CN114636825B - Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用及检测Golm1的试剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肺纤维化技术领域，公开了Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用及检测Golm1的试剂的应用。检测样本中的Golm1蛋白含量或表达量的试剂用于制备检验肺纤维化的试剂盒，制得的试剂盒具有取材方便、操作简单、快速准确、结果稳定等优点，能够及时、快速的诊断肺纤维化患者，对肺纤维化的快速诊断具有极大的临床应用价值。

Description

Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用及检测Golm1的 试剂的应用

技术领域

本发明涉及肺纤维化技术领域，具体涉及Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用及检测Golm1的试剂的应用。

背景技术

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是正常的肺泡组织被损坏后，经过异常修复导致的结构异常。其中，绝大部分肺纤维化病人病因不明，特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)最为常见。IPF是一种病因和发病机制尚不明确的、慢性进行性、纤维化性肺部间质性疾病，从诊断到死亡，IPF的生存期仅为3年左右，预后极差，终末期患者还需要进行肺移植治疗。IPF的临床和病理的主要特征为肺泡间隔(间质)、肺泡不同程度的纤维化和炎症。

尽管已经有很多基础研究和临床研究在开展，但仅有两种药物应用于IPF的治疗(吡非尼酮和尼达尼布)，而且这两种药物也仅仅是延缓疾病加重的速度，并不能逆转和治愈IPF。

因此，对IPF的发病机制进行深入探讨，发现新的生物标记物和治疗靶点，开发新的治疗药物和方法是亟待解决的重要问题。

目前，IPF治疗手段严重缺乏，距离个体化精准医疗这一理想目标相距甚远，因此，确定能准确反映IPF疾病机制、诊断、严重程度和预后的生物标记物显得至关重要。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶蛋白家族，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它由雷帕霉素敏感蛋白复合物(mTORC1)和雷帕霉素不敏感蛋白复合物(mTORC2)组成。

徐凯峰团队前期研究了mTOR信号通路在多种呼吸疾病中的机制，包括肺纤维化、淋巴管肌瘤病、急性肺损伤和心血管胚胎发育等，例如该团队开展了PI3K-AKT-TSC-mTOR信号通路在IPF中的研究(Gui Y S,Wang L,Tian X,et al.mTOR Overactivation andCompromised Autophagy in the Pathogenesis of Pulmonary Fibrosis[J].Plos One,2015,10(9):e0138625.)，在IPF患者以及博来霉素肺纤维化模型中发现mTOR下游效应蛋白p-S6的表达水平增加，证明了mTOR过度活化，通过肺泡上皮细胞Tsc1定向敲除模型，发现了mTOR过度活化参与了肺纤维化的发病机制，确认了mTOR过度活化是肺纤维化的潜在治疗靶点，同时也证实了mTOR抑制剂是肺纤维化的候选治疗方法。

高尔基体膜蛋白I(Golgi membrane protein 1,Golm 1)，又称II型高尔基体膜蛋白(Golgi phosphoprotein 2,Golph 2)和高尔基膜蛋白73(Glogi protein 73,Gp73)，是高尔基体膜上的II型跨膜糖蛋白，同时它也是mTORC1的下游蛋白，相对分子量为73kDa。近年来，Golm1及其相关应用研究主要集中在肝癌早期诊断领域，Golm1相关专利申请也主要集中在应用Golm1及其抗体进行肝癌检测的体外诊断试剂盒领域，而Golm1在肺纤维化中的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种肺纤维化相关的生物标记物，该生物标记物可以用于检测肺纤维化。

本发明的发明人发现差异表达Golm1在肺纤维化疾病中具有统计学意义，而且经过大量的实验(例如Golm1在IPF患者的血清中的表达、Golm1在博来霉素动物模型中的表达等)证实了Golm1是肺纤维化的重要生物标记物，是治疗肺纤维化的新治疗靶点。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供Golm1蛋白作为非疾病诊断目的的检测样本中肺纤维化生物标记物的应用。

本发明的第二方面提供用于检测样本中的Golm1蛋白含量或表达量的试剂在制备检验肺纤维化的试剂盒中的应用。

本发明的第三方面提供用于检测样本中的Golm1蛋白含量或表达量的试剂在制备肺纤维化治疗方案的试剂盒中的应用。

本发明的第四方面提供一种非疾病诊断目的的检测肺纤维化的方法，测试待检测样本中的Golm1蛋白含量；所述待检测样本为血清、细胞、组织中的至少一种。

本发明的第五方面提供Golm1蛋白作为靶点在制备诊断肺纤维化试剂中的应用。

本发明的第六方面提供Golm1蛋白抑制剂在制备治疗肺纤维化的药物中的应用，所述药物靶向Golm1蛋白。

本发明成功检测出肺纤维化样本中高表达的生物标记物Golm1，该生物标记物能应用于制备检测肺纤维化的试剂盒中，也能作为靶点用于制备诊断肺纤维化的试剂，有利于进一步阐明肺纤维化的发生机制、信号通路，在医学上具有应用前景和理论价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中Golm1在健康志愿者与IPF患者的肺组织基因中的差异表达图；

