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CN114561276A - 集成流体装置及相关方法 - Google Patents

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CN114561276A
CN114561276A CN202210181244.9A CN202210181244A CN114561276A CN 114561276 A CN114561276 A CN 114561276A CN 202210181244 A CN202210181244 A CN 202210181244A CN 114561276 A CN114561276 A CN 114561276A
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fluid
equal
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fluidic
channel
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CN202210181244.9A
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艾尔隆·辛格尔
兰吉特·普拉卡什
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Helixbind Inc
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Abstract

本申请涉及集成流体装置及相关方法。总体上提供了流体装置及相关方法。本文所述的流体装置可以用于例如诊断目的(例如，检测患者样品中一种或更多种引起疾病的细菌的存在)。与用于诊断目的的某些现有流体装置不同，本文所述的流体装置和方法可以用于基本上同时(例如，并行地)检测患者样品中多种引起疾病的细菌的存在。在一些实施方案中，与某些现有的流体检测(例如，微流体)装置和方法相比，本文所述的流体装置和方法提供相对大流体样品(例如，0.5mL至约5mL)中微生物的高度灵敏检测。在一个示例性实施方案中，通过在灵敏检测微生物感染之前选择性地去除人核酸来提高患者样品(例如血液)中存在的微生物病原体的检测灵敏度。在一些实施方案中，流体装置允许直接从未经处理的血液中鉴定微生物病原体，而不必进行血液培养过程。

Description

集成流体装置及相关方法
本申请是申请号为201780016859.3的发明名称为“集成流体装置及相关方法”的中国专利申请的分案申请，原申请是2017年03月14日提交的PCT国际申请PCT/US2017/022280于2018年09月12日进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本发明总体上涉及流体装置及相关方法。
背景技术
血流感染(bloodstream infection，BSI)在美国已经上升成为第六位致死原因和最昂贵的医院治疗病症，每年超过300亿美元。BSI在美国占所有ICU使用量的25％和所有医院死亡的约50％。BSI通常由细菌或真菌引起，并且有效的疾病管理需要对其进行及早且准确的鉴定。BSI通常通过一系列血液培养来鉴定，这需要多至数天以鉴定潜在的病原体。血液培养被广泛认为是假设驱动的一线抗微生物干预的障碍。
现代分子方法有可能为这一领域带来革命，然而包括缺乏灵敏度、性能不准确、覆盖范围窄和诊断细节不足在内的限制阻碍了这些方法产生影响。事实上，与许多感染性疾病相比，尽管有巨大的临床需求，但仍存在明显的能力缺口。这是以下困难的组合：非常低的病原体负荷(1至100CFU/ml)、对高细节水平的广泛覆盖的要求(20种病原体导致大约90％在临床上需要物种水平信息的病例)、困难的样品基质(血液)、以及对快速周转的需要；其所有当组合时已证明难以克服。
用于鉴定微生物病原体的分子诊断方法可以通过探测其各自基因组物质中的保守区来进行。用于基因组鉴定的方法包括分离和检测病原体DNA。进一步有利的是开发进行分子方法的自动化方式。
自动化分子方法具有不太可能因人为错误、污染而受损的优点，并且潜在地更快。此外，其具有提供更加可重复的结果的潜能；这是一种被积极追寻的特性。
发明内容
本发明总体上涉及流体装置及相关方法。
在一个方面，提供了流体装置。在一些实施方案中，流体装置包含样品入口；与样品入口流体连通的流体通道，其中所述流体通道的长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1；与流体通道流体连通的第一裂解区；与第一裂解区流体连通的第一分离区；与第一分离区流体连通的第二裂解区；与第二裂解区流体连通的第二分离区；与第二分离区流体连通的至少一个反应区；与至少一个反应区流体连通的扩增区；和多个处理室，其各自与至少一个反应区和/或扩增区流体连通。
在一些实施方案中，流体装置包含：多个流体贮存器，其中每个流体贮存器的容积为至少0.1mL；多个气体室，其中每个气体室与流体贮存器流体连通，并且其中每个气体室的容积为至少0.1mL；和多个流体通道，其中每个流体通道与一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个气体室流体连通，并且其中每个流体通道的容积小于1000μL，其中至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
在一些实施方案中，流体装置包含：流体枢纽(fluidic hub)，所述流体枢纽包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；至少10个从流体枢纽分支的分支通道；多个阀，每个阀定位在分支通道与流体枢纽之间；和多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
在一些实施方案中，流体装置包含：流体枢纽，所述流体枢纽包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；从流体枢纽分支的第一分支通道；与第一分支通道流体连通的第一流体贮存器；与第一流体贮存器流体连通的第一气体室；从流体枢纽分支的第二分支通道；与第二分支通道流体连通的第二流体贮存器；和与第二流体贮存器流体连通的第二气体室。
在一些实施方案中，流体装置包含：第一流体贮存器；与第一流体贮存器流体连通的第一通道；与第一通道相关联的第一阀；第二流体贮存器；与第二流体贮存器流体连通的第二通道；与第二通道相关联的第二阀；和定位在第一流体贮存器与第二流体贮存器之间的连接通道，其中连接通道的至少一部分的截面面积小于第一流体贮存器的截面面积和第二流体贮存器的截面尺寸，并且连接通道的长度大于或等于250微米且小于或等于10cm。
在一些实施方案中，流体装置包含：通道、与通道连接的流体贮存器，与流体贮存器流体连通的出口通道、与出口通道相关联的阀和与流体贮存器相邻的盖，其中所述盖封闭流体贮存器，其中所述盖是半透膜，并且其中所述半透膜是疏水性的，其透气度在1psi下大于或等于0.4slpm且在1psi下小于或等于5slpm。
在另一方面，提供了输送流体(例如，在流体装置中)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含流体贮存器、与流体贮存器流体连通的气体室和与流体贮存器流体连通的流体通道，其中流体贮存器的纵向轴线与流体通道的纵向轴线基本上垂直，所述步骤为：在流体贮存器中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；在气体室中引入第二流体，其中所述第二流体是气体；以及对第二流体施加压力，使得第二流体从气体室流至流体贮存器并推动第一流体从流体柱进入流体通道中。
在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含含有长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道的流体枢纽、从流体枢纽分支的第一分支通道和从流体枢纽分支的第二分支通道，所述步骤为：在第一分支通道中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；在第一分支通道中引入第二流体，其中所述第二流体是气体；在第一分支通道与流体枢纽流体连通且第二分支通道未与流体枢纽流体连通的同时，向第二流体施加压力使得第二流体推动第一流体从第一分支通道进入流体枢纽中；以及将第二流体引入流体枢纽中。
在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含含有长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道的流体枢纽；从流体枢纽分支的第一分支通道；与第一分支通道连接的第一流体贮存器；从流体枢纽分支的第二分支通道；与第二分支通道连接的第二流体贮存器；从流体枢纽分支的第三分支通道；和与第二分支通道连接的第三流体贮存器，所述步骤为：使体积为至少0.1mL的第一流体经由第一分支通道从第一流体贮存器流至流体枢纽；使第一流体经由第二分支通道从流体枢纽流至第二流体贮存器，其中所述第二流体贮存器包含试剂；使第一流体与试剂反应以形成经反应流体；使经反应流体从第二流体贮存器流入流体枢纽中；以及使经反应流体经由第三分支通道从流体枢纽流至第三流体贮存器。
在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含含有长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道的流体枢纽；从流体枢纽分支的第一分支通道；与第一分支通道连接的第一流体贮存器；与第一流体贮存器流体连通的第一气体室；和从流体枢纽分支的第二分支通道，所述步骤为：使体积为至少0.1mL的第一流体经由第一分支通道从流体枢纽流至第一流体贮存器；使第一流体在第一流体贮存器中与试剂反应以形成经反应流体；以及向第一气体室施加压力使得经反应流体流入流体枢纽中并流入第二分支通道中。
在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含含有气体的流体贮存器、与流体贮存器流体连通的出口通道、与出口通道相关联的阀和与流体贮存器相邻的盖，其中所述盖封闭流体贮存器，并且其中所述盖是半透膜，所述步骤为：关闭阀；向流体贮存器中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；使包含在流体贮存器中的气体通过半透膜；以及基本上阻止第一流体通过半透膜。
在另一个方面，提供了在流体装置中混合流体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含第一流体贮存器、第二流体贮存器和定位在第一流体贮存器与第二流体贮存器之间的连接通道，其中所述连接通道的至少一部分的截面面积小于第一流体贮存器的截面面积和第二流体贮存器的截面尺寸，所述步骤未：在第一方向上使第一流体经由连接通道从第一流体贮存器流至第二流体贮存器，其中所述第一流体是液体；在第二方向上使第一流体经由连接通道从第二流体贮存器流至第一流体贮存器，其中第二方向不同于第一方向；以及在第一流体中引起混合。
在结合附图考虑时，从本发明的多个非限制性实施方案的以下详细描述中，本发明的其他优点和新颖特征将变得明显。在本说明书和通过引用并入的文件包括冲突和/或不一致的公开内容的情况下，以本说明书为准。
附图说明
将参照附图通过示例的方式来描述本发明的一些非限制性实施方案，附图为示意性的并且不旨在按比例绘制。在附图中，所示的每个相同或近似相同的组件通常用单一附图标记表示。为了清楚起见，在不需要举例说明来使本领域普通技术人员理解本发明的情况下，没有在每幅图中标注出每个组件，也没有示出本发明各实施方案的每个组件。在附图中：
图1是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图2是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图3是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图4是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图5是根据一组实施方案的流体装置的示意图；
图6A是根据一组实施方案的一种示例性流体装置的示意图；
图6B是根据一组实施方案的一种示例性流体装置的示意图；
图7是根据一组实施方案与在工作台上人工处理相比使用本文所述的流体装置对0.5飞摩尔(fmole)白念珠菌(Candida albicans)进行光学检测的图；
图8是根据一组实施方案使用本文所述流体装置对0.5飞摩尔的阴沟肠杆菌(E.cloacae，顶部)、屎肠球菌(E.faecium，中部)或光滑念珠菌(C.glabrata，底部)进行光学检测的图；
图9是凝胶照片，其突出显示了根据一组实施方案在工作台上(泳道1-5)或在装置上(泳道6-10)酶促扩增不同初始浓度的微生物基因组物质的产率；
图10A是根据一组实施方案在50CFU/ml下将在工作台上或人工从未经处理的人全血去除选定真核生物DNA、裂解白念珠菌、和分离白念珠菌提取的基因组物质与本文所述流体装置进行比较的图；
图10B是根据一组实施方案在16CFU/ml下将在工作台上或人工从未经处理的人全血去除选定真核生物DNA、裂解白念珠菌和分离白念珠菌提取的基因组物质与本文所述流体装置进行比较的图；
图11A是根据一组实施方案的包括流体贮存器的流体装置的一部分的示意图；
图11B是根据一组实施方案的包括流体贮存器的流体装置的一部分的示意图；
图12A是根据一组实施方案的可以用于混合的流体装置的一部分的示意图；以及
图12B是根据一组实施方案的可以用于混合的流体装置的一部分的示意图。
具体实施方式
总体上提供了流体装置及相关方法。本文所述的流体装置可以用于例如诊断目的(例如，检测患者样品中一种或更多种引起疾病的细菌的存在)。与用于诊断目的的某些现有流体装置不同，本文所述的流体装置和方法可以用于基本上同时(例如，并行地)检测患者样品中多种引起疾病的细菌的存在。此外并且在检测之外，本文所述的流体装置和方法还可以用于监测微生物负荷，例如，监测源于多个来源(例如，身体部位)的样品的微生物负荷的变化和/或用于监测随时间和/或响应于所应用治疗微生物负荷的变化。本文所述的流体装置和方法可以用于确定微生物负荷的定量效应(例如，以及定性效应)。在一些实施方案中，与某些现有的流体检测(例如，微流体)装置和方法相比，本文所述的流体装置和方法提供相对大流体样品(例如，0.5mL至约5mL)中微生物的高度灵敏检测。在一个示例性实施方案中，通过在灵敏检测微生物感染之前选择性地去除人核酸提高患者样品(例如血液)中存在的微生物病原体的检测灵敏度。在一些实施方案中，流体装置允许直接从未经处理的血液中鉴定微生物病原体，而不必进行血液培养过程。在一些实施方案中，流体装置允许直接从未经处理的血液中鉴定微生物病原体，而不必首先对血液进行离心。
在某些实施方案中，本文所述的流体装置和方法涉及将相对大体积(例如，数毫升)的流体与微米级或毫米级流体通道接合的独特方法。例如，在一些实施方案中，本文描述的装置包括一系列流体贮存器，其可以适于且布置成包含相对大量(例如，数毫升)的流体，例如试剂。每个流体贮存器可以与一个或更多个流体通道连接。该装置还可以包括一个或更多个与流体贮存器流体连通的气体室。例如，气体室可以用于对贮存器中的流体加压，以促进流体流入和/或流出流体通道。流体通道可以与流体枢纽连接，这可以有利于一种或更多种流体在两个或更多个流体贮存器之间流动。例如，流体枢纽可以包括一系列阀和/或通道，其将流体流引导至特定的贮存器以进行特定操作(例如，裂解、反应、分离、扩增、检测)。然后，可以通过将流体经由流体通道输送回流体枢纽并输送到不同的贮存器中来进行后续操作。在一些情况下，流体枢纽可以有利于将气体输送至一个或更多个贮存器，并且随后输送至一个或更多个气体室。如本文所述的流体装置的使用可以有利于在不使用多个泵和/或压力源下使流体在两个或更多个贮存器之间输送。例如，在一些情况下，可以向流体装置施加恒定压力，并且可以依次打开多个阀，使得流体在两个或更多个流体贮存器之间输送(例如，无需调整、改变、或重定向压力)。
有利地，本文描述的装置和方法可以用于进行反应和/或步骤的特定组合，而不需要使用者干预(例如，自动或半自动)、吸移单独试剂或大规模实验室过程(例如，离心)。与用于样品检测和分析的流体装置相比，本文描述的装置在一些情况下可以是独立的(例如，不需要专用仪器)。
在一些实施方案中，流体装置包含流体枢纽和多个流体贮存器。在某些实施方案中，每个流体贮存器与从流体枢纽分支的分支通道连接。例如，如图1所示，流体装置100包含流体枢纽110和流体贮存器120，流体贮存器120与从流体枢纽110分支并且与流体枢纽110流体连通的分支通道125连接。在某些实施方案中，阀122可以定位在分支通道125和流体枢纽110之间。然而，在一些替代实施方案中，在分支通道和流体枢纽之间可以不存在阀。
在一些情况下，流体装置100包含经由分支通道105与流体枢纽110流体连通的流体贮存器115(例如，样品入口贮存器)。在一些这样的实施方案中，可以将流体引入样品入口贮存器中并经由流体枢纽输送至流体贮存器。例如，可以将流体引入流体贮存器115并输送至流体枢纽，随后通过打开阀122输送至分支通道125并输送至流体贮存器120。在一些实施方案中，可以在流体贮存器120中进行特定操作(例如，裂解、反应、分离、扩增、检测)。
在一些实施方案中，气体室可以与流体贮存器流体连通。例如，如图2所示，流体装置102包含与气体室190流体连通的流体贮存器120。在一些实施方案中，流体管道(例如，流体通道)195有利于气体室190和流体贮存器120之间的流体连通。在一些实施方案中，气体可以从气体室190流至流体贮存器120。在另一些实施方案中，气体可以从流体贮存器120流至气体室190。在一个示例性实施方案中，可以将气体引入流体枢纽110中并通过打开阀122输送至分支通道125，随后输送至流体贮存器120。在一些这样的实施方案中，然后可以将气体从流体贮存器120输送至气体室190。如下面更详细描述的，将气体引入流体贮存器中可以有助于流体贮存器中试剂的混合。
在某些实施方案中，流体装置包含多个流体贮存器和多个从流体枢纽分支的分支通道。在一些这样的实施方案中，每个流体贮存器均可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，分支通道可以与流体枢纽直接流体连通。在某些实施方案中，一个或更多个阀可以定位在每个分支通道和流体枢纽之间。在一个示例性实施方案中，如图3所示，流体装置104包含多个流体贮存器，其包括流体贮存器115(例如，样品入口贮存器)、流体贮存器120、流体贮存器130、流体贮存器140、流体贮存器150、流体贮存器160和流体贮存器170。每个流体贮存器可以分别经由分支通道105、125、135、145、155、165和175与流体枢纽110连接。在一些情况下，一个或更多个流体贮存器可以包含流体(例如，反应物、缓冲液)。在某些实施方案中，一个或更多个流体贮存器可以用于进行特定操作(例如，裂解、分离、扩增和/或反应)。在一些情况下，阀(例如，阀122、阀132、阀142、阀152、阀162、阀172)可以定位在分支通道和流体枢纽之间。在一个示例性实施方案中，流体可以被引入流体贮存器115中并被输送至流体枢纽110(经由分支通道105)。在这样的实施方案中，阀122可以打开(并且数个或所有其他阀关闭)，使得流体从流体枢纽110输送至流体贮存器120(经由分支通道125)。在某些实施方案中，然后可以打开阀132，使得流体从流体贮存器120输送至流体枢纽110(经由分支通道125)并输送到流体贮存器130中(经由分支通道135)。
流体装置可以包含任意合适数目的分支通道。例如，在某些实施方案中，流体装置包含至少2个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个或至少40个分支通道，每个通道从流体枢纽分支(例如，延伸)。在一些实施方案中，流体装置包含少于或等于50个、少于或等于40个、少于或等于30个、少于或等于20个、少于或等于10个、少于或等于5个、或者少于或等于4个分支通道，每个通道从流体枢纽分支。上述范围的组合也是可能的(例如，至少2个且少于或等于50个)。其他范围也是可能的。
在某些实施方案中，流体装置包含多个流体贮存器，每个贮存器连接至与流体枢纽流体连通的分支通道。例如，在某些实施方案中，流体装置包含至少2个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个或至少40个流体贮存器，每个贮存器与分支通道流体连通(例如，连接)。在一些实施方案中，流体装置包含少于或等于50个、少于或等于40个、少于或等于30个、少于或等于20个、少于或等于10个、少于或等于5个、或者少于或等于4个流体贮存器，每个贮存器与分支通道流体连通(例如，连接)。上述范围的组合也是可能的(例如，至少2个且少于或等于50个)。其他范围也是可能的。
在一些情况下，流体装置可以包含一个或更多个另外的与流体枢纽流体连通的室和/或区域。例如，再次参照图3，在一些实施方案中(例如，在多个流体贮存器中进行一系列操作之后)，流体可以从流体枢纽110输送至流体通道185(例如，通过打开阀182)。如下面更详细描述的，流体通道185可以与例如一个或更多个处理室和/或一个或更多个检测区流体连通。
在一些情况下，气体室可以对大气开放(例如，用于排出气体)。在某些实施方案中，气体室可以与压力源流体连通，使得可以向在气体室中的第二流体(例如，气体)施加压力，使得第二流体推动包含在与气体室流体连通的流体贮存器中的第一流体。
如上所述，在一些实施方案中，流体装置包含与流体贮存器流体连通的气体室。在一些实施方案中，气体室可以具有特定容积。在某些实施方案中，气体室的容积为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL或至少5mL。在某些实施方案中，气体室的容积为小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于10mL)。其他范围也是可能的。
