Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN114540396A - 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法 - Google Patents

希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114540396A
CN114540396A CN202210175954.0A CN202210175954A CN114540396A CN 114540396 A CN114540396 A CN 114540396A CN 202210175954 A CN202210175954 A CN 202210175954A CN 114540396 A CN114540396 A CN 114540396A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pyydt
glk
ompc
glf
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210175954.0A
Other languages
English (en)
Inventor
宋浩
杨池
张君奇
李锋
尹静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202210175954.0A priority Critical patent/CN114540396A/zh
Publication of CN114540396A publication Critical patent/CN114540396A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01002—Glucokinase (2.7.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01011—6-Phosphofructokinase (2.7.1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0104—Pyruvate kinase (2.7.1.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01031—6-Phosphogluconolactonase (3.1.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02014—2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolase (4.1.2.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01012—Phosphogluconate dehydratase (4.2.1.12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/99—Intramolecular transferases (5.4) transferring other groups (5.4.99)
    • C12Y504/99009—UDP-galactopyranose mutase (5.4.99.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法；通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化(Ompc,galp,glf,glk)和葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢(zwf,pgl,edd,eda,pfkA,pykA)的关键基因,通过Biobrick的构建重组质粒，并导入野生型希瓦氏菌MR‑1中，重构希瓦氏菌的代谢通路，使其能够以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢，拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。得到能13株能够进行葡萄糖生长代谢的工程菌株。为微生物燃料电池底物共利用的设计提供了现实依据，有利于提高菌株的胞外电子传递效率。

Description

希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程和生物代谢技术领域，更具体的说是一种可以使希瓦氏菌以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢的菌株构建方法。
背景技术
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
葡萄糖(Glucose)(化学式C6H12O6)，简称为葡糖。化学名称：2，3，4，5，6-五羟基己醛，是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。纯净的葡萄糖为无色晶体，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，植物可通过光合作用产生葡萄糖，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。葡萄糖进入红细胞是协助扩散进入细胞内的，进入其他细胞的过程则是主动运输，均需要载体蛋白的参与。进入细胞内的葡萄糖经过EMP途径→三羧酸循环→呼吸链完全氧化为二氧化碳和水，并从中产生能量。
希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)属是一种兼性厌氧菌，遗传背景清楚，且易于操作。模式产电微生物-奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1简称MR-1)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将电子转移到微生物燃料电池中的阳极，成为研究微生物如何在MFC中产生电流的模型生物之一。野生型希瓦氏菌一般以乳酸为底物进行生长代谢，不能利用葡萄糖、木糖等糖类，使得菌种可利用底物谱过窄，胞外电子传递效率较低。
EMP途径(Embden-Meyerhofpathway)是指在无氧条件下，葡萄糖被分解成丙酮酸，同时释放出少量ATP的过程。大致可分为两个阶段：第一阶段只是生成两分子的主要中间代谢产物3-磷酸-甘油醛。第二阶段发生氧化还原反应，释放能量合成的ATP，同时形成两分子的丙酮酸。通过EMP途径，每氧化一个分子的葡萄糖净得两分子ATP，为生物的生命活动提供能量和物质准备。ED途径又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)途径。这是存在于某些缺乏完整EMP途径的严格需氧细菌中的一种降解葡萄糖的替代途径，为微生物所特有。特点是葡萄糖只经过4步反应即可快速获得由EMP途径须经10步反应才能形成的丙酮酸。这条途径的关键是2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解，即分解为3-磷酸甘油醛和丙酮酸。3-磷酸甘油醛可进入EMP途径转变成丙酮酸。(特征性酶：KDPG醛缩酶)
本发明公开了一种可以使希瓦氏菌以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢的菌株构建方法，旨在通过异源表达技术，结合基因工程等手段，构建13种可用重组质粒，将葡萄糖利用代谢的关键基因引入MR-1中，从“葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化”和“葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢”两个模块来重构希瓦氏菌株的代谢通路，使工程希瓦氏菌能够在以葡萄糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。
发明内容：
本发明旨在通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将“葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化”(Ompc,galp,glf,glk)和“葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢”(zwf,pgl, edd,eda,pfkA,pykA)两个模块的关键基因，通过Biobrick的构建策略进行整合，构建重组质粒，并导入野生型Shewanella oneidensis MR-1中，重构希瓦氏菌的代谢通路，使其能够以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。
本发明的技术方案概述如下：
希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法；将葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化的基因Ompc、galp、glf或/和glk；葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢基因zwf、pgl、 edd、eda、pfkA或/和pykA；将两个模块的关键基因,通过Biobrick的构建策略进行整合，构建重组质粒，并导入野生型Shewanella oneidensis MR-1中，重构希瓦氏菌的代谢通路，以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢。
所述的构建方法；两个模块的关键基因连接到载体质粒pYYDT上形成重组质粒，再引入 S.oneidensis MR-1中，得到13种含有重组质粒并能进行葡萄糖代谢和利用的工程希瓦氏菌株。
所述的构建方法；基因ompC优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；基因galp优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因glf优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；基因glk优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因zwf优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.5 所示；基因pgl优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；基因edd优化后的核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示；基因eda优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；基因pfkA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；基因pykA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
所述的构建方法；载体质粒pYYDT核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
所述的构建方法；将经过密码子优化后的基因通过Ptac启动子和T1终止子完成表达，采用Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上。
本发明构建13种含有重组质粒并能进行葡萄糖代谢和利用的工程希瓦氏菌株如下：模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①pSH1(pYYDT-glf-glk)；
②pSH2(pYYDT-galp-glk)；
③pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)；
④pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；
模块二：葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢
⑤pSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)；
⑥pSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)；
⑦pSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)；
⑧pSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)；
⑨pSH9(pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)；
⑩pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)；
Figure RE-GDA0003616061810000021
pSH11(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)；
Figure RE-GDA0003616061810000022
pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)；
Figure RE-GDA0003616061810000023
pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)。
具体构建方法说明如下：
利用Biobrick方法，构建重组质粒：
得到优化后的序列，分别在目的基因片段的5’端添加XbaI酶(公知)切位点，3’端依次添加SpeI，SbfI酶(公知)切位点；用SpeI和SbfI酶对自带该酶切位点的pYYDT质粒(质粒图谱如图1(1)所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，参考文献EnhancingBidirectional Electron Transfer ofShewanella oneidensis by a Synthetic FlavinPathway)进行酶切；由于XbaI 和SpeI酶是同尾酶，酶切后会产生相同的粘性末端，再通过T4连接酶进行连接，构建以pYYDT 为载体并含有目的基因的重组质粒。
模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①pSH1(pYYDT-glf-glk)质粒的构建。
用XbaI和SbfI酶对目的基因glf进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)；用SpeI和SbfI酶对pYYDT质粒进行酶切；再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因glf的重组质粒pYYDT-glf。