图2为本发明实施例2中健康志愿者与IPF患者肺组织进行Golm1免疫组化染色后的结果图；该图像使用倒置相差显微镜在4×放大倍数下获得；

图3为本发明实施例3中Golm1在健康志愿者与IPF患者血清中的表达水平；

图4为本发明实施例4中小鼠肺组织进行HE染色和Masson染色后的结果图；该图像使用倒置相差显微镜在10×放大倍数下获得；

图5为本发明实施例4中Western blot验证生物标记物Golm1的结果图；

图6为本发明实施例5中敲除Golm1的小鼠(Golm1缺失)和野生型小鼠(对照组)的体重增长率曲线图；

图7为本发明实施例5中敲除Golm1的小鼠(Golm1缺失)和野生型小鼠(对照组)的生存率曲线图；

图8为本发明实施例5中敲除Golm1的小鼠(Golm1缺失)和野生型小鼠(对照组)进行Masson染色后的结果图；该图像使用倒置相差显微镜在4×放大倍数下获得；

图9为本发明实施例5中Western blot验证Golm1过表达的结果图；

图10为本发明实施例6中Western blot验证MRC-5细胞株中Golm1表达水平的结果图；

图11为本发明实施例6中Western blot验证细胞系中Golm1的表达水平的结果图；(A)Western blot验证Golm1过表达细胞系中Golm1的表达水平；(B)Western blot验证Golm1敲低细胞系中Golm1的表达水平。

具体实施方式

以下通过具体的实施方式进一步说明本发明的技术方案。本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

在本文中的Fibronectin表示纤维粘连蛋白，简写为Fn1；

在本文中的p-Smad2表示磷酸化的Smad2；

在本文中的TGF-β1表示转化生长因子-β1；

在本文中的p-S6表示磷酸化核糖体蛋白S6；

在本文中的CollagenII表示II型胶原蛋白抗体，简写为Col1a2；

在本文中的CollagenI表示I型胶原蛋白抗体，简写为Col1al；

在本文中的α-SMA表示α平滑肌肌动蛋白；

在本文中的β-actin表示β-肌动蛋白；

在本文中的Vinculin表示粘着斑蛋白。

如前所述，本发明的第一方面提供了Golm1蛋白作为非疾病诊断目的的检测样本中肺纤维化生物标记物的应用。

如前所述，本发明的第二方面提供了用于检测样本中的Golm1蛋白含量或表达量的试剂在制备检验肺纤维化的试剂盒中的应用。

优选地，所述检测样本中Golm1含量或表达量的方法为酶联免疫法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western Blot)和免疫组化法中的至少一种。

为了快速检测样本中Golm1的含量或表达量，更优选地，所述检测样本中Golm1含量或表达量的方法为酶联免疫法。

优选情况下，在本发明的第一方面或第二方面中，所述样本为血清、细胞、组织中的至少一种。

需要说明的是，本发明对检测样本中Golm1含量或表达量的酶联免疫法、蛋白质印迹法、免疫组化法的具体操作没有特别的限制，本领域技术人员可根据已知技术进行选择，使之达到优异的检测结果即可。同时，本发明对肺组织进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色的方法没有特别的限定，本领域技术人员可根据已知技术手段进行。本发明的后文中示例性的给出了几种检测Golm1含量的方法以及HE染色、Masson染色的方法，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

需要说明的是，本发明为了进一步验证Golm1蛋白是肺纤维化的生物标记物，使用Western Blot测试所述待检测样本中Golm1的表达量时，也测试了p-Smad2、p-S6、Fibronectin、p-Smad2、Collagen I、Collagen II和α-SMA中的至少一种蛋白含量或表达量；所述p-Smad2、p-S6、Fibronectin、Collagen I、p-Smad2、Collagen II和α-SMA分子均是与肺纤维化相关的分子。

在本发明中，Golm1生物标记物及其Golm1检测方法通过应用抗Golm1蛋白抗体，制备成基于抗原抗体免疫结合反应的免疫学检测方法的检测试剂，能够用于肺纤维化的血清、细胞、组织样本检测。

本领域技术人员能够根据本发明公开的Golm1生物标记物，按照试剂盒制备领域内的已知技术制备出相应的检测肺纤维化的试剂盒，该试剂盒中含有能够检测样本中Golm1蛋白含量或表达量的试剂，例如检测Golm1蛋白含量的ELISA盒或试纸条。

优选地，在本发明的第一方面或第二方面中，所述肺纤维化为特发性肺纤维、继发性肺纤维化中的至少一种。

更优选地，所述肺纤维化为特发性肺纤维。

如前所述，本发明的第三方面提供了用于检测样本中的Golm1蛋白含量或表达量的试剂在制备肺纤维化治疗方案的试剂盒中的应用。

如前所述，本发明的第四方面提供了一种非疾病诊断目的的检测肺纤维化的方法，测试待检测样本中的Golm1蛋白含量；所述待检测样本为血清、细胞、组织中的至少一种。

优选地，所述肺纤维化为特发性肺纤维、继发性肺纤维化中的至少一种。

更优选地，所述肺纤维化为特发性肺纤维。

如前所述，本发明的第五方面提供了Golm1蛋白作为靶点在制备诊断肺纤维化试剂中的应用。

如前所述，本发明的第六方面提供了Golm1蛋白抑制剂在制备治疗肺纤维化的药物中的应用，所述药物靶向Golm1蛋白。

在本发明中，所述治疗肺纤维化的药物可以是用于治疗已经确诊的肺纤维化的病人的药物，也可以是用于预防肺纤维化的药物。

本发明的发明人发现了一种与肺纤维化相关的生物标记物Golm1，该生物标记物能应用于制备检测肺纤维化的试剂盒，该试剂盒具有取材方便、操作简单、快速准确、结果稳定等优点，能够及时、快速的诊断肺纤维化患者。因此，本发明对肺纤维化的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在肺纤维化上使用的快速诊断试剂盒提供了方向。

本发明的发明人为了验证Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用以及检测Golm1的试剂在试剂盒中的应用。首先通过免疫组化法检测了Golm1在IPF患者中的表达；其次测试了Golm1在IPF患者血清中的表达水平；然后通过博来霉素诱导肺纤维化动物模型实验检测Golm1的表达水平，在肺纤维化模型实验中，使用野生型小鼠C57BL/6、Golm1全身敲除纯合基因改变的小鼠(Golm1缺失)、Golm1全身过表达的基因型小鼠(Golm1 KI)通过HE染色、Masson染色、免疫组化、Western blot中的至少一种方法检测Golm1的表达水平；最后通过TGF-β1细胞模型实验研究Smad通路以及mTOR通路在肺纤维化中Golm1的表达水平。

