法，所述方法包括向所述人患者施用治疗有效剂量的权利要求11至32中任一项的修饰的rAAV或权利要求33的药物组合物。
38.权利要求37的方法，其中所述可表达核酸是转基因。
39.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽向所述靶器官的细胞的转导，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽向所述靶器官的细胞的转导。
40.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽向所述靶器官的细胞的转导，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽向所述靶器官的细胞的转导。
41.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽向所述靶器官外细胞的转导，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽向所述靶器官外细胞的转导。
42.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽向所述靶器官外细胞的转导，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽向所述靶器官外细胞的转导。
43.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在所述靶器官的细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在所述靶器官的细胞中的表达。
44.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在所述靶器官的细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在所述靶器官的细胞中的表达。
45.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在所述靶器官细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更高的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在所述靶器官外细胞中的表达。
46.权利要求37或权利要求38的方法，其中相较于包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV施用于第二对应哺乳动物受试者后的可表达多肽在所述靶器官细胞中的表达，所述修饰的rAAV在施用于第一哺乳动物受试者后表现出更低的由所述重组核酸载体编码的所述可表达多肽在所述靶器官外细胞中的表达。
47.权利要求37至46中任一项的方法，其中所述靶器官是肝。
48.权利要求37至47中任一项的方法，其中所述靶器官外的细胞是肌肉细胞。
49.权利要求37至47中任一项的方法，其中：
所述未修饰的AAV是AAV1、AAV8或AAV9，且递送被改变至的所述靶器官是心脏；
所述未修饰的AAV是AAV2，且递送被改变至的所述靶器官是肾；
所述未修饰的AAV是AAV7、AAV8、AAV9，且递送被改变至的所述靶器官是肝；
所述未修饰的AAV是AAV4、AAV5、AAV6、AAV9，且递送被改变至的所述靶器官是肺；
所述未修饰的AAV是AAV8，且递送被改变至的所述靶器官是胰腺；
所述未修饰的AAV是AAV2、AAV5、AAV8，且递送被改变至的所述靶器官是眼的感光细胞；
所述未修饰的AAV是AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8，且递送被改变至的所述靶器官是视网膜色素上皮(RPE)；
所述未修饰的AAV是AAV1、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9，且递送被改变至的所述靶器官是骨骼肌。
50.权利要求37至48中任一项的方法，其中相较于通过相同施用途径施用的相同剂量的包含所述未修饰的VP1衣壳蛋白的未修饰的rAAV，所述修饰的rAAV在施用于哺乳动物受试者例如人受试者时具有更低的肝毒性。
51.权利要求37至50中任一项的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者或非人灵长类动物。
52.组合物，其用于权利要求37至51中任一项的方法。
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