用XbaI和SbfI酶对基因glk进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因glf的重组质粒pYYDT-glf进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有glf，glk两个目的基因的重组质粒：pSH1(pYYDT-glf-glk)。
②pSH2(pYYDT-galp-glk)质粒的构建。
用XbaI和SbfI酶对目的基因galp进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)；用SpeI和SbfI酶对pYYDT质粒进行酶切；再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因galp的重组质粒pYYDT-galp。
用XbaI和SbfI酶对基因glk进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因galp的重组质粒pYYDT-galp进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有galp，glk两个目的基因的重组质粒：pSH2(pYYDT-galp-glk)。
③pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)，
用XbaI和SbfI酶对目的基因ompC进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)；用SpeI和SbfI酶对pYYDT质粒进行酶切；再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因ompC的重组质粒pYYDT-ompC。
用XbaI和SbfI酶对基因galp进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.2)，用SpeI和SbfI 酶对刚构建的含有基因ompC的重组质粒pYYDT-ompC进行酶切，经过T4连接酶后，构建含有基因ompC，galp的重组质粒pYYDT-ompC-galp。
用XbaI和SbfI酶对基因glk进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ompC，galp的重组质粒pYYDT-ompC-galp进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ompC，galp，glk三个目的基因的重组质粒：pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)。
④pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；
用XbaI和SbfI酶对目的基因ompC进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)；用SpeI和SbfI酶对pYYDT质粒进行酶切；再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因ompC的重组质粒pYYDT-ompC。
用XbaI和SbfI酶对基因glf进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ompC的重组质粒pYYDT-ompC进行酶切，经过T4连接酶后，构建含有基因ompC，glf的重组质粒pYYDT-ompC-glf。
用XbaI和SbfI酶对基因glk进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ompC，glf的重组质粒pYYDT-ompC-glf进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ompC，glf，glk三个目的基因的重组质粒：pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)，
同样按照上述模块一重组质粒的构建方法，完成对模块二：葡萄糖转运模块结合ED 模块增强葡萄糖代谢的重组质粒构建：
⑤pSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)；
用XbaI和SbfI酶对模块一已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk用SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因zwf进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.5)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，zwf四个目的基因的重组质粒：pSH5 (pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)。
⑥pSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)
用XbaI和SbfI酶对模块一已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk用SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因pgl进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.6)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，pgl四个目的基因的重组质粒：pSH6 (pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)。
⑦pSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)
用XbaI和SbfI酶对模块一已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk用SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因edd进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.7)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，edd四个目的基因的重组质粒：pSH7 (pYYDT-ompC-glf-glk-edd)。
⑧pSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)
用XbaI和SbfI酶对模块一已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk用SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因eda进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.8)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，eda四个目的基因的重组质粒：pSH8 (pYYDT-ompC-glf-glk-eda)。
⑨pSH9(pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)
用XbaI和SbfI酶对模块一已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk用SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因pfkA进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.9)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，pfkA四个目的基因的重组质粒：pSH9 (pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)。
⑩pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)
用XbaI和SbfI酶对模块二已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk-zwf用SpeI和SbfI 酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因pgl进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.6)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，zwf，pgl五个目的基因的重组质粒：pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)。
Figure RE-GDA0003616061810000041
pSH11(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)
用XbaI和SbfI酶对模块二已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl用SpeI和 SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因edd进行酶切(核苷酸序列为SEQID NO.7)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，zwf，pgl，edd六个目的基因的重组质粒：pSH11(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)。
Figure RE-GDA0003616061810000042
pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)
用XbaI和SbfI酶对模块二已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd用SpeI 和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因eda进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.8)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，zwf，pgl，edd，eda七个目的基因的重组质粒：pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)。
Figure RE-GDA0003616061810000043
pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)
用XbaI和SbfI酶对模块二已经构建的重组质粒pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda用 SpeI和SbfI酶对进行酶切；用XbaI和SbfI酶对目的基因pykA进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.10)，再通过T4连接酶进行连接，最终获得含有ompC，glf，glk，zwf，pgl，edd，eda， pykA八个目的基因的重组质粒：pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)。
对应的质粒图谱分别如图1(2)-(14)所示。按照上述步骤方法，完成质粒的构建连接，最终得到了13种重组质粒。
本发明方法得到的代谢重组希瓦氏菌株用于在以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基中进行有氧发酵，并测定发酵液中的生物量和糖代谢量。
本发明方法得到的代谢重组希瓦氏菌株用于在以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基中进行厌氧发酵，并测定发酵液中的生物量和糖代谢量。
克服现有技术的不足，提供了一种可以使希瓦氏菌以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢的菌株构建方法。主要技术方案是利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒，将促进葡萄糖摄取进入细胞(葡萄糖跨膜转运模块：ompC,galp,glf,glk)到促进胞内代谢(优化 ED途径：zwf,pgl,edd,eda,pfkA,pykA)两个模块的关键基因引入Shewanellaoneidensis MR-1 菌中，重构S.oneidensis MR-1的代谢通路，使工程希瓦氏菌能够在以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。将改造菌株进行有氧和厌氧发酵，并测定其在3g/L葡萄糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中的生长曲线及残糖量。
在模块一中，数据显示，无论是有氧还是厌氧发酵，导入空质粒的对照菌株WT几乎不摄取代谢葡萄糖；构建的工程菌株能摄取一定量的葡萄糖，菌株PSH3：pYYDT-ompC-glf-glk的有氧和厌氧发酵生物量较对照菌株WT均相对较高，且摄取利用的葡萄糖量更多。PSH3有氧发酵12h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.51333)是WT(OD600＝0.21467)的2.4倍，培养基中的葡萄糖在8h后几乎耗尽；PSH3的厌氧发酵8h后到达生长平台期，生物量 (OD600＝0.19967)是WT(OD600＝0.12833)的约1.6倍，培养基中最终消耗了约45％的葡萄糖。因此我们得到“葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造”优化后工程菌株PSH3：pYYDT-ompC-glf-glk。
在模块二中，数据显示，在模块一优化后工程菌株PSH3：pYYDT-ompC-glf-glk的基础上继续进行改造的菌株，无论是有氧还是厌氧发酵，导入空质粒的对照菌株WT和工程菌PSH9 几乎不摄取代谢葡萄糖；构建的其他8株工程菌株PSH5，PSH6，PSH7，PSH8，PSH10，PSH11， PSH12，PSH13均能摄取一定量的葡萄糖，其中菌株PSH11：pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd 在3g/L葡萄糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中的有氧和厌氧发酵生物量均相对较高，且摄取利用的葡萄糖量最多。PSH11有氧发酵24h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.58267) 是WT(OD600＝0.19133)的3倍，培养基中的葡萄糖在16h后几乎耗尽；PSH11的厌氧发酵 48h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.22467)是WT(OD600＝0.13300)的约1.7倍，培养基中消耗了约59％的葡萄糖。