以下将通过实例对本发明进行详细描述。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

下文中在没有特别说明的情况下，有关乙醇的百分用量均表示体积分数，且该溶剂为水。例如95％乙醇，表示体积分数为95％的乙醇与体积分数为5％的水的溶液；75％乙醇具有与此类似的解释，不同的是乙醇的体积分数、水的体积分数不同。

二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III均表示相同成分的二甲苯，三份二甲苯各自独立，编号为I、II、III；无水乙醇I、无水乙醇II均表示无水乙醇。

5％山羊血清表示用PBS(0.01mol/L pH7.2-7.4)将封闭山羊血清原液稀释20倍，配成体积分数为5％的工作液浓度。

5％CO₂表示体积分数为5％的CO₂与体积分数为95％的空气的气体环境。

室温均指温度为20±5℃。

实验材料

C57BL/6雄性小鼠购自维通利华公司；

过表达Golm1基因型小鼠(Golm1KI)、Golm1全身敲除纯合基因(Golm1缺失)的小鼠、以及与Golm1全身敲除或过表达相对应的对照组野生型小鼠(由同种背景小鼠繁殖获得)，均由北京协和医学院基础所张宏冰教授课题组提供，使小鼠Golm1基因过表达或敲除Golm1基因的方法参照(mTORC1Up-Regulates GP73 to Promote Proliferation andMigration of Hepatocellular Carcinoma Cells and Growth of Xenograft Tumors inMice[J].Gastroenterology,2015,149(3):741-752.e14.)文献进行；

人成纤维细胞株MRC-5、CCC-HPF-1均购自国家生物医学实验细胞资源库(BMCR)；

Golm1试剂盒(Human Golm1 ELISA Kit)购自北京热景生物技术有限公司；

苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，牌号G1120；

Masson三色染色液购自武汉塞维尔科技有限公司，牌号G1006；

牛血清白蛋白(BSA)购自于北京索莱宝科技有限公司，牌号A8010-5；

RIPA裂解液购于碧云天有限公司，牌号P0013B；

BCA蛋白含量测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，牌号PC0020；

封闭山羊血清(原液)购自北京索莱宝科技有限公司公司，牌号SL2-10；

DMEM培养基购自Gibco公司，牌号C11995500BT；

免疫组化二抗试剂盒购自于优宁维生物科技有限公司；

双抗购自于Gibco公司，牌号15140163；

Golm1抗体购自中国武汉的Abclonal公司，牌号A11538；

p-Smad2抗体购自中国武汉的Abclonal公司，牌号AP1007；

Fibronectin抗体购自中国武汉的Abclonal公司，牌号A16678；

p-S6抗体购自美国Cell Signaling technology公司，牌号#2211；

α-SMA抗体购自美国Cell Signaling technology公司，牌号#19245；

β-actin抗体均购自美国Cell Signaling technology公司，牌号#8457；

Vinculin抗体购自中国武汉的Abclonal公司，牌号A2752；

Collagen I抗体购自Abcam公司，牌号ab138492；

Collagen II抗体购自Abcam公司，牌号ab34712。

仪器

离心机：常温台式低速离心机，厂家Eppendorf；

倒置相差显微镜：牌号NIKON eclipse 80i光学显微镜，厂家日本尼康公司；

电泳仪：牌号DYY-6C型电泳仪，厂家北京市六一仪器厂；

双色荧光成像系统：牌号Odyssey Clx，厂家美国Licor公司。

HE染色方法：

(1)脱蜡和水化：将肺组织切片置于二甲苯中浸泡3次，每次10min以实现脱蜡，再将脱蜡后的组织切片依次置于无水乙醇、95％乙醇、75％乙醇、蒸馏水中分别浸泡3min以实现水化；

(2)染色：将水化后的切片置于苏木精染液浸染2min，用流水冲洗；再将冲洗后的切片置于酸性乙醇分化液中褪色10s，用流水冲洗；然后置于返蓝液(碳酸锂水溶液，购自北京索莱宝，G1841)中10s，流水冲洗；再将切片置于伊红染液中浸染2min，用流水冲洗；

(3)脱水和透明：将切片依次浸泡在95％乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II溶液中，每次浸泡2min；

(4)封片：用中性树胶封片，显微镜下观察。

Masson染色方法：

(1)脱蜡和水化：与HE染色步骤中的脱蜡、水化操作相同；

(2)染色：用weigert铁苏木素染色液对切片染色8min；再使用酸性乙醇分化液分化10s，用流水冲洗；再使用Masson蓝化液返蓝4min，用流水冲洗，蒸馏水洗1min；丽春红酸性品红染色液染色8s，然后配制弱酸(0.3％冰醋酸)，用弱酸分化1min，磷钼酸溶液洗2min，苯胺蓝染色液染色1min，弱酸分化1min；

(3)脱水和透明：将切片依次通过95％的乙醇脱水1次、无水乙醇脱水3次，每次8s。再将切片依次浸泡在二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中，每次1min；