如上所述，在一些实施方案中，流体可以在流体枢纽和一个或更多个流体贮存器之间输送。在一些实施方案中，流体可以与存在于流体贮存器中的试剂反应以在流体贮存器中形成经反应流体。在一些这样的实施方案中，可以向经反应流体施加压力，使得经反应流体流入流体枢纽中。例如，在一些实施方案中，可以向与流体贮存器流体连通的气体室施加压力，使得经反应流体流入流体枢纽中。在某些实施方案中，然后可以将流体输送(例如，通过继续施加压力)至一个或更多个另外的分支通道。例如，如图2所示，流体可以从流体枢纽110流入流体贮存器120中(在阀122打开之后经由分支通道125)并与试剂反应以形成经反应流体。在一些实施方案中，可以经由气体室190向经反应流体施加压力，使得经反应流体从流体贮存器120流出并流入流体枢纽110中。在打开阀152之后，经反应流体可以从流体枢纽110流出并流入分支通道155中。在一些实施方案中，流体可以通过在一个或更多个另外的流体贮存器之间流动来经历一系列另外的反应和/或操作。在一个示例性实施方案中，经反应流体可以从第二流体贮存器流入流体枢纽中并随后流入第三流体贮存器中(例如，用于与一种或更多种另外的试剂反应)。
在一些实施方案中，向流体装置的多个组件(例如，气体室、流体贮存器、流体枢纽和/或其中包含的流体)施加恒定差压。在某些实施方案中，一个或更多个阀的打开和/或关闭有助于流体在一个或更多个流体贮存器和流体枢纽之间流动。在一些情况下，差压阻止一个或更多个流体贮存器之间的流动。在一些实施方案中，恒定差压是正压。在某些实施方案中，恒定差压是负压。在一些情况下，恒定差压可以为至少0.1psig、至少0.2psig、至少0.3psig、至少0.5psig、至少0.8psig、至少1psig、至少2psig、至少5psig、至少10psig、或至少15psig。在某些实施方案中，恒定差压为小于或等于20psig、小于或等于15psig、小于或等于10psig、小于或等于5psig、2psig、小于或等于1psig、小于或等于0.8psig、小于或等于0.5psig、小于或等于0.3psig、或者小于或等于0.2psig。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1psig且小于或等于20psig)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，可以通过用与第一流体不混溶的第二流体推动(即，移位)第一流体来输送第一流体(例如，液体)。在某些实施方案中，第二流体是气体。例如，在一些实施方案中，流体贮存器可以包含第一流体(例如，储存的试剂)，并且第二流体可以被引入流体贮存器中，使第一流体从流体贮存器移位(例如，经由分支通道移位到流体枢纽中)。在某些实施方案中，流体通道(例如，分支通道)可以包含第一流体，并且第二流体可以被引入流体通道中，使第一流体从分支通道移位(例如，移位到流体贮存器中、移位到流体枢纽中)。在一些实施方案中，可以向第二流体施加恒定差压，使得第二流体接触并推动第一流体。
在一个示例性实施方案中，第一流体可以被引入第一分支通道中，并且第二流体在第一分支通道中，同时第一分支通道与流体枢纽流体连通。再次参照图2，在一些实施方案中，分支通道125可以与流体枢纽110流体连通(例如，通过打开阀122)，并且分支通道155可以未与流体枢纽流体连通(例如，通过关闭阀152)。在一些这样的实施方案中，存在于分支通道125中的流体可以被引入到分支通道125中的第二流体(例如，经由流体管道195从气体室190引入)推动，并且流体被推动到流体枢纽110中。在一些实施方案中，第二流体进入流体枢纽。
在一些实施方案中，流体贮存器可以包含与流体贮存器相邻(例如，直接相邻)的盖。如本文所用，当组件被称为与另一组件“相邻”时，其可以直接与该组件相邻，或者也可以存在一个或更多个间插组件。与另一组件“直接相邻”的组件意味着不存在间插组件。盖可以封闭和/或密封贮存器的至少一部分(例如，使得至少第一液体包含在流体贮存器中)。例如，盖可以形成流体贮存器的“壁”。在某些实施方案中，盖可以是半透性的。例如，在一些实施方案中，盖被配置成限制/阻止第一流体流过盖(例如，在小于或等于特定的施加压力下阻止第一流体流过盖)，而允许第二流体流过盖。在一些这样的实施方案中，盖可以包含半透膜。
例如，如图11A所示，装置1100的一部分可以包含与通道1120(例如，入口通道)连接的流体贮存器1110和与流体贮存器1100相邻的盖1130(例如，半透膜)。如图11A举例说明性地所示，盖1130可以封闭流体贮存器1110。盖还可以封闭与流体贮存器连接的一个或更多个通道(例如，入口通道、出口通道)的全部或一部分。在一些实施方案中，通道1140(例如，出口通道)可以与流体贮存器1110流体连通。在一些情况下，阀1145可以与出口通道1145相关联。任选地，阀可以与入口通道1120相关联(未示出)。
在一个示例性实施方案中，与流体贮存器相邻的盖是半透性的，并且在使用期间允许气体流过盖且阻止液体流过盖。例如，再次参照图11A，气体(例如，第二流体)可以存在于流体贮存器1110中。可以经由通道1120将第一流体(例如，液体)引入流体贮存器中。在一些实施方案中，阀1145可以关闭，使得第一流体不进入出口通道1140。当第一流体被引入流体贮存器中(例如，经由通道1120)时，盖可以允许气体通过盖，例如，气体可以流过盖并且流体离开流体贮存器。在一些这样的实施方案中，盖基本上阻止第一流体通过盖，使得第一流体保留在流体贮存器中。阀1145可以处于关闭位置以阻止第一流体进入通道1140。
在一些实施方案中，整个流体贮存器填充有第一流体。关闭阀1145以阻止第一流体进入通道1140可以能够使仅流体贮存器填充有第一流体。有利地，这样的方法可以允许以良好精度计量流体。例如，通过用流体(例如，第一流体)充满具有已知/特定容积的流体贮存器，可以在流体系统中测量相同体积的流体并用于本文所述的方法。在所需量的流体进入贮存器之后，可以打开阀，使得第一流体被引入出口通道中(例如，用于进一步处理)。在一些这样的实施方案中，预先在流体贮存器中的第二流体(例如，气体)不进入通道1140，因为其已通过盖从流体贮存器释放。
在某些实施方案中，可以向第一流体施加压力，使得第一流体推动气体(例如，第二流体)通过和穿过盖(例如，半透膜)。在一些实施方案中，向流体施加的压力可以为大于或等于0.2psi、大于或等于0.4psi、大于或等于0.6psi、大于或等于0.8psi、大于或等于1psi、大于或等于1.2psi、大于或等于1.4psi、大于或等于1.6psi、大于或等于1.8psi、大于或等于2psi、大于或等于2.5psi、大于或等于3psi、大于或等于3.5psi、大于或等于4psi、或者大于或等于4.5psi。在某些实施方案中，向第一流体施加的压力为小于或等于5psi、小于或等于4.5psi、小于或等于4psi、小于或等于3.5psi、小于或等于3psi、小于或等于2.5psi、小于或等于2psi、小于或等于1.8psi、小于或等于1.6psi、小于或等于1.4psi、小于或等于1.2psi、小于或等于1psi、小于或等于0.8psi、小于或等于0.6psi、或者小于或等于0.4psi。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于0.4psi且小于或等于5psi、大于或等于0.4psi且小于或等于1psi)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)被配置成接收密封垫。例如，装置可以插入包含密封垫的仪器中。在一些情况下，密封垫可以与盖(例如，半透膜)的至少一部分接触，使得在向流体施加压力进入流体贮存器之后盖(例如，半透膜)维持流体贮存器的封闭(例如，以防止流体在盖(例如，半透膜)和流体贮存器之间泄漏)。例如，现在参照示出了装置部分1102的俯视图的图11B，垫1150可以与与流体贮存器1110相邻的盖(例如，半透膜)1130接触。在一些实施方案中，垫基本上包围被配置和设计成包含流体的流体贮存器部分。
在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)的至少一部分黏附(例如，通过黏合剂和/或黏合层)于流体贮存器。在某些实施方案中，黏合剂和/或密封垫维持盖(例如，半透膜)和流体贮存器之间的接触，使得在施加小于装置/组合件的液体损失压力的压力(例如，小于或等于50psi)之后，至少第一流体(例如，液体)不会通过或穿过盖(例如，半透膜)或在盖(例如，半透膜)和流体贮存器之间泄漏。
装置/组合件的不同液体损失压力(例如，在流体贮存器处、在流体贮存器和盖之间)可以是可能的。在一些实施方案中，液体损失压力为小于或等于50psi、小于或等于45psi、小于或等于40psi、小于或等于35psi、小于或等于30psi、小于或等于25psi、小于或等于20psi、小于或等于15psi、小于或等于10psi、小于或等于8psi、小于或等于6psi、或者小于或等于4psi。在某些实施方案中，液体损失压力为大于或等于2psi、大于或等于4psi、大于或等于6psi、大于或等于8psi、大于或等于10psi、大于或等于15psi、大于或等于20psi、大于或等于25psi、大于或等于30psi、大于或等于35psi、大于或等于40psi或者大于或等于45psi。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于2psi且小于或等于50psi)。其他范围也是可能的。液体损失压力可以通过在接触压力为5psi下使垫与与流体贮存器相邻的盖(例如，半透膜)接触并在连续提高压力下将水引入流体贮存器中直到观察到流体开始从盖(例如，半透膜)和流体贮存器之间泄漏来确定。观察到流体泄漏时的压力等于液体损失压力。
有利地，如本文所述的例如半透膜的盖的使用可以降低或防止在与流体贮存器流体连接的通道中形成气泡(例如，在流体从流体贮存器流入通道期间)和/或可以使得能够对流体进行计量(例如，使得流体充满流体贮存器而在流体贮存器中不存在气体)。
在某些实施方案中，盖是具有特定透气度的半透膜。在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)的透气度在1psi下为大于或等于0.4slpm、大于或等于0.6slpm、大于或等于0.8slpm、大于或等于1slpm、大于或等于1.2slpm、大于或等于1.4slpm、大于或等于1.6slpm、大于或等于1.8slpm、大于或等于2slpm、大于或等于2.5slpm、大于或等于3slpm、大于或等于3.5slpm、大于或等于4slpm、或者大于或等于4.5slpm。在某些实施方案中，盖(例如，半透膜)的透气度在1psi下为小于或等于5slpm、小于或等于4.5slpm、小于或等于4slpm、小于或等于3.5slpm、小于或等于3slpm、小于或等于2.5slpm、小于或等于2slpm、小于或等于1.8slpm、小于或等于1.6slpm、小于或等于1.4slpm、小于或等于1.2slpm、小于或等于1slpm、小于或等于0.8slpm、或者小于或等于0.6slpm。上述范围的组合也是可能的(例如，在1psi下大于或等于0.4slpm且小于或等于5slpm、在1psi下大于或等于0.4slpm且小于或等于1slpm)。其他范围也是可能的。透气度可以根据ASTM标准F788-88(2014)在1psi下确定。
在一些实施方案中，盖/半透膜可以具有特定的水侵入压力。在某些实施方案中，盖(例如，半透膜)的水侵入压力为大于或等于2psi、大于或等于4psi、大于或等于6psi、大于或等于8psi、大于或等于10psi、大于或等于15psi、大于或等于20psi、大于或等于25psi、大于或等于30psi、大于或等于35psi、大于或等于40psi、大于或等于45psi、大于或等于50psi、大于或等于55psi、大于或等于60psi、大于或等于65psi、大于或等于70psi、大于或等于75psi、大于或等于80psi、大于或等于85psi、大于或等于90psi、大于或等于95psi、大于或等于100psi、大于或等于105psi、大于或等于110psi、或者大于或等于115psi。在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)的水侵入压力为小于或等于120psi、小于或等于115psi、小于或等于110psi、小于或等于105psi、小于或等于100psi、小于或等于95psi、小于或等于90psi、小于或等于85psi、小于或等于80psi、小于或等于75psi、小于或等于70psi、小于或等于65psi、小于或等于60psi、小于或等于55psi、小于或等于50psi、小于或等于45psi、小于或等于40psi、小于或等于35psi、小于或等于30psi、小于或等于25psi、小于或等于20psi、小于或等于15psi、小于或等于10psi、小于或等于8psi、小于或等于6psi、或者小于或等于4psi。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于2psi且小于或等于120psi、大于或等于15psi且小于或等于120psi、大于或等于25psi且小于或等于120psi、大于或等于45psi且小于或等于120psi、大于或等于70psi且小于或等于120psi)。其他范围也是可能的。水侵入压力可以根据例如1998年7月28日授权且题为“Water Intrusion Test ForFilters”的美国专利号5,786,528(出于所有目的而通过引用整体并入本文)使用Millipore HydroCorr水流完整性测试(Millipore HydroCorr Water Flow IntegrityTest)来确定。
在一些情况下，盖(例如，半透膜)具有特定的平均孔径。在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)的平均孔径为大于或等于0.02微米、大于或等于0.04微米、大于或等于0.06微米、大于或等于0.08微米、大于或等于0.1微米、大于或等于0.15微米、大于或等于0.2微米、大于或等于0.25微米、大于或等于0.3微米、大于或等于0.3微米、大于或等于0.4微米、或者大于或等于0.45微米。在某些实施方案中，盖(例如，半透膜)的平均孔径为小于或等于0.5微米、小于或等于0.45微米、小于或等于0.4微米、小于或等于0.35微米、小于或等于0.3微米、小于或等于0.25微米、小于或等于0.2微米、小于或等于0.15微米、小于或等于0.1微米、小于或等于0.08微米、小于或等于0.06微米，或者小于或等于0.04微米。上述范围的组合也是可能的(例如，大于或等于0.02微米且小于或等于0.5微米)。其他范围也是可能的。
盖(例如，半透膜)可以包含任何合适的材料。合适材料的一些非限制性实例包括氟化材料，例如聚偏氟乙烯(PVDF)。在一个示例性实施方案中，半透膜是可商购的膜，例如
Figure BDA0003521052760000141
PVDF膜(Millipore，Billerica，MA)。
在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)是疏水性的。在某些实施方案中，半透膜是超疏水性的。术语“超疏水性的”是指如通过接触角测角术确定的平衡水接触角大于150度的材料。
在一些实施方案中，第一流体(例如，由第二流体推动的第一流体)可以具有特定体积。例如，在一些实施方案中，第一流体的体积为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL或至少5mL。在某些实施方案中，第一流体的体积可以为小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于10mL)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，第二流体与第一流体不混溶。在某些实施方案中，第二流体包含气体(例如，经灭菌气体)。在某些传统的流体(例如，微流体)装置中，通常不希望气体在系统中流动，因为其可以引入可抑制液体流动的气泡。有利地，在本文所述的流体装置中使用气体可以用于促进一种或更多种流体在系统中流动和/或促进流体混合，如本文更详细描述的。
如上所述，在一些实施方案中，流体装置包含至少一个与流体贮存器流体连通的流体通道。本文所述的流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)可以具有特定的平均截面尺寸。通道的“截面尺寸”(例如，直径、宽度)垂直于流体流的方向进行测量。在一些实施方案中，至少一个通道的平均截面尺寸为小于或等于约3mm、小于或等于约2mm、小于或等于约1mm、小于或等于约800微米、小于或等于约600微米、小于或等于约500微米、小于或等于约400微米、小于或等于约300微米、小于或等于约200微米、小于或等于约175微米、小于或等于约150微米、或者小于或等于约125微米。在某些实施方案中，至少一个通道的平均截面尺寸为大于或等于约100微米、大于或等于约125微米、大于或等于约150微米、大于或等于约175微米、大于或等于约200微米、大于或等于约250微米、大于或等于约300微米、大于或等于约400微米、大于或等于约500微米、大于或等于约600微米、大于或等于约800微米、大于或等于约1mm、或者大于或等于约2mm。上述范围的组合也是可能的(例如，约250微米至约2mm、约400微米至约1mm、约300微米至约600微米)。其他范围也是可能的。还可以对通道的尺寸进行选择以例如在通道中允许特定体积或线性流量的流体和/或在通道中容纳特定体积的流体。当然，通道的数目和通道的形状可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法改变。流体通道可以具有任何截面形状(圆形、卵形、三角形、不规则形、梯形、正方形或矩形等)。
一个或更多个流体通道的通道长宽比(长度：平均截面尺寸)还可以为至少5:1、至少6:1、至少8:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1、或至少100:1。
流体通道可以具有任何合适的容积。在一些实施方案中，流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)的容积可以为至少0.1微升、至少0.5微升、至少1微升、至少2微升、至少5微升、至少10微升、至少25微升、至少50微升、至少100微升、至少200微升、至少500微升、或至少1000微升。在某些实施方案中，一个或更多个流体通道的容积可以为小于或等于2000微升、小于或等于1000微升、小于或等于500微升、小于或等于200微升、小于或等于100微升、小于或等于50微升、小于或等于25微升、小于或等于10微升、小于或等于5微升、小于或等于2微升、小于或等于1微升、或者小于或等于0.5微升。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1微升且小于或等于2000微升、至少0.1微升且小于或等于1000微升)。其他范围也是可能的。
流体通道(例如，分支通道、枢纽通道)也可以具有任何合适的长度。在一些实施方案中，一个或更多个流体通道的长度为至少1cm、至少2cm、至少5cm、至少10cm或至少20cm。在某些实施方案中，一个或更多个流体通道的长度可以为小于或等于30cm、小于或等于10cm、小于或等于5cm、或者小于或等于2cm。上述范围的组合是可能的(例如，至少1cm且小于或等于30cm)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，至少一个流体通道的纵向轴线与至少一个流体贮存器的纵向轴线(例如，高)基本上垂直。例如，如图4所示，流体装置400包含流体贮存器410和流体通道420。在一些实施方案中，流体贮存器410的纵向轴线412与流体通道420的纵向轴线422基本上垂直。如该图中举例说明性地所示，流体贮存器412的纵向轴线412与流体通道420的纵向轴线422位于不同的平面上。通过延伸贮存器的纵向轴线(例如，高)，与其中流体贮存器和流体通道(与流体贮存器连接)的纵向轴线在同一平面上或彼此平行的配置相比，该配置可以允许流体贮存器容纳更大的体积量。
在一些实施方案中，上述至少一个流体通道是分支通道。在某些实施方案中，流体枢纽是如本文所述的流体通道(例如，长度为至少1cm)。
在一些实施方案中，每个流体贮存器可以具有特定容积。例如，在一些实施方案中，每个流体贮存器的容积可以为至少0.1mL、至少0.2mL、至少0.5mL、至少1mL、至少2mL、至少5mL、至少10mL、至少25mL、或至少50mL。在某些实施方案中，每个流体贮存器的容积可以小于或等于100mL、小于或等于50mL、小于或等于25mL、小于或等于10mL、小于或等于5mL、小于或等于2mL、小于或等于1mL、小于或等于0.5mL、或者小于或等于0.2mL。上述范围的组合也是可能的(例如，至少0.1mL且小于或等于100mL、至少0.5mL且小于或等于2mL)。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，流体贮存器的纵向轴线可以定向为垂直于与流体贮存器流体连通的至少一个流体通道的纵向轴线(例如，如图4中举例说明性所示)。在另一些实施方案中，流体贮存器的纵向轴线可以定向为平行于与流体贮存器流体连通的至少一个流体通道的纵向轴线(例如，如图11A-11B中举例说明性所示)。在一些情况下，流体贮存器的纵向轴线可以与与流体贮存器流体连通的至少一个流体通道的纵向轴线位于同一平面内。
在某些实施方案中，流体贮存器可以具有特定形状(例如，当从俯视图观察时)。在一些实施方案中，流体贮存器可以具有圆柱形形状、立方体形状、类立方体形状、棱柱形状或圆锥形形状。在一个示例性实施方案中，流体贮存器具有圆柱形形状。在另一个示例性实施方案中，流体贮存器具有类立方体形状。其他形状也是可能的。
在一些实施方案中，流体贮存器可以具有特定的截面形状。例如，在一些情况下，流体贮存器的至少一个截面可以是矩形、正方形、三角形、圆形、U形、蛇形、六边形或不规则形状的。在一个示例性实施方案中，流体贮存器可以具有U形截面形状(例如，当从流体通道的俯视图观察时)。其他截面形状也是可能的。