本发明的效果如下：
1、本发明提供了一种可以使希瓦氏菌以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢的菌株构建方法。利用异源表达技术，结合基因工程等手段，从构建重组质粒，将“葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化”和“葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢”两个模块的关键基因引入MR-1中，得到能13株能够进行葡萄糖生长代谢的工程菌株。
2、在构建的工程菌株中，PSH11有氧发酵24h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.58267) 是WT(OD600＝0.19133)的3倍，培养基中的葡萄糖在16h后几乎耗尽；PSH11的厌氧发酵 48h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.22467)是WT(OD600＝0.13300)的约1.7倍，培养基中消耗了约59％的葡萄糖。
3、本发明拓宽了模式产电菌MR-1的可用底物谱，为微生物燃料电池底物共利用的设计提供了现实依据，有利于提高菌株的胞外电子传递效率。
附图说明
图1:为构建的pYYDT和重组质粒图谱及核苷酸序列
图2:为本发明基因片段生物砖设计示意图
图3:为本发明构建的工程希瓦氏菌葡萄糖代谢设计原理图
图4:为本发明工程菌株在有氧条件下，以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9培养基中生长及糖耗情况
图5:为本发明工程菌株在无氧条件下，以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9培养基中生长及糖耗情况
具体实施方式
本发明中构建的质粒是本实验室设计，在全合成过程中，需要将发明所需要的各外源基因连接到质粒载体上并保存。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
首先在KEGG上查询所需目的基因序列信息，目的基因包括促进葡萄糖摄取进入细胞 (葡萄糖跨膜转运模块)到促进胞内代谢(优化ED途径)两个模块的关键基因：Ompc,galp, glf,glk,zwf,pgl,edd,eda,pfkA,pykA(如SEQ ID NO.1-10所示)；连接到载体质粒pYYDT(质粒图谱见图1(1)所示，序列信息如SEQ ID NO.11所示)，最终得到13个pYYDT上连有目的基因的重组质粒，分别命名为：
模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①pSH1(pYYDT-glf-glk)；重组质粒pSH1图谱如图1(2)所示；
②pSH2(pYYDT-galp-glk)；重组质粒pSH2图谱如图1(3)所示；
③pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)；重组质粒pSH3图谱如图1(4)所示；
④pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；重组质粒pSH3图谱如图1(5)所示。
模块二：葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢
⑤pSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)；重组质粒pSH3图谱如图1(6)所示；
⑥pSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)；重组质粒pSH3图谱如图1(7)所示；
⑦pSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)；重组质粒pSH3图谱如图1(8)所示；
⑧pSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)；重组质粒pSH3图谱如图1(9)所示；
⑨pSH9(pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)；重组质粒pSH3图谱如图1(10)所示；
⑩pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)；重组质粒pSH3图谱如图1(11)所示；
Figure RE-GDA0003616061810000061
pSH11(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)；重组质粒pSH3图谱如图1(12)所示；
Figure RE-GDA0003616061810000062
pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)；重组质粒pSH3图谱如图1(13)所示；
Figure RE-GDA0003616061810000063
pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)；重组质粒pSH3图谱如图1(14) 所示。
glk：来自大肠杆菌K-12中的葡萄糖激酶基因
galp：来自大肠杆菌K-12中的半乳糖转运蛋白基因
glf：来自大肠杆菌K-12中的UDP-吡喃半乳糖变位酶基因
ompC：来自大肠杆菌K-12中的能够提高细胞膜透过性的外膜孔蛋白基因
zwf：来自大肠杆菌K-12中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因
pgl：来自大肠杆菌K-12中的6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因
pfkA：来自大肠杆菌K-12中的6-磷酸果糖激酶基因
edd：来自希瓦氏MR-1中的磷酸葡萄糖酸脱水酶基因
eda：来自希瓦氏MR-1中的2-脱氢-3-脱氧磷酸葡萄糖醛酸醛缩酶基因
pykA：来自希瓦氏MR-1中的丙酮酸激酶基因
本发明将上述经过密码子优化后的基因通过Ptac启动子和T1终止子完成表达，采用 Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4 连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的外源基因不受后续内切酶的影响，由此构建重组质粒，从而发挥不同的功能。
所选重组质粒扩增的工程菌为营养缺陷型菌株E.coil WM3064，最终宿主工程菌为S. oneidensis MR-1，WM3064的转化方法可采用本领域常规的方法，例如物理转化法。然后接合转移到MR-1菌中，得到构建的工程菌。导入pYYDT空质粒的野生型菌株命名为WT，导入其他重组质粒的工程菌株命名为：
在上述构建方法中，本发明通过该重组质粒表达所实现的技术效果提出了希瓦氏菌株能够以葡萄糖为唯一碳源进行有氧和厌氧的生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌的可用底物谱。
实施例1：重组质粒的构建
⑴目的基因的获取和序列优化：
首先在KEGG上查询所需目的基因序列信息(http://www.kegg.jp/kegg/genes.html)，目的基因包括促进葡萄糖摄取进入细胞(葡萄糖跨膜转运模块：ompC,galp,glf,glk)到促进胞内代谢(优化ED途径：zwf,pgl,edd,eda,pfkA,pykA)两个模块的关键基因；利用Jcat (http://www.jcat.de/)对coding sequence进行密码子优化以及定点突变掉序列中所存在的生物砖酶切位点，选择在Shewanella oneidensis MR-1中进行优化，并避免以后实验所需要用到的酶切位点EcoRI，XbaI，SpeI和PstI。
⑵利用Biobrick方法，构建重组质粒：
得到优化后的序列，在各目的基因片段的5’端添加XbaI酶切位点，3’端依次添加SpeI， SbfI酶切位点，并合成。利用Biobrick方法，将上述基因通过酶切连接的方式，构建重组质粒①pSH1(pYYDT-glf-glk)。
首先利用XbaI和SbfI酶(公知)对基因glf进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，利用SpeI和SbfI酶(公知)对自带该酶切位点的pYYDT质粒(质粒图谱如图1(1)所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，参考文献Enhancing Bidirectional Electron Transfer ofShewanella oneidensis by a Synthetic Flavin Pathway)进行酶切。由于XbaI和SpeI酶是同尾酶，酶切后会产生相同的粘性末端，再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因glf的重组质粒。
利用XbaI和SbfI酶对基因glk进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因glf的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有glf，glk两个目的基因的重组质粒：①pSH1(pYYDT-glf-glk)，质粒图谱如图1(2)所示。
同样按照上述步骤⑵中的方法，完成其它质粒的构建连接，最终得到了13种重组质粒模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①pSH1(pYYDT-glf-glk)，②pSH2(pYYDT-galp-glk)，③pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)，④pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；
模块二：葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢
⑤pSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)，⑥pSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)，⑦pSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)，⑧pSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)，⑨pSH9 (pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)，⑩pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)，
Figure RE-GDA0003616061810000071
pSH11 (pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)，
Figure RE-GDA0003616061810000072
pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)，
Figure RE-GDA0003616061810000073
pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)。
质粒图谱分别如图1(2)-(14)所示。
按照上述步骤依次完成重组质粒的构建，构建质粒的生物砖设计原理如图2所示，由于 pYYDT作为基础质粒载体含有卡那霉素抗性基因序列，可用于后期工程菌株的定向筛选。
实施例2：重组希瓦氏菌株的构建
①转化：将上述得到的重组质粒通过物理转化法导入E.coliWM3064中，用于后续工程希瓦氏菌的构建。
从-80℃冰箱取出E.coliWM3064感受态细胞50μL，置于冰盒内自然解冻后加入重组质粒pSH33μL，冰上静置30min，42℃热击90s，再冰上静置2-3min，向EP管中加入1mL LB+DAP 液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl、0.059g/L 2,6-二氨基庚二酸)，置于37℃、220rpm的摇床中复苏1h。离心后涂布至LB+DAP+kana固体平板上(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl、0.059g/L DAP、50mg/mL卡那霉素(kana，1:1000)、15g/L琼脂粉)最后倒置放到37℃的恒温培养箱过夜培养，挑取阳性克隆，并保藏菌种，取过夜培养的阳性克隆菌500μL，50％的甘油500μL，加入到保菌管中，置于-80℃保存。
②接合转移：将上述得到的阳性克隆菌中的重组质粒通过接合转移到模式产电菌S.oneidensis MR-1中，得到能够进行葡萄糖摄取利用的工程菌株。
将转化后的大肠杆菌接种到3mL LB+DPA+kana液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L 胰蛋白胨、10g/LNaCl、0.059g/L DAP、50mg/mL卡那霉素(kana，1:1000))中培养，37℃，200rpm 10-12h；将野生型菌株MR-1接种到3mL LB液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl)中培养，30℃，200rpm 10-12h。将得到的大肠杆菌种子液和MR-1种子液各取500μL混合到一个1.5mL无菌EP管中，混合均匀，5000rpm下离心10min，倒掉上清液。用1mL LB+DAP液体培养基重悬，在30℃下静置2h。静置完成后混合均匀并取50μL菌液接种于LB+kana的固体平板上(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl、15g/L琼脂粉、50mg/mL卡那霉素(kana，1:1000))置于30℃培养箱中培养12小时以上，得到希瓦氏工程菌。
菌落PCR进行验证：接合转移涂板的菌长出明显单菌落(直径大约0.5-1mm)后，准备菌 P验证质粒是否结转成功。需要准备LB+kana平板，并画好格子做好标记。配制PCR体系，分装入96孔板，可以比实际需要的多配2-5个体系，防止因枪头沾有溶液造成损失。准备足量的灭菌牙签。在超净台，一根牙签挑取一个单菌落，放入一个体系的孔中；挑完后，每根牙签在新平板对应的格中划线接种，丢弃牙签。全部划完后，96孔板用封板垫严密封口，放入 PCR仪，设定参数，开始运行。平板放入30℃恒温培养箱(生长不少于10h，具体看菌落长势，长到一定程度可以用保鲜膜包好放4℃)。单个PCR反应体系配置(trans fast Taq)：ddH20 11.55μL；上、下游引物各0.3μL；10x buffer1.5μL；dNTPS，1.2μL；Taq酶0.15μL；一个反应体系共15μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸Xs(1kb/30s，只能时间富裕不能不足)，30cycles，最后72℃再延伸7min，4℃保温。
琼脂糖凝胶电泳：先制胶，1XTAE缓冲液100mL，琼脂糖1.0g，加热溶解，待适当冷却后加核酸染料5μL，摇匀倒入放好透明垫和梳子的胶槽中，等待凝固。