(4)封片：中性树胶封片，显微镜下观察。

肺组织蛋白提取方法：

(1)称取20mg肺组织放入2mL研磨管中；

(2)每管加入2颗2mm钢珠和1颗4mm钢珠；

(3)按每20mg加入1mL的比例，向研磨管中加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液；

(4)将准备好的研磨管配平，在适配器中对称放置(适配器需先在-20℃预冷10min)；

(5)置于高速组织研磨器中裂解；研磨器的运行频率为60Hz，运行时间为60s，研磨3次；

(6)取出研磨管，低温离心机4℃、13000g离心10min；

(7)吸取上清至新的1.5mL EP管中，在98℃下蛋白变性10min；

(8)按1：1的比例用含有溴酚蓝的细胞裂解液稀释变性后的蛋白。

BCA法测定蛋白浓度：用PBS溶液将蛋白标准品稀释成0.5mg/mL，取96孔板，按照表2的加样顺序布孔加样；

表2：蛋白浓度测定标准曲线及样品加样顺序

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8
									0.5mg/mL蛋白标准品体积(μL)	0	1	2	4	8	12	16	20
去离子水体积(μL)	20	19	18	16	12	8	4	0
									待测蛋白样品体积(μL)	2	2	2	2	2	2	2	2
去离子水体积(μL)	18	18	18	18	18	18	18	18

分别为配置成浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的蛋白标准品；待测蛋白样品均加入2μL，去离子水加入18μL；加入完成后，各孔加入200μL BCA工作液(A液:B液＝50:1)；将96孔板盖好放置在37℃下培养30min，冷却到室温；酶标仪检测562nm处的吸光度，绘制标准曲线，得出方程，计算蛋白浓度。然后用PBS溶液稀释蛋白，使得每个管子里的蛋白浓度保持一致，置于-20℃冰箱保存备用。

Western blot实验方法：

(1)取4-12％Bis-Tris预制梯度胶(Invitrogen，NP0323)放到电泳槽中，添加1×MES电泳缓冲液，其中1×MES电泳缓冲液配制如下：向50mL20×MES SDS Running Buffer(Invitrogen，B0002)中加入950mL纯水(娃哈哈纯净水，中国)。

(2)用移液器吸取蛋白样品加入到胶孔中，另需加入蛋白Marker(Invitrogen，26616)做指示，在200V恒压下电泳35min。

(3)转膜：

a、裁取7cm×8cm的PVDF膜，用甲醇浸泡1min；

b、配制转膜液：10×电转液(索莱宝，D1060)+700纯水+200mL甲醇；

c、将泡沫、滤纸和膜浸泡在配制好的转膜液中；

d、按照泡沫-滤纸-膜-胶-滤纸-泡沫的顺序叠放好，轻轻赶走膜与胶之间的气泡，夹紧，放入转膜槽中；

e、倒满转膜液，在400mA下转膜1h。

(4)封闭：

a、配制牛奶封闭液：将2.5g脱脂奶粉加入到50mLTBST(索莱宝，T1081)中充分混匀，

b、将膜放入其中，摇床上室温封闭45min。

(5)切膜：按照p-Smad2、Fibronectin、p-S6、α-SMA、β-actin、Vinculin、CollagenI、Collagen II说明书上对应的分子量进行条带切割；

(6)抗原抗体反应：

a、一抗稀释液稀释一抗(p-Smad2、Golm1、Fibronectin、p-S6、α-SMA、β-actin、Vinculin、Collagen I、Collagen II)，将切好的膜放到对应的一抗孵育液中进行孵育，4℃摇床孵育过夜；

b、回收一抗，用TBST洗7min，共3次，用封闭用牛奶稀释二抗(1:3000)，孵育1.5h；

c、回收二抗，用TBST洗7min，共3次，于Odyssey Clx双色荧光成像系统中显影。

动物造模方法：

(1)将小鼠分为正常对照组、模型组，称重，用质量分数为0.6％的戊巴比妥钠麻醉小鼠固定于操作台，消毒颈部皮肤；

(2)模型组小鼠气管内滴入博来霉素，对照组小鼠气管内滴入质量分数为0.9％的生理盐水(0.9％NS)；其中博来霉素的给药浓度为2.5mg/kg，生理盐水及博来霉素的给药体积均按小鼠体重克数×2.5μL计；

(3)药物注射完成后，将小鼠提起，轻拍后背使药物分布均匀；

(4)用镊子对合小鼠的颈部皮肤，并放回笼中；

在注射博莱霉素或生理盐水后第21天处死小鼠进行分析。收集各组小鼠部分肺组织，用体积分数为10％的福尔马林固定过夜，常规石蜡包埋，制作5μm厚切片。

实施例1：与肺纤维化诊断相关的生物标记物

实验方法：

1、数据来源和数据预处理

基因表达数据从scRNA-Seq(单细胞RNA测序)研究(GSE110147)的GEO数据库中下载。使用Seurat V4包进行数据分析，对于每个数据集，将mtx文件、cellbarcode文件和基因ID文件加载到R软件中，并从metatable中获取细胞类型和群体信息，然后提取相关基因的表达，比较IPF患者组与健康对照组之间的差异。

2、差异表达分析

使用R软件中的“limma”包进行差异表达分析，差异基因的筛选标准为P值＜0.05。

分析结果：如图1所示，横坐标分别为IPF患者组与健康对照组，纵坐标表示Golm1的表达量；从图1可以看出，与健康对照组相比，在IPF患者中Golm1蛋白呈现显著上调，其中，***p<0.0001。

实施例2：Golm1蛋白在IPF患者肺组织中的表达

本实验采用免疫组化法检测3例IPF患者和3例健康志愿者的肺组织中Golm1的表达量。

免疫组化染色的实验方法具体如下：(本实验中使用到优宁维免疫组化试剂盒，其中A液为H₂O₂，B液为超级封闭液，C液为一抗放大液，D液为酶标二抗聚合物，E液(DAB稀释液)、F液(DAB底物)用于配制DAB液；)

(1)脱蜡水化：将肺组织切片在二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中分别浸泡10min以实现脱蜡，再将脱蜡后的组织切片置于无水乙醇I、无水乙醇II中浸泡5min，置于95％乙醇浸泡3min，75％乙醇浸泡2min，蒸馏水浸泡3min以实现水化。

