CN114588256A

CN114588256A - 一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的开发与应用

Info

Publication number: CN114588256A
Application number: CN202210242795.1A
Authority: CN
Inventors: 牛旻; 杨瑞华; 贾宾; 李婧
Original assignee: Muyuan Foods Co Ltd
Current assignee: Muyuan Foods Co Ltd
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2022-06-07

Abstract

本发明涉及疫苗开发领域，尤其涉及一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的开发与应用。本发明通过蛋白片段的优化，实现了ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素和外膜蛋白OMP蛋白的高效可溶表达。进一步地，ApxI、ApxII截短体蛋白作用于VERO细胞展示出较强的生物活性。与包涵体纯化方式相比，本发明筛选的截短体蛋白溶解性好、纯化方式简单从而生物活性更强。随后将纯化的蛋白与Gel/206佐剂混合制备成疫苗，免疫6周龄BALB/C小鼠，使用APP7型攻毒也展现出良好的攻毒保护效果。本发明提供了可溶、易制备、活性好的猪传染性胸膜肺炎的抗原片段，使得该细菌的亚单位疫苗制备更简单高效。

Description

一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的开发与应用

技术领域

本发明涉及疫苗开发领域，尤其涉及一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的开发与应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)是一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征，急性型呈现高死亡率。猪传染性胸膜肺炎是一种世界性疾病，广泛分布于英国、德国、瑞士、丹麦、澳大利亚、加拿大、墨西哥、阿根廷、瑞典、波兰、日本、美国、中国等全世界所有养猪国家，给集约化养猪业造成巨大的经济损失，被国际公认为危害现代养猪业的重要疫病之一。猪传染性胸膜肺炎病原为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的。APP为革兰氏阴性的小球杆状菌或纤细的小杆菌。根据细菌荚膜多糖和细菌脂多糖对血清的反应，该菌分为APP1～APP15型，其中APP1分为APP1a和APP1b亚型,APP5分为APP5a和APP5b亚型。APP有很多毒力因子可以引起猪致病，包括荚膜多糖、蛋白酶、Apx毒素和外膜蛋白(Outermemberanc protein，OMP)等，其中Apx毒素和外膜蛋白OMP在胸膜肺炎发生的过程中扮演着最为重要的角色，也是主要的免疫原物质。

Apx毒素是分泌型蛋白酶，是APP最主要的毒力因子，在APP的15个血清型中共发现四种不同的分Apx毒素，包括：分子量为105～110KD的Ap xI、分子量为103～105KD的ApxII、子量为120KD的ApxIII和子量为220KD的ApxⅣ。ApxⅣ在所有血清型的APP中都存在，其他3种毒素只被某些血清型的APP合成并分泌。Apx毒素对肺泡巨噬细胞、中性细胞和红细胞具有细胞毒作用，使机体的免疫系统遭到破坏，从而使APP在机体内增殖和致病。Apx是APP的毒力因子，也是重要的保护性抗原。OMP是APP的另一个重要毒力因子，针对OMP的抗体具有调理活性，所以OMP也是APP的一种重要保护性抗原。

为防治猪传染性胸膜肺炎，行业内流行用APP菌体制备疫苗：先规模扩大培养APP，然后用灭活剂灭活，再添加免疫佐剂制备得APP疫苗。这种疫苗总蛋白含量大，存在免疫应激的问题，而且该疫苗的使用会导致过多无效蛋白的引入，造成免疫效果不佳。

另一种方式是表达APP中重要的抗原部分并纯化，然后用做APP疫苗。目前对猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗相关的研究多基于APP最主要的毒力因子：Apx毒素和OMP蛋白。这种亚单位疫苗避免了导入过多无效蛋白的问题，但用工具菌表达的APP抗原蛋白主要以包涵体形式存在，经过包涵体纯化和复性的蛋白的生物学活性比较差，难以在生产中使用。综上，基因工程亚单位疫苗的开发中主要问题为：目的蛋白的表达不可溶限制了基因工程疫苗的制备和应用，包涵体蛋白不具备生物活性难以发挥免疫效应，所以目前市面上很少有此类疫苗。

因此，为了解决包涵体蛋白活性低、制备工艺复杂的问题，有必要解决APP疫苗中重组蛋白的可溶性问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供猪传染性胸膜肺炎的可溶性抗原蛋白，本发明通过优化ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素的片段，从而获得了溶解性好、易制备且生物活性高的截短体蛋白，并基于此制备了高效的猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗。