跑胶：PCR结束后，加DNALoading buffer，点样，每孔各10μL，电泳8-12min。观察有无目的条带并记录对应编号。
保菌：将验证成功的工程希瓦氏菌保菌备用。取过夜培养的希瓦氏工程菌500μL，50％的甘油500μL，加入到保菌管中，置于-80℃保存。
导入空质粒(pYYDT)的野生型希瓦氏菌株命名为WT，导入其它重组质粒的工程菌株分别命名为：
模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①PSH1(pYYDT-glf-glk)；②PSH2(pYYDT-galp-glk)；③PSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)；④PSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；
模块二：葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢
⑤PSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)；⑥PSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)；⑦PSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)；⑧PSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)；⑨PSH9 (pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)；⑩PSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)；
Figure RE-GDA0003616061810000091
PSH11 (pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)；
Figure RE-GDA0003616061810000092
PSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)；
Figure RE-GDA0003616061810000093
PSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)。
如图3所示，为本发明构建的工程希瓦氏菌葡萄糖代谢设计的原理图，从源头开始设计，包括促进葡萄糖摄取进入细胞的葡萄糖跨膜转运模块的合成生物学改造及优化(ompC,galp,glf， glk)到促进胞内代谢(优化ED途径：zwf，pgl，edd，eda,pfkA,pykA)的全过程，得到能进行葡萄糖代谢的工程希瓦氏菌。
实施例3：希瓦氏工程菌WT，PSH1-13在含有浓度为3g/L葡萄糖溶液的改良后M9培养液中发酵培养(包含有氧和厌氧)
先将各工程菌株接种(1:100)到LB+Kana的液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl，50mg/mL卡那霉素(kana，1:1000))中活化培养，然后在发酵瓶中进一步进行有氧和厌氧发酵，并加入适量IPTG(1M,1:2000)诱导外源基因的表达。每隔2h在超净工作台中取发酵液适量用于检测各菌株的OD600值并记录；用液相色谱仪检测每次取样发酵液中的残糖含量。选取导入空质粒(pYYDT)的野生型菌株WT作为空白对照组，且每株菌做三组平行实验。
工程希瓦氏菌葡萄糖代谢生长曲线及残糖测定：
1.菌种活化：早上取经过高压蒸汽灭菌的10mL EP管若干，在超净工作台中分别加入3mL LB+kana的液体培养基，接菌，30℃，200rpm/min，培养12h。
2.一级种子：将活化的各菌液按1％接种至含有100mL LB+kana液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm/min，培养12h。
3.二级种子，发酵：测定一级种子液OD600，并将各菌株调至同一生长状态，按2％接种至含有90mL M9+10mL Glucose+100μL kana+50μL IPTG液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm/min进行有氧发酵培养并定时取样4℃保存待用。
同时准备一批厌氧环境下菌株的吃糖实验组：取经过高压蒸汽灭菌的10mL EP管若干(白管的溶氧效果差)，10mL管内分别加入7885μLM9+1mL Glucose+10μLkana+5μL IPTG+100 μL菌液+1mL反丁烯二酸(电子受体)，放入30℃培养箱中静置，进行厌氧发酵培养并定时取样4℃保存待用。
4.测定0-24h发酵液的OD600，记录数据，并每组预留1mL发酵样液离心取上清液过液相测残糖含量。
该实验中，配制30g/L葡萄糖溶液足量，在超净工作台中过0.25μm滤膜，4℃保存待用；配制5×M9溶液足量，加dH2O稀释至1×M9溶液，经过高压蒸汽灭菌，冷却后4℃保存待用。
其中，
5×M9母液(1L)：2.5gNaCl、5g NH4Cl、15g KH2PO4、30gNa2HPO4，灭菌。
卡那霉素母液(50mg/mL)：0.5g kana粉末，ddH2O定容至10mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为1mL/管，-20℃保存。
IPTG母液(1M)：1.9064g IPTG、ddH2O定容至8mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为1mL/管，-20℃保存。
工程菌株在有氧(无氧)条件下，以葡萄糖为唯一碳源的改良后M9培养基中生长及糖耗情况如图4(图5)所示：数据显示，在模块一中，无论是有氧还是厌氧发酵，导入空质粒的对照菌株WT几乎不摄取代谢葡萄糖；构建的工程菌株能摄取一定量的葡萄糖，菌株PSH3：pYYDT-ompC-glf-glk的有氧和厌氧发酵生物量较对照菌株WT均相对较高，且摄取利用的葡萄糖量更多。PSH3有氧发酵12h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.51333)是WT (OD600＝0.21467)的2.4倍，培养基中的葡萄糖在8h后几乎耗尽；PSH3的厌氧发酵8h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.19967)是WT(OD600＝0.12833)的约1.6倍，培养基中最终消耗了约45％的葡萄糖。因此我们得到“葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造”优化后的工程菌株PSH3：pYYDT-ompC-glf-glk。模块二中，在模块一优化后工程菌株PSH3： pYYDT-ompC-glf-glk的基础上继续进行改造的菌株。无论是有氧还是厌氧发酵，导入空质粒的对照菌株WT和工程菌PSH9几乎不摄取代谢葡萄糖；构建的其他8株工程菌株PSH5，PSH6， PSH7，PSH8，PSH10，PSH11，PSH12，PSH13均能摄取一定量的葡萄糖，其中菌株PSH11： pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd在3g/L葡萄糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中的有氧和厌氧发酵生物量均相对较高，且摄取利用的葡萄糖量最多。PSH11有氧发酵24h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.58267)是WT(OD600＝0.19133)的3倍，培养基中的葡萄糖在16h 后几乎耗尽；PSH11的厌氧发酵48h后到达生长平台期，生物量(OD600＝0.22467)是WT (OD600＝0.13300)的约1.7倍，培养基中消耗了约59％的葡萄糖。
所选重组质粒扩增的工程菌为营养缺陷型菌株E.coilWM3064(市售可得，ColiGenetic Stock Center http://cgsc.biology.yale.edu/)，最终宿主工程菌为S.oneidensis MR-1(市售可得， ATCC 700550)；以上所用限制性内切酶、DNA连接酶和分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)；所用其他生化试剂从生工生物工程(上海) 股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。
序列表
<110> 天津大学
<120> 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctctagata ctagagaaag aggagaaaat gatgaaacgt aacatcttag ctgttatcgt 60
tccagcgtta ttagttgctg gcactgctaa cgctgctgaa atctacaaca aagatggtaa 120
caaagttgat ttatacggta aagctgttgg tttacactac ttctctaaag gtaacggtga 180
aaactcttac ggtggtaacg gtgatatgac ttacgctcgt ttaggtttca aaggtgaaac 240
tcaaatcaac tctgatttaa ctggttacgg tcaatgggaa tacaacttcc aaggtaacaa 300
ctctgaaggt gctgatgctc aaactggtaa caaaactcgt ttagctttcg ctggtttaaa 360
atacgctgat gttggttctt tcgattacgg tcgtaactac ggtgttgttt acgatgcttt 420
aggttacact gatatgttac cagaattcgg tggtgatact gcttactctg atgatttctt 480
cgttggtcgt gttggtggtg ttgctactta ccgtaactct aacttcttcg gtttagttga 540
tggtttaaac ttcgctgttc aatacttagg taaaaacgaa cgtgatactg ctcgtcgttc 600
taacggtgat ggtgttggtg gttctatctc ttacgaatac gaaggtttcg gtatcgttgg 660
tgcttacggt gctgctgatc gtactaactt acaagaagct caaccattag gtaacggtaa 720
aaaagctgaa caatgggcta ctggtttaaa atacgatgct aacaacatct acttagctgc 780
taactacggt gaaactcgta acgctactcc aatcactaac aaattcacta acacttctgg 840
tttcgctaac aaaactcaag atgttttatt agttgctcaa taccaattcg atttcggttt 900
acgtccatct atcgcttaca ctaaatctaa agctaaagat gttgaaggta tcggtgatgt 960
tgatttagtt aactacttcg aagttggtgc tacttactac ttcaacaaaa acatgtctac 1020
ttacgttgat tacatcatca accaaatcga ttctgataac aaattaggtg ttggttctga 1080
tgatactgtt gctgttggta tcgtttacca attctaatct ccccaaacta gtccctgcag 1140
ggct 1144
<210> 2
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatgc cagatgctaa aaaacaaggt 60
cgttctaaca aagctatgac tttcttcgtt tgtttcttag ctgctctcgc gggcttactc 120
ttcggtttag atatcggtgt tatcgctggt gctttaccat tcatcgctga tgaattccaa 180
atcacttctc acactcaaga atgggttgtt tcttctatga tgttcggtgc tgctgttggt 240
gctgttggtt ctggttggtt atctttcaaa ttaggtcgta aaaaatcttt aatgatcggt 300
gctatcttat tcgttgctgg ttctttattc tctgctgctg ctcccaacgt tgaagtacta 360
atcttatctc gtgttttatt aggtttagct gttggtgttg cttcttacac tgctccatta 420
tacttatctg aaatcgctcc agaaaaaatc cgtggttcta tgatctctat gtaccaatta 480
atgatcacta tcggtatctt aggtgcttac ttatctgata ctgctttctc ttacactggt 540
gcttggcgtt ggatgttagg tgttatcatc atcccagcta tcttattatt aatcggtgtt 600
ttcttcttac cagattctcc acgttggttc gctgctaaac gtcgtttcgt tgatgctgag 660
cgtgtcctct tacgtttacg tgatacttct gctgaagcta aacgtgaatt agatgaaatc 720
cgtgaatctt tacaagttaa acaatctggt tgggctttat tcaaagaaaa ctctaacttc 780
cgtcgtgctg ttttcttagg tgttttatta caagttatgc aacaattcac tggtatgaac 840
gttatcatgt actacgctcc aaaaatcttc gaattagctg gttacactaa cactactgaa 900
caaatgtggg gtactgttat agttggttta actaacgtgc tggctacttt catcgctatc 960
ggtttagttg atcgttgggg tcgtaaacca actttaactt taggtttctt agttatggct 1020
gctggtatgg gtgttttagg tactatgatg cacatcggta tccactctcc atctgctcaa 1080
tacttcgcta tcgctatgtt attaatgttc atcgttggtt tcgctatgtc tgctggtcca 1140
ttaatctggg ttttatgttc tgaaatccaa ccattaaaag gtcgtgattt cggtatcact 1200
tgttctactg ctactaactg gatcgctaac atgatcgttg gtgctacttt cttaactatg 1260
ttaaacactt taggtaacgc taacactttc tgggtttacg ctgctttaaa cgttttattc 1320
atcttattaa ctttatggtt agttccagaa acaaagcacg taagcttaga acacatcgaa 1380