(2)抗原修复：使用微波辐射修复的方法进行抗原修复；将切片架置于微波炉中的修复盒内，加入200mLpH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液，用微波炉中火加热5min×4次。将切片架从修复盒中取出，用自来水流水冲洗至冷却。

(3)阻断内源性过氧化物酶：每个切面用免疫组化笔圈出组织区域，每个切面滴加一滴A液至圈内，平稳放置于湿盒内孵育10min；每个切面加入一滴B液，孵育8min；然后将切片放入抗原修复盒中，摇床上使用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。

(4)一抗孵育：将山羊血清原液用PBS稀释成5％山羊血清，5％的山羊血清按照比例稀释一抗Golm1(1:400)，将100μL稀释后的一抗滴加于切片上，室温下孵育2h，摇床上使用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。

(5)一抗放大：滴加一滴C液，室温孵育10min后置于摇床上用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。

(6)二抗孵育：滴加一滴D液，室温孵育10min后置于摇床上用PBS缓冲液冲洗3次，每次5min。

(7)显色：滴加30μL现配的DAB溶液(由1mL的E液(DAB稀释液)+30μL的F(DAB底物)液配制而成)；在显微镜下观察2-5min，染色合适即可终止反应，自来水冲洗。

(8)苏木精复染：将切片架置于苏木素中浸泡2min，自来水冲洗，置于1％盐酸酒精中分化10s至切片褪色(至淡兰红色)，自来水冲洗，置于氨水溶液中返蓝，流水冲洗，显微镜下观察细胞核染色清晰。

(9)脱水透明：依次将切片置于75％乙醇、95％乙醇、无水乙醇I、无水乙醇II、二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III中脱水透明各2min，通风橱内晾干。

(10)封片：中性树胶封片，常温保存，显微镜下观察。

实验结果：

如图2所示，在图2中IPF表示特发性肺纤维化患者，Normal表示健康志愿者(作为对照)；从图2可以看出，相比于健康人，IPF患者肺组织Golm1的特异性染色(棕色)明显变深，说明IPF患者肺组织中的Golm1表达明显升高。

实施例3：Golm1蛋白在IPF患者血清中的表达

实验方法：

本研究涉及的IPF患者及健康志愿者均提供了书面知情同意书，本研究经获得北京协和医院伦理审查委员会的批准。

IPF患者筛选标准：

入选标准：年龄≥40岁，男性或女性；诊断符合中华医学会2016年“特发性肺纤维化诊断和治疗的中国专家共识”的诊断标准(中华结核和呼吸杂志2016,39:427)。

排除标准：过去3个月内有任何疾病急性加重的情况，或因其他合并症急诊、住院；因依赖吸氧、行走困难等因素难以完成评估；程度不一的任何肝病(肝硬化、肝炎、肝纤维化等)；合并中重度心、肾功能障碍；未治愈恶性肿瘤；难以完成随访。

健康志愿者筛选标准：

不处于哺乳或妊娠怀孕期；无吸烟史；无慢性呼吸及其他系统疾病；同意留取血清样本。

评估和随访方案：入选患者需要参加每6个月1次的随访评估，共随访12月。具体随访计划和评估内容见表1。

表1：IPF患者临床观察计划表

	基线评估	+6月	+12月	退出评估
					症状与体征	√	√	√	√
肺功能(容量、通气、弥散、可逆试验)	√	√	√	√
					6分钟步行距离，Borg呼吸困难量表	√	√	√	√
胸部HRCT	√		√	√
					彩超(肝、肾)	√
血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂	√	√	√	√
					乙肝两对半，AFP	√
血清Golm1*	√	√	√	√
					详细治疗(包括中医中药)	√	√	√	√

血清样品的制备：分别采集10例健康志愿者、11例符合入排标准的IPF患者的外周血3mL，于12000g离心10min，收集血清样本，保存于-80℃环境。采用ELISA检测Golm1在血清中的表达水平，Golm1均采用商业试剂盒测定，所有测试均遵照产品说明书进行。

实验结果：在11例IPF患者中，Golm1蛋白的血清浓度分别为46.68ng/mL、76.53ng/mL、50.92ng/mL、72.35ng/mL、60.40ng/mL、31.24ng/mL、44.25ng/mL、73.21ng/mL、69.00ng/mL、33.71ng/mL、55.75ng/mL；在10例健康志愿者中，Golm1蛋白的血清浓度分别为18.97ng/mL、24.66ng/mL、14.51ng/mL、36.40ng/mL、32.46ng/mL、27.88ng/mL、36.04ng/mL、47.35ng/mL、25.74ng/mL,22.72ng/mL。如图3所示，其中横坐标为健康对照、IPF患者，纵坐标表示血清样品中Golm1的表达水平；从图3可以看出，健康对照的Golm1蛋白血清平均浓度为28.7ng/mL，IPF患者的Golm1蛋白血清平均浓度为55.8ng/mL，两组具有显著统计学差异，其中***p<0.0001。

实施例4：Golm1在小鼠肺纤维化模型中的表达

本发明中Golm1在C57BL/6小鼠肺纤维化模型中的研究技术路线：对C57BL/6小鼠注射质量分数为0.9％的无菌生理盐水(0.9％NS)或者博来霉素(Bleomycin)建立小鼠肺纤维化模型，然后将注射0.9％NS或者博来霉素的小鼠的肺组织进行HE、Masson染色，以及Western blot实验，用于验证Golm1在小鼠肺纤维化模型中的表达水平。

本研究使用的动物包括：年龄6-8周，体重20-25g成年C57BL/6雄性小鼠。将16只小鼠适应性地饲养6-8周后，随机分成正常对照组(Control)、模型组(BLM)，每组8只小鼠，然后进行造模。