本发明提供了ApxI截短体蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了ApxII截短体蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明提供了编码所述截短体蛋白的核酸。

本发明提供了一种载体，其特征在于，包括骨架载体和编码所述截短体蛋白的核酸。

一些实施例中，骨架载体为pET-28s、pET32a、pETSUMO、phTO-BS或PGE-6p-1载体。

本发明还提供了转化了所述载体的重组宿主。

一些实施例中，宿主为大肠杆菌BL21。

本发明提供了所述截短体蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养并诱导所述的重组宿主表达蛋白，所述诱导的表达温度为16～30℃。

一些实施例中，所述培养至菌体OD₆₀₀数值在0.6～0.7时开始诱导，所述诱导的试剂为IPTG，诱导的温度为25℃，诱导的时间为12～16h。

本发明提供了一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其包括：ApxI截短体蛋白、ApxII截短体蛋白和OMP蛋白。

其中，所述ApxI截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，所述ApxII截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述OMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述的疫苗还包括ApxIII截短体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的疫苗中：佐剂为206佐剂或Gel佐剂，佐剂体积占比为50％；各蛋白的浓度为25μg/mL。

本发明还提供了所述的截短体蛋白、截短体蛋白制备方法、核酸、载体、重组宿主和/或疫苗在制备防治猪传染性胸膜肺炎的药物中的应用。

本发明通过蛋白片段的优化，实现了ApxI、ApxII、ApxIII三种毒素和外膜蛋白OMP蛋白的高效可溶表达。进一步地，ApxI、ApxII截短体蛋白作用于VERO细胞展示出较强的生物活性。与包涵体纯化方式相比，本发明筛选的截短体蛋白溶解性好、纯化方式简单从而生物活性更强。随后将纯化的蛋白与Gel/206佐剂混合制备成疫苗，免疫6周龄BALB/C小鼠，使用APP7型攻毒也展现出良好的攻毒保护效果。本发明提供了可溶、易制备、活性好的猪传染性胸膜肺炎的抗原片段，使得该细菌的亚单位疫苗制备更简单高效。

附图说明

图1示pET-28s载体模式图；

图2示pET-28s-APP-130种毒素片段构建模式图；

图3示ApxI、ApxII、ApxIII的不可溶性片段表达胶图；

图4示ApxI、ApxII、ApxIII的可溶性片段和OMP蛋白的纯化胶图；

图5示细胞活性实验图；

图6示免疫攻毒实验小鼠解剖图。

具体实施方式

本发明提供了一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1表达载体构建

构建ApxI、ApxII、ApxIII和OMP蛋白的表达载体。ApxI、ApxII、Apx III全长蛋白表达不可溶，故需要从全蛋白序列上做截短及修饰，提高蛋白的可溶性。片段的截取主要有三点依据：1)密码子偏好性上，尽量保证N端密码子GC含量在40％左右。2)保证表达起始段，也就是N端氨基酸亲水性要高才能保证后续蛋白可溶形式。3)在结构上要保证截短的片段具备相对独立的结构，片段与片段之间无明显骨架连接等。

按照以上原则在ApxI、ApxII、ApxIII全蛋白序列上共截取了130个不同的片段，并且与pET28S、pET32a、pETSUMO、phTO-BS和PGE-6p-1载体连接，构建APX(X取1～130)的表达载体。具体操作步骤如下：

1、猪场病料基因组提取后，使用特异性引物PCR鉴定APP毒素阳性后，送测序获得序列。

2、获得APP菌毒素全序列之后，根据氨基酸兼并偏好，优化了分离的原始序列以便于在mRNA水平促使蛋白的更好翻译与表达。

3、根据ApxI、ApxII和ApxIII蛋白的全序列做不同片段的截短，分别引物进行扩增，共计130种片段。

4、通过BamHI和XhoI两种限制性内切酶分别对上述130种片段进行酶切后经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段。

5、PET28S、pET32a、pETSUMO、phTO-BS和PGE-6p-1质粒提取制备后，同样使用BamHI和XhoI两种限制性内切酶进行酶切，后经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段回收。