cgtaacttaa tgaaaggtcg taaattacgt gaaatcggtg ctcacgatta atctccccaa 1440
actagtccct gcagggct 1458
<210> 3
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatgt cttctgaatc ttctcaaggt 60
ttagttactc gtttagcttt aatcgctgct atcggtggtt tattattcgg ttacgattct 120
gctgttatcg ctgctatcgg tactccagtt gatatccact tcatcgctcc acgtcactta 180
tctgctactg ctgctgcttc tttatctggt atggttgttg ttgctgtttt agttggttgt 240
gttactggtt ctttattatc tggttggata ggcatcaggt tcggtcgtcg tggcggttta 300
ttaatgtctt ctatctgttt cgttgctgct ggtttcggtg ctgctttaac tgaaaaatta 360
ttcggtactg gtggttctgc tttacaaatc ttctgtttct tccgtttctt agctggttta 420
ggtatcggtg ttgtttctac tttaactcca acttacatcg ctgaaatcgc tccaccagat 480
aaacgtggtc aaatggtttc tggtcaacaa atggctatcg ttactggtgc tttaactggt 540
tacatcttca cttggttatt agctcacttc ggttctatcg attgggttaa cgcttctggt 600
tggtgttggt ctccagcgtc ggaaggtctc atcggtatcg cgttcttatt attattatta 660
actgctccag atactccaca ctggttagtt atgaaaggtc gtcactctga agcttctaaa 720
atactcgctc gtctcgaacc acaagcggat ccaaacttaa ctatccaaaa aatcaaagct 780
ggtttcgata aagctatgga taaatcttct gctggtttat tcgctttcgg catcactgtt 840
gtgttcgcgg gtgtttctgt tgctgctttc caacaattag ttggcataaa cgctgtgctc 900
tactacgctc cacaaatgtt ccaaaactta ggtttcggtg ccgatacagc gttattacaa 960
actatatcta tcggtgttgt taacttcatc ttcactatga tcgcttctcg tgttgttgat 1020
cgtttcggtc gtaaaccatt attaatctgg ggtgctttag gtatggctgc gatgatggct 1080
gtgctcggtt gttgtttctg gttcaaagtt ggtggtgttt taccactcgc gtctgtacta 1140
ttatacatcg ctgttttcgg tatgtcttgg ggtccagttt gttgggttgt tttatctgaa 1200
atgttcccat cttctatcaa aggtgctgct atgccaatcg ctgttactgg tcaatggtta 1260
gctaacatct tagttaactt cttattcaaa gttgctgatg gttcgcccgc tctcaaccaa 1320
acttttaacc acggtttctc ttacttagtt ttcgctgctt tatctatctt aggtggttta 1380
atcgttgctc gtttcgttcc agaaactaaa ggtcgttctt tagatgaaat cgaagaaatg 1440
tggcgttctc aaaaataatc tccccaaact agtccctgca gggct 1485
<210> 4
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatgg aaatcgttgc tatcgatatc 60
ggtggtactc acgctcgttt ctctatcgct gaagtttcta acggtcgtgt tttatcttta 120
ggtgaagaaa ctactttcaa aactgctgaa cacgcttctt tacaattagc ttgggaacgt 180
ttcggtgaaa aattaggtcg tccattacca cgtgctgctg ctatcgcttg ggctggtcca 240
gttcacggtg aagttttaaa attaactaac aacccatggg ttttacgtcc agctacttta 300
aacgaaaaat tagatatcga tactcacgta ttaataaacg acttcggtgc tgttgcgcac 360
gctgttgctc acatggattc ttcttactta gatcacatct gtggtccaga cgaagctctc 420
ccatctgatg gcgttatcac tatcttaggt ccgggtacag gtctcggtgt tgctcattta 480
ttacgtactg aaggtcgtta cttcgttatc gaaactgaag gtggtcacat cgatttcgct 540
ccattagatc gtttagaaga taaaatctta gctcgtttac gtgagaggtt ccgtcgtgtt 600
tcgatcgaac gtatcatctc tggtccaggt ttaggtaaca tctacgaagc tttagctgct 660
atcgaaggtg ttccattctc tttattagat gatatcaaat tatggcaaat ggctttagaa 720
ggtaaagata acttagctga agctgcgctc gataggttct gtttaagttt aggtgctatc 780
gctggtgatt tagctttagc tcaaggtgct acttctgttg ttatcggtgg tggtgttggt 840
ttacgtatcg cttctcactt accagagagt ggcttccgtc aacgttttgt ttctaaaggt 900
cgtttcgaac gtgttatgtc taaaatccca gttaaattaa tcacttaccc acaaccaggt 960
ttattaggtg ctgctgctgc ttacgctaac aaatactctg aagttgaata atctccccaa 1020
actagtccct gcagggct 1038
<210> 5
<211> 1574
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctctagatt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 60
atactagaga aagaggagaa atactagaga tgactaacac tgtttctact atgatcttat 120
tcggctctac tggtgactta tctcaacgta tgttattacc atctttatac ggtttagatg 180
ctgatggttt attagctgat gatttacgta tcgtttgtac ttctcgttct gaatacgata 240
ctgatggttt ccgtgatttc gctgaaaaag ctttagatcg tttcgttgct tctgatcgtt 300
taaacgatga tgctaaagct aaattcttaa acaaattatt ctacgctact gttgatatca 360
ctgatccaac tcaattcggt aaattagctg atttatgtgg tccagttgaa aaaggtatcg 420
ctatctactt atctactgct ccatctttat tcgaaggtgc tatcgctggt ttaaagcagg 480
ctggtctcgc tggtccaact tctcgtttag ctttagaaaa accattaggt caagatttag 540
cttcttctga tcacatcaat gacgctgtac tcaaagtttt ctctgaaaaa caagtttacc 600
gtatcgatca ctacttaggt aaagaaactg ttcaaaactt attaacttta aggttcggca 660
acgcgttatt cgaaccactc tggaactcta aaggtatcga tcacgttcaa atctctgttg 720
ctgaaactgt tggtttagaa ggtcgtatcg gttacttcga tggttctggt tctttacgtg 780
atatggttca atctcacatc ttacaattag ttgctttagt tgctatggaa ccaccagctc 840
acatggaagc taacgctgtt cgtgatgaaa aagttaaagt tttccgtgct ttacgtccaa 900
tcaacaacga tactgttttc actcacactg ttactggtca atacggtgct ggtgtttctg 960
gtggtaaaga agttgctggt tacatcgatg aattaggtca accatctgat actgaaactt 1020
tcgttgctat caaagctcac gttgataact ggcgttggca aggtgttcca ttctacatcc 1080
gtactggtaa acgtttacca gctcgtcgtt ctgaaatcgt tgttcaattc aaaccagttc 1140
cacactctat cttctcttct tctggtggta tcttacaacc aaacaaatta cgtatcgttt 1200
tacaaccaga tgaaactatc caaatctcta tgatggttaa agagccaggt ctcgatcgta 1260
acggcgctca catgcgtgaa gtttggttag atttatcttt aactgatgtt ttcaaagatc 1320
gtaaacgtcg tatcgcgtac gaaaggttaa tgttagatct catcgaaggg gacgctacat 1380
tattcgttcg tcgtgatgaa gttgaagctc aatgggtttg gatcgatggt atccgtgaag 1440
gttggaaagc taactctatg aaaccaaaaa cttacgtttc tggtacttgg ggtccatcta 1500
ctgctatcgc tttagctgaa cgtgatggtg ttacttggta cgattaatct ccccaaacta 1560
gtccctgcag ggct 1574
<210> 6
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatga ctgaagctga atggtgggaa 60
ttcgaaaacg ttgaagctat ggctaaacaa atcgctgatg atatcgaatt catcatcaaa 120
caagctatcg aaaaaaaagg tcgtgcttta atcatcgttc caggtggttc tactccaaaa 180
ttagttttcc caactttagc tgctcgtgat ttagattggt ctaaagttac tttaatgtta 240
actgatgatc gtttagttgc taaagataac ccattatcta acttcggttt attaactaaa 300
cacttcggtt cttctggtgc tgaattagtt tctttaatcg atgaaaacta cttagatgat 360
cgtgctgctg ctggtcgtgc tgctgatcaa aaattagctt cttacaaatg gccagctgat 420
ttagtttggt taggtatggg taacgatggt cacactgctt ctatcttccc aggtccaaac 480
ttcgatgaag ctgttaacgg tccaagggaa cgtcgtgcgt taggtttatt accagttcca 540
ttaccaccag aagctccagt tgctcgtgtt actttatctt tatctacttt agcttctgct 600
cacactgtta tggttgttat cactggtgat cacaaacgta ctgttttaac tgatgcttta 660
aaagaaggtg cttcgtcgcg tctcccagtt ggtcgtgttt taggtgaaac tgaagcttct 720
atcgatgttt actggtctaa ataatctccc caaactagtc cctgcagggc t 771
<210> 7
<211> 1887
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatga ctgatttaca ctctactgtt 60
gaaaaagtta ctgctcgtgt tatcgaacgt tctcgtgaaa ctcgtaaagc ttacttagat 120
ttaatccaat acgaacgtga aaaaggtgtt gatcgtccaa acttatcttg ttctaactta 180
gctcacggtt tcgctgctat gaacggtgat aaaccagctt tacgtgattt caaccgtatg 240
aacatcggtg ttgttacttc ttacaacgat atgttatctg ctcacgaacc atactaccgt 300
tacccagaac aaatgaaagt tttcgctcgt gaagttggtg ctactgttca agttgctggt 360
ggtgttccag ctatgtgtga tggtgttact caaggtcaac caggtatgga agaatcttta 420
ttctctcgtg atgttatagc tctcgctact tctgtttctt tatctcacgg tatgttcgaa 480
ggtgctgctt tattaggtat ctgtgataaa atcgttccag gtttattaat gggtgcttta 540
cgtttcggtc acttaccaac tatcttagtt ccatctggtc caatgactac tggtatccca 600
aacaaagaaa aaatccgtat ccgtcaatta tacgctcaag gtaaaatcgg tcaaaaagaa 660
ttattagata tggaagctgc ttgttaccac gctgaaggta cttgtacttt ctacggtact 720
gctaacacta accaaatggt tatggaagtg ctaggtttac acatgccagg ttctgctttc 780