(1)肺纤维化小鼠模型的建立

对注射博来霉素的小鼠、注射生理盐水的小鼠的肺组织进行HE染色以及Masson染色。结果如图4所示，Control表示对照组(小鼠未注射博来霉素)，BLM表示模型组(小鼠注射博来霉素)，H&E表示采用苏木精-伊红对小鼠肺组织染色(细胞核呈蓝色，胞浆呈红色)，Masson表示采用Masson染色(胶原纤维呈蓝色)，Masson染色用于评估纤维化的胶原形成。从图4中可以看出，H&E显示，与对照组相比，注射博来霉素的模型组出现肺泡壁增厚、炎性细胞浸润、肺泡结构紊乱、弥漫性出血、胶原纤维沉积等肺实变。Masson染色的对照小鼠肺组织极少量纤维蓝染；注射博来霉素的小鼠肺组织Masson染色有连续蓝染区域。说明成功建立小鼠肺纤维化模型。

(2)Western blot验证生物标记物Golm1

通过Western blot实验检测注射博来霉素的小鼠、注射生理盐水的小鼠的肺组织中Golm1、Fn1、p-Smad2、p-S6等蛋白的表达水平，结果如图5所示，图中C-1、C-2、C-3、C-6、C-7、C-9表示对照组(6只未注射博来霉素的小鼠)，B21-1、B21-2、B21-4、B21-5、B21-6、B21-8表示模型组(6只注射博来霉素的小鼠)；从图5可以看出，与对照组(0.9％NS)相比，模型组中Golm1的条带灰度加深，同时模型组中纤维化标记物Fn1、p-Smad2、p-S6的条带灰度也加深，说明模型组小鼠中肺纤维化标记物Golm1、Fn1、p-Smad2表达水平升高，mTOR信号通路过度活化(p-S6表达水平升高)。

实施例5：Golm1敲低和过度活化的动物模型研究

本发明中Golm1敲低和过度活化的动物模型研究技术路线：首先，使小鼠Golm1基因过表达(Golm1KI)或敲除Golm1基因(Golm1缺失)，然后对野生型小鼠(对照或Golm1WT)、过表达Golm1基因小鼠以及敲除Golm1基因小鼠注射博来霉素建立小鼠肺纤维化模型，观察Golm1缺失小鼠的体重及生存率，并对敲除Golm1基因小鼠、野生型小鼠的肺组织进行Masson染色，通过Western blot实验检测过表达Golm1基因小鼠、野生型小鼠中Golm1的表达水平。

(1)敲除Golm1对小鼠体重及生存率的影响

敲除Golm1的小鼠(实验组小鼠)和野生型小鼠(作为对照)每组8只鼠，将野生型小鼠注射、敲除Golm1的小鼠注射博来霉素造模后，开始记录小鼠体重，直至造模后第21天处死小鼠。实验结果如图6所示，图6中实线表示对照组，即野生型小鼠的体重增长率曲线，虚线表示Golm1缺失，即敲除Golm1的小鼠的体重增长率曲线，其中*P＜0.05，纵坐标表示小鼠体重增长率；从图6可以看出，野生型小鼠的体重增长比敲除Golm1的小鼠更缓慢。

敲除Golm1的小鼠和野生型小鼠从小鼠气道给药造模后，开始记录死亡时间，每组8只小鼠。结果如图7所示，实线表示对照组野生型小鼠的存活率曲线，虚线表示敲除Golm1(Golm1缺失)小鼠的存活率曲线，纵坐标表示小鼠生存率；从图7可以看出，敲除Golm1的小鼠生存率明显高于野生型小鼠。

以上结果表明生物标记物Golm1对肺纤维化小鼠的体重及存活具有重要的影响。

(2)肺组织病理学观察(Masson染色)

我们对敲除Golm1的小鼠和野生型小鼠气道注射博来霉素造模后，于第21天取下肺组织，进行Masson染色，评估两组小鼠肺纤维化的程度。结果如图8所示，胶原纤维呈蓝色，左边的图表示对野生型小鼠(对照组)的肺组织进行Masson染色的结果，右边的图表示对敲除Golm1小鼠(Golm1缺失)的肺组织进行Masson染色的结果；由图8可知，与野生型小鼠相比，敲除Golm1小鼠的纤维形成较少，说明敲除Golm1小鼠肺纤维化程度更轻，Golm1的减少可以降低肺组织的纤维化。

(3)Western blot验证Golm1过表达

通过Western blot检测过表达Golm1基因小鼠(Golm1KI)、野生型小鼠(Golm1WT)的肺组织中Golm1、Fn1、p-Smad2等蛋白的表达水平，使用β-actin作为内参。结果如图9所示，Golm1WT(WT-73、WT-75、WT-77、WT-79)为对照组，Golm1KI(KI-69、KI-70、KI-71、KI-74)表示Golm1过表达的小鼠肺纤维化模型组；从图9可以看出，与对照组相比，Golm1过表达的模型组中Fn1、Golm1、p-Smad2的条带加深，说明在Golm1过表达的小鼠肺纤维化模型中，Golm1以及纤维化相关分子Fn1、p-Smad2的表达明显升高。

实施例6：通过细胞模型研究Golm1的作用机制

本发明通过细胞模型研究Golm1的作用机制，通过慢病毒感染构建稳定沉默和稳定过表达Golm1细胞系，通过WesternBlot等方法检测Golm1的表达，来判断稳转细胞系是否构建成功。

Golm1过表达和敲低细胞：通过RNAi，CRISPR-Cas9构建Golm1沉默(可用敲低替代)和敲除的稳转细胞系，并通过设计表达Golm1启动子序列的慢病毒载体构建Golm1过表达的稳转细胞系。

Golm1过表达和沉默的实验方法，参考吉凯公司提供的慢病毒转染方法，具体地为：

1)通过向GV492载体中插入Golm1启动子序列或对照空白序列，构建过表达的Golm1及其相对应的对照空载质粒；同时构建表达靶向沉默Golm1的序列的GV493载体及其对照质粒，以上Golm1过表达及其对照分名为LVGolm1、Ctrl；Golm1沉默及其对照分别命名为ShGolm1和Shc；所有这些重组质粒的DNA序列通过测序和比对序列得到证实，该重组质粒和包装病毒由吉凯基因公司提供。

其中Golm1过表达插入的序列如下：LvGolm1：5'-ATGATGGGCTTGGGAAACGGGCGTCGCAGCATGAAGTCGCCGCCCCTCGTGCTGGCCGCCCTGGTGGCCTGCATCATCGTCTTGGGCTTCAACTACTGGATTGCGAGCTCCCGGAGCGTGGACCTCCAGACACGGATCATGGAGCTGGAAGGCAGGGTCCGCAGGGCGGCTGCAGAGAGAGGCGCCGTGGAGCTGAAGAAGAACGAGTTCCAGGGAGAGCTGGAGAAGCAGCGGGAGCAGCTTGACAAAATCCAGTCCAGCCACAACTTCCAGCTGGAGAGCGTCAACAAGCTGTACCAGGACGAAAAGGCGGTTTTGGTGAATAACATCACCACAGGTGAGAGGCTCATCCGAGTGCTGCAAGACCAGTTAAAGACCCTGCAGAGGAATTACGGCAGGCTGCAGCAGGATGTCCTCCAGTTTCAGAAGAACCAGACCAACCTGGAGAGGAAGTTCTCCTACGACCTGAGCCAGTGCATCAATCAGATGAAGGAGGTGAAGGAACAGTGTGAGGAGCGAATAGAAGAGGTCACCAAAAAGGGGAATGAAGCTGTAGCTTCCAGAGACCTGAGTGAAAACAACGACCAGAGACAGCAGCTCCAAGCCCTCAGTGAGCCTCAGCCCAGGCTGCAGGCAGCAGGCCTGCCACACACAGAGGTGCCACAAGGGAAGGGAAACGTGCTTGGTAACAGCAAGTCCCAGACACCAGCCCCCAGTTCCGAAGTGGTTTTGGATTCAAAGAGACAAGTTGAGAAAGAGGAAACCAATGAGATCCAGGTGGTGAATGAGGAGCCTCAGAGGGACAGGCTGCCGCAGGAGCCAGGCCGGGAGCAGGTGGTGGAAGACAGACCTGTAGGTGGAAGAGGCTTCGGGGGAGCCGGAGAACTGGGCCAGACCCCACAGGTGCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAATCCAGAGATGGAGGGCCCTGAGCGAGACCAGCTTGTCATCCCCGACGGACAGGAGGAGGAGCAGGAAGCTGCCGGGGAAGGGAGAAACCAGCAGAAACTGAGAGGAGAAGATGACTACAACATGGATGAAAATGAAGCAGAATCTGAGACAGACAAGCAAGCAGCCCTGGCAGGGAATGACAGAAACATAGATGTTTTTAATGTTGAAGATCAGAAAAGAGACACCATAAATTTACTTGATCAGCGTGAAAAGCGGAATCATACACTC-3'；

Golm1沉默序列及其对照组插入的无义序列分别如下：

shGolm1：5'-GCCAGTGCATCAATCAGATGA-3'；

shc：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；

2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(上述载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1mL，在室温下温育15min；感染到HEK293T细胞中，混匀于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养；

3)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即为0h计)的293T细胞上清液，即为病毒液，用0.45μm滤器进行过滤获得病毒液，再用收集的病毒液感染目的细胞(待目的细胞汇合生长至50％左右)；

4)感染12h后将其换成完全培养基，感染48h后在荧光显微镜下观察，根据荧光强弱判断感染效率；

5)感染成功的细胞再加入2ug/ml的嘌呤霉素筛选，建立稳定表达细胞系。

细胞培养方法：

(1)从液氮中取出细胞，放到37℃蒸馏水快速融化细胞；

(2)然后室温下低速离心机1000g离心3min，弃掉上清液；

(3)加入1mL DMEM完全培养基(含质量分数为20％的胎牛血清和体积分数为1％的双抗)，移液器轻柔吹打混匀悬浮细胞，加入到干净的60mm培养皿中，再补加2mL DMEM完全培养基，并摇晃以混匀；

(4)将培养皿置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养，4-6h观察细胞贴壁情况。

细胞株消化、传代处理方法：

(1)贴壁细胞培养一段时间后，当细胞汇合率达80％左右，取出培养皿吸掉培养液，用1mL PBS溶液洗2次；

(2)用质量分数为0.25％的胰蛋白酶1mL消化细胞1min左右，同时在显微镜下观察消化中的细胞，当细胞边缘变亮，细胞间距离变大，细胞形态变圆，并有少量细胞飘落时，迅速吸掉胰蛋白酶；

(3)加入1mL完全培养基，反复吹打直至细胞完全被重悬；

(4)取适量细胞悬液，1：2传代到新的培养皿中，并补加完全培养基，摇晃混匀后放入培养箱中继续培养，每天观察细胞生长情况，2天更换一次培养液。

提取细胞中总蛋白的方法：

(1)细胞用胰蛋白酶消化处理后，加入1mLDMEM完全培养基，低速离心机1000rpm离心3min，弃去上清液制成细胞悬液，然后加入1mLDMEM完全培养基制成细胞悬液吹打混匀，计数，使得12孔板中的细胞密度达50％以上；