在一些实施方案中，流体贮存器可以是储存用贮存器(storage reservoir)(例如，用于储存用于进行特定操作的一种或更多种试剂)。试剂可以被储存并且密封在流体贮存器中，例如，在使用者使用流体装置之前和/或在将样品插入装置中之前。在一些实施方案中，包含在流体贮存器中的一种或更多种试剂可以是液体试剂(例如，洗涤缓冲液、裂解试剂、分离试剂)。在某些实施方案中，包含在流体贮存器中的一种或更多种试剂可以是干燥的、冻干的和/或丸粒化的试剂。在一些这样的实施方案中，可以使储存的试剂混悬(例如，在将流体引入包含储存的试剂的流体贮存器中之后)。
在一些情况下，流体贮存器可以限定用于进行特定操作的区域。在一些实施方案中，流体贮存器可以重复使用并且限定用于进行多于一个操作的区域。在一些情况下，一个或更多个操作可以并行进行(例如，在一个或更多个流体贮存器中)。
在一些情况下，流体贮存器可以重复用于两个或更多个操作。在某些实施方案中，第一流体贮存器可以用于第一反应，并且在流体已经流至一个或更多个另外的流体贮存器之后，流体可以再次流至第一流体贮存器以进行与第一反应相同或不同的第二反应。在一个示例性实施方案中，可以在第一流体贮存器中进行例如裂解的第一操作，并且在流体已经流至一个或更多个另外的流体贮存器(例如，用于进行一个或更多个特定操作)之后，流体可以流至第一流体贮存器以进行第二操作，例如混合。本领域技术人员将理解，使用流体贮存器进行裂解和混合操作仅是示例性的，并且本文所述的一个或更多个操作可以在同一或不同的贮存器中进行。在一些情况下，流体贮存器可以重复用作废物贮存器(例如，用于储存在不同贮存器中进行的特定操作之后剩余的废流体)。有利地，与用于样品检测和分析的其他流体装置相比，将一个或更多个流体贮存器重复用作废物贮存器的能力可以例如减小流体装置的尺寸和成本，和/或可以消除在流体装置操作期间移除废产物和/或废流体的需要。
应当理解，尽管本文主要描述了检测，但是在一些实施方案中，本文描述的流体装置和方法可以用于监测多个过程、事件或条件，例如微生物负荷。例如，装置或方法可以用于监测源自多个来源(例如，身体部位)的样品的微生物负荷的变化和/或用于监测随时间和/或响应于所应用治疗微生物负荷的变化。在一些实施方案中，本文所述的流体装置和方法可以用于确定微生物负荷的定量效应(例如，以及定性效应)。监测可以在单个检测事件中定期或连续发生。
在某些实施方案中，可以加热一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道。在一些实施方案中，流体贮存器和/或一个或更多个流体通道可以通过邻近流体贮存器的一个或更多个加热元件(包括例如电阻加热器、热电加热器、光学加热器等)加热。在一些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器(或者其中包含和/或储存的一种或更多种流体)加热至特定温度(例如，用于给定操作，例如裂解、分离、扩增、检测)。例如，在某些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道加热至至少5℃、至少10℃、至少15℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少37℃、至少40℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、至少100℃、或至少110℃。在某些实施方案中，可以将一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个流体通道加热至以下温度：低于或等于120℃、低于或等于110℃、低于或等于100℃、低于或等于95℃、低于或等于90℃、低于或等于85℃、低于或等于80℃、低于或等于75℃、低于或等于70℃、低于或等于60℃、低于或等于50℃、低于或等于40℃、低于或等于37℃、低于或等于35℃、低于或等于30℃、低于或等于25℃、低于或等于20℃、低于或等于15℃、或者低于或等于10℃。上述范围的组合是可能的(例如，至少5℃且低于或等于100℃)。其他范围也是可能的。在一些情况下，温度可以是循环的(例如，在扩增操作期间)。例如，在一些实施方案中，温度可以在50℃至120℃之间、或在70℃至120℃之间以及在约25℃和75℃进行循环。
在一些实施方案中，阀可以定位在分支通道和流体枢纽之间。例如，再次参照图1，在某些实施方案中，阀122可以定位在分支通道125和流体枢纽110之间。在一些实施方案中，阀是流闸门(flow-gate)。在某些实施方案中，阀可以是基于膜的阀。例如，可以在基于膜的阀上设置活塞，使得阀关闭。在某些实施方案中，活塞可以升高，使得阀打开。其他流动限制阀也是可能的，包括但不限于微型螺线管、歧管、可变形凝胶和/或膜，以控制流体从流体枢纽到一个或更多个分支通道的通过或流动。在一些实施方案中，本文所述的流体装置和/或方法可以包含2015年9月15日授权且题为“Simplified gating method for sealingand flow control in micro and nano devices”的美国专利No.9,132,426(其出于所有目的而通过引用整体并入本文)中描述的一种或更多种阀(例如，流闸门)。其他阀也是可能的。
在一些情况下，定位在气体室和流体贮存器之间的流体管道包含阀(例如，流闸门)。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个裂解区。在一些实施方案中，一个或更多个裂解区与流体通道(例如，流体枢纽)流体连通。在某些实施方案中，如本文所述，一个或更多个裂解区与分离区流体连通。在一些情况下，一个或更多个裂解区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个裂解区可以与流体枢纽流体连通。在某些实施方案中，裂解操作包括化学裂解，包括例如使患者的样品暴露于化学裂解试剂，其导致选定真核生物细胞的细胞膜打开或破裂。在某些实施方案中，在样品流至流体贮存器之前，流体贮存器包含一种或更多种裂解试剂(例如，储存的裂解试剂)。在另一些实施方案中，可以在样品流至流体贮存器之后向流体贮存器添加一种或更多种裂解试剂。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体装置104包含第一裂解区和第二裂解区，所述第一裂解区包含用于进行第一裂解操作的流体贮存器120，所述第二裂解区包含用于进行第二裂解操作的流体贮存器130。在一些实施方案中，第一裂解区包含一种或更多种储存的裂解试剂。在某些实施方案中，第二裂解区包含一种或更多种储存的裂解试剂，其可以与第一裂解区中的裂解试剂相同或不同。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至第一裂解区，并且可以向第一裂解区添加一种或更多种裂解试剂(例如，从一个或更多个另外的包含裂解试剂的流体贮存器流出的裂解试剂)。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至第二裂解区，并且可以向第二裂解区添加一种或更多种裂解试剂(例如，从一个或更多个另外的包含裂解试剂的流体贮存器流出的裂解试剂)。
在一些实施方案中，一个或更多个裂解操作包括裂解选定真核生物细胞(例如，存在于患者样品中的选定真核生物细胞)。在一些实施方案中，裂解操作从样品中释放哺乳动物DNA(例如，使得其可以从样品中分离和/或除去)。在某些实施方案中，可以在裂解之后将释放的选定真核生物DNA从样品中分离和/或除去，从而从样品中耗尽选定真核生物基因组物质。
在一些实施方案中，裂解操作包括裂解一种或更多种微生物细胞。在一些实施方案中，裂解操作将微生物基因组物质从微生物细胞释放到流体中(例如，使得其可以被分离、扩增和/或检测)。在一些情况下，一种或更多种微生物细胞的裂解发生在裂解选定真核生物细胞之后。在一些这样的实施方案中，在裂解一种或更多种微生物细胞之前，样品已经基本上耗尽选定真核生物DNA。在一些替代实施方案中，一种或更多种微生物细胞的裂解在不裂解选定真核生物细胞下进行。在某些实施方案中，在裂解选定真核生物细胞之后但在裂解微生物细胞之前，至少一部分微生物细胞可以是完整的(例如，未裂解的)。
合适化学裂解试剂的一些非限制性实例包括阳离子洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、酶、及其组合。在一些实施方案中，化学裂解试剂还包括酶、洗涤剂、盐、缓冲剂、金属螯合剂、和/或其组合中的一种或更多种。
在一些情况下，裂解操作包括机械裂解，包括例如超声搅拌和/或珠打。在一些实施方案中，第一裂解操作包括热裂解，包括例如热激。化学裂解、机械裂解或热裂解操作的组合也是可能的。用于裂解细胞的其他方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，一个或更多个裂解操作在约15℃至50℃、约20℃至45℃、约25℃至40℃、或约30℃至35℃的温度下进行。其他范围也是可能的。在一些实施方案中，一个或更多个裂解操作在室温下进行。
在一些实施方案中，本文公开的微生物细胞裂解方法导致高分子量微生物DNA的释放。不希望超出理论范围，在一些实施方案中，本文公开的微生物细胞裂解方法导致降低在微生物细胞裂解期间微生物基因组物质的剪切并且促进经裂解流体中高分子量微生物DNA的存在。在一些实施方案中，高分子量微生物DNA为约2kbp至200kbp、约10kbp至190kbp、约20kbp至180kbp、约30kbp至170kbp、约40kbp至160kbp、约50kbp至150kbp、约60kbp至140kbp、约70kbp至130kbp、约80kbp至120kbp、或约90kbp至110kbp。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个分离区。在某些实施方案中，一个或更多个分离区与一个或更多个裂解区流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个分离区可以与流体枢纽流体连通。在一些情况下，一个或更多个分离区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在某些实施方案中，在一个或更多个裂解操作之后，可以从流体中分离经裂解的基因组物质(例如，选定真核生物基因组物质、微生物基因组物质)和/或使其与流体隔离。在一些情况下，通过与支持基底结合并将支持基底和基因组物质与流体隔离来分离基因组物质。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，在进行第一裂解操作之后，流体(例如，包含经裂解的物质)流至包含流体贮存器140的第一分离区，用于进行第一分离操作(例如，以从流体中去除/耗尽选定真核生物基因组物质)。在一些这样的实施方案中，然后可以将流体(例如，基本上耗尽选定真核生物基因组物质)输送至流体贮存器130以进行第二裂解操作。在进行第二裂解操作之后，流体可以流至包含流体贮存器150的第二分离区，用于进行第二分离操作(例如，以从流体中去除/耗尽选定真核生物基因组物质、以从流体中分离微生物基因组物质)。基于本说明书的教导，本领域技术人员将理解，可以在分离操作之前进行(例如，在两个或更多个流体贮存器中进行)两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、或者五个或更多个裂解操作。
支持基底可以添加到或包含在一个或更多个流体贮存器中(例如，在一个或更多个分离区中)以进行分离操作。在某些实施方案中，基因组物质(例如，经裂解的基因组物质)与支持基底的至少一部分结合。基因组物质可以以任何合适的方式附接或结合至支持基底。在一些情况下，单一类型的基因组物质附接或结合至单支持基底。在一些实施方案中，多于一种类型的基因组物质可以附接或结合至单支持基底。在某些实施方案中，基因组物质可以通过形成非特异性键(例如，非特异性吸附)与支持基底附接或结合。在一些情况下，基因组物质可以与存在于支持基底表面上的官能团相互作用。例如，基因组物质可以通过例如以下的键与支持基底和/或存在于支持基底表面上的官能团结合：离子键、共价键(例如，碳-碳、碳-氧、氧-硅、硫-硫、磷-氮、碳-氮、金属-氧或其他共价键)、氢键(例如，在羟基、胺、羧基、巯基和/或类似的官能团之间)、配价键(例如，金属离子和单齿配体或多齿配体之间的络合或螯合)、和/或通过范德华相互作用。在一些实施方案中，支持基底包含结合至支持基底的阴离子交换剂(例如，阴离子交换剂树脂)。
在一些实施方案中，使结合至支持基底的至少一种阴离子交换剂与流体(例如，经裂解的流体)接触和/或孵育。在一些实施方案中，在与流体接触和/或孵育之后，从流体中移除阴离子交换剂。在另一个实施方案中，在与流体接触和/或孵育之后，固定阴离子交换剂并移出流体。
在一些实施方案中，支持基底包含珠、颗粒或磁性微粒。基因组物质可以如下从流体中分离：例如向包含结合到支持基底的基因组物质的流体贮存器施加磁场，使得支持基底被吸引到磁场源，并且流体可以从流体贮存器移出(例如，流出)。移出的流体可以流至例如废流体贮存器。
支持基底可以包含任何合适的磁性(或可磁化)材料。在某些实施方案中，磁性材料包含铁磁材料。合适磁性材料的一些非限制性实例包括铁、镍、钴、及其合金、以及其组合。合适支持基底的另一些非限制性实例包括颗粒、珠、表面或球体。在一些实施方案中，支持基底是磁性的，例如磁性颗粒或磁珠。在一些实施方案中，阴离子交换树脂与支持基底缀合。
在一些实施方案中，使流体与阴离子交换剂接触和/或孵育从流体中提取和/或耗尽选定真核生物DNA和/或RNA。在一些实施方案中，使流体与阴离子交换剂接触和/或孵育提取/分离微生物基因组物质(例如，gDNA)。在一些实施方案中，选定真核生物DNA(和/或RNA)与阴离子交换剂结合。在一些实施方案中，选定m DNA(和/或RNA)与阴离子交换剂结合。在某些实施方案中，微生物基因组物质与阴离子交换剂结合。在一些实施方案中，阴离子交换剂从流体中提取约5％至100％、约10％至99％、约15％至85％、约20％至80％、约25％至75％、约30％至70％、约35％至65％、约40％至60％、或约45％至55％的基因组物质。在一些实施方案中，阴离子交换树脂从流体中提取超过95％的基因组物质。
在某些实施方案中，在分离操作期间和/或之后，可以洗脱分离的基因组物质。例如，在一些实施方案中，通过从阴离子交换剂和/或支持基底洗脱或移出基因组物质来促进分离过程的完成。在一些实施方案中，基因组物质的洗脱包括添加洗脱缓冲液(例如，储存在与流体枢纽流体连通的流体贮存器中，并输送至分离区)。在某些实施方案中，在分离操作期间和/或之后，可以在洗脱之前洗涤结合至阴离子交换剂的分离的基因组物质。
在一些实施方案中，分离操作进行特定的时间。例如，可以将包含经裂解组分和支持基底(例如，包含结合至支持基底的阴离子交换剂的支持基底)的流体孵育(和/或搅拌)约0.1至10分钟、约2至9分钟、约3至8分钟、约4至7分钟、或约5至6分钟。在一些实施方案中，将微生物裂解反应物与阴离子交换树脂一起孵育约10至30分钟、约12至28分钟、约15至25分钟、约18至23分钟或约19至22分钟。在一些实施方案中，可以将包含经裂解组分和支持基底(例如，包含结合至支持基底的阴离子交换剂的支持基底)的流体孵育(和/或搅拌)少于1分钟。
在一些实施方案中，流体装置包含扩增区。在某些实施方案中，扩增区与至少一个反应区流体连通。在一些情况下，扩增区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，扩增区与流体枢纽流体连通。在某些实施方案中，在一个或更多个裂解和/或分离操作之后，可以扩增微生物基因组物质。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体装置104可以包含含有流体贮存器170的扩增区。在一些这样的实施方案中，流体贮存器170可以包含用于扩增基因组物质的一种或更多种试剂。在某些实施方案中，一种或更多种试剂(例如，储存在一个或更多个另外的流体贮存器中)可以流至流体贮存器170以进行扩增操作。在一些实施方案中，扩增的基因组物质是RNA或DNA。在一些实施方案中，DNA是单链DNA(ssDNA)和/或双链DNA(dDNA)。在一些实施方案中，DNA是核糖体DNA(rDNA)。
在某些实施方案中，扩增操作包括等温扩增和/或热循环扩增过程。在一个示例性实施方案中，扩增操作包括聚合酶链式反应(PCR)。PCR是本领域已知的并且通常包括基因组物质的基于热循环的酶促扩增(例如，使用引物进行)。
在一些实施方案中，可以稀释在扩增操作期间产生的扩增子。在某些实施方案中，可以向包含在扩增操作期间产生的扩增子的流体中添加侵入缓冲液。例如，在某些实施方案中，再次参照图3，流体贮存器170可以包含扩增操作的产物并且侵入缓冲液(例如，储存在一个或更多个另外的流体贮存器中的侵入缓冲液)可以流入流体贮存器170中。侵入缓冲液在下面更详细地描述。
在一些实施方案中，流体装置包含一个或更多个反应区(例如，其包含一个或更多个流体贮存器)。在某些实施方案中，一个或更多个反应区与一个或更多个分离区流体连通。在一些情况下，一个或更多个裂解区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个反应区可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，反应区包括洗涤操作。再次参照图3，在一个示例性实施方案中，流体贮存器160可以包含用于进行洗涤操作的洗涤区。在一些实施方案中，洗涤区包含一种或更多种洗涤缓冲液。洗涤缓冲液可以储存并密封在流体贮存器中，例如，在使用者使用流体装置之前和/或在将样品插入装置中之前。在一些情况下，流体(例如，样品)可以流至洗涤区，并且可以向洗涤区添加一种或更多种洗涤缓冲液(例如，从一个或更多个另外的储存洗涤缓冲液的流体贮存器流出的洗涤缓冲液)。在某些实施方案中，流体贮存器包含分离区和洗涤区。也就是说，在一些实施方案中，流体(例如，样品)可以存在于其中已经进行特定操作(例如，裂解、分离)的流体贮存器中并且可以向该流体贮存器添加洗涤缓冲液(例如，从一个或更多个另外的流体贮存器流出的洗涤缓冲液)，以洗涤任何未结合的组分和/或废试剂。
在一些实施方案中，在使微生物基因组物质与结合至支持基底的阴离子交换剂结合之后，使用洗涤缓冲液洗涤支持基底。在一些这样的实施方案中，并且在洗涤操作之前，将与微生物基因组物质结合的阴离子交换剂固定，使得可以移除未结合的物质而基本上不损失微生物基因组物质。
在某些实施方案中，所述方法包括一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、或者四个或更多个洗涤操作(例如，在裂解操作和分离操作之间的两个或更多个洗涤操作)。
在一些实施方案中，一个或更多个反应区包括流体的中和(例如，用碱或酸进行)。例如，在一些实施方案中，可以向在一个或更多个流体贮存器中的流体中添加酸以改变流体的pH。酸和碱可以储存在一个或更多个如本文所述的贮存器中。
在某些实施方案中，一个或更多个反应区包含或含有储存的双链体DNA侵入人工核酸(DNA Invading Artificial Nucleic Acid，DIANA)(例如，用于检测一种或更多种微生物病原体)。
在一些实施方案中，可以混合包含在流体贮存器中的一种或更多种流体(与任选地一种或更多种另外的组分)(例如，流体与另外的组分、流体与分析物、第一流体与第二流体)。在某些实施方案中，混合包括搅拌，例如机械搅拌(例如，超声搅拌)。
在一些实施方案中，本文所述的装置和方法可以有利于在不使用混合组件(例如，螺旋桨等)的情况下混合两种或更多种流体(例如，样品和试剂)。
在一些实施方案中，一种或更多种流体和任选地一种或更多种另外的组分的混合(例如，两种或更多种流体的混合、一种流体和另外的组分的混合等)可以如下进行：使一种或更多种流体流入第一流体贮存器中，使一种或更多种流体流入第二流体贮存器中，然后使一种或更多种流体流回到第一流体贮存器中。任选地，一种或更多种流体可以在第一流体贮存器和第二流体贮存器之间来回流动数次。如下面更详细描述的，一种或更多种流体(例如，两种或更多种流体)在两个(或更多个)流体贮存器之间的穿梭/转移可以有利于正转移的流体(和/或组分)的混合。在一些实施方案中，一种或更多种另外的组分包含支持基底。在一些这样的实施方案中，可以如本文所述通过混合将支持基底重悬于流体中。
现在参照图12A，在一些实施方案中，装置1200的一部分包含流体贮存器1210(例如，第一流体贮存器)和流体贮存器1220(例如，第二流体贮存器)，其中连接通道1230(例如，如本文所述的流体通道)定位在流体贮存器1210和流体贮存器1220之间和/或与流体贮存器1210和流体贮存器1220流体连通。在一些实施方案中，通道1240(例如，入口通道、出口通道)与流体贮存器1210流体连通。在一些实施方案中，通道1250(例如，出口通道、入口通道)与流体贮存器1220流体连通。在一些情况下，阀1245可以与通道1240相关联。在一些实施方案中，阀1255可以与通道1250相关联。
在一些实施方案中，连接通道的至少一部分的截面尺寸(例如，宽度、高度)小于第一流体贮存器的截面尺寸和第二流体贮存器的截面尺寸(例如，宽度、高度)(即，连接通道定位在其之间和/或与其流体连通的第一流体贮存器和第二流体贮存器)。作为补充或替代，在一些实施方案中，连接通道的至少一部分的截面面积小于第一流体贮存器的截面面积和第二流体贮存器的截面面积。在一些实施方案中，连接通道的截面尺寸(例如，宽度、高度)(或截面面积)为第一流体贮存器的截面尺寸(或截面面积)和/或第二流体贮存器的截面尺寸(或截面面积)的小于或等于50％、小于或等于45％、小于或等于40％、小于或等于35％、小于或等于30％、小于或等于25％、小于或等于20％、小于或等于15％、小于或等于10％、小于或等于8％、小于或等于6％、小于或等于4％、或者小于或等于2％。在某些实施方案中，连接通道的截面尺寸(或截面面积)为第一流体贮存器的截面尺寸(或截面面积)和/或第二流体贮存器的截面尺寸(或截面面积)的大于或等于1％、大于或等于2％、大于或等于4％、大于或等于6％、大于或等于8％、大于或等于10％、大于或等于15％、大于或等于20％、大于或等于25％、大于或等于30％、大于或等于35％、大于或等于40％、或者大于或等于45％。上述范围的组合也是可能的(例如，小于或等于50％且大于或等于1％)。其他范围也是可能的。
应当理解，上述每个范围可以独立地适用于比较连接通道与第一流体贮存器，以及比较连接通道与第二流体贮存器。例如，在一些实施方案中，连接通道的截面尺寸(例如，宽度、高度)(或截面面积)为第一流体贮存器的截面尺寸的1％至10％且为第二流体贮存器的截面尺寸的1％至25％。