gttactccag gtactccatt acgtcaagct ttaactcgtg ctgctgttca ccgtgttgct 840
gaattaggtt ggaaaggtga tgattaccgt ccattaggta aaatcatcga tgaaaaatct 900
atcgttaacg ctatcgttgg tttattagct actggtggtt ctactaacca cactatgcac 960
atcccagcta tcgctcgtgc tgctggtgtt atcgtaaact ggaacgactt ccacgacctg 1020
tctgaagttg ttccattaat cgctcgtatc tacccaaacg gtccacgtga tatcaacgaa 1080
ttccaaaacg ctggtggtat ggcttacgtt atcaaagaat tattatctgc taacttatta 1140
aaccgtgatg ttactactat cgctaaaggt ggtatcgaag aatacgctaa agctccagct 1200
ttaaacgatg ctggtgaatt agtttggaaa ccagctggtg aaccaggtga tgatactatc 1260
ttacgtccag tttctaaccc attcgctaaa gatggtggtt tacgtttatt agaaggtaac 1320
ttaggtcgtg ctatgtacaa agcttctgct gttgatccaa aattctggac tatcgaagct 1380
ccagttcgtg ttttctctga tcaagatgat gttcaaaaag ctttcaaagc tggtgaatta 1440
aacaaagatg ttatcgttgt tgttcgtttc caaggtccac gtgctaacgg tatgccagaa 1500
ttacacaaat taactccagc tttaggtgtt ttacaagata acggttacaa agttgcttta 1560
gttactgatg gtcgtatgtc tggtgctaca ggtaaagttc cagttgctct ccacgtttct 1620
ccagaggctc tcggtggtgg tgcgatcggt aaattacgtg atggtgatat cgttcgtatc 1680
tctgttgaag aaggtaaatt agaagcttta gttccagctg atgaatggaa cgctcgtcca 1740
cacgctgaaa agcccgcgtt ccgtccaggt actggtcgtg aattattcga tatcttccgt 1800
caaaacgctg ctaaagctga agatggtgct gttgctatct acgctggtgc tggtatctaa 1860
tctccccaaa ctagtccctg cagggct 1887
<210> 8
<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctctagatt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 60
atactagaga aagaggagaa atactagaga tgcgtgatat cgattctgtt atgcgtttag 120
ctccagttat gccagtttta gttatcgaag atatcgctga tgctaaacca atcgctgaag 180
ctttagttgc tggtggttta aacgttttag aagttacttt acgtactcca tgtgctttag 240
aagctatcaa aatcatgaaa gaagttccag gtgctgttgt tggtgctggt actgttttaa 300
acgctaaaat gttagatcaa gctcaagaag ctggttgtga attcttcgtt tctccaggtt 360
taactgctga tttaggtaaa cacgctgttg ctcaaaaagc tgctttatta ccaggtgttg 420
ctaacgctgc tgatgttatg ttaggtttag atttaggcct cgataggttc aaattcttcc 480
cagctgaaaa catcggtggt ctcccagctc tcaaatctat ggcgtctgtt ttccgtcaag 540
ttcgtttctg tccaactggt ggtatcactc caacttctgc tccaaaatac ttagaaaacc 600
catctatctt atgtgttggt ggttcttggg ttgttccagc tggtaaacca gatgttgcta 660
aaatcactgc tttagctaaa gaagcttctg ctttcaaacg tgctgctgtt gcttaatctc 720
cccaaactag tccctgcagg gct 743
<210> 9
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctctagatt gacaattaat catcggctcg tataatgtgt ggaattgtga gcggataaca 60
atactagaga aagaggagaa aatgatcaaa aaaatcggtg ttttaacttc tggtggtgat 120
gctccaggta tgaacgctgc tatccgtggt gttgttcgtt ctgctttaac tgaaggttta 180
gaagttatgg gtatctacga tggttactta ggtttatacg aagatcgtat ggttcaatta 240
gatcgttact ctgtttctga tatgatcaac cgtggtggta ctttcttagg ttctgctcgt 300
ttcccagaat tccgtgatga aaacatccgt gctgttgcta tcgaaaactt aaaaaaacgt 360
ggtatcgatg ctttagttgt tatcggtggt gatggttctt atatgggcgc tatgcgtctc 420
actgaaatgg gcttcccatg tatcggttta ccaggtacta tcgataacga tatcaaaggt 480
actgattaca ctatcggttt cttcactgct ttatctactg ttgttgaagc tatcgatcgt 540
ttacgtgata cttcttcttc tcaccaacgt atctctgttg ttgaagttat gggtcgttac 600
tgtggtgatt taactttagc tgctgctatc gctggtggtt gtgaattcgt tgttgttcca 660
gaagttgaat tctctcgtga agatttagtt aacgaaatca aagctggtat cgctaaaggt 720
aaaaaacacg ctatcgttgc tatcactgaa cacatgtgtg atgttgatga attagctcac 780
ttcatcgaaa aagaaactgg tcgtgaaact cgtgctactg ttttaggtca catccaacgt 840
ggtggttctc cagttccata cgatcgtatc ttagcttctc gtatgggtgc ttacgctatc 900
gatttattat tagctggtta cggtggtcgt tgtgttggta tccaaaacga acaattagtt 960
caccacgata tcatcgatgc tatcgaaaac atgaaacgtc cattcaaagg tgattggtta 1020
gattgtgcta aaaaattata ctaatctccc caaactagtc cctgcagggc t 1071
<210> 10
<211> 1503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctctagata ctagagaaag aggagaaata ctagagatgt tccgtcgtac taaaatcgtt 60
actactttag gtccagctac tgatcgtgat gataacttac gtcgtatcat cgctgctggt 120
gctaacgttg ttcgtttaaa cttctctcac ggttctccag aagatcactt aaaacgtgct 180
actcaagctc gtgaaatcgc taaagaatta ggtgttcacg ttgctatctt aggtgattta 240
caaggtccaa aaatccgtgt ttctactttc aaagataaca aaaaaatcca attaaaatta 300
ggtcaaactt acatcttaga tgctgaatta gctaaaggtg aaggtgatga aaaccaagtt 360
ggtatcgatt acaaacaatt accagatgat gttaacgttg gtgatatctt aatgttagat 420
gatggtcgtg ttcaattacg tgttgaacgt gttgaaggtc gtaaagttca cactactgtt 480
actgttgctg gtccattatc taacaacaaa ggtatcaaca aacaaggtgg tggtttatct 540
gctgctgctt taactgaaaa agataaagct gatatcttaa ctgctgctat gatccaagtt 600
gattacttag ctgtttcttt cccacgttct ggtgctgatt tagaatacgc tcgttcttta 660
gctcaacaag ctggttctaa cgctttaatc gttgctaaag ttgaacgtgc tgaagctgtt 720
gcttctgatg aagctatgga tgatgttatc ttagcttctg atgttgttat ggttgctcgt 780
ggtgatttag gtgttgaaat cggtgatgct gctttagttg ctgttcaaaa aaaattaatc 840
gctcgttctc gtcaattaaa caaaatcgtt atcactgcta ctcaaatgat ggaatctatg 900
atctcttctc caatgccaac tcgtgctgaa gttatggatg ttgctaacgc tgttttagat 960
ggtactgatg ctgttatgtt atctgctgaa actgctgctg gtgatttccc agaagaaact 1020
gttaaagcta tggctaacgt ttgtgttggt gctgaatctc acccatctgt taaagtttct 1080
aaacaccgtc tcgacgctag gttcacttct gttgaggaaa ctatcgcttt atctactatg 1140
tacgctgcta accacttaga aggtgttaaa gctatcatcg ctttaactga atctggtgct 1200
actccaaaat taatgtctcg tatctcttct tctttaccaa tcttaggttt atctcgtcac 1260
gatactactt tagcgaagat ggcgttatac cgtggtgttt taccaatcta cttcgattct 1320
actatctacc cagctgatga attagctcaa aaagctttag aatctttaac taaagctggt 1380
tacttacact ctggtgattt agttttaatg actaaaggtg atgctatgga aactatcggt 1440
ggtactaaca cttgtaaagt tttaatcgtt gcttaatctc cccaaactag tccctgcagg 1500
gct 1503
<210> 11
<211> 5904
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60
tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120
cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtca gaatttcaga taaaaaaaat 180
ccttagcttt cgctaaggat gatttctgtg gtacctcgga tcccggggag ctagcacgaa 240
ttcgcggccg cttctagacc gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 300
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 360
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 420
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 480
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 540
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 600
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 660
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 720
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 780
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 840
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 900
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 960
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 1020
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 1080
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 1140
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 1200
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 1260
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 1320
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1380
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 1440