(2)6h后，待细胞贴壁后更换细胞培养液，PBS洗一遍，饥饿细胞6h；

(3)向其中加入TGF-β1，使其终浓度为2ng/mL或5ng/mL；

(4)24h后收样，加入200μL蛋白裂解液；

(5)100℃煮10min，在10000rpm下离心2min，置于-20℃环境中，待Western Blot实验使用。

(1)Western blot验证MRC-5细胞株中Golm1的表达

为了探究体外纤维化过程中Golm1的表达水平，我们通过蛋白质印迹检测了在TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞MRC5后，纤维化相关的表型分子：α-SMA、p-S6、Col1a2、Golm1、p-Smad2的变化，同时使用β-actin作为内参，结果如图10所示。在图10中，C表示未用TGF-β1刺激的正常MRC-5细胞(对照组)，2和5分别表示用2ng/mL或5ng/mL的TGF-β1刺激MRC-5细胞；从图10可以看出，使用2ng/mL的TGF-β1刺激MRC-5细胞后，p-Smad2、α-SMA的表达明显升高，同时Golm1的表达也明显升高(条带颜色比对照组深)；使用5ng/mL的TGF-β1刺激MRC-5细胞后，与对照组相比，纤维化相关的表型分子Col1a2、p-Smad2、α-SMA、p-S6的表达升高(条带颜色明显加深)，同时Golm1的表达也明显升高。说明在细胞水平，通过使用TGF-β1进行刺激后，在促进纤维化的同时，Golm1的表达也明显的升高。

(2)Western blot验证细胞系中Golm1的表达

在细胞水平对Golm1分别进行过表达和沉默，我们通过利用人的另一种人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1构建了Golm1稳定过表达以及Golm1稳定沉默的细胞系。通过Westernblot检测Col1a1、Fn1、Golm1、p-Smad2、α-SMA的表达水平，Vinculin作为内参，结果如图11所示。在图11中，左边的图A为Western blot检测Golm1过表达细胞系中Golm1的表达水平结果，Ctrl表示CCC-HPF-1细胞感染空白载体GV492病毒(对照组)，LvGolm1表示Golm1过表达的CCC-HPF-1细胞；右边的图B为Western blot检测Golm1沉默细胞系中Golm1的表达水平结果，Shc表示正常的CCC-HPF-1细胞感染空白载体GV493病毒(对照组)，ShGolm1表示感染沉默Golm1靶向序列的GV493病毒，即Golm1敲低的CCC-HPF-1细胞。

从图11的左边的A可以看出，与对照组相比，Golm1过表达的细胞系中Col1a1、Fn1、Golm1、p-Smad2、α-SMA的电泳条带颜色变深，说明Golm1过表，同时纤维化表型分子p-Smad2、Fn1、Col1a1和肌成纤维细胞标记物α-SMA表达水平明显升高；从图11的右边的B可以看出，与对照组相比，Golm1沉默的细胞系中Col1a1、Fn1、Golm1、p-Smad2的电泳条带颜色变浅，说明敲低Golm1后，纤维化相关的表型分子的表达水平也明显的降低。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> Golm1作为肺纤维化生物标记物、靶点的应用及检测Golm1的试剂的应用

<130> CSI0706BJXH

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgggct tgggaaacgg gcgtcgcagc atgaagtcgc cgcccctcgt gctggccgcc 60

ctggtggcct gcatcatcgt cttgggcttc aactactgga ttgcgagctc ccggagcgtg 120

gacctccaga cacggatcat ggagctggaa ggcagggtcc gcagggcggc tgcagagaga 180

ggcgccgtgg agctgaagaa gaacgagttc cagggagagc tggagaagca gcgggagcag 240

cttgacaaaa tccagtccag ccacaacttc cagctggaga gcgtcaacaa gctgtaccag 300

gacgaaaagg cggttttggt gaataacatc accacaggtg agaggctcat ccgagtgctg 360

caagaccagt taaagaccct gcagaggaat tacggcaggc tgcagcagga tgtcctccag 420

tttcagaaga accagaccaa cctggagagg aagttctcct acgacctgag ccagtgcatc 480

aatcagatga aggaggtgaa ggaacagtgt gaggagcgaa tagaagaggt caccaaaaag 540

gggaatgaag ctgtagcttc cagagacctg agtgaaaaca acgaccagag acagcagctc 600

caagccctca gtgagcctca gcccaggctg caggcagcag gcctgccaca cacagaggtg 660

ccacaaggga agggaaacgt gcttggtaac agcaagtccc agacaccagc ccccagttcc 720

gaagtggttt tggattcaaa gagacaagtt gagaaagagg aaaccaatga gatccaggtg 780

gtgaatgagg agcctcagag ggacaggctg ccgcaggagc caggccggga gcaggtggtg 840

gaagacagac ctgtaggtgg aagaggcttc gggggagccg gagaactggg ccagacccca 900

caggtgcagg ctgccctgtc agtgagccag gaaaatccag agatggaggg ccctgagcga 960

gaccagcttg tcatccccga cggacaggag gaggagcagg aagctgccgg ggaagggaga 1020

aaccagcaga aactgagagg agaagatgac tacaacatgg atgaaaatga agcagaatct 1080

gagacagaca agcaagcagc cctggcaggg aatgacagaa acatagatgt ttttaatgtt 1140

gaagatcaga aaagagacac cataaattta cttgatcagc gtgaaaagcg gaatcataca 1200

ctc 1203

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccagtgcat caatcagatg a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims (4)

1.用于检测样本中的Golm1蛋白含量的试剂在制备检验肺纤维化的试剂盒中的应用；所述肺纤维化为特发性肺纤维、继发性肺纤维化中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述检测样本中Golm1蛋白含量或表达量的方法为酶联免疫法、蛋白质印迹法和免疫组化法中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述样本为血清、细胞、组织中的至少一种。

4.Golm1蛋白作为靶点在制备诊断肺纤维化试剂中的应用；所述肺纤维化为特发性肺纤维、继发性肺纤维化中的至少一种。

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