在某些实施方案中，连接通道可以具有特定长度。例如，在一些实施方案中，连接通道的长度为大于或等于250微米、大于或等于500微米、大于或等于750微米、大于或等于1mm、大于或等于2.5mm、大于或等于5mm、大于或等于7.5mm、大于或等于10mm、大于或等于25mm、大于或等于50mm、大于或等于75mm、大于或等于100mm、大于或等于250mm、大于或等于500mm、大于或等于750mm、大于或等于1cm、大于或等于2.5cm、大于或等于5cm、或者大于或等于7.5cm。在某些实施方案中，连接通道的长度为小于或等于10cm、小于或等于7.5cm、小于或等于5cm、小于或等于2.5cm、小于或等于1cm、小于或等于750mm、小于或等于500mm、小于或等于250mm、小于或等于100mm、小于或等于75mm、小于或等于50mm、小于或等于25mm、小于或等于10mm、小于或等于7.5mm、小于或等于5mm、小于或等于2.5mm、小于或等于1mm、小于或等于750微米，或者小于或等于500微米。
再次参照图12A，在一些情况下，一个或更多个阀1235可以与连接通道1230相关联。如图12A中举例说明性地所示，阀1235可以定位在流体贮存器1210和流体贮存器1220之间。阀可以位于沿连接通道的任何合适位置。在一些实施方案中，阀位于邻近第一流体贮存器的位置1236A处(例如，在第一流体贮存器的入口或出口处)。在另一些实施方案中，阀位于邻近第二流体贮存器的位置1236B处(例如，在第二流体贮存器的入口或出口处)。其他配置也是可能的。
在一些实施方案中，两个或更多个阀可以与连接通道1230相关联。例如，阀可以定位在位置1236A(邻近第一流体贮存器)和位置1236B(邻近第二流体贮存器)二者处。
在一些实施方案中，流体枢纽可以与连接通道流体连通。例如，如图12B所示，装置1202的一部分包含与连接通道1230流体连通的流体枢纽1260。在一些这样的实施方案中，阀1235和阀1237可以与连接通道1230相关联(例如，以有利于在流体贮存器1210、流体贮存器1220和/或流体枢纽1260之间的流动)。然而，在一些这样的实施方案中，不需要存在阀1235和阀1237。
在一些实施方案中，可以使用一个或更多个连接通道(例如，每个连接通道定位在两个流体贮存器之间)。例如，在一些实施方案中，可以在两对或更多对流体贮存器(例如，包含四个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、或者十二个或更多个流体贮存器)之间进行混合，每对与连接通道相关联。在一些实施方案中，流体枢纽可以与一个或更多个连接通道相关联且流体连通。
两个或更多个流体贮存器(例如，如图12A-12B所示)可以用于促进流体和/或组分的混合。在一个示例性实施方案中，流体(例如，第一流体)可以在第一方向上经由连接通道(例如，连接通道1230)从第一流体贮存器(例如，图12A或图12B的流体贮存器1210)流至第二流体贮存器(例如，流体贮存器1220)。然后，流体可以在第二方向(不同于第一方向)上经由连接通道从第二流体贮存器流至第一流体贮存器。该过程可以引起流体中至少部分中的混合。在一些情况下，第二方向是与第一方向相反的方向。在一些实施方案中，流体包含两种或更多种类型的流体，使得在混合之后，两种或更多种流体混合在一起。在某些实施方案中，流体包含第一流体和一种或更多种另外的组分(例如，支持基底)，使得第一流体和另外的组分混合在一起。例如，可以如本文所述通过混合来将支持基底重悬于和/或混合于第一流体中。在一些实施方案中，类似的方法可以用于在反应混合物中洗涤支持基底(例如，磁珠)(例如，作为混合的替代或补充)。
在一些实施方案中，如本文所述，可以通过选择第一流体贮存器与连接通道，以及第二流体贮存器与连接通道之间的截面尺寸(例如，宽度、高度)或截面面积差异来促进混合。例如，上述方法可以在包括以下连接通道的装置中进行，所述连接通道的至少一部分的截面面积小于第一流体贮存器的截面面积和第二流体贮存器的截面尺寸(例如，为其的小于或等于50％、小于或等于25％、或本文所述的其他范围)。
在一些实施方案中，可以使用第二流体(例如，气体)来促进第一流体在装置的两个位置之间转移(例如，通过推动第一流体)。例如，在一些实施方案中，可以将第二流体(例如，第一气体)引入(例如，经由图12A中的通道1240)到第一流体贮存器中。可以向第二流体施加压力(例如，正压力)，使得第二流体推动第一流体从第一流体贮存器通过连接通道，并且进入第二流体贮存器中(例如，在第一方向上)。然后，可以将第三流体(例如，第二气体)引入(例如，经由图12A中的通道1250)到第二流体贮存器中。然后，可以向第三流体施加压力，使得第三流体推动第一流体从第二流体贮存器通过连接通道，并且进入第一流体贮存器中(例如，在与第一方向不同/相反的第二方向上)。
可以通过打开和/或关闭一个或更多个阀(或流闸门)来促进一种或更多种流体的引入和/或在流体贮存器之间的流动。例如，再次参照图12A，在一些实施方案中，可以将流体(例如，液体)引入第一流体贮存器1210中。在一些这样的实施方案中，阀1235可以关闭并且盖(例如，半透膜)与第一流体贮存器1210相关联，使得在向流体施加压力之后，第一流体贮存器中存在的任何气体通过半透膜，但流体(液体)保留在第一流体贮存器中。然后，可以打开阀1235并向流体施加压力(例如，通过第二流体，例如气体)，使得流体经由连接通道1230流至第二流体贮存器1220。在一些这样的实施方案中，阀1255可以关闭。在一些实施方案中，盖(例如，半透膜)可以与第二流体贮存器1220相关联，使得存在于第二流体贮存器中的任何气体通过盖，但是流体保留在第二流体贮存器中。在一些实施方案中，在第一流体贮存器之上的盖是在第二流体贮存器之上的同一盖。在一些情况下，然后，可以关闭阀1245并打开阀1255，并且向流体施加压力，使得流体经由连接通道1230从第二流体贮存器1220转移到第一流体贮存器1210，并且存在于第一流体贮存器1210和/或第二流体贮存器1220中的任何气体(例如，第二流体)通过与第一流体贮存器1210相关联的盖。进行这样的步骤可以用于混合流体而不将气泡(或降低气泡量)引入通道中和/或用于混合特定量(计量的)流体(例如，基本上等于流体贮存器的容积的流体体积)。在一些情况下，可以通过在特定操作之前、期间和/或之后使气体(例如，经灭菌气体)的流流入流体贮存器中来进行混合。气体流可以流动任何合适的时间(例如，至少1秒、3秒、5秒、7秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、60秒；和/或少于120秒、60秒)。在一些这样的实施方案中，气体流不需要是连续的，而可以是脉冲的。在一些这样的实施方案中，气体流可以引起流体贮存器中一种或更多种流体和/或试剂的混合和/或均化。气体可以从例如流体枢纽流入流体贮存器中，并且从流体贮存器流至与流体贮存器流体连通的气体室。气体流过包含一种或更多种流体(和一种或更多种试剂)的流体贮存器并流入气体室中可以使一种或更多种流体和一种或更多种试剂混合。在一些实施方案中，通过包含在流体贮存器中的流体的气体流动导致流体中的湍流。不希望受理论束缚，湍流可以导致流体贮存器中的流体和/或试剂混合。在一些实施方案中，类似的方法可以用于在反应混合物中洗涤支持基底(例如，磁珠)。
再次参照图2，可以将流体引入流体贮存器120中。在一些实施方案中，气体可以从流体枢纽110流入流体贮存器120中(经由阀122和分支通道125)，使得气体流入流体贮存器中通过流体。在一些这样的实施方案中，气体(但不是流体)可以流入与气体室190流体连通的流体管道195中。在一些实施方案中，气体室可以对大气开放并且气体排放到大气中。
在某些实施方案中，基本上阻止第一流体和/或试剂流入气体室中。例如，在一些实施方案中，定位在流体贮存器和气体室之间的阀(或流闸门)可以阻止一种或更多种流体和/或试剂流入气体室中，同时选择性地允许气体流入气体室中。
在某些实施方案中，流体贮存器被构造、布置和操作以进行一组特定操作。在一个示例性实施方案中，该组操作包括从样品中选择性地耗尽选定真核生物DNA(例如，通过裂解选定真核生物细胞和/或分离提取其基因组物质)、裂解其中的一种或更多种微生物细胞、分离微生物基因组物质(例如，DNA和/或RNA)、扩增微生物基因组物质、与双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)反应、以及检测一种或更多种微生物病原体。在一些这样的实施方案中，还可以进行一个或更多个另外的洗涤、分离、反应、混合或其他操作。
在一些实施方案中，在上述一个或更多个操作之后，流体(例如，包含扩增子和/或侵入缓冲液的流体)可以被分入用于计量(例如，在计量通道中)DIANA结合/侵入和/或检测(例如，检测区)的一个或更多个处理室中。在一些实施方案中，一个或更多个处理室各自与扩增区和/或至少一个反应区流体连通。在一些情况下，一个或更多个处理室可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在一些实施方案中，一个或更多个处理室可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，流体装置包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、十二个或更多个、十四个或更多个、或者十六个或更多个处理室。例如，如图5所示，流体装置500包含与多个处理室520流体连通的流体通道510，每个处理室520包含计量通道525。在某些实施方案中，每个计量通道彼此具有相同的长度、容积、长宽比和/或截面尺寸。在一些情况下，计量通道的使用将流体分开使其基本上相等地流入每个计量通道中。有利地，计量通道的使用可以产生两个或更多个基本上相等的流体体积(例如，使得包含在流体中的一种或更多种病原体的检测以相等体积并且基本上同时进行)。
在某些实施方案中，处理室包含检测区。例如，再次参照图5，每个处理室包含与计量通道525流体连通的检测区530。在一些实施方案中，每个检测区可以与一个或更多个另外的包含一个或更多个本文所述的流体贮存器的区域流体连通。在某些实施方案中，每个检测区与每个处理室流体连通。在一些情况下，一个或更多个检测区可以与流体枢纽流体连通。在一些实施方案中，在每个检测区中包含靶向期望病原体的一种或更多种探针。在一些这样的实施方案中，可以通过一种或更多种探针与病原体结合并产生信号来检测一种或更多种微生物病原体的存在。在一些实施方案中，可以通过光学、化学、电学或机械检测方法来检测信号。
在一些实施方案中，在扩增操作之后，可以检测和/或鉴定(例如，在计量通道中)在酶促扩增期间生成/产生的扩增子。
在一些实施方案中，可以使用DNA侵入人工核酸(DIANA)来检测和鉴定微生物基因组物质。例如，在一些实施方案中，可以将DIANA添加到包含在扩增操作期间产生的扩增子的流体贮存器中。在某些实施方案中，一种或更多种DIANA可以存在于一个或更多个计量通道的检测区中。
在一些实施方案中，DIANA探针包含本文所述的SEQ ID NO:1至37中任一个的反向互补序列。在一些实施方案中，DIANA探针包含与SEQ ID NO:1至37或其反向互补对应物中任一个具有大于85％同一性的序列。
在一些实施方案中，DIANA采用特化类型或类别的肽核酸(Peptide NucleicAcid，PNA)的形式。在一些实施方案中，DIANA采用特化类型或类别的锁核酸或桥接核酸(Locked Nucleic Acid，LNA；和/或Bridged Nucleic Acid，BNA)的形式。在一些实施方案中，局部侵入双链体DNA的DIANA可以用于本文公开的装置和方法中。
在一些实施方案中，基于PNA寡聚体的DIANA在骨架的γ-位置具有手性立体中心(也称为γPNA)。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，在结构上预先定向成右手螺旋的PNA寡聚体可以在能量上有利于进行双链体DNA侵入。在一些实施方案中，如WO 2013/176992(其内容通过引用整体并入)中所教导的使用γPNA检测微生物DNA。在一些实施方案中，如He等,J.Am.Chem.Soc.2009,131,12088–12090中所述使用γPNA检测微生物DNA。
在一些实施方案中，用于在扩增的基因组物质中检测的目的靶基因组区包括但不限于细菌16S、ITS、23S、RPL基因或TUF基因。在一些实施方案中，用于在扩增的基因组物质中检测的目的靶基因组区包括但不限于真菌18S、ITS、5.8S和25/28S。在某些实施方案中，用于在扩增的基因组物质中检测的目的靶基因组区包括抗生素抗性标记和/或基因，和/或质粒。
在一些实施方案中，每种DIANA靶向来自单一微生物物种的特定微生物基因组物质(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，每种DIANA靶向一个微生物组群的特定微生物基因组物质(例如，DNA或RNA)。在一些实施方案中，特定微生物基因组物质(例如，DNA或RNA)是扩增的微生物基因组物质。
在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记与DIANA结合。在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记结合在DNA扩增子上。在一些实施方案中，一种或更多种可检测标记定位在一些或所有潜在靶标通用的寡聚体上。
在一些实施方案中，DIANA与其各自靶标的结合的检测是通过光学、化学、电学或机械检测方法进行。在一些实施方案中，光学检测是通过使用荧光或发光进行。
流体装置或其部分(例如，基底、流体通道、流体贮存器、气体室)可以由适于形成通道或其他组件的任何材料制成。材料的一些非限制性实例包括聚合物(例如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚(苯乙烯-共-丙烯腈)、聚(苯乙烯-共-丁二烯)、聚(丙烯腈,丁二烯,苯乙烯)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-丙烯酸酯)、聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚碳酸酯、聚(二甲基硅氧烷)、PVC、PTFE、PET、环烯烃共聚物、聚酰亚胺、环烯烃聚合物或共聚物、或者两种或更多种这样的聚合物的共混物；或者金属，包括镍、铜、不锈钢、块体金属玻璃、或其他金属或者合金；或者陶瓷，包括玻璃、石英、二氧化硅、氧化铝、氧化锆、碳化钨、碳化硅；或者非金属材料，例如石墨、硅，等等。
图6A中示出了流体装置的一个示例性透视图。在一些实施方案中，流体装置600包含第一区域610和第二区域620，所述第一区域610包含多个流体通道，所述第二区域620包含多个流体贮存器。在一些情况下，流体装置包含盖630，包含多个流体管道(例如，定位在一个或更多个气体室和一个或更多个流体贮存器之间的流体管道)。
图6B是流体装置600的自顶向下视图。在一些实施方案中，第二区域620包含一个或更多个流体贮存器，其包括例如示例性的流体贮存器625。在某些实施方案中，第一区域610包含多个流体通道，其包括例如示例性的流体通道635。如图6B所示，流体装置还包含多个计量通道640(每个计量通道包含检测区645)。
在一些实施方案中，包含多个流体通道的第一区域610还包含附接到流体装置的底部的薄膜(例如，薄膜聚合物)(例如，以封闭流体通道)。在一些情况下，附接到装置底部的薄膜具有相对高的光学透明度(例如，以有利于有效地检测从一个或更多个检测区发射的任何光学信号)。
在一些实施方案中，流体装置具有总宽度、总高度和总长度。例如，再次参照图6B，流体装置600具有总高度650和总宽度660，以及总长度670。
在某些实施方案中，流体装置的总高度与总宽度之比为至少1:1、至少2:1、至少3:1、至少5:1、或至少10:1。在一些实施方案中，流体装置的总高度与总长度之比为至少1:1、至少2:1、至少3:1、至少5:1、或至少10:1。
在某些实施方案中，流体装置具有特定的总宽度。在一些实施方案中，流体装置的宽度为约2至5英寸、约2.5至5英寸、3至6英寸。
在某些实施方案中，流体装置具有特定的总长度。在一些实施方案中，流体装置的长度为约5至12英寸、约6至16英寸、或8至20英寸。
在一些实施方案中，流体装置占据特定的表面积。在一些实施方案中，流体装置占据的表面积为约10至63平方英寸、约17至85平方英寸、约23至115平方英寸或约28至120平方英寸。如本文所述的表面积是在平行于多个流体通道(并且垂直于至少一个流体贮存器)的流体装置的最大截面上测量的。
在一些实施方案中，流体装置包括用于添加样品，例如将样品注射到样品入口贮存器中的开口。在一些实施方案中，开口具有可再密封的盖。在一些实施方案中，打开盖需要机械力，其中在没有机械力的情况下盖保持闭合。在一些实施方案中，开口覆盖有膜，样品被插入通过所述膜。
在一些实施方案中，流体样品或样本经由流体装置中构造和布置成从vacuette或者类似样本管或瓶接收和提取流体样品的接收器流至流体装置。
在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收Monovette的接收器。通过在Monovette的柱塞上施加力/压力，来自Monovette的流体样本经由接收器流至流体装置。在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收Vacuette的接收器。在一些实施方案中，流体装置包含构造和布置成接收能够和/或储存和/或输送流体的任何容器的接收器。
在一些实施方案中，流体装置被构造和布置成并入一个或更多个设计成使样品从样本瓶或接收器流出的管。在一些实施方案中，这样的管各自且单独地可以提供正压、负压和/或环境压力以促进样品流入装置中。在一些实施方案中，一个或更多个管设计成串联、和/或并联、和/或顺序工作，以能够使样品有效地流入装置中。在一些实施方案中，仅需要单个管。
在一些实施方案中，并且在可以使用多于一个管来使样品从瓶流至流体装置的情况下，可以紧密靠近地放置，一个非限制性实例可以是“并排”。在另一个非限制性实例中，一个管可以放置在另一个管内。
在一些实施方案中，这些管可以用于在使样品能够流至流体装置之前刺穿瓶的密封。
在一些实施方案中，样品通过气动力从瓶流至流体装置，而在另一些情况下，其可以是机械的或电的。
在一些实施方案中，引入流体装置中的流体(例如，样品)是来自一定来源(例如，患者、或实验动物、或液体培养基、或任何生物体)的流体。在一些实施方案中，流体是体液、身体分泌物或身体排泄物。在一些实施方案中，流体包括但不限于粪便、痰、尿、血液、和/或其组合。如本文所述，可以将流体引入例如流体装置的样品入口贮存器(例如，图1中的流体贮存器115)中。
在一些实施方案中，引入流体装置中的流体(例如，样品)为约100μl至2.5ml、约200μl至2ml、约300μl至1.5ml、约400μl至1ml、或约500μl至750μl。在一些实施方案中，样品的体积为约0.5ml至10ml、约1ml至9ml、约2ml至8ml、约3ml至7ml、或约4ml至6ml。其他体积也是可能的。
在一些实施方案中，裂解试剂包含一种或更多种洗涤剂或表面活性剂。在一些实施方案中，洗涤剂或表面活性剂是非离子的、两性离子的、或非洗涤剂磺基甜菜碱。洗涤剂和表面活性剂包括但不限于BigCHAP、脱氧BigCHAP、Brij 35、Brij 58P、Cymal-1、Cymal-2、Cymal-5、Cymal-6、癸基-β-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十六烷基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、癸基-β-D-1-硫代吡喃麦芽糖苷、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基-β-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基-β-二硫代吡喃葡萄糖苷、毛地黄皂苷、二甲基癸基氧化膦(APO-10)、十二烷基二甲基氧化膦(APO-12)、IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630和IGEPAL CO-720、N-辛酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-8)、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-9)、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺(MEGA-10)、nonidet P40-替代品、Pluronic F-68、皂苷、thesit、Triton X-100、Triton X-114、吐温20、吐温40、吐温80、ASB-14(酰氨基磺基甜菜碱-14)、ASB-16(酰氨基磺基甜菜碱-16)、C7BzO、CHAPS、CHAPSO、EMPIGEN BB、3-(N,N-二甲基辛基氨基)丙烷磺酸盐内盐(SB3-8)、3-(癸基二甲基氨基)-丙烷磺酸盐内盐(SB3-10)、3-(十二烷基二甲基氨基)-丙烷磺酸盐内盐(SB3-12)、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-14)、3-(N,N-二甲基棕榈基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-16)、3-(N,N-二甲基十八烷基氨基)-丙烷磺酸盐(SB3-18)、3-(1-吡啶基)-1-丙烷磺酸盐(NDSB 201)和3-(苄基二甲基氨基)丙烷磺酸盐(NDSB 256)。
在一些实施方案中，裂解试剂(例如，用于选定真核生物细胞裂解)的表面活性剂浓度为约0.27％至15％v/v、约0.39％至13％v/v、约0.45％至12％(v/v)或约0.60％至10％(v/v)的吐温表面活性剂和/或约0.22％至10％(v/v)、约0.16％至8.25％(v/v)、或约0.44％至6.75％(v/v)的Triton或IGEPAL。
在一些实施方案中，裂解试剂(例如，用于选定真核生物细胞裂解)包含的表面活性剂浓度为约0.25％至1％(v/v)、约0.35％至0.85％(v/v)、约0.45％至0.75％(v/v)或约0.55％至0.65％(v/v)的吐温表面活性剂和/或约0.15％至0.65％(v/v)、约0.25％至0.55％(v/v)、或约0.35％至0.45％(v/v)的Triton或IGEPAL。在一些实施方案中，吐温表面活性剂选自吐温-20、吐温-40和吐温-80。在一些实施方案中，Triton是Triton X-100或Triton X-114。在一些实施方案中，IGEPAL选自IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630和IGEPALCO-720。
在一些实施方案中，裂解试剂包含至少一种消泡剂。合适的消泡剂包括但不限于Antifoam A、Antifoam 204、Antifoam B、Antifoam C、Antifoam Y-30、Antifoam SE-15和基于西甲硅油的消泡剂。其他消泡剂也是可能的。
在某些实施方案中，裂解试剂包含约0.15M至0.75M、约0.2M至0.7M、约0.25M至0.65M、约0.3M至0.6M、约0.35M至0.55M、或约0.4M至0.5M的一价盐。在一些实施方案中，裂解试剂包含少于约0.15M的一价盐(例如，用于诱导渗透应激)。在一些实施方案中，裂解试剂中一价盐的浓度为约50mM至6M、约150mM至5M、约350mM至4.5M、约550mM至4M、约900mM至3.75M、或约1M至3.5M。在一些实施方案中，裂解试剂中一价盐的盐浓度为约50mM至800mM、约100mM至700mM、约200mM至600mM、约300mM至500mM、或约350mM至450mM。
一价盐的一些非限制性实例包括例如NaCl、KCl、LiCl、及其组合。
在一些实施方案中，裂解试剂的pH为约6至9。在一些实施方案中，pH为中性pH或为约中性pH。在一些实施方案中，在约6至9或接近中性的pH下进行选定真核生物细胞或微生物细胞裂解反应优于本领域已知的现有方法，因为在一些表面活性剂的存在下微生物细胞的生存力和/或结构完整性提高。
在一些实施方案中，裂解操作在室温下进行。在某些实施方案中，裂解操作在约5℃至20℃、约9℃至16℃、约25℃至75℃、约30℃至70℃或约35℃至55℃下进行。
在某些实施方案中，裂解操作进行约0.01至20分钟、约0.1至9.0分钟、约1.0至8.0分钟、约2.0至7.0分钟、约3.0至6.0分钟、或约4.0至5.0分钟。
在一些情况下，可以通过添加裂解终止缓冲液来终止裂解操作(例如，可以抑制裂解)。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液包含至少一种电解质。在一些实施方案中，相对于总裂解试剂浓度，添加至裂解试剂的电解质的浓度为约100mM至750mM、约150mM至650mM、约200mM至550mM、约250mM至450mM、或约300mM至400mM。可以添加到裂解终止缓冲液中的电解质包括但不限于一价盐和二价盐。有利地，在一些实施方案中，使用至少一种电解质终止裂解试剂改善使用阴离子交换树脂的下游过程(例如，选定真核生物DNA的除去、微生物细胞的分离、微生物细胞的裂解或微生物基因组物质的分离)。
在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH低于约9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH为约6至9。在一些实施方案中，裂解终止缓冲液的pH为中性pH或为约中性pH。在一些实施方案中，将裂解终止缓冲液维持在约6至9或约中性的pH改善完整微生物细胞的下游处理(例如，选定真核生物DNA的除去、微生物细胞的分离、微生物细胞的裂解或微生物DNA的扩增)。
在某些实施方案中，裂解试剂(例如，用于裂解微生物细胞)包含酶，例如溶菌酶、溶细胞酶、酶解酶(zymolyase)、变溶菌素和溶葡萄球菌素。
在一些实施方案中，裂解试剂中的溶菌酶浓度为约5至200mg/ml、约1至150mg/ml、5至175mg/ml、约15至140mg/ml、约20至100mg/ml、约30至95mg/ml、约45至75mg/ml、或约50至62mg/ml。其他范围也是可能的。
在一些实施方案中，可以在进行裂解操作之后将裂解试剂中的溶菌酶浓度稀释至约0.01至1mg/ml、约0.1至10mg/ml、0.5至15mg/ml、约1至20mg/ml、约0.3至8mg/ml、约0.7至7mg/ml、约0.2至0.9mg/ml、或约0.05至0.35mg/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂中的溶细胞酶浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、或约3,000至15,000U/ml。
在一些实施方案中，可以在进行裂解操作之后将裂解试剂中的溶细胞酶浓度稀释为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20U/ml至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、约90至100U/ml、或者在前面公开的浓度中的任意两个之间。
在一些实施方案中，裂解试剂中的酶解酶浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425U/ml至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、或约3,000至15,000U/ml。
在一些实施方案中，可以在进行裂解操作之后将裂解试剂中的酶解酶浓度稀释为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20U/ml至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、或约90至100U/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂中的变溶菌素浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、或约3,000至15,000U/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂中的变溶菌素浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、或约90至100U/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂中的溶葡萄球菌素浓度为约500至50,000U/ml、约250至10,000U/ml、425U/ml至8,000U/ml、约300至6,000U/ml、约400至5,000U/ml、约1,000至4,750U/ml、约1,500至4,500U/ml、约2,000至6,500U/ml、约2,500至5,500U/ml、或约3,000至15,000U/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂中的溶葡萄球菌素浓度为约1至1000U/ml、约5至200U/ml、20至800U/ml、约30至700U/ml、约40至600U/ml、约50至500U/ml、约60至400U/ml、约70至300U/ml、约80至200U/ml、或约90至100U/ml。
在一些实施方案中，裂解试剂包含一种或更多种洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂是两性离子洗涤剂。在一些实施方案中，两性离子洗涤剂来自磺基甜菜碱家族。合适磺基甜菜碱洗涤剂的一些非限制性实例包括但不限于N-癸基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-癸基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十六烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐、N-十八烷基-N,N-二甲基-3-氨基-1-丙烷磺酸盐和3-[N,N-二甲基(3-肉豆蔻酰基氨基丙基)氨基]丙烷磺酸盐。
在一些实施方案中，洗涤剂是来自吡喃葡萄糖苷家族的非离子洗涤剂。合适非离子吡喃葡萄糖苷洗涤剂的一些非限制性实例包括例如3-乙酰基伞形酮基b-D-吡喃葡萄糖苷、N-戊基b-D-吡喃葡萄糖苷癸基b-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正十二烷基b-D-吡喃葡萄糖苷、十六烷基b-D-吡喃葡萄糖苷、己基b-D-吡喃葡萄糖苷、甲基a-D-吡喃葡萄糖苷、辛基b-D-吡喃葡萄糖苷和苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷。
在一些实施方案中，洗涤剂是阳离子洗涤剂。合适阳离子洗涤剂的一些非限制性实例包括例如烷基三甲基溴化铵、盐酸氨丙啉、苯扎氯铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、十六烷基氯化吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、甲苄索氯铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、奥芬溴铵、四庚基溴化铵、四(癸基)溴化铵、四(癸基)溴化铵和三辛酰基甲基氯化铵。在一些实施方案中，阳离子洗涤剂的浓度为阳离子洗涤剂的约1-100×临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)。
在一些实施方案中，洗涤剂的浓度取决于裂解试剂中特定洗涤剂的临界胶束浓度(CMC)。在一些实施方案中，裂解试剂中的每种洗涤剂浓度为约10至11,000、约25至12,500、约50至8,000、约75至7,000、约95至8,500、或约98至6,750倍的CMC。在一些实施方案中，裂解试剂中的洗涤剂浓度为约100至5,000、约125至9,000、约200至8,000、约400至7,000、或约500至6,000倍的CMC。在一些实施方案中，裂解试剂中的洗涤剂浓度为约100至1000、约200至900、约300至800、约400至700、或约500至600倍的CMC。在一些实施方案中，裂解试剂中的每种洗涤剂浓度为约0.1至100、约1.0至90、约10至80、约20至70、约30至60、或约40至50倍的CMC。
在一些实施方案中，裂解试剂包含一种或更多种金属螯合剂。合适金属螯合剂的一些非限制性实例包括例如乙二醇四乙酸(EGTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，裂解试剂中金属螯合剂的浓度为约50mM至1.0M、约100mM至0.75M、约110mM至500mM、约125mM至500mM、或约125mM至450mM。
在一些实施方案中，裂解试剂包含一种或更多种还原剂。合适还原剂的一些非限制性实例包括例如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。在一些实施方案中，裂解试剂中还原剂的浓度为约10mM至20M、约15mM至15M、约50mM至14M、约100mM至14M、或约110mM至15M。在一些实施方案中，裂解试剂中还原剂的浓度为约1mM至100mM、约10mM至90mM、约20mM至80mM、约30mM至70mM、约40mM至60mM、或约45mM至55mM。
在一些实施方案中，在使用之前向裂解试剂中添加至少一种DNA嵌入染料。在一些实施方案中，DNA嵌入染料是在用合适波长和剂量的光源活化之后与两条DNA链产生共价键的染料。不希望受理论束缚，在一些实施方案中，共价键使样品中存在的至少一些DNA不可扩增。合适DNA嵌入染料的一些非限制性实例包括单叠氮乙锭(EMA)和单叠氮丙锭(PMA)。
在一些实施方案中，在开始扩增操作之前，用可检测标记或结合部分标记在扩增区中使用的引物。
在一些实施方案中，在扩增操作中使用包含标签或被修饰以实现下游标签缀合的经修饰核苷酸。作为实例但不作为限制，经标签修饰的核苷酸包括但不限于经二乙基氨基香豆素(DEAC)、花青3(Cy3)、花青5(Cy5)、荧光素(FITC)、丽丝胺(Lissamine)、R110、R6G、四甲基罗丹明(TAMRA)或德克萨斯红染料修饰的核苷酸。能够进行后续标记的经修饰核苷酸的一些实例可以是但不限于经氨基-地高辛配基(DIG)、生物素或二硝基苯基(DNP)修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，DNA扩增子的标记通过随后与嵌入染料孵育来实现。合适嵌入染料的一些非限制性实例包括但不限于PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR Gold、SYBRGreen I、SYBR Green II、SYBR Safe、TOTO-1、YOYO-1、YOYO-3、POPO-1、BOBO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3、SYTOX-Blue、SYTOX-Green、SYTOX-Orange、SYTOX-Red和EtBr。
在一些实施方案中，裂解试剂中DNA嵌入染料的浓度为约0.01μM至1.0μM、约0.1μM至0.9μM、0.2μM至0.8μM、约0.3μM至0.7μM、或约0.4μM至0.6μM。
在一些实施方案中，裂解试剂可以在使用之前用一种或更多种核酸酶预处理。在一些实施方案中，在使用微生物裂解溶液之前中和核酸酶。不希望受理论束缚，所使用的核酸酶可以取决于下游目的序列。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，核酸酶选自但不限于EcoRI、HindIII、SalI、HhaI、DdeI、RsaI、Sau3AI和MspI。
在一些实施方案中，裂解试剂可以用高剂量的紫外线照射(特别是在约260nm的范围内)进行预处理。不希望受理论束缚，UV诱导DNA骨架中的缺口使其通常不可扩增。
在一些实施方案中，阴离子交换剂(例如，阴离子交换剂树脂)用于捕获/固定选定真核生物和/或微生物基因组物质。阴离子交换树脂可以定位在流体装置的一个或更多个贮存器或通道中。在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种弱阴离子交换树脂(weak anion-exchange resin，WAX)。WAX的一些实例包括但不限于羧甲基(CM)、二乙基氨基丙基(ANX)、二乙基乙醇胺(DEAE)、Amberlite Ira67、Purolite A847、Amberlite Ira96、Amberlite IRA96SB、Dowex Marathon WBA、Dowex Upcore Mono WB-500、Purolite A835、Dowex Monosphere 77和Dowex Monosphere 66。
在一些实施方案中，WAX树脂包含至少一个叔胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是一种或更多种强阴离子交换树脂(stronganion-exchange resin，SAX)。SAX的一些实例包括但不限于-O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3、Amberjet Up4000、Amberjet 9000OH、Amberlite FPA40 Cl、和Dowex UpcoreMono MA-600。
在一些实施方案中，基于SAX的树脂包含至少一个季胺官能团。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂是至少一种WAX和至少一种SAX的组合。
在一些实施方案中，阴离子交换树脂的形式选自纤维、膜、吸着剂、凝胶和滤纸。在一些实施方案中，使具有经裂解的选定真核生物细胞和/或经裂解的微生物细胞的样品通过阴离子交换树脂或与阴离子交换树脂接触。在一些实施方案中，阴离子交换树脂在溶液中。
在一些实施方案中，支持基底可以定位在流体装置的一个或更多个贮存器或通道中。在一些实施方案中，支持基底包含二氧化硅、玻璃、金属、基于聚苯乙烯的材料、基于纤维素的材料、基于琼脂糖的材料、基于葡聚糖的材料、基于甲基丙烯酸酯的材料、基于sepharose的材料、或其组合。在一些实施方案中，支持基底是多孔的。
在一些实施方案中，支持基底包含聚合物，例如如但不限于聚苯乙烯或聚(甲基丙烯酸甲酯)。
在一些实施方案中，在固体支持基底是多孔的情况下，阴离子交换树脂可以与所述基底的外层缀合。在另一些实施方案中，阴离子交换树脂与固体支持基底的内部缀合。在另一些实施方案中，对于阴离子交换树脂在固体支持树脂上缀合的位置，不作区分。
作为一个非限制性实例，并且不希望受理论束缚，多孔固体支持基底是有益的，因为其有利于在与非多孔材料具有类似体积的同时增加用于结合的表面积。在一些实施方案中，增加的表面积可以是有益的，例如，有益于提高系统的结合能力、或提高系统的动力学、或二者同时实现。
在一些实施方案中，固体支持基底是珠或球体，其最大截面尺寸为约10至100μm、约20至90μm、约30至80μm、约40至70μm、或约50至60μm。
在另一个实施方案中，支持基底是珠或球体，其最大截面尺寸为约0.01至10μm、约0.1至9.0μm、约1.0至8.0μm、约2.0至7.0μm、约3.0至6.0μm、或约4.0至5.0μm。
在一些实施方案中，支持基底具有特定的外表面积。在一些实施方案中，外表面积为约3×10-4至3×102μm2、约3×10-2至2.5×102μm2、约1至2×102μm2、约1×101至1.5×102μm2、约3×101至1×102μm2、约5×102至1.0×102μm2、约3×102至3×104μm2、约1×102至2.5×104μm2、约3×103至2×104μm2、约5×103至1.5×104μm2、或约7×103至1.5×104μm2。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液可以定位在流体装置的一个或更多个贮存器或通道中。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液的pH为约3.0至7.5、约3.5至7.0、约4.0至6.5、约4.5至6.0、或约5.0至5.5。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液的盐浓度为约0.5M至3.0M、约0.75M至2.75M、约1.0M至2.5M、约1.25M至2.25M、或约1.5M至2.0M。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含一种或更多种如上所述的表面活性剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，表面活性剂包括但不限于吐温和Triton-X。在一些实施方案中，吐温和/或Triton-X浓度为约0.01％至1.0％(v/v)、约0.1％至0.9％(v/v)、约0.2％至0.8％(v/v)、约0.3％至0.7％(v/v)、或约0.4％至0.6％(v/v)。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含一种或更多种洗涤剂。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，洗涤剂包括但不限于两性离子洗涤剂。在一些实施方案中，两性离子洗涤剂浓度为约0.1×至350×CMC、约1.0×至300×CMC、约10×至250×CMC、约50×至200×CMC或约100×至150×CMC。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含以下一种或更多种：1)一价盐，例如如NaCl或KCl，其为约0至150mM、约10至250mM、约25至475mM、约50至525mM、或约75至750mM；2)缓冲至接近中性pH，例如约6-9；和3)表面活性剂，例如吐温-20或Triton X-100，其为约0.01％至1.0％(v/v)、约0.02％至0.9％(v/v)、约0.03％至0.8％(v/v)、约0.04％至0.7％(v/v)、或约0.05％至0.6％(v/v)。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液可以定位在流体装置的一个或更多个贮存器或通道中。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约11.5至13.5。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含缓冲剂，例如磷酸钠或磷酸钾。在一些实施方案中，洗脱缓冲液中磷酸钠或磷酸钾的浓度为约0.01M至1M、约0.1M至1.8M、约0.4M至1.6M、约0.8M至1.4M、或约1.0M至1.2M。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含氢氧化钠或氢氧化钾。在一些实施方案中，氢氧化钠或氢氧化钾的浓度为约10至500mM、约30至450mM、约50至400mM、约70至350mM、约90至300mM、约110至250mM、或约130至200mM。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含一价盐。在一些实施方案中，305中洗脱缓冲液中一种或更多种一价盐的浓度为约0mM至200mM、约25mM至175mM、约50mM至150mM、约75mM至125mM、或约90mM至110mM。在一些实施方案中，洗脱缓冲液不包含任何一价盐。
合适缓冲剂的另一些非限制性实例包括tris、磷酸钠和磷酸钾。在一些实施方案中，在洗脱缓冲液中缓冲剂的浓度为约1mM至500mM、约50mM至450mM、约100mM至400mM、约150mM至350mM、或约200mM至300mM。
在一些实施方案中，侵入缓冲液可以定位在流体装置的一个或更多个贮存器或通道中。
在一些实施方案中，侵入缓冲液包含一种或更多种一价盐。在一些实施方案中，一价盐是NaCl或KCl。在一些实施方案中，侵入缓冲液中一价盐的浓度为约1mM至150mM、约5mM至145mM、约15mM至130mM、约25mM至115mM、约35mM至100mM、约45mM至85mM、或约55mM至70mM。在一些实施方案中，侵入缓冲液不包含一价盐。
在一些实施方案中，侵入缓冲液包含一种或更多种表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂降低非特异性结合。在一些实施方案中，侵入缓冲液中表面活性剂的浓度为约0.01％至1.0％(v/v)、约0.1％至0.9％(v/v)、约0.2％至0.8％(v/v)、约0.3％至0.7％(v/v)、或约0.4％至0.6％(v/v)。
在一些实施方案中，侵入缓冲液包含改变排除体积的组分(例如，拥挤剂(crowding agent))。作为实例，但不作为限制，拥挤剂包括但不限于聚-乙二醇(EG)、EG-200、EG-250、EG-300、EG-400、EG-500、EG-750、EG-1,000、EG-9,500、EG-2,000、EG-4,000、EG-5,000、EG-6,000、EG-8,000、EG-10,000、EG-12,000、EG-13,000、EG-20,000、葡聚糖(DX)、聚乙烯醇(PVA)、Ficoll(FC)、DX-1,000、DX-5,000、DX-12,000、DX-50,000、DX-80,000、PVA 89k-98k、PVA 85k-124k、PVA 130k、PVA 31k-50k、PVA50k-80k、PVA 70k-100k、PVA90k-120k、PVA 170k-250k、PVA 61k、PVA31k、PVA 130k、PVA 67k、PVA 27k、PVA 25k、FC-400、FC-70、FC-40、甘油、葡萄糖和蔗糖。在一些实施方案中，侵入缓冲液中拥挤剂的浓度范围为侵入缓冲液的总体积的约1％至20％(v/v)、约3％至17％(v/v)、约6％至14％(v/v)、或约9％至11％(v/v)。
在一些实施方案中，侵入缓冲液包含一种或更多种DNA变性剂。作为实例，但不作为限制，DNA变性剂包括但不限于DMSO、甲酰胺和甜菜碱。侵入缓冲液。在一些实施方案中，DMSO和/或甲酰胺为侵入缓冲液的总体积的约1％至30％(v/v)、约5％至25％(v/v)、约10％至20％(v/v)或约14％至16％(v/v)。在一些实施方案中，侵入缓冲液中甜菜碱的浓度为约0.1M至2.5M、约0.5M至2.0M、或约1.0M至1.5M。
在一些实施方案中，洗涤缓冲液例如DIANA洗涤缓冲液在添加DIANA之后用作洗涤缓冲液。
在一些实施方案中，DIANA洗涤缓冲液包含以下一种或更多种：1)一价盐，例如如NaCl或KCl，其为约50至650mM、约100至600mM、约150至550mM、约200至500mM、约250至450mM、或约300至400mM；2)缓冲至接近中性pH，例如约6-9；和3)表面活性剂，例如吐温-20或Triton X-100，其为约0.1％至1.0％(v/v)、约0.2％至0.9％(v/v)、约0.3％至0.8％(v/v)、约0.4％至0.7％(v/v)、或约0.5％至0.6％(v/v)。在一些实施方案中，加热洗涤缓冲液。
在一些实施方案中，DIANA洗涤缓冲液包含一种或更多种DNA去稳定剂或变性剂，例如DMSO、甜菜碱和甲酰胺。在一些实施方案中，DMSO和/或甲酰胺为侵入缓冲液的总体积的约10％至30％(v/v)、约15％至25％(v/v)、约10％至20％(v/v)或约14％至16％(v/v)。在一些实施方案中，侵入缓冲液中甜菜碱的浓度为约0.1M至2.5M、约0.5M至2.0M、或约1.0M至1.5M。
在一些实施方案中，DIANA洗涤缓冲液的pH高于9.0并且包含约0mM至300mM、约50mM至250mM、约100mM至200mM、或约125mM至175mM的一价盐和/或表面活性剂。在一些实施方案中，洗涤缓冲液的pH低于6.0并且包含约0mM至800mM、约50mM至750mM、约100mM至700mM、约150mM至650mM、或约200mM至600mM、约250mM至550mM、约300mM至500mM、或约350mM至450mM的一价盐和/或表面活性剂。
在一些实施方案中，洗涤过程持续约0.01至5分钟、约1至10分钟或约5至30分钟。在一些实施方案中，进行多个洗涤步骤，其中在各个洗涤步骤之间将固体基底固定。在一些实施方案中，向洗涤缓冲液中添加核酸，dsDNA或ssDNA或二者。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA洗涤步骤包括洗涤尺寸为约14至18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度限定为约：TM(DNA)+20℃，并且较高的洗涤温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA洗涤步骤包括洗涤大于18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度限定为约：TM(DNA)+0.9℃×(碱基数)，并且较高的洗涤温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA洗涤步骤包括洗涤少于/短于14个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的洗涤温度限定为约：TM(DNA)+1.25℃×(碱基数)，并且较高的洗涤温度为99℃。
在一些实施方案中，进入装置的气体或液体通过设置在装置中的至少一个多孔膜进行灭菌。在一些实施方案中，多孔膜的表面是亲水性的或疏水性的。在一些实施方案中，多孔膜是疏油性的。
在一些实施方案中，灭菌多孔膜的孔为约0.02μm至10μm、约0.05μm至4μm、约0.1μm至3μm、或约1.0μm至50μm。
在一些实施方案中，对气体进行基于UV的去污染过程。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，可检测标记包括但不限于荧光染料、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶、甲氧基香豆素、丹酰、芘、Alexa Fluor 350、AMCA、Marina Blue染料、dapoxyl染料、二烷基氨基香豆素、bimane、羟基香豆素、cascade blue染料、Pacific Orange染料、Alexa Fluor 405、Cascade Yellow染料、Pacific Blue染料、PyMPO、Alexa Fluor 430、荧光素、Alexa Fluor 488、Oregon Green 488、BODIPY493/503、Oregon Green 514、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、BODIPY TMR、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、BODIPY 558/568、Rhodamine Red染料、Alexa Fluor 568、BODIPY 581/591、Alexa Fluor 594、德克萨斯红染料、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、AlexaFluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750和Alexa Fluor 790。
作为实例，但不作为限制，能够间接检测的可检测标记包括但不限于地高辛配基(DIG)、生物素或二硝基苯基。
在一些实施方案中，可检测标志物可以产生例如通过使用者的视觉检查和/或荧光检测方法可检测的光学信号。
在一些实施方案中，扩增子大于约400bp。在一些实施方案中，扩增子为约400至4000bp、约700至3700bp、约1000至3400bp、约1300至3100bp、约1600至2700bp、约1900至2400bp、或约2100至2200bp。在一些实施方案中，使用上文公开的长度的扩增子对于本文公开的方法中的下游处理(例如，微生物基因组物质的检测和鉴定)是有利的。
在一些实施方案中，可以使用以下引物中的一些或全部：
Figure BDA0003521052760000461
在一些实施方案中，另外和/或替代的引物序列可以用于扩增微生物基因组物质。引物序列开发是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，仅扩增细菌基因组物质。在一些实施方案中，仅扩增真菌基因组物质。在一些实施方案中，扩增真菌和细菌靶标二者。在一些实施方案中，扩增合成靶标。在一些实施方案中，合成靶标包括但不限于质粒和合成基因。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，质粒包括DNA片段，例如如M13mp18、pBR322、pCLIPf、pCLus、pCMV-Cluc、pKLAC2、PMAL-p5x、pNEB206A、pSNAPf、pSV40-CLuc、pTK-GLuc、pTXB1、pTYB21、pUC19和θX174。
在一些实施方案中，DIANA探针以液体形式储存，而在一些优选实施方案中，DIANA探针干燥储存。
在一些实施方案中，用于微生物检测和鉴定的DIANA的一些示例性寡聚体序列列于表1中。
Figure BDA0003521052760000471
在一些实施方案中，DIANA探针用于检测和鉴定抗生素抗性微生物细胞。用于鉴定这些核酸生物标记的序列的一些非限制性实例列于表2中。
Figure BDA0003521052760000481
在一些实施方案中，DIANA和微生物基因组物质(例如，扩增的微生物DNA)的孵育在约65℃至99℃、约70℃至95℃、约75℃至90℃、或约80℃至85℃的温度下进行。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA添加操作包括具有约14至18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的侵入温度限定为约：TM(DNA)+15℃，并且较高的侵入温度为99℃。TM(DNA)定义为当置于几乎相同的溶液条件(电解质强度、缓冲液、pH、其他添加剂等)下时与DIANA寡聚体具有相同的组成和序列的DNA寡聚体的解链温度。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA添加操作包括使用大于18个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的侵入温度限定为约：TM(DNA)+0.7℃×(碱基数)，并且较高的侵入温度为99℃。
作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，DIANA添加操作包括使用少于/短于14个碱基的DIANA寡聚体，其中较低的侵入温度限定为约：TM(DNA)+1.1℃×(碱基数)，并且较高的侵入温度为99℃。
在一些实施方案中，DIANA被修饰以包含结合部分。在一些实施方案中，结合部分使DIANA结合至固体基底。在一些实施方案中，使DIANA结合至固体基底可用于下游的分离或洗涤步骤。作为实例，但不作为限制，在一些实施方案中，结合部分包括但不限于非共价结合部分(例如如生物素、地高辛、毛地黄毒苷)或共价结合部分(例如，COOH基团、NHS-酯基团、马来酰亚胺(malemide)化学和点击化学(Click chemistry))。
在一些实施方案中，结合部分通过一个或更多个接头与DIANA探针隔开。在一些实施方案中，接头是单个分子。在一些实施方案中，接头由多个单独分子的线性或支化链构成，所述分子组合以产生单个接头分子。
在一些实施方案中，接头选自：(乙烯)二醇、二(乙烯)二醇、三(乙烯)二醇、聚(乙烯)二醇、碳接头、氨基酸、基于硅烷的接头、或其任意组合。在一些实施方案中，接头用于使DIANA标记的DNA片段与DIANA结合至的固相基底的表面隔开。
在一些实施方案中，接头可以是支化的。作为实例，但不作为限制，具有从DIANA探针起始并且在特定距离之后分支或分成两个或更多个接头的接头可以是有益的，其中每个分支或新接头包含一个或更多个结合部分。
在一些实施方案中，接头长度为约20至200、约40至180、约60至160、约80至140、或约100至120个原子。在一些实施方案中，接头长度为至少40个原子。所公开的接头长度在本领域中不常用。
在一些实施方案中，沿着单个接头使用一个或更多个结合部分。在一些实施方案中，两个或更多个结合部分沿着单个接头，其中每个接头具有1个或更多个结合部分，并且其中每个结合部分沿着寡聚体附接到不同的位置。在一些实施方案中，多个结合部分提高表面结合动力学和/或产率和/或效率和/或强度。
在一些实施方案中，首先用一种或更多种DIANA标记DNA扩增子，然后将杂交复合体捕获到固相表面上。
在一些实施方案中，在捕获扩增子之前，将DIANA与固体表面一起孵育。
在一些实施方案中，固相表面是珠、纳米颗粒、微粒或平坦基底。在一些实施方案中，固相表面被进一步化学修饰以促进DIANA与其的结合。
在一些实施方案中，本文描述的方法和/或装置可以用于来自单个全血样品的超过10种单独微生物病原体的分析(例如，鉴定、和/或检测、和/或筛选、和/或定量)。在一些实施方案中，引入流体装置中的全血样品的体积为至少1mL。在一些情况下，本文描述的方法和/或流体装置可以用于细菌和/或真菌的分析(例如，鉴定、和/或检测、和/或筛选、和/或定量、和/或监测)。在一些实施方案中，分析包括高灵敏度化学发光检测。
在一些实施方案中，所述方法和/或装置通过化学反应(例如，不使用机械力或电力)在单个反应中并行地裂解细菌和真菌二者。在某些实施方案中，本文所述的方法和/或装置包括在不使用离心机的情况下从全血样品中耗尽选定真核生物DNA。在某些实施方案中，本文所述的方法和/或装置在裂解过程期间不剪切基因组物质(例如，从而能够提取和/或分离长度通常超过5kbp的高分子量基因组物质)。在某些实施方案中，本文所述的方法和/或装置包括酶促产生长度大于1000bp的扩增子。在一些情况下，本文所述的方法和/或装置包括在30分钟以内将DNA固定到固体基底，其中DNA长度大于1kbp。
在一些实施方案中，本文所述的方法和/或装置不需要使用任何离液盐用于其任何过程。
在某些实施方案中，本文所述的方法和/或装置包含DIANA探针用于以序列高序列特异性捕获DNA并将DNA固定到固体表面或基底。在一些情况下，本文描述的方法和/或装置包括在一个或更多个处理室中合并多种DIANA探针，使得一种或更多种信号的组合说明病原体的鉴定(例如，从而降低为说明病原体鉴定所需的处理室的数目)。
在一些实施方案中，本文描述的一个或更多个操作或一组操作可以半自动或自动地进行。
在某些实施方案中，一个或更多个流体贮存器可以储存一种或更多种试剂和/或可以配置成接收废流体。
在一些实施方案中，所述方法和/或装置包括沿在正方向和负方向二者上的三个平面(X、Y和Z)转移(例如，流动)一种或更多种流体(例如，通过使用流动限制性结构)。在某些实施方案中，用于将流体从第一流体贮存器转移至第二流体贮存器的多个流体通道位于单个平面内。在某些实施方案中，在流体装置中流动的一种或更多种流体可以具有相对大的体积(例如，0.5至10ml)或相对减小的体积(例如，0.01μl至500μl)。
在一些情况下，所述方法和/或装置包括通过将无菌气体作为流或作为脉冲添加到室来混合、搅拌和/或均化流体(例如，和一种或更多种试剂)。
在一些实施方案中，在一个或更多个检测区中存在信号(例如，光学信号)指示存在特定微生物病原体的基因组物质。在一些实施方案中，通过组合学(例如，多重)方法提供特定分析物(例如病原体)的检测。在这样的方法中，检测到的分析物的种数可以大于用于检测的活性检测区的数量。在一些实施方案中，流体装置包含两个或更多个检测区。在一些实施方案中，检测一种或更多种扩增子(例如，通过产生可检测的信号，例如光学信号)的检测区的特定组合可以指示一种或更多种特定病原体的存在。
在一个实例中，在第一检测区和第二检测区而非第三检测区中检测到的信号指示患者样品中存在第一病原体。在第一检测区和第三检测区而非第二检测区中检测到的信号指示患者样品中存在与第一病原体不同的第二病原体。
使用组合学方法进行检测相对于传统的1对1检测方法(例如，在单个孔中检测病原体和/或多个孔中的单病原体检测)可以提供数个优点，包括例如，简化流体通道设计、减小占用空间、减少处理时间、提高精度和/或简化检测。
在一些实施方案中，单一类型的光学信号(例如，特定波长或频率的光学信号)可以用于检测多种病原体。例如，单荧光标签可以用于流体装置中，并且在病原体存在下，一个或更多个检测区从荧光标签产生可检测的光学信号，指示存在特定微生物病原体的基因组物质。
作为实例，但不作为限制，如果希望使用的病原体组包含以下微生物病原体：金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、白念珠菌、光滑念珠菌和克鲁斯氏念珠菌，可以使用以下4种室布局用于基于DIANA的过程：反应室(1)：SEQ ID NO 23；反应室(2)：SEQ ID No 1和17；反应室(3)：SEQ ID NO 4和18；反应室(4)：SEQ ID No 10和19。因此，如果作为实例而非限制检测到金黄色葡萄球菌，则反应室1和2将产生可检测的信号。可替代地，如果作为实例而非限制检测到光滑念珠菌，则反应室3将产生可检测的信号。
在病原体特异性基因组物质的情况下，可以将与特定病原体相关的每种不同病原体基因组物质(PGM)鉴定为PGMn，其中n＝1、2、3、...、n。例如，在一些实施方案中，在鉴定十五种潜在病原体之一的流体装置设计中，流体装置可以鉴定PGMn，其中n＝1、2、3、...、15，其中可以使用8个检测区对十五种潜在病原体进行检测。在表3中所示的一个示例性实施方案中，一个或更多个检测区中特定捕获寡聚体的存在将指示患者样品中特定病原体的存在。
表3
Figure BDA0003521052760000521
例如，在一个具体实施方案中，如果在检测区1和4中产生可检测信号，则唯一的共有PGM是PGM1，指示患者样品中存在对应于PGM1的特定病原体。作为另一个实例，在另一个实施方案中，如果在检测区1和7中产生可检测信号，则唯一的共有PGM是PGM4，指示患者样品中存在对应于PGM4的特定病原体。
基于本说明书的教导，本领域技术人员将理解，这样的组合学方法不限于15种潜在病原体和/或8个检测区，而流体装置可以用于使用两个或更多个(例如，四个或更多个、六个或更多个、八个或更多个、十个或更多个、十二个或更多个、十五个或更多个)检测区来检测两种或更多种、四种或更多种、六种或更多种、八种或更多种、十种或更多种、十二种或更多种、十五种或更多种、或者二十种或更多种病原体。
在一些实施方案中，一种或更多种病原体的检测不使用组合学方法。例如，在某些实施方案中，每个检测区对应于单一病原体。
在另一个示例性实施方案中，流体装置包含具有针对以下的捕获寡聚体的检测区：
1.五种不同的真菌病原体：F1、F2、F3、F4和F5
2.五种不同的革兰氏阳性病原体：GP1、GP2、GP3、GP4和GP5
3.五种不同的革兰氏阴性病原体：GN1、GN2、GN3、GN4和GN5
4.三种另外的病原体，其分别是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或真菌的任意组合-A1、A2和A3。
在一个这样的示例性实施方案中，一种或更多种病原体的基于组合学的检测示于表4中。
表4
Figure BDA0003521052760000531
例如，在这样的实施方案中，18种不同的病原体使用11个检测区。在一个示例性实施方案中，检测区1和11中信号的检出将指示F1的检出，而检测区2和8中信号的检出将指示GP2的检出。信号和病原体的其他组合也是可能的。
实施例
以下实施例旨在举例说明本文所述的某些实施方案(包括本发明的某些方面)，但不例示本发明的全部范围。
实施例0
以下实施例展示了使用如本文所述的流体装置的一组示例性操作。
在一些实施方案中，在流体装置中进行的该组操作包括以下步骤或过程中的一个或更多个：(1)从样品中选择性地耗尽选定真核生物DNA；(2)裂解输入样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物基因组物质；(3)分离这多种微生物基因组物质(即DNA和/或RNA)；(4)扩增这多种微生物基因组物质；(5)使扩增的微生物基因组物质(本文中为“扩增子”)与多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)接触和/或向扩增的微生物基因组物质(本文中为“扩增子”)引入多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)，其中每种DIANA靶向源自特定病原体或病原体组群的一种或更多种扩增子，以及检测一种或更多种DIANA与其靶扩增子的结合，其中结合的检出指示原始样品中存在一种或更多种特定的微生物物种。
在一些实施方案中，该组操作包括：(1)选定真核生物细胞裂解并去除释放的基因组物质；(2)病原体裂解；(3)微生物基因组物质的分离；(4)酶促扩增；和(5)基于DNA侵入人工核酸(DIANA)的检测\分类\鉴定。
在一些实施方案中，该组操作包括：(1)从样品中耗尽选定真核生物DNA；(2)裂解样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物基因组物质；(3)分离多种微生物基因组物质；(4)扩增多种微生物基因组物质；(5)使扩增的微生物基因组物质与多种DNA侵入人工核酸(DIANA)接触；和(6)检测一种或更多种DIANA与其相应单一微生物物种或微生物组群的微生物基因组物质的结合，其中结合的检出指示原始样品中存在一种或更多种特定微生物物种或微生物组群。
实施例1：从全血中选择性地去除选定真核生物DNA
该实施例表明，使用本文所述的方法和装置从全血中选择性地去除hDNA。
用于从全血中选择性地去除选定真核生物DNA的装置的一个示意图示于图6A-6B中。
方法
将1.5ml未经处理人全血样品加入装置中的初始贮存器中。为了引发反应，使1.5ml血液样品通过气体力学流入反应贮存器，该反应贮存器包含1.75ml含有约0.5％(v/v)吐温20和Triton X-100的选择性裂解溶液。将合并的血液-选择性裂解溶液混合物在环境温度(约21℃)下孵育并搅拌约1分钟。搅拌通过向贮存器中添加无菌空气来进行。同样地在室温下，通过添加pH等于约7.0含有4M NaCl的裂解终止溶液终止反应。
在终止裂解过程之后，使合并的血液-选择性裂解溶液混合物流入包含约1mg二乙基乙醇胺偶联的磁珠(例如，支持基底)(直径为约500nm至1μm)的新贮存器中，即将磁珠和溶液在室温下在温和搅拌下孵育5分钟。
在孵育和搅拌期之后，将稀土磁体引到贮存器外部以将珠固定到贮存器的壁上。将上清液从贮存器中移出并通过气体力学流至新的贮存器。
该过程的最终结果是，现在固定的磁珠包含从血液样品中提取的选定真核生物DNA，而最终的混合物或上清液在很大程度上耗尽了选定真核生物DNA。
通过基于吸收的测定来量化hDNA输出。
上述所有处理步骤进行5次，其中表5中所示的结果显示为平均值±S.dev。
表5
Figure BDA0003521052760000551
实施例2：真菌18S的γPNA检测
该实施例表明，预先用宽范围PCR方法扩增的真菌18S扩增子可以在对基于γ-修饰PNA的检测具有特异性的自动化装置上鉴定。此外，该实施例突出，由于低背景和脱靶结合，靶DNA通常可以被区分到物种水平。
方法
将预先用半抗原修饰引物扩增的白念珠菌全长18S用作受试分子。在初始化研究之后，将0.5飞摩尔的白念珠菌全长18S等分到装置贮存器中的5个贮存器中，每个贮存器装载有对白念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌(C.krusei)、热带念珠菌(C.tropicalis)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis)具有特异性的单一生物素化γ-修饰PNA探针类型，其具有表1中标示的序列。将含有吐温-20、NaCl和聚-EG-12,000的侵入缓冲液引入到5个贮存器中的每一个中，使每个贮存器填充至约200μl的体积。并行地将每个贮存器加热至75℃5分钟，在此之后从MyOne C1链霉亲和素储存用贮存器中向每个贮存器中引入50μl MyOne C1链霉亲和素包被珠。将合并的DNA-γPNA-珠混合物通过使无菌空气流入每个贮存器中搅拌约3分钟。
在将γPNA固定在珠上之后，将珠固定，去除缓冲液，然后在至少75℃至95℃的温度下在包含150至550mM NaCl的溶液中重悬并洗涤。在洗涤之后，向每个贮存器中添加包含靶向引物-半抗原的HRP-缀合物的溶液，其与在捕获的扩增子上的游离半抗原(如果存在的话)结合。在中性低盐洗涤下进行多个洗涤步骤之后，添加鲁米诺以仅在捕获微生物DNA的地方产生明显的光学特征。使用Promega GloMax读板仪读取光学特征，其中积分时间为2.5秒/孔。
为了比较目的，类似的研究“在工作台上”完成。
结果：仅在白念珠菌通道中观察到可清楚识别的光学特征(其来自用对白念珠菌具有特异性的γ-修饰PNA探针激活的室)。参见图7。
这些结果表明，本文公开的组合物、方法和装置可以鉴定至少一种特定的病原体扩增子。因此，本文公开的组合物和方法可用于检测和鉴定微生物。
实施例3：一组微生物16S/18S的γPNA检测
该实施例表明，预先用宽范围PCR方法扩增的微生物16S/18S扩增子可以在对基于γ-修饰PNA的检测具有特异性的自动化装置上鉴定。此外，该实施例突出，由于低背景和脱靶结合，靶DNA可以被区分到物种水平。
方法
将预先用半抗原修饰引物扩增的来自阴沟肠杆菌、屎肠球菌或光滑念珠菌的全长16S/18S用作受试分子。在初始化研究之后，将0.5飞摩尔的扩增的全长16S/18S等分到装置的流体贮存器中的17个贮存器中，每个贮存器装载有对表1中突出显示的病原体的列表具有特异性的单一生物素化γ-修饰PNA探针类型，其具有如表1中同样标示的序列。将含有吐温-20、NaCl和聚-EG-12,000的侵入缓冲液引入到17个贮存器中的每一个中，使每个贮存器填充至约200μl的体积。并行地将每个贮存器加热至75℃5分钟，在此之后从MyOne C1链霉亲和素储存用贮存器中向每个贮存器中引入50μl MyOne C1链霉亲和素包被珠。将合并的DNA-γPNA-珠混合物通过使无菌空气流入每个贮存器中搅拌约3分钟。
在将γPNA固定在珠上之后，将珠固定，去除缓冲液，然后在至少75℃至95℃的温度下在包含150至550mM NaCl的溶液中重悬并洗涤。在洗涤之后，向每个贮存器中添加包含靶向引物-半抗原的HRP-缀合物的溶液，其与在捕获的扩增子上的游离半抗原(如果存在的话)结合。在中性低盐洗涤下进行多个洗涤步骤之后，添加鲁米诺以仅在捕获微生物DNA的地方产生明显的光学特征。使用Promega GloMax读板仪读取光学特征，其中积分时间为2.5秒/孔。
结果：仅在阴沟肠杆菌(顶部)、屎肠球菌(中间)和光滑念珠菌(底部)通道中观察到可清楚识别的光学特征(其分别来自用对阴沟肠杆菌、屎肠球菌和光滑念珠菌具有特异性的γ修饰PNA探针激活的贮存器)。参见图8。
这些结果表明，本文公开的组合物、方法和装置可以鉴定至少一种特定的病原体扩增子。因此，本文公开的组合物和方法可用于检测和鉴定微生物。
实施例4：基因组物质的基于装置的PCR扩增
该实施例表明，微生物基因组物质可以在自动化装置上以高灵敏度扩增，该自动化装置被开发包括前述多步骤方法中的前四个步骤：1)从样品中选择性地耗尽选定真核生物DNA；(2)裂解输入样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物基因组物质；(3)分离这多种微生物基因组物质(即DNA和/或RNA)；和(4)扩增这多种微生物基因组物质。
方法
在这些研究中，使用预先提取的来源于白念珠菌的基因组物质作为DNA模板。使用以下基因组输入物如制造商的方案(Q5，New England BioLabs)中所限定的设置50μl PCR反应：130个拷贝、26个拷贝、5个拷贝、1个拷贝和不添加模板(阴性对照)。具有以下序列的引物对用于扩增基因组物质：
Figure BDA0003521052760000581
扩增循环采用以下方案：98℃30秒；随后进行4个以下循环：98℃10秒，62℃30秒，和72℃45秒；随后进行26个以下循环：98℃10秒，和72℃45秒；随后是72℃2分钟。
所有过程均在标准0.2ml PCR管中完全相同地在装置上和在工作台上完成。在处理之后，将约13％的样品装载在1％凝胶上并运行，并使用SYBR安全嵌入染料在自制成像系统上成像。
结果：低至单个拷贝都检测到明显可识别的光学特征，，其中阴性对照反应不产生可量化的结果。参见图9。
这些结果表明，本文公开的组合物、方法和装置可以以高灵敏度酶促扩增微生物基因组物质，其结果与在工作台上完成的结果相当。
实施例5：全血样品中微生物基因组物质的基于装置的提取
该实施例表明，可以在自动化装置上以高灵敏度从未经处理的全人血中提取和分离微生物基因组物质，该自动化装置被开发包括前述多步骤方法中的前四个步骤：1)从样品中选择性地耗尽选定真核生物DNA；(2)裂解输入样品中的一种或更多种微生物细胞，其中一种或更多种微生物细胞的裂解释放多种微生物基因组物质；(3)分离这多种微生物基因组物质(即DNA和/或RNA)；和(4)扩增这多种微生物基因组物质。
方法
向抽吸到EDTA vacuette中的新鲜人全血接种50CFU/ml和16CFU/ml的白念珠菌(ATCC#90028)。提取1.5ml人造人血液并置于新的瓶中。将1.5ml样品装载到装置中并气动地流入包含WAX磁珠的反应贮存器中。向1.5ml血液样品中，气动地添加从其储存用贮存器流出的1.5ml包含吐温-20(v/v)和Triton-X100(v/v)的选择性或温和裂解溶液。在约5分钟之后，向合并的混合物中添加NaCl至终浓度为150至300mM，并添加WAX缀合的磁性颗粒。在约2分钟之后，使用稀土磁体将磁性颗粒固定到瓶表面，移出约3ml溶液，并使其气动地流入新贮存器中，所述新贮存器包含交联且经亲和纯化的溶菌酶(2至13mg)、变溶菌素(10至350U)、酶解酶(18至200U)和溶葡萄球菌素(65至250U)以及含有吡喃葡萄糖苷、阳离子洗涤剂和磺基甜菜碱的基于洗涤剂的试剂(其所有都在高于其各自CMC的浓度下(>10×))。微生物裂解反应还包括EDTA(约10mM)和2-巯基乙醇(约25mM)。
将合并的反应混合物搅拌约10至15分钟，在此之后混合物气动地流入包含WAX-修饰的磁珠的新贮存器中。在该贮存器中，将合并的溶液-珠混合物搅拌约1至5分钟，在此之后使用稀土磁体将磁性颗粒固定到瓶的表面，并使溶液气动地流出贮存器。
然后，通过流动包含1M NaCl的洗涤溶液使珠重悬，搅拌珠，固定珠并除去洗涤溶液来重复洗涤珠。洗涤2至3次之后，用从其专用储存用贮存器气动地流至贮存器的缓冲至pH 12.5的洗脱试剂从珠上洗脱微生物DNA。然后，将溶液从装置中移出并在工作台上进行处理。
使用以下引物序列(5'-3')对微生物DNA进行全长rDNA的PCR：
Figure BDA0003521052760000591
每种引物包含半抗原部分用于随后的标记。在PCR之后，将样品等分到5个贮存器中，每个贮存器装载有针对白念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯氏念珠菌、热带念珠菌和通用真菌的具有表1中标示的序列的生物素化γ修饰PNA探针，和包含吐温-20、NaCl和聚-EG-12,000的侵入支持试剂。将每个孔加热至70℃至95℃1至5分钟，并添加5ml MyOne C1链霉亲和素包被珠贮存液。在将γPNA探针固定在珠上之后，将珠在至少75℃至95℃的温度下在包含150至550mM NaCl的溶液中洗涤。在洗涤之后，向每个贮存器中添加包含靶向引物-半抗原的HRP-缀合物的溶液，其与在捕获的扩增子上的游离半抗原(如果存在的话)结合。在中性低盐洗涤下进行多个洗涤步骤之后，添加鲁米诺以仅在捕获微生物DNA的地方产生明显的光学特征。使用Promega GloMax读板仪读取光学特征，其中积分时间为2.5秒/孔。
结果：仅在白念珠菌和通用真菌通道中观察到可清楚识别的光学特征(其来自用对白念珠菌和通用真菌具有特异性的γ修饰PNA探针激活的贮存器)。完全在工作台上完成的比较研究产生类似的结果。对于50CFU/ml研究，参见图10A；对于16CFU/ml研究，参见图10B。
实施例6:混合/重悬
以下实施例展示了使用流体装置来混合/重悬流体的一组示例性操作(例如，使用图12A中所示的装置部分)。
在一个实验中，反应发生在如本文所述的流体装置中，其中DNA与大量重悬于100μl体积的Gu-HCl基水溶液中的磁珠/磁性颗粒(例如，支持基底；平均直径1±0.15μm)结合。一个或更多个洗涤步骤(例如，以去除与磁珠的非特异性结合)可以如下进行：在1psi的压力下使反应混合物从与通道流体连通的上游反应室(例如，图12A中未示出；流体贮存器1210的上游)通过与阀(例如，图12A中的阀1245)相关联的第一入口通道(例如，图12A中的通道1240)流至容积为约100μl(例如，25mm长×3mm深×1.33mm宽的尺寸)的第一流体贮存器(例如，图12A中的流体贮存器1210)，其被构造成具有半透膜作为贮存器的盖。在流动过程期间，在第一流体贮存器下游并且与连接通道(例如，图12A中的连接通道1230，例如具有3mm深、4cm长和0.15mm宽的尺寸)连接的阀(例如，图12A中的阀1235)被关闭。这使第一贮存器填充至完全，因为空气通过穿过半透膜从该贮存器中除去。
使磁体靠近(例如，如下所述)第一流体贮存器，以将所述体积的磁珠表面固定到第一流体贮存器的底部。然后，打开与连接通道相关联的阀(例如，阀1235)。向第一流体贮存器中引入1psi的气体(例如空气)，以经由连接通道将反应混合物推出第一流体贮存器。在将反应混合物从第一流体贮存器中移出之后，关闭与连接通道相关联的阀。然后，将磁体从靠近第一流体贮存器移开(任选步骤)。向第一流体贮存器中引入洗涤溶液(例如，1MNaCl、10mM Tris-HCl，pH 7.2)。为了重悬并洗涤磁珠，在引入洗涤溶液之后，打开与连接通道相关联的阀(例如，阀1235)，并且将洗涤溶液和磁珠经由连接通道(例如，连接通道1230)转移到第二流体贮存器(例如，图12A中的流体贮存器1220)。第二流体贮存器与第一流体贮存器具有相同的容积和尺寸(但是其他配置也是可能的)，并且同样地被构造成具有在贮存器的顶部/作为贮存器的顶部的半透膜。第二流体贮存器流体连接到第二通道(例如，图12A中的通道1250)和与第二通道相关联的第二阀(例如，图12A中的阀1255)。在转移步骤期间关闭该第二阀。
经由连接通道和第一流体贮存器将洗涤缓冲液引入第二流体贮存器中。在该步骤期间打开与连接通道(例如，阀1235)和第二通道(例如，阀1255)相关联的阀。引入1psi的气体(例如空气)，经由第二通道将反应混合物经由连接通道推出第二流体贮存器，返回到第一流体贮存器中。在该步骤期间，关闭与第一通道相关联的阀(例如，阀1245)。通过重复在第一流体贮存器和第二流体贮存器之间转移或“穿梭”洗涤溶液的这一过程，可以重悬和/或洗涤磁珠。在完成磁珠的洗涤之后，可以将珠表面固定到第一流体贮存器，并且可以除去任何高盐洗涤溶液，从而准备好DNA结合珠用于下游反应/检测。
虽然本文中已描述并举例说明了本发明的数个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易预见用于进行本文中所述的功能和/或获得本文中所述的结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化方案和/或修改方案均被视为在本发明的范围之内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文中描述的所有参数、尺寸、材料和构造意为示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于使用本发明教导的具体应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文中所描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。因此，应理解的是，前述实施方案仅通过实例的方式给出，且在所附权利要求书及其等效文件的范围之内，可相对于具体描述和要求保护的以其他方式来实施本发明。本发明涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法。此外，如果这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法不相互不一致，则两个或更多个这样的特征、系统、制品、材料、套件和/或方法的任意组合也包括在本发明范围内。
除非明确指出相反，否则如本文中在说明书和权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词应理解为意指“至少一个/种”。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应被理解为意指如此连接的要素(即，在一些情况下联合存在而在另一些情况下分开存在的要素)中的“任一个或两个”。除非明确指出相反，否则除通过“和/或”子句所具体确定的要素之外，其他要素也可任选地存在，无论是否与具体确定的那些要素相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言(例如“包含/包括”)联合使用时对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可指A而没有B(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，可指B而没有A(任选地包括除A之外的要素)；在另一个实施方案中，可指A和B二者(任选地包括其他要素)等。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的“或/或者”应被理解为与如上限定的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或/或者”或“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，但是也包括多于一个，任选地包括另外的未列出项目。只有明确指出相反的术语(例如“仅之一”或“恰好之一”，或者，在权利要求书中使用时，“由......组成”)才将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性的术语(例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“恰好之一”)时，本文中使用的术语“或/或者”应仅解释为表示排他性的替代选择(即“一个或另一个但不是二者”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文中在本说明书和权利要求书中使用的，短语“选定真核生物”应理解为意指源自植物/真菌或哺乳动物来源。在一些实施方案中，使用动物(例如哺乳动物)真核细胞。在某些实施方案中，使用植物真核细胞。在一些情况下，使用真菌真核细胞。在一些实施方案中，处理(例如，裂解)样品的所有真核细胞。在一些实施方案中，哺乳动物真核细胞被处理，并且样品中的其他真核细胞(例如，真菌细胞)不被处理或裂解。
如本文中本说明书和权利要求书中使用的，短语“基因组”应理解为意指DNA和/或RNA。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的，关于一个或更多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包括要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任意组合。该定义还允许可任选地存在除短语“至少一个”所指在要素列表内明确确定的要素之外的要素，不论与那些明确确定的要素是否相关。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以指，至少一个A，任选地包括多于一个A，而不存在B(且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个B，任选地包括多于一个B，而不存在A(且任选地包括除A之外的要素)；在另一个实施方案中，可以指至少一个A，任选地包括多于一个A，以及至少一个B，任选地包括多于一个B(且任选地包括其他要素)等。
在权利要求书以及在上述说明书中，所有的过渡性短语例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等应理解为是开放式的，即意指包括但不限于。仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭式或半封闭式过渡性短语，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分中所述。
“对象”或“患者”是指任何哺乳动物(例如人)，例如可能易患疾病或身体病症的哺乳动物。对象或患者的一些实例包括人、非人灵长类、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠。一般地，本发明针对用于人。患者可以是被诊断患有特定疾病或身体病症或者以其他方式已知患有疾病或身体病症的对象。在一些实施方案中，患者可以被诊断为或已知处于发生疾病或身体病症的风险之中。在另一些实施方案中，患者可以被怀疑患有或发生疾病或身体病症，例如，基于多种临床因素和/或其他数据。
除非另外限定或指出，否则本文涉及例如一个或更多个制品、结构、力、场、流、方向/轨迹和/或其子组件和/或其任意组合和/或上文未列出的可通过此类术语表征的任何其他有形或无形元件或者其之间的形状、取向、排列和/或几何关系所使用的任何术语均应理解为不要求绝对符合此类术语的数学定义，而应理解为指示在如此表征的主题可能的程度上符合此类术语的数学定义，如与这样的主题最密切相关领域技术人员将理解的。涉及形状、取向和/或几何关系的此类术语的一些实例包括但不限于以下描述性术语：形状-例如圆的、方形的、圆形的/圆、矩形的/矩形、三角形的/三角形、圆柱形的/圆柱形、椭圆形的/椭圆、(n)多边形的/(n)多边形等等；角度取向–例如成直角的、正交的、平行的、垂直的、水平的、共线的等等；轮廓和/或轨迹-例如平面/平面的、共面的、半球形的、半-半球形的、线/线性的、双曲线的、抛物线的、平坦的、弯曲的、直线的、弧形的、正弦的、相切/相切的等等；方向-例如北、南、东、西等等；表面和/或本体材料特性和/或空间/时间分辨率和/或分布-例如平滑的、反射的、透明的、清澈的、不透明的、刚性的、不透的、均匀的(均匀地)、惰性的、不可湿润的、不溶的、稳定的、不变的、恒定的、同质的等等；以及对于相关领域技术人员来说显而易见的许多其他内容。作为一个实例，本文中被描述为“方形”的制造物品不要求这样的物品具有完全平面或线性且以恰好90度的角度相交的面或侧面(事实上，这样的物品只能作为数学抽象而存在)，而是这样的物品的形状应被解释为在所记载制造技术通常可实现且已实现的程度上接近数学上定义的“方形”，如本领域技术人员所理解的或具体描述的。作为另一个实例，在本文中被描述为“对齐”的两个或更多个制造物品不要求这样的物品具有完全对齐的面或侧面(事实上，这样的物品只能作为数学抽象而存在)，而是这样的物品的布置应被解释为在所记载制造技术通常可实现且已实现的程度上接近数学上定义的“对齐”，如本领域技术人员所理解的或具体描述的。
本申请母案的原始权利要求在此并入本说明书：
1.流体装置，其包含：
样品入口；
与所述样品入口流体连通的流体通道，其中所述流体通道的长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1；
与所述流体通道流体连通的第一裂解区；
与所述第一裂解区流体连通的第一分离区；
与所述第一分离区流体连通的第二裂解区；
与所述第二裂解区流体连通的第二分离区；
与所述第二分离区流体连通的至少一个反应区；
与至少一个所述反应区流体连通的扩增区；和
多个处理室，其各自与至少一个所述反应区和/或所述扩增区流体连通。
2.流体装置，其包含：
多个流体贮存器，其中每个流体贮存器的容积为至少0.1mL；
多个气体室，其中每个气体室与流体贮存器流体连通，并且其中每个气体室的容积为至少0.1mL；和
多个流体通道，其中每个流体通道与一个或更多个流体贮存器和/或一个或更多个气体室流体连通，并且其中每个流体通道的容积小于1000μL，
其中至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
3.流体装置，其包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道；
多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间；和
多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
4.流体装置，其包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
从所述流体枢纽分支的第一分支通道；
与所述第一分支通道流体连通的第一流体贮存器；
与所述第一流体贮存器流体连通的第一气体室；
从所述流体枢纽分支的第二分支通道；
与所述第二分支通道流体连通的第二流体贮存器；和
与所述第二流体贮存器流体连通的第二气体室。
5.流体装置，其包含：
第一流体贮存器；
与所述第一流体贮存器流体连通的第一通道；
与所述第一通道相关联的第一阀；
第二流体贮存器；
与所述第二流体贮存器流体连通的第二通道；
与所述第二通道相关联的第二阀；以及
定位在所述第一流体贮存器与第二流体贮存器之间的连接通道，
其中：
所述连接通道的至少一部分的截面面积小于所述第一流体贮存器的截面面积和所述第二流体贮存器的截面尺寸，并且
所述连接通道的长度大于或等于250微米且小于或等于10cm。
6.流体装置，其包含：
通道；
与所述通道连接的流体贮存器；
与所述流体贮存器流体连通的出口通道；
与所述出口通道相关联的阀；和
与所述流体贮存器相邻的盖，其中所述盖封闭所述流体贮存器，其中所述盖是半透膜，并且其中所述半透膜是疏水性的，其透气度在1psi下大于或等于0.4slpm且在1psi下小于或等于5slpm。
7.如权利要求5所述的流体装置，其包含与所述连接通道相关联的第三阀。
8.如权利要求7所述的流体装置，其中所述第三阀定位在邻近所述第一流体贮存器。
9.如权利要求7所述的流体装置，其包含与所述连接通道相关联的第四阀。
10.如权利要求9所述的流体装置，其中所述第四阀定位在邻近所述第二流体贮存器。
11.如权利要求1所述的流体装置，其包含与每个处理室流体连通的检测区。
12.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中每个流体贮存器的容积为至少0.1mL。
13.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中每个气体室与流体贮存器流体连通。
14.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中每个气体室的容积为至少0.1mL。
15.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中每个流体通道与一个或更多个流体贮存器流体连通。
16.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中每个流体通道的容积小于2000μL。
17.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
18.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述流体通道的长度为至少1cm。
19.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述流体通道的通道长宽比为至少5:1。
20.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其包含至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道。
21.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其包含多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间。
22.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其包含多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
23.如权利要求6所述的流体装置，其中所述半透膜的平均孔径大于或等于0.02微米且小于或等于0.5微米。
24.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜的水侵入压力大于或等于2psi且小于或等于120psi。
25.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜是超疏水性的。
26.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜包含氟化材料。
27.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜包含聚偏氟乙烯。
28.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述第一流体贮存器的容积小于或等于500微升。
29.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述第二流体贮存器的容积小于或等于500微升。
30.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述第一流体包含多个珠和/或颗粒。
31.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述连接通道与流体枢纽相关联。
32.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述第一流体贮存器和/或第二流体贮存器的截面尺寸小于或等于2mm。
33.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述第一通道和/或第二通道的平均截面尺寸小于或等于1mm。
34.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜配置并布置成具有小于或等于50psi的液体损失压力。
35.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述流体贮存器的容积小于或等于500微升。
36.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜配置并布置成接收密封垫。
37.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜是疏水性的。
38.如前述权利要求中任一项所述的流体装置，其中所述半透膜的透气度为在1psi下至少0.4slpm。
39.用于在流体装置中输送流体的方法，其包括：
在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含：
流体贮存器；
与所述流体贮存器流体连通的气体室；和
与所述流体贮存器流体连通的流体通道，
其中所述流体贮存器的纵向轴线与所述流体通道的纵向轴线基本上垂直，
所述步骤为：
在所述流体贮存器中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；
在所述气体室中引入第二流体，其中所述第二流体是气体；以及
向所述第二流体施加压力，使得所述第二流体从所述气体室流至所述流体贮存器，并推动所述第一流体从流体柱进入所述流体通道中。
40.在流体装置中输送流体的方法，其包括：
在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
从所述流体枢纽分支的第一分支通道；和
从所述流体枢纽分支的第二分支通道，
所述步骤为：
在所述第一分支通道中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；
在所述第一分支通道中引入第二流体，其中所述第二流体是气体；
在所述第一分支通道与流体枢纽流体连通且所述第二分支通道未与流体枢纽流体连通同时，向所述第二流体施加压力使得所述第二流体推动所述第一流体从所述第一分支通道进入所述流体枢纽中；以及
将所述第二流体引入所述流体枢纽中。
41.在流体装置中输送流体的方法，其包括：
在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
从所述流体枢纽分支的第一分支通道；
与所述第一分支通道连接的第一流体贮存器；
从所述流体枢纽分支的第二分支通道；
与所述第二分支通道连接的第二流体贮存器，
从所述流体枢纽分支的第三分支通道；和
与所述第二分支通道连接的第三流体贮存器，
所述步骤为：
使体积为至少0.1mL的第一流体经由所述第一分支通道从所述第一流体贮存器流至所述流体枢纽；
使所述第一流体经由所述第二分支通道从所述流体枢纽流至所述第二流体贮存器，其中所述第二流体贮存器包含试剂；
使所述第一流体与所述试剂反应以形成经反应流体；
使所述经反应流体从所述第二流体贮存器流入所述流体枢纽中；以及
使所述经反应流体经由所述第三分支通道从所述流体枢纽流至第三流体贮存器。
42.输送流体的方法，其包括：
在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
从所述流体枢纽分支的第一分支通道；
与所述第一分支通道连接的第一流体贮存器；
与所述第一流体贮存器流体连通的第一气体室；和
从所述流体枢纽分支的第二分支通道，
所述步骤为：
使体积为至少0.1mL的第一流体经由所述第一分支通道从所述流体枢纽流至所述第一流体贮存器；
使所述第一流体在所述第一流体贮存器中与试剂反应以形成经反应流体；以及
向所述第一气体室施加压力使得所述经反应流体流入所述流体枢纽中并流入所述第二分支通道中。
43.用于在流体装置中输送流体的方法，其包括：
在流体装置中进行以下步骤，所述流体装置包含含有气体的流体贮存器、与所述流体贮存器流体连通的出口通道、与所述出口通道相关联的阀和与所述流体贮存器相邻的盖，其中所述盖封闭所述流体贮存器，并且其中所述盖是半透膜，
所述步骤为：
关闭所述阀；
向所述流体贮存器中引入第一流体，其中所述第一流体是液体；
使包含在所述流体贮存器中的所述气体通过所述半透膜；以及
基本上阻止所述第一流体通过所述半透膜。
44.用于在流体装置中混合流体的方法，其包括：
在流体装置中进行步骤，所述流体装置包含：
第一流体贮存器；
第二流体贮存器；和
定位在所述第一流体贮存器和第二流体贮存器之间的连接通道，其中所述连接通道的至少一部分的截面面积小于所述第一流体贮存器的截面面积和所述第二流体贮存器的截面尺寸，
所述步骤为：
在第一方向上使第一流体经由所述连接通道从所述第一流体贮存器流至所述第二流体贮存器，其中所述第一流体是液体；
在第二方向上使所述第一流体经由所述连接通道从所述第二流体贮存器流至所述第一流体贮存器，其中所述第二方向不同于所述第一方向；以及
在所述第一流体中引起混合。
45.如权利要求44所述的方法，其包括：
向所述第一流体贮存器中引入第二流体，其中所述第二流体是气体；
向所述第二流体施加压力，使得所述第二流体推动所述第一流体从所述第一流体贮存器通过所述连接通道并且进入所述第二流体贮存器中；
向所述第二流体贮存器中引入第三流体，其中所述第三流体是气体；
向所述第三流体施加压力，使得所述第三流体推动所述第一流体从所述第二流体贮存器通过所述连接通道并且进入所述第一流体贮存器中。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接通道的长度大于或等于250微米且小于10cm。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接通道的截面宽度小于或等于所述第一流体贮存器和第二流体贮存器中至少一个的截面宽度的50％。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个流体贮存器的容积为至少0.1mL。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个气体室与流体贮存器流体连通。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个气体室的容积为至少0.1mL。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个流体通道与一个或更多个流体贮存器流体连通。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个流体通道的容积小于2000μL。
53.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一个流体贮存器的纵向轴线与至少一个长度为至少1cm的流体通道的纵向轴线基本上垂直。
54.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体通道的长度为至少1cm。
55.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体通道的通道长宽比为至少5:1。
56.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包含至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道。
57.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包含多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间。
58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包含多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接。
59.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括使体积为至少0.1mL的第一流体经由所述流体通道流入所述流体贮存器中。
60.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在所述流体贮存器中引入气体的流或泡以引起所述第一流体与试剂混合，其中所述气体从所述流体通道输送。
61.如前述权利要求中任一项所述的方法，其包括使所述气体从所述流体贮存器流入所述气体室中，并基本上阻止所述第一流体和/或试剂流入所述气体室中。
62.如权利要求43所述的方法，其中所述半透膜的平均孔径大于或等于0.02微米且小于或等于0.5微米。
63.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜的水侵入压力大于或等于2psi且小于或等于120psi。
64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜是超疏水性的。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜包含氟化材料。
66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜包含聚偏氟乙烯。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一流体贮存器的容积小于或等于500微升。
68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二流体贮存器的容积小于或等于500微升。
69.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所施加的压力大于或等于0.2psi且小于或等于5psi。
70.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一流体包含多个珠和/或颗粒。
71.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述连接通道与流体枢纽相关联。
72.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一流体贮存器和/或所述第二流体贮存器的截面尺寸小于或等于2mm。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一通道和/或第二通道的平均截面尺寸小于或等于1mm。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜配置并布置成具有小于或等于50psi的液体损失压力。
75.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述流体贮存器的容积小于或等于500微升。
76.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜配置并布置成接收密封垫。
77.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜是疏水性的。
78.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述半透膜的透气度为在1psi下至少0.4slpm。
79.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中引起包含在所述流体贮存器中的所述气体通过所述半透膜包括向所述第一流体施加压力使得所述第一流体推动所述气体。
80.如权利要求44所述的方法，在所述在第一方向上使所述第一流体经由所述连接通道从所述第一流体贮存器流至所述第二流体贮存器的步骤和在第二方向上使所述第一流体经由所述连接通道从所述第二流体贮存器流至所述第一流体贮存器的步骤之后，进行以下步骤：在所述第一方向上，使所述第一流体经由所述连接通道从所述第一流体贮存器流至所述第二流体贮存器。

Claims (10)

1.流体装置，其包含：
一个或更多个反应区；
扩增区；和
一个或更多个处理室，其包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)，其与至少一个反应区和/或扩增区流体连通。
2.流体装置，其包含：
多个流体贮存器，其中每个流体贮存器具有至少0.1mL的体积；和
与一个或更多个流体贮存器流体连通的一个或更多个处理室，
其中所述处理室包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)。
3.流体装置，其包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道；
多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间；
多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接；和
与一个或更多个流体贮存器流体连通的一个或更多个处理室，
其中所述处理室包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)。
4.方法，其包括：
使流体流入流体装置，其中所述流体装置包含：
一个或更多个反应区；
扩增区；和
一个或更多个处理室，其包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)，其与至少一个反应区和/或扩增区流体连通。
5.方法，其包括：
使流体流入流体装置，其中所述流体装置包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道；
多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间；
多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接；和
与一个或更多个流体贮存器流体连通的一个或更多个处理室，并且
其中所述处理室包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)。
6.方法，其包括：
使流体流入流体装置，其中所述流体装置包含：
流体枢纽，其包含长度为至少1cm且通道长宽比为至少5:1的枢纽通道；
至少10个从所述流体枢纽分支的分支通道；
多个阀，每个阀定位在所述分支通道与流体枢纽之间；和
多个流体贮存器，每个流体贮存器与分支通道连接；和
与一个或更多个流体贮存器流体连通的一个或更多个处理室，
其中所述处理室包含一种或更多种双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)。
7.方法，其包括：
在单个流体装置中，对包含人细胞和微生物细胞的流体执行以下步骤：
选择性地裂解所述人细胞；
裂解所述微生物细胞；
分离最初存在于所述微生物细胞中的微生物DNA；
扩增所述微生物DNA；和
在包括使所述微生物DNA与双链体DNA侵入人工核酸(DIANA)接触的过程中检测所述微生物DNA。
8.如前述权利要求中任一项所述的流体装置或方法，其中所述DIANA包含SEQ ID NOS1:37中任一项的序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的流体装置或方法，其中所述DIANA包含与SEQ IDNOS 1:37中任一项具有大于85％同一性的序列。
10.如前述权利要求中任一项所述的流体装置或方法，其中所述DIANA是PNA。
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