agttagctca ctcattaggc acaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 1500
gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 1560
aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 1620
gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg 1680
gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagccagtcc 1740
gtttaggtgt tttcacgagc acttcaccaa caaggaccat agcatatgcc actagtagcg 1800
gccgcctgca ggtggtcgac cactcgaggc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 1860
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctct actagagtca 1920
cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg cgtttataac cggtaaacca gcaatagaca 1980
taagcggcta tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaac 2040
cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 2100
cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 2160
cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 2220
cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 2280
cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 2340
gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 2400
cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 2460
tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 2520
caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 2580
cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 2640
gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 2700
tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 2760
cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 2820
ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag 2880
atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc 2940
agggcttccc aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc 3000
ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct 3060
ttgcgcttgc gttttccctt gtccagatag cccagtagct gacattcatc ccaggtggca 3120
cttttcgggg aaatgtgcgc gcccgcgttc ctgctggcgc tgggcctgtt tctggcgctg 3180
gacttcccgc tgttccgtca gcagcttttc gcccacggcc ttgatgatcg cggcggcctt 3240
ggcctgcata tcccgattca acggccccag ggcgtccaga acgggcttca ggcgctcccg 3300
aaggtctcgg gccgtctctt gggcttgatc ggccttcttg cgcatctcac gcgctcctgc 3360
ggcggcctgt agggcaggct catacccctg ccgaaccgct tttgtcagcc ggtcggccac 3420
ggcttccggc gtctcaacgc gctttgagat tcccagcttt tcggccaatc cctgcggtgc 3480
ataggcgcgt ggctcgaccg cttgcgggct gatggtgacg tggcccactg gtggccgctc 3540
cagggcctcg tagaacgcct gaatgcgcgt gtgacgtgcc ttgctgccct cgatgccccg 3600
ttgcagccct agatcggcca cagcggccgc aaacgtggtc tggtcgcggg tcatctgcgc 3660
tttgttgccg atgaactcct tggccgacag cctgccgtcc tgcgtcagcg gcaccacgaa 3720
cgcggtcatg tgcgggctgg tttcgtcacg gtggatgctg gccgtcacga tgcgatccgc 3780
cccgtacttg tccgccagcc acttgtgcgc cttctcgaag aacgccgcct gctgttcttg 3840
gctggccgac ttccaccatt ccgggctggc cgtcatgacg tactcgaccg ccaacacagc 3900
gtccttgcgc cgcttctctg gcagcaactc gcgcagtcgg cccatcgctt catcggtgct 3960
gctggccgcc cagtgctcgt tctctggcgt cctgctggcg tcagcgttgg gcgtctcgcg 4020
ctcgcggtag gcgtgcttga gactggccgc cacgttgccc attttcgcca gcttcttgca 4080
tcgcatgatc gcgtatgccg ccatgcctgc ccctcccttt tggtgtccaa ccggctcgac 4140
gggggcagcg caaggcggtg cctccggcgg gccactcaat gcttgagtat actcactaga 4200
ctttgcttcg caaagtcgtg accgcctacg gcggctgcgg cgccctacgg gcttgctctc 4260
cgggcttcgc cctgcgcggt cgctgcgctc ccttgccagc ccgtggatat gtggacgatg 4320
gccgcgagcg gccaccggct ggctcgcttc gctcggcccg tggacaaccc tgctggacaa 4380
gctgatggac aggctgcgcc tgcccacgag cttgaccaca gggattgccc accggctacc 4440
cagccttcga ccacataccc accggctcca actgcgcggc ctgcggcctt gccccatcaa 4500
tttttttaat tttctctggg gaaaagcctc cggcctgcgg cctgcgcgct tcgcttgccg 4560
gttggacacc aagtggaagg cgggtcaagg ctcgcgcagc gaccgcgcag cggcttggcc 4620
ttgacgcgcc tggaacgacc caagcctatg cgagtggggg cagtcgaagg cgaagcccgc 4680
ccgcctgccc cccgagcctc acggcggcga gtgcgggggt tccaaggggg cagcgccacc 4740
ttgggcaagg ccgaaggccg cgcagtcgat caacaagccc cggaggggcc actttttgcc 4800
ggagggggag ccgcgccgaa ggcgtggggg aaccccgcag gggtgccctt ctttgggcac 4860
caaagaacta gatatagggc gaaatgcgaa agacttaaaa atcaacaact taaaaaaggg 4920
gggtacgcaa cagctcattg cggcaccccc cgcaatagct cattgcgtag gttaaagaaa 4980
atctgtaatt gactgccact tttacgcaac gcataattgt tgtcgcgctg ccgaaaagtt 5040
gcagctgatt gcgcatggtg ccgcaaccgt gcggcaccct accgcatgga gataagcatg 5100
gccacgcagt ccagagaaat cggcattcaa gccaagaaca agcccggtca ctgggtgcaa 5160
acggaacgca aagcgcatga ggcgtgggcc gggcttattg cgaggaaacc cacggcggca 5220
atgctgctgc atcacctcgt ggcgcagatg ggccaccaga acgccgtggt ggtcagccag 5280
aagacacttt ccaagctcat cggacgttct ttgcggacgg tccaatacgc agtcaaggac 5340
ttggtggccg agcgctggat ctccgtcgtg aagctcaacg gccccggcac cgtgtcggcc 5400
tacgtggtca atgaccgcgt ggcgtggggc cagccccgcg accagttgcg cctgtcggtg 5460
ttcagtgccg ccgtggtggt tgatcacgac gaccaggacg aatcgctgtt ggggcatggc 5520
gacctgcgcc gcatcccgac cctgtatccg ggcgagcagc aactaccgac cggccccggc 5580
gaggagccgc ccagccagcc cggcattccg ggcatggaac cagacctgcc agccttgacc 5640
gaaacggagg aatgggaacg gcgcgggcag cagcgcctgc cgatgcccga tgagccgtgt 5700
tttctggacg atggcgagcc gttggagccg ccgacacggg tcacgctgcc gcgccggtag 5760
cacttgggtt gcgcagcaac ccgtaagtgc gctgttccag actatcggct gtagccgcct 5820
cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac 5880
ctcgacctga atggaagccg gcgg 5904

Claims (6)

1.希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法；其特征是，将葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化的基因Ompc、galp、glf或/和glk；葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢基因zwf、pgl、edd、eda、pfkA或/和pykA；将两个模块的关键基因,通过Biobrick的构建策略进行整合，构建重组质粒，并导入野生型Shewanella oneidensis MR-1中，重构希瓦氏菌的代谢通路，以葡萄糖为唯一碳源进行生长代谢。
2.如权利要求1所述的构建方法；其特征是，两个模块的关键基因连接到载体质粒pYYDT上形成重组质粒，再引入S.oneidensis MR-1中，得到13种含有重组质粒并能进行葡萄糖代谢和利用的工程希瓦氏菌株。
3.如权利要求1所述的构建方法；其特征是，基因ompC优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；基因galp优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因glf优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；基因glk优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因zwf优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；基因pgl优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；基因edd优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；基因eda优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；基因pfkA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；基因pykA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
4.如权利要求2所述的构建方法；其特征是，载体质粒pYYDT核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
5.如权利要求1所述的构建方法；其特征是，将经过密码子优化后的基因通过Ptac启动子和T1终止子完成表达，采用Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上。
6.如权利要求5所述的构建方法；其特征是，构建13种含有重组质粒并能进行葡萄糖代谢和利用的工程希瓦氏菌株如下：
模块一：葡萄糖跨膜转运模块合成生物学改造及优化
①pSH1(pYYDT-glf-glk)；
②pSH2(pYYDT-galp-glk)；
③pSH3(pYYDT-ompC-galp-glk)；
④pSH4(pYYDT-ompC-glf-glk)；
模块二：葡萄糖转运模块结合ED模块增强葡萄糖代谢
⑤pSH5(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf)；
⑥pSH6(pYYDT-ompC-glf-glk-pgl)；
⑦pSH7(pYYDT-ompC-glf-glk-edd)；
⑧pSH8(pYYDT-ompC-glf-glk-eda)；
⑨pSH9(pYYDT-ompC-glf-glk-pfkA)；
⑩pSH10(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl)；