6、将上述130种片段分别与载体pET-28S进行连接。

7、然后用T4连接酶在16℃条件下连接12-16h。

8、次日将连接产物转化BL21感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选。

9、14～16h后用特异性引物进行鉴定。

10、引物鉴定正确的单克隆菌株送测序公司测序。

11、将鉴定正确的质粒命名并保存。命名的方式为：根据连接载体和连接片段的名称分别命名为pET28S-APPX、pET32a-APPX、pETSUMO-APPX、phTO-BS-APPX和PGE-6p-1-APPX(其中，X取1～130，对应实施例1步骤3所述的片段)。

实施例2诱导表达

将实施例1中得到的截短体蛋白的表达载体分别转化到大肠杆菌表达系统，然后诱导表达并检测截短体蛋白是否表达。具体的操作步骤如下：

①将实施例1中得到的所有质粒分别转化表达菌株BL21(DE3)的感受态细胞。首先是-80℃中取出保存的感受态细胞，在其刚刚融化时加入的PET28S-APX质粒轻柔的在感受态细胞中吹打均匀，然后完全置于冰中25～30min。提前开启金属孵育器或者水浴锅，温度设置为42℃，冰浴完成后立即放在42℃热激处理90s，保证PET28S-APX质粒的进入细胞内，随后再次放入冰中，使感受态细胞膜闭合3～5min。在超净工作台中加入600uL无抗培养基在37℃、220rpm转速下培养1小时，使阳性转化子长出第一代后，再取100ul均匀涂布在对应抗性的固体培养基上，然后在37℃生化培养箱中过夜约12-15h。

②次日挑取阳性单克隆并扩大培养，保存甘油菌或用于进一步扩大诱导表达。诱导表达过程中实时监测OD₆₀₀的数值，当数值在0.6～0.7时立即冷却，然后向培养基中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，然后分别在25℃，180rp m培养条件下诱导12-16h，同时设置未加IPTG的培养组作为阴性对照。

③当OD₆₀₀数值在0.6～0.8时，取1ml阴性对照菌液作为未诱导样品，另取诱导后的菌液1ml作为诱导后样品。8000g离心3min，弃上清，用OD₆₀₀值×100倍(体积，mL)PBS重悬菌体，吸取30μL重悬菌体于新的离心管中，加入等体积的2×蛋白上样缓冲液(loadingbuffer)混匀，99℃金属浴10min充分变性后，瞬间离心，随后做SDS-PAGE检测。

实施例3菌体处理

将实施例2中筛选得到的截短体蛋白的诱导菌液做进一步处理，检测截短体蛋白是否表达在包涵体里，或为可溶表达。具体操作步骤如下：

①将50ml菌液于8000g，离心20min，弃上清，菌体用重悬液(2mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)清洗三次，8000g离心20min，弃上清，沉淀用10ml裂解液(20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，2％Triton X-100，0.1mM PMSF，pH＝7.4)重悬并进行超声破碎(超声破碎前可选择性加入溶菌酶或者反复冻融处理)。

②为防止破坏蛋白，整个超声过程中重悬液必须放置在冰水混合物中。超声破碎仪的参数设置为:on 5s；off 7s；total 5～10min；功率35％×100W。

③破碎结束后，于12000g，4℃离心30min。取上清液30μL加入30μL的2×loadingbuffer进行制样(99℃金属浴10min)，沉淀用10ml的裂解液重悬(此处可取30μL混合液加30μL的2×loading buffer进行制样，99℃金属浴10min)。做SDS-PAGE检测。

④SDS-PAGE检测

将上面四次制得的样品，各取10μL蛋白点样。在进行蛋白质电泳时，样品首先在5％的浓缩胶中于80V电压下电泳进行浓缩，然后在10％的分离胶中于120V电压下进行蛋白分离。跑胶结束后，放入考马斯亮蓝染色液中进行染色2h，染色结束后，将考马斯亮蓝染色液进行回收，然后将蛋白凝胶放入脱色液中进行脱色，及时更换脱色液直至洗去底色。通过Image J软件对条带进行灰度扫描，计算目的蛋白的比重和目的蛋白的可溶性表达水平等数据。

已有研究结果表明ApxI、ApxI、ApxIII蛋白及其截短体常以包涵体形式表达，它们的可溶性表达一直是有待解决的问题。本发明将实施例1中设计的130种截短体用不同的载体表达，结果表明密码子优化后，大部分截短体能在大肠杆菌表达系统中表达，少部分不能表达。在表达的截短体中，90％以上为包涵体形式表达，这与已有研究结果一致。

展示部分截短体在不同载体中的表达情况如表1，其中，密码子未优化一列代表密码子未优化时该片段的表达情况，其它列代表密码子优化的该片段连接在相应载体上的表达情况。从表1中也可以看到，ApxI、ApxI、ApxIII蛋白的截短体主要以包涵体的形式表达，少部分以可溶形式表达。

另外展示几个典型截短体的表达纯化的SDS-PAGE蛋白胶图如图3，图中，英文字母是所示范的截短体的编号，阿拉伯数字是泳道编号。“全菌”为诱导表达后的菌株样品、“上清”为破碎的菌体离心后的上清样品，“沉淀”为破碎的菌体离心后的沉淀样品，“洗脱”为所述上清液经过NTA吸附后洗脱的样品。从图3可见，截短体a、b、c、e、h、i、j、k、l、p和q基本全表达在包涵体里，沉淀里有大量的目的条带，上清或洗脱样品中基本没有目的条带。其它未展示的表达在包涵体里的截短体的表达情况与这些相似。截短体m和r的上清和沉淀里都有相当的目的条带，这些截短体部分表达在上清里，部分表达在包涵体里，其它未展示的“部分表达在包涵体”的截短体的的蛋白胶图与这些相似。而截短体d、n和o的沉淀里基本上只有极少量的目的条带，大部分都表达在上清里，这些可作为备选截短体用于后续步骤，其它未展示的“表达在上清、可溶表达”的截短体的蛋白胶图与这些相似。

综上，在实施例1中设计的130种截短体中，只有极少部分截短体以可溶形式表达。本发明在可溶表达的片段中，选取表达量较高且包含较多抗原区段(软件预测)的截短体ApxI_691-1031、ApxII_22-907、ApxIII_438-737作为备选抗原，以进行进一步的分离纯化及活性测试。

表1截短体蛋白诱导表达情况表

实施例4蛋白纯化

进一步纯化OMP蛋白和实施例3筛选得到的ApxI_691-1031、ApxII_22-907、ApxIII_438-737可溶性截短体蛋白。具体步骤如下：

采用亲和层析法(Ni-NTA重力柱)进行蛋白纯化，纯化步骤(全程低温处理)如下：

①配液：

平衡液：20mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L Nacl，pH＝7.4；

洗杂液：20mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L Nacl，20mM咪唑，pH＝7.4；

洗脱液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，500mM咪唑，pH＝7.4。

②用5～10CV纯水冲洗柱子；

③用5～10CV平衡液平衡柱子；

④加入蛋白样品(不超过10CV)，收集流穿液；

⑤用5～10CV平衡液平衡柱子；

⑥用5～10CV洗杂液冲洗柱子(此步需要摸索洗杂浓度)；

⑦用0.5CV洗脱液冲洗柱子，收集洗脱液；

⑧Ni柱使用完后用5～10CV洗脱液冲洗柱子，再用5～10CV纯水冲洗柱子，最后用20％乙醇进行封存，4℃保存。

过程中样品经SDS-PAGE分析纯化效果。如图1所示：蛋白可以经Ni-NAT纯化获得，回收效率可已经条件优化后进一步提高。

⑨根据使用情况进行镍柱的脱镍再生：

a.用5～10CV纯水冲洗柱子。

b.用5～10CV 0.02M Tris-HCl、0.1M EDTA、pH＝7.4冲洗，再用5～10CV纯水冲洗柱子。

c.用5～10CV 1.0M NaOH冲洗，静置10小时后再用纯化水冲洗至中性。

d.用5～10CV 0.1M NiSO4冲洗，静置0.5小时后再用纯化水冲洗，直至流下来的液体里面不含有硫酸镍(绿色液体)为止。

e.用5～10CV的20％乙醇冲洗后保存。

纯化ApxI_691-1031、ApxII_22-907、ApxIII_438-737和OMP蛋白的结果如图4所示。最左边的图是纯化后的ApxI_691-1031蛋白的四个样品，其具有良好的可溶性和较高的纯度。中间的图是ApxII_22-907和ApxIII_438-737的纯化蛋白胶图，泳道从左依次是：ApxII_22-907诱导后样品、破碎后上清、纯化的蛋白样品；ApxIII_438-737诱导后样品、破碎后上清、纯化的蛋白样品。可见经过NTA吸附后，可以纯化得到较高纯度的ApxII_22-907和ApxIII_438-737蛋白。最右边的图是OMP蛋白的纯化蛋白胶图，从左到右依次是未诱导的样品、诱导表达后的样品、破碎后上清、破碎后的沉淀、NTA吸附流穿后的样品、洗脱的蛋白样品。可见洗脱后可得到高纯度可溶的OMP蛋白。

胸膜炎放线杆菌的毒素1、毒素2、毒素3、外膜蛋白OMP可以在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，经过变性、复性处理后再经NTA纯化，可以获得具有一定活性的蛋白。本发明通过筛选130种蛋白片段，获得了可溶表达ApxI、ApxII和ApxIII片段，进一步纯化后获得了纯度较高的可溶蛋白。这些高纯度的可溶蛋白可用于进一步的活性验证和动物实验验证。

实施例5蛋白活性验证

OMP蛋白是菌体蛋白，不具备细胞毒素功能。ApxI、ApxII、ApxIII是细菌毒素，其免疫原性来源于动物注射毒素，耐受后产生的针对毒素的高抗体保护动物机体；故初步进行蛋白功能验证，以判定蛋白是否具备生物活性，如果蛋白自身具备对应功能，就可以初步判定纯化的蛋白具有正常的活性。

分别取纯化的ApxI_691-1031、ApxII_22-907、ApxIII_438-737蛋白定量，经0.22um滤膜过滤除菌后，按照图5所展示的体积1uL、5uL、10uL、20uL、50uL、100uL，分别加入生长状态良好的VERO细胞中(6孔板中、2mL细胞培养基中培养至汇合度60％-70％)，混匀后在37度培养箱中培养，每隔6h观察一次，记录细胞状态。

结果显示，ApxIII_438-737蛋白具有很弱的细胞毒素作用，通过细胞水平没有得到明显肉眼可见的结果。而毒素片段ApxI_691-1031、ApxII_22-907具备较高的生物学活性，(如图5所示)可以推测这俩个蛋白片段具有比较完整的蛋白功能，有潜力具有比较好的免疫原性。

实施例6动物免疫攻毒保护实验

如表2所示，混合蛋白和佐剂，制备不同组分的疫苗A、B、C、D，并用其进行小鼠免疫攻毒保护实验，以评估自制APP疫苗对小鼠的攻毒保护效果。具体操作步骤如下：

将实施例4纯化获得的ApxI_691-1031、ApxII_22-907、ApxIII_438-737和OMP蛋白分别添加50％(V/V)的206佐剂或者15％(V/V)的Gel佐剂，充分乳化30min。保证乳液均匀不分层后，分别用自制苗A、B、C、D免疫6周龄的BALB/C小鼠，首次免疫后3周进行2次加强免疫。免疫后15天，使用APP7型毒株进行攻毒以验证保护率，在攻毒10天后对所有小鼠进行剖检，观察小鼠内脏病变，结果如图6所示，将结果统计于表2。

如表2所示，攻毒保护实验结果显示：A\B\C组的保护率均为100％，D组的保护率为66.67％；商品苗对照保护效果较差仅为33.33％，其次是空白对照。自制的APP疫苗在APP7型攻毒后，展示出良好的免疫保护效果。

表2 APP疫苗免疫/攻毒保护实验表

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 牧原食品股份有限公司

<120> 一种猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的开发与应用

<130> MP21038408

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 333

<212> PRT

<213> Susscrofa domestica

<400> 1

Met Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly Asn

1 5 10 15

Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly

20 25 30

Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile Phe

35 40 45

His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His Asp

50 55 60

Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp Gly

65 70 75 80

Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly Gly

85 90 95

Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu Gln

100 105 110

Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn Asp

115 120 125

Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val Gly

130 135 140

Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr Ser

145 150 155 160

Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp Asp

165 170 175

Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile Arg

180 185 190

Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu Tyr

195 200 205

Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp Phe

210 215 220

Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val Asp

225 230 235 240

Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Ala

245 250 255

Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu Tyr

260 265 270

Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile Glu

275 280 285

Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Phe Thr Gly Asp His Gly Lys Val

290 295 300

Ser Val Gly Ser Gly Gly Pro Leu Val Tyr Asn Asn Ser Ala Asn Asn

305 310 315 320

Val Ala Asn Ser Leu Ser Tyr Ser Leu Ala Gln Ala Ala

325 330

<210> 2

<211> 408

<212> PRT

<213> Susscrofa domestica

<400> 2

Met Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly Lys Asn Ser Tyr Ile Thr Lys Leu

1 5 10 15

His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Gly Asp Ala Ser

20 25 30

Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile Ala Val Lys Phe

35 40 45

Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr Lys Ile Ile Ala

50 55 60

Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly Ser Ser Thr Thr

65 70 75 80

Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His Tyr Ser Arg Gly

85 90 95

Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu Thr Glu Lys Gly

100 105 110

Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys Ala Leu His Glu

115 120 125

Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Asn Arg Glu Glu Lys Ile

130 135 140

Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly Tyr Thr Val Thr

145 150 155 160

Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser Gln Phe Asn Asp

165 170 175

Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His Gly Gly Asn Gly

180 185 190

Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His Leu Phe Gly Gly

195 200 205

Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn Asn Phe Leu Val

210 215 220

Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys Asp Asn Asp Ile

225 230 235 240

Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile Thr Asp Ser Gly

245 250 255

Gly Gln Asp Lys Leu Ala Phe Ser Asp Val Asn Leu Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Phe Lys Lys Val Asp Ser Ser Leu Glu Ile Ile Asn Gln Lys Gly Glu

275 280 285

Lys Val Arg Ile Gly Asn Trp Phe Leu Glu Asp Asp Leu Ala Ser Thr

290 295 300

Val Ala Asn Tyr Lys Ala Thr Asn Asp Arg Lys Ile Glu Glu Ile Ile

305 310 315 320

Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val Asp Lys Leu Ile

325 330 335

Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu Ser Lys Val Val

340 345 350

Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val Ser Asn Ser Leu

355 360 365

Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser Ser Ser Asp Phe

370 375 380

Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile Asp Val Ser Asn

385 390 395 400

Asn Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ala

405

<210> 3

<211> 610

<212> PRT

<213> Susscrofa domestica

<400> 3

Met Lys Tyr Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His

1 5 10 15

Lys Ala Phe Leu Glu Asp Ser Phe Ser Leu Leu Ser Ser Phe Asn Lys

20 25 30

Gln Tyr Glu Thr Glu Arg Ala Val Leu Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp

35 40 45

Glu Tyr Ile Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Gly Lys Gly Asp Lys Leu

50 55 60

Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp Tyr Phe Gln Glu Gly Lys Leu Leu

65 70 75 80

Glu Lys Lys Pro Asp Asp Phe Ser Lys Val Val Phe Asp Pro Thr Lys

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Gly Glu Ile Asp Ile Ser Asn Ser Gln Thr Ser Thr Leu Leu Lys Phe

100 105 110

Val Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly Thr Glu Ser Arg Glu Arg Thr Gln

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Thr Gly Lys Tyr Glu Tyr Ile Thr Lys Leu Val Val Lys Gly Lys Asp

130 135 140

Lys Trp Val Val Asn Gly Val Lys Asp Lys Gly Ala Val Tyr Asp Tyr

145 150 155 160

Thr Asn Leu Ile Gln His Ala His Ile Ser Ser Ser Val Ala Arg Gly

165 170 175

Glu Glu Tyr Arg Glu Val Arg Leu Val Ser His Leu Gly Asn Gly Asn

180 185 190

Asp Lys Val Phe Leu Ala Ala Gly Ser Ala Glu Ile His Ala Gly Glu

195 200 205

Gly His Asp Val Val Tyr Tyr Asp Lys Thr Asp Thr Gly Leu Leu Val

210 215 220

Ile Asp Gly Thr Lys Ala Thr Glu Gln Gly Arg Tyr Ser Val Thr Arg

225 230 235 240

Glu Leu Ser Gly Ala Thr Lys Ile Leu Arg Glu Val Ile Lys Asn Gln

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Lys Ser Ala Val Gly Lys Arg Glu Glu Thr Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr

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Glu Leu Thr Gln Ser Gly Asn Ser Asn Leu Lys Ala His Asp Glu Leu

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His Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser Asn Gln Arg Asp Glu Phe Lys

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Gly Ser Lys Phe Arg Asp Ile Phe His Gly Ala Asp Gly Asp Asp Leu

305 310 315 320

Leu Asn Gly Asn Asp Gly Asp Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Lys Gly Asn

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Asp Glu Leu Arg Gly Asp Asn Gly Asn Asp Gln Leu Tyr Gly Gly Glu

340 345 350

Gly Asp Asp Lys Leu Leu Gly Gly Asn Gly Asn Asn Tyr Leu Ser Gly

355 360 365

Gly Asp Gly Asn Asp Glu Leu Gln Val Leu Gly Asn Gly Phe Asn Val

370 375 380

Leu Arg Gly Gly Lys Gly Asp Asp Lys Leu Tyr Gly Ser Ser Gly Ser

385 390 395 400

Asp Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Asp

405 410 415

Gly Ser Asp Phe Tyr Val Tyr Arg Ser Thr Ser Gly Asn His Thr Ile

420 425 430

Tyr Asp Gln Gly Lys Ala Ser Asp Ser Asp Lys Leu Tyr Leu Ser Asp

435 440 445

Leu Ser Phe Asp Asn Ile Leu Val Lys Arg Val Asn Asp Asn Leu Glu

450 455 460

Phe Arg Ser Asn Asn Asn Ser Asn Ser Gly Val Leu Thr Ile Lys Asp

465 470 475 480

Trp Phe Lys Gly Gly Asn Ser Tyr Asn His Lys Ile Glu Gln Ile Val

485 490 495

Asp Lys Asn Gly Arg Lys Leu Thr Ala Gly Asn Leu Gly Asn Asn Phe

500 505 510

His Asp Thr Gln Gln Ala Ser Ser Leu Leu Lys Asn Val Thr Gln Glu

515 520 525

Gln Asn Glu Ser Asn Leu Ser Ser Leu Lys Thr Glu Leu Gly Lys Ile

530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610

<210> 4

<211> 392

<212> PRT

<213> Susscrofa domestica

<400> 4

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1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Phe Met Asn Ile Ala Thr

20 25 30

Lys Leu Ile Ala Gly Leu Val Ala Gly Leu Val Leu Thr Ala Cys Ser

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Ser Pro Lys Pro Asn Ser Glu Ser Thr

50 55 60

Pro Lys Val Asp Met Ser Ala Pro Lys Ala Glu Gln Pro Lys Lys Glu

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Pro Leu Met Met Glu Asn Pro Lys Val Glu Lys Gln Lys Glu Asn

100 105 110

Asn Leu Gln Glu Lys Ser Pro Lys Ala Asp Glu Pro Gln Val Met Asp

115 120 125

Pro Lys Leu Gly Ala Pro Gln Lys Asp Asp Gln Lys Leu Glu Glu Pro

130 135 140

Lys Asn Lys Ser Asn Ala Glu Ile Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Asp

145 150 155 160

Ile Lys Thr Gly Ile Ile Thr Arg Ser Asp Val Val Leu Asn Leu Thr

165 170 175

Leu Asp Glu Gln Glu Asn Ile Gln Ile Arg Leu Ser Glu Ser Asp Ile

180 185 190

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195 200 205

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260 265 270

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275 280 285

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370 375 380

Ala Thr Thr Lys Glu Asp Lys Lys

385 390

Claims

1.一种猪传染性胸膜肺炎疫苗，其特征在于，包括：ApxI截短体蛋白、ApxII截短体蛋白和OMP蛋白；

其中，所述ApxI截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，

所述ApxII截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述OMP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，还包括ApxIII截短体蛋白，所述ApxIII截短体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，包括：

所述疫苗中佐剂为206佐剂或Gel佐剂；

所述疫苗中各蛋白的浓度为25μg/mL。

5.ApxI截短体蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

6.ApxII截短体蛋白，其特征在于，具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

7.编码权利要求5或6所述截短体蛋白的核酸。

8.一种载体，其特征在于，包括骨架载体和权利要求7所述的核酸。

9.转化了权利要求8所述载体的重组宿主。

10.权利要求6或7所述截短体蛋白的制备方法，其特征在于，包括：培养并诱导权利要求9所述的重组宿主表达蛋白，所述诱导的表达温度为16～30℃。