Figure 1
pSH11(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd)；
Figure 2
pSH12(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda)；
Figure 3
pSH13(pYYDT-ompC-glf-glk-zwf-pgl-edd-eda-pykA)。
CN202210175954.0A 2022-02-24 2022-02-24 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法 Pending CN114540396A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210175954.0A CN114540396A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210175954.0A CN114540396A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114540396A true CN114540396A (zh) 2022-05-27

Family

ID=81679915

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210175954.0A Pending CN114540396A (zh) 2022-02-24 2022-02-24 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114540396A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114540395A (zh) * 2022-01-10 2022-05-27 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602030A (en) * 1994-03-28 1997-02-11 University Of Florida Research Foundation Recombinant glucose uptake system
US20050221455A1 (en) * 2003-10-21 2005-10-06 Cargill, Inc. Production of monatin and monatin precursors
CN1768147A (zh) * 2003-04-01 2006-05-03 底古萨股份公司 利用肠杆菌科的菌株生产L－氨基酸的方法,该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因
KR20110128582A (ko) * 2010-05-24 2011-11-30 광주과학기술원 쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 그 용도
US20120015413A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Neste Oil Oyj Microorganisms with Extended Substrate Utilization Range
CN103243064A (zh) * 2013-05-28 2013-08-14 山东大学 一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用
CN106164252A (zh) * 2014-02-07 2016-11-23 巴斯夫欧洲公司 用于琥珀酸产生的改进微生物
CN106755035A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 天津大学 一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法
CN109415684A (zh) * 2016-03-02 2019-03-01 Ptt全球化学公众有限公司 从基因工程微生物改进的黏康酸生产
CN109402035A (zh) * 2018-11-06 2019-03-01 华中农业大学 一种肠外致病性大肠杆菌重组菌株及其应用
CN110079488A (zh) * 2018-01-25 2019-08-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用
CN110283789A (zh) * 2019-06-13 2019-09-27 天津大学 重组菌株及其应用
WO2020018506A2 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Manus Bio, Inc. Production of steviol glycosides through whole cell biotransformation
CN111549049A (zh) * 2020-05-29 2020-08-18 天津大学 一种产核黄素的重组海藻希瓦氏菌及在产电中的应用
CN112105716A (zh) * 2018-05-01 2020-12-18 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 转化体以及使用其的有机化合物的制造方法
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN113817658A (zh) * 2021-08-24 2021-12-21 天津科技大学 一株生产n-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用
CN114381416A (zh) * 2022-03-23 2022-04-22 北京道合成企业管理有限公司 一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其应用
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114806998A (zh) * 2022-06-27 2022-07-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5602030A (en) * 1994-03-28 1997-02-11 University Of Florida Research Foundation Recombinant glucose uptake system
CN1768147A (zh) * 2003-04-01 2006-05-03 底古萨股份公司 利用肠杆菌科的菌株生产L－氨基酸的方法,该菌株过表达编码半乳糖质子同向转运蛋白的galP基因
US20050221455A1 (en) * 2003-10-21 2005-10-06 Cargill, Inc. Production of monatin and monatin precursors
KR20110128582A (ko) * 2010-05-24 2011-11-30 광주과학기술원 쉬와넬라 변이균주, 제조방법 및 그 용도
US20120015413A1 (en) * 2010-07-16 2012-01-19 Neste Oil Oyj Microorganisms with Extended Substrate Utilization Range
CN103243064A (zh) * 2013-05-28 2013-08-14 山东大学 一种大肠杆菌工程菌株及其好氧-微好氧-厌氧全阶段发酵生产琥珀酸的应用
CN106164252A (zh) * 2014-02-07 2016-11-23 巴斯夫欧洲公司 用于琥珀酸产生的改进微生物
CN109415684A (zh) * 2016-03-02 2019-03-01 Ptt全球化学公众有限公司 从基因工程微生物改进的黏康酸生产
CN106755035A (zh) * 2016-12-05 2017-05-31 天津大学 一种基于高效低残糖发酵异丁醇的大肠杆菌合成菌株构建方法
CN110079488A (zh) * 2018-01-25 2019-08-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用
CN112105716A (zh) * 2018-05-01 2020-12-18 公益财团法人地球环境产业技术研究机构 转化体以及使用其的有机化合物的制造方法
WO2020018506A2 (en) * 2018-07-16 2020-01-23 Manus Bio, Inc. Production of steviol glycosides through whole cell biotransformation
CN109402035A (zh) * 2018-11-06 2019-03-01 华中农业大学 一种肠外致病性大肠杆菌重组菌株及其应用
CN110283789A (zh) * 2019-06-13 2019-09-27 天津大学 重组菌株及其应用
CN111549049A (zh) * 2020-05-29 2020-08-18 天津大学 一种产核黄素的重组海藻希瓦氏菌及在产电中的应用
CN112877272A (zh) * 2021-04-28 2021-06-01 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法
CN113817658A (zh) * 2021-08-24 2021-12-21 天津科技大学 一株生产n-乙酰神经氨酸的基因工程菌及其构建与应用
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114381416A (zh) * 2022-03-23 2022-04-22 北京道合成企业管理有限公司 一种高产5-氨基乙酰丙酸的重组大肠杆菌菌株及其应用
CN114806998A (zh) * 2022-06-27 2022-07-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 产葡萄糖的罗尔斯通氏菌工程菌及发酵生产方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGGEON CHOI等: "Metabolically engineered glucose-utilizing Shewanella strains under anaerobic conditions", BIORESOURCE TECHNOLOGY, pages 234 - 235 *
胡涛;马尧;战嵛华;陆伟;黄和;林敏;燕永亮;: "6-磷酸果糖激酶基因pfkA在施氏假单胞菌中的异源表达及其表型分析", 中国农业科技导报, no. 02, pages 72 - 80 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540395A (zh) * 2022-01-10 2022-05-27 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法
CN114540395B (zh) * 2022-01-10 2023-06-27 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114410672B (zh) * 2022-01-12 2023-11-07 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114410672B (zh) 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
EP0963439B1 (en) Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol
ES2546669T3 (es) Utilización mejorada de xilosa en bacterias Zymomonas recombinantes que presentan una actividad ribosa-5-fosfato aumentada
JP5907865B2 (ja) 改善されたアラビノース資化能を有するザイモモナス（ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
CN114540396A (zh) 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法
CN107771214A (zh) 用于具有增加的2,4‑二羟基丁酸外排物的优化的2,4‑二羟基丁酸产生的修饰的微生物
Dong et al. Design and construction of improved new vectors for Zymomonas mobilis recombinants
CN115806922B (zh) 运动发酵单胞菌的基因工程菌株及其应用
CN111849847B (zh) 一种提高大肠杆菌胞内血红素含量的方法
CN110229774B (zh) 一种精氨酸脱羧酶基因工程菌及其高密度发酵培养方法
CN101748069A (zh) 一种重组蓝藻
CN103215301B (zh) 一种用于微生物燃料电池的产电基因工程菌及其构建方法和应用
CN109652434B (zh) 一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
CN114540395B (zh) 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法
JP2023520238A (ja) 組換え微生物及び方法
CN109706104B (zh) sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用
CN106636238A (zh) 一种微生物利用酒糟发酵生产γ‑氨基丁酸的方法
CN103667374A (zh) 一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产d-乳酸的方法
CN114561416B (zh) 利用电能固定co2及合成异丙醇的工程菌及构建方法
CN114438112A (zh) 希瓦氏菌株代谢乙酸盐改造方法及应用
CN113122563B (zh) 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法
CN112359007B (zh) 用于产杆菌肽的外源引入edd基因地衣芽孢杆菌及应用
CN101633690B (zh) 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
CN114836458B (zh) 增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进mo降解和电能回收方法
CN112280725A (zh) 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220527

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication