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CN114507284B - 抗tigit的抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

抗tigit的抗体、其制备方法和应用 Download PDF

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CN114507284B CN202210181241.5A CN202210181241A CN114507284B CN 114507284 B CN114507284 B CN 114507284B CN 202210181241 A CN202210181241 A CN 202210181241A CN 114507284 B CN114507284 B CN 114507284B
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Abstract

本申请涉及一种分离的抗原结合蛋白，以及包含所述分离的抗原结合蛋白的药物组合物，以及其作为药物的用途。本申请的抗原结合蛋白能够特异性结合TIGIT抗原，阻断TIGIT与其配体的结合，并且能够用于制备预防或治疗TIGIT相关的疾病的药物。

Description

抗TIGIT的抗体、其制备方法和应用
本申请是申请日为2020年5月9日、申请号为2020103876304、发明名称为“抗TIGIT的抗体、其制备方法和应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向于TIGIT的抗原结合蛋白、其制备方法和应用。
背景技术
正常情况下，T细胞依赖抗原提呈细胞(Antigen-presenting cells，APCs)提呈的外源或内源抗原-MHC-I/II复合物与T细胞(CD4+、CD8+)表面受体(T Cell Receptor，TCR)结合以及额外的共刺激(Costimulatory)信号来充分激活，然后通过其他效应细胞对表达相关抗原的细胞进行杀伤。相反的是，T细胞还受到共抑制(Coinhibitory)信号调节，后者对T细胞的活性、增殖、存活等具有负面调节作用，也可维持自身耐受，防止过度的自身免疫反应，减小免疫应答所致的组织损伤。在肿瘤细胞微环境中，T细胞的激活与抑制处于异常模式，目前，其正常化被广泛视为肿瘤治疗的重要手段。
TIGIT(T cell Ig and ITIM domain，也称为WUCAM、Vstm3或VSIG9)是脊髓灰质炎病毒受体(PVR)/Nectin家族的成员。它由细胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构域，1型跨膜结构域和具有经典免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫球蛋白酪氨酸尾(ITT)基序的细胞内结构域组成。TIGIT在淋巴细胞中表达，特别是在效应和调节性CD4+T细胞，滤泡辅助CD4+T细胞，效应CD8+T细胞和自然杀伤(NK)细胞中高表达。TIGIT基因位于人类第16号染色体，编码由244个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。人TIGIT分子胞膜外区长141个氨基酸，有1个免疫球蛋白V样结构域；跨膜区23个氨基酸；胞质区较短，有80个氨基酸，具有1个PDZ结合结构域和1个ITIM模体。
CD155(也叫PVR、Necl5或Tage4)是TIGIT的高亲和力配体。肿瘤表面高表达的CD155一旦与NK和T细胞表面的TIGIT结合，它们对肿瘤细胞的杀伤作用就会被抑制。TIGIT可以通过阻止肿瘤细胞的初始死亡和释放肿瘤抗原来抑制NK细胞效应；抑制树突细胞协同刺激能力，导致癌抗原呈递减少和抗炎细胞因子如IL-10增加，TIGIT还可以诱导其他细胞如肿瘤细胞的PVR信号传导；TIGIT可以直接抑制CD8+T细胞效应，或者TIGIT+Treg可以抑制CD8+T细胞，防止癌细胞的清除(Manieri et al.,Inhibition of the Cancer ImmunityCycle by TIGIT.2016)。
大量的临床前研究结果表明，TIGIT将成为癌症乃至其他疾病患者的合适靶标，因此，鉴于TIGIT在各类相关疾病中作用和功能，本领域仍然需要开发适于治疗患者的改善的抗TIGIT特异性抗体。
发明内容
本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。所述分离的抗原结合蛋白也可包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。所述分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：1)能够以1×10-10M或更低(例如，8×10-11M、5×10-11M、2×10-11M、1×10-11M或更低)的KD值结合TIGIT蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振法测定；2)在FACS测定中，能够阻断CD155与TIGIT的结合；和3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：1)能够以1×10-10M或更低的KD值结合TIGIT蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振法测定；2)在FACS测定中，能够阻断CD155与TIGIT的结合；和3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和42中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR3包含SEQ ID NO:5和43中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ IDNO:65所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6和52中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR2包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述LCDR3包含SEQ ID NO:8和53中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白与参比抗体竞争结合所述TIGIT蛋白，其中所述参比抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQID NO:56所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
在某些实施方式中，所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR1包含SEQ ID NO:15、16、44和45中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR2包含SEQ ID NO:17、18、46和47中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR3包含SEQ ID NO:19、20、21、48、49和50中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述L-FR4包含SEQ ID NO:22和51中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VL包含SEQ ID NO:2、10、11、13、33和34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区来自人κ轻链恒定区，且所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:23和35中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:24、25、26、36和37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:27、38和39中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:28、40和41中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述VH包含SEQ ID NO:1、9、12、14和32中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
在某些实施方式中，所述抗体重链恒定区包括人IgG1恒定区，且人IgG1恒定区包含SEQ ID NO:29-30中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种载体，其包含所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸分子或所述的载体。
另一方面，本申请提供了一种制备所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述的细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含所述的分离的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
另一方面，本申请提供了所述的分离的抗原结合蛋白、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗TIGIT相关疾病。
在某些实施方式中，所述TIGIT相关疾病为T细胞功能障碍性病症。
在某些实施方式中，所述TIGIT相关疾病为肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肾癌、黑色素瘤、T淋巴瘤和胰腺癌。
另一方面，本申请提供了一种抑制CD155与TIGIT结合的方法，所述方法包括施用所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种预防、缓解或治疗TIGIT相关疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用所述的分离的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述TIGIT相关疾病为T细胞功能障碍性病症。
在某些实施方式中，所述TIGIT相关疾病为肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤选自下组：乳腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肾癌、黑色素瘤、T淋巴瘤和胰腺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是TIGIT嵌合抗体对表达人TIGIT的细胞结合活性。
图2显示的是TIGIT人源化抗体对表达人TIGIT的细胞结合活性。
图3显示的是TIGIT嵌合抗体对人TIGIT与其配体CD155结合的阻断活性。
图4显示的是TIGIT人源化抗体对人TIGIT与其配体CD155结合的阻断活性。
图5显示的是TIGIT抗体在动物体内药效检测。
图6显示的是TIGIT抗体在动物体内与对照抗体Tiragolumab的药效检测比较。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“TIGIT”称为“含Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”，通常为免疫球蛋白的PVR(脊髓灰质炎病毒受体)家族的成员，其可结合PVR/CD155和Nectin-2/CD112。本申请的TIGIT可以指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人、恒河猴和食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的TIGIT蛋白。该术语涵盖全长的TIGIT或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)，未加工的TIGIT，因细胞中的加工所致的任何形式的TIGIT，以及人工合成的TIGIT。该术语还涵盖TIGIT的变体，例如剪接变体或等位变体。在某些情形中，TIGIT为人TIGIT，人TIGIT的氨基酸序列包含UniProt登录号Q495A1所示的氨基酸序列。在某些情形中，TIGIT为食蟹猴TIGIT，食蟹猴TIGIT的氨基酸序列包含UniProt登录号G7NXM4所示的氨基酸序列。在某些情形中，TIGIT为小鼠TIGIT，小鼠TIGIT的氨基酸序列包含UniProt登录号P86176所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“Fab”通常是指含有重链可变结构域和轻链可变结构域的片段，并且还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)；术语“Fab’”通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段；术语“F(ab')2”通常是指Fab’的二聚体，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。术语“Fv”通常是指含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。在某些情形中，该片段可以由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成；术语“dsFv”通常是指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。术语“dAb片段”通常是指由VH结构域组成的抗体片段。在本申请中，术语“scFv”通常是指抗体的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域通过柔性肽连接子共价连接配对形成的单价分子；此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接子-VH-COOH或NH2-VH-连接子-VL-COOH。
在本申请中，术语“抗体”其以最广泛意义使用，且具体涵盖，但不限于，单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人类抗体、嵌合抗体和骆驼化单结构域抗体。“抗体”通常可以包含通过二硫键互相连接的至少两条重链(HC)和两条轻链(LC)的蛋白，或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中，各轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为超变性的区域，称为互补决定区(CDR)，其与称为框架区(FR)的较保守的区域交替。各VH和VL包含三个CDR和四个框架区(FR)，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(H-FR1，H-FR2，H-FR3，H-FR4，L-FR1，L-FR2，L-FR3，L-FR4)，大部分采用β-折叠构型，通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)结合。
在本申请中，术语“可变”通常是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架(FR)。在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见，Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991))、基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见，A1-Lazikani等人，JMol Biol 273:927-48,1997)和基于IMGT本体论(IMGT-ONTOLOGY)的概念和IMGT Scientific图表规则的IMGT定义规则。
IMGT指国际ImMunoGeneTics信息系统，一种免疫遗传学和免疫信息学的全球参考数据库(http://www.imgt.org)。IMGT专门研究来自人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)或抗体、T细胞受体(TR)、主要组织相容性(MH)，以及来自脊椎动物和非脊椎动物的免疫球蛋白超家族(IgSF)、MH超家族(MhSF)和免疫系统相关蛋白(RPI)。
在本申请中，术语“分离的”抗原结合蛋白通常是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别，分离和/或回收的抗原结合蛋白。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗原结合蛋白或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指其中可变区源自一个物种，而恒定区源自另一个物种的抗体。通常，可变区源自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定区源自人类抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠来源)抗体相比，在人类个体中引发不良免疫反应的可能性降低。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
在本申请中，术语“结合”、“特异性结合”或“对…特异性的”通常是指可测量且可再现的相互作用，诸如抗原和抗体之间的结合，其可以确定在存在分子(包括生物学分子)的异质群体的情况中靶物的存在。例如，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比其结合其它靶物更大的亲和力、亲合力、更容易和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。“表位”是指抗原上与抗原结合蛋白(如抗体)结合的特定的原子基团(例如，糖侧链、磷酰基、磺酰基)或氨基酸。
在本申请中，术语“KD”、“KD”可互换地使用，通常是指平衡解离常数，“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。可使用结合速率常数(kon)、解离速率常数(kdis)和平衡解离常数(KD)表示抗原结合蛋白(例如抗体)对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知，包括但不限于生物膜干涉技术(BLI)、放射免疫法(RIA)、平衡透析法、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量迁移(FRET)、免疫共沉淀(Co-IP)以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
在本申请中，术语“参比抗体”通常是指本申请所述抗原结合蛋白与之竞争结合抗原TIGIT的抗体。
在本申请中，术语“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”通常是指这样一种细胞毒性形式，一些分泌型免疫球蛋白结合到某些细胞毒性效应细胞(例如，NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。介导ADCC的主要细胞(例如NK细胞)只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FeγRIII(可参见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3)。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以评估目的分子的ADCC活性，例如，可进行体外ADCC测定法，可参见美国专利号No.5,500,362或No.5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。
ADCC活性可通过修饰Fc区而减少。在某些情形中，影响与Fc受体结合的位点可被除去，例如，除去并非补救受体结合位点的位点。在某些情形中，Fc区可经修饰以除去ADCC位点。ADCC位点是本领域已知的，关于IgG1的ADCC位点，参见例如，Sarmay et al.(1992)Molec.Immunol.29(5):633-9。
在本申请中，术语“在……之间”通常是指某种氨基酸片段的C端与第一氨基酸片段的N端直接或间接连接，并且其N端与第二氨基酸片段的C端直接或间接连接。在轻链中，例如，所述L-FR2的N末端与所述LCDR1的C末端直接或间接相连，且所述L-FR2的C末端与所述LCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述L-FR3的N末端与所述LCDR2的C末端直接或间接相连，且所述L-FR3的C末端与所述LCDR3的N末端直接或间接相连。在重链中，例如，所述H-FR2的N末端与所述HCDR1的C末端直接或间接相连，且所述H-FR2的C末端与所述HCDR2的N末端直接或间接相连。又例如，所述H-FR3的N末端与所述HCDR2的C末端直接或间接相连，且所述H-FR3的C末端与所述HCDR3的N末端直接或间接相连。在本申请中，“第一氨基酸片段”和“第二氨基酸片段”可以为相同或不同的任意一段氨基酸片段。
在本申请中，术语“分离的”抗原结合蛋白通常是指已经从其产生环境(例如，天然的或重组的)的组分中识别，分离和/或回收的抗原结合蛋白。其产生环境的污染组分通常是干扰其研究、诊断或治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的抗原结合蛋白或抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。本申请所述的分离的抗原结合蛋白通常不结合非TIGIT抗原的抗原。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”通产是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一定组合，其不与在自然界中发现的多核苷酸的全部或一部分缔合，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本申请中，术语“重组细胞”通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文所用，术语“给予”和“处理”是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体。“给予”和“处理”可以指治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触、以及试剂与流体的接触、流体与细胞的接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理。“处理”当应用于人、动物或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断；包括TIGIT结合物与人或动物、受试者、细胞、组织、生理区室或生理流体的接触。
如本文所用，术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂，包含本申请的任何一种TIGIT抗原结合蛋白及其组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。治疗的期望效果包括降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。例如，若一种或多种与癌症有关的症状是减轻或消除的，包括但不限于，降低(或破坏)癌细胞增殖，减少源自疾病的症状，提高那些患有疾病的个体的生命质量，降低治疗疾病需要的其它药物的剂量，延迟疾病的进展，和/或延长个体存活，则个体得到成功“治疗”。
在本申请中，术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
抗原结合蛋白
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其可以包含重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含HCDR1，其中所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列：GYSITSDYA。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含HCDR2，其中所述HCDR2可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列：IX2X3SGX6X7，其中，X2为S或T，X3为S或Y，X6为A或S，且X7为P或T。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:4和42中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含HCDR2，其中所述HCDR2可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列：ITSSGST。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，其中所述HCDR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列：AX2LX4X5X6X7YX9X10AMDY，其中，X2为R或S，X4为D或G，X5为F或T，X6为D或G，X7为N或Y，X9为G或不存在，X10为G或不存在。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:5和43中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含HCDR3，其中所述HCDR3可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列：ARLDFGNYGGAMDY。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白还可以包含框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR1，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO:58所示的氨基酸序列：X1VQLQESGPGLVKPSX16X17LSLTCTVX25，其中，X1为D或Q，X16为E或Q，X17为S或T，且X25为S或T。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述H-FR1可以包含SEQ ID NO:23和35中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR1，其中所述H-FR1可包含SEQ IDNO:23所示的氨基酸序列：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR2，其中所述H-FR2可包含SEQ IDNO:60所示的氨基酸序列：WX2WIRQX7PGX10X11X12EWX15GY；其中，X2为I或N，X7为F或P，X10为K或N，X11为G、R或K，X12为L或V，且，X15为I或M。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述H-FR2可包含SEQ ID NO:24-26和36-37中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR2，其中所述H-FR2可包含SEQ IDNO:59所示的氨基酸序列：WIWIRQPPGX10X11LEWIGY；其中，X10为K或N，X11为G或K。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述H-FR2可包含SEQ ID NO:24-26中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR3，其中所述H-FR3可包含SEQ IDNO:61所示的氨基酸序列：X1YNPSLKSRX10X11X12X13X14DTSKNQFX22LX24LX26X27VTX30X31DTATYYC，其中，X1为R、S或Y，X10为I或V，X11为S或T，X12为F或I，X13为S或T，X14为R或V，X22为F或S，X24为K或Q，X26为S或T，X27为F或S，X30为A或T，且，X31为A或E。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述H-FR3可包含SEQ ID NO:27、38和39中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR3，其中所述H-FR3可包含SEQ IDNO:27所示的氨基酸序列：YYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYC。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR4，其中所述H-FR4可包含SEQ IDNO:62所示的氨基酸序列：WGQGTX6VX8VSS，其中，X6为L或S，且X8为I或T。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述H-FR4可包含SEQ ID NO:28、40和41中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区H-FR4，其中所述H-FR4可包含SEQ IDNO:28所示的氨基酸序列：WGQGTLVTVSS。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VH，其中所述VH可包含SEQ IDNO:55所示的氨基酸序列：X1VQLQESGPGLVKPSX16X17LSLTCTVX25GYSITSDYAWX36WIRQX41PGX44X4 5X46EWX49GYIX53X54SGX57X58X59YNPSLKSRX68X69X70X71X72DTSKNQFX80LX82LX84X85VTX88X89DTATYYCAX98LX100X101X102X103YX105X106AMDYWGQGTX116VX118VSS，其中X1为D或Q，X16为E或Q，X17为S或T，X25为S或T，X36为I或N，X41为F或P，X44为N或K，X45为G、K或R，X46为L或V，X49为I或M，X53为S或T，X54为S或Y，X57为A或S，X58为P或T，X59为R、S或Y，X68为I或V，X69为S或T，X70为F或I，X71为S或T，X72为R或V，X80为F或S，X82为K或Q，X84为S或T，X85为F或S，X88为A或T，X89为A或E，X98为R或S，X100为D或G，X101为F或T，X102为D或G，X103为N或Y，X105为G或不存在，X106为G或不存在，X116为L或S，且X118为I或T。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述的抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，其中所述VH可包含SEQ IDNO:1、9、12、14和32中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VH，其中所述VH可包含SEQ IDNO:54所示的氨基酸序列：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGX44X45LEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS，其中X44为K或N，且，X45为G或K。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述的抗原结合蛋白可以包含重链可变区VH，其中所述VH可包含SEQ IDNO:9、12和14中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含重链恒定区，所述重链恒定区可以来自人IgG，例如，人IgG1。在某些情形中，可以对人IgG1的Fc区进行修饰以达到所期望的性质(例如，ADCC KO)。所述修饰可以是氨基酸突变。在某些情形中，对IgG1的修饰可以为L234A/L235A，即，按照EU编号，第234位和第235位的氨基酸分别由亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)。在某些情形中，本申请所述的抗原结合蛋白的重链恒定区可以来自野生型的人IgG1。
例如，本申请所述的抗原结合蛋白可以包含重链恒定区，其可包含SEQ ID NO:35-36中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其可以包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，其可以包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，其中所述LCDR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列：QHVSX5A，其中，X5为N或T。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:6和52中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含LCDR1，其中所述LCDR1可包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列：QHVSTA。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含LCDR2，其中所述LCDR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列：SAS。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，其中所述LCDR3可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列：QQX3YX5X6PX8T，其中，X3为H或Y，X5为I或S，X6为L或T，且X8为W或Y。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述LCDR3可包含SEQ ID NO:8和53中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含LCDR3，其中所述LCDR3可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列：QQHYITPYT。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白还可以包含框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR1，其中所述L-FR1可包含SEQ IDNO:68所示的氨基酸序列：DIX3MTQSX8X9X10X11X12X13SX15GDRVX20ITCX24AS；其中，X3为Q或V，X8为H或P，X9为K或S，X10为F或S，X11为L或M，X12为F或S，X13为A或T，X15为I或V，X20为S或T，X24为K或R。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR1可包含SEQ ID NO:15、16、44和45中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR1，其中所述L-FR1可包含SEQ IDNO:67所示的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX24AS；其中，X24为K或R。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR1可包含SEQ ID NO:15和16中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR2，其中所述L-FR2可包含SEQ IDNO:70所示的氨基酸序列：X1X2WYQQKPGX10X11PKLLIX17；其中，X1为L或V，X2为A或N，X10为K或Q，X11为A或S，且，X17为H或Y。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17、18、46和47中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR2，其中所述L-FR2可包含SEQ IDNO:69所示的氨基酸序列：X1X2WYQQKPGKAPKLLIY；其中，X1为L或V，且X2为A或N。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR2可包含SEQ ID NO:17和18中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR3，其中所述L-FR3可包含SEQ IDNO:72所示的氨基酸序列：YX2X3X4GVPX8RFX11GX13X14SGTDFTX21TIX24SX26QX28EDX31AX33YYC；其中，X2为L或R，X3为Q或Y，X4为S或T，X8为D或S，X11为I、S或T，X13为R或S，X14为G或R，X21为F或L，X24为N或S，X26为L或V，X28为A或P，X33为F或L，且X14为T或V。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR3可包含SEQ ID NO:19-21和48-50中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR3，其中所述L-FR3可包含SEQ IDNO:71所示的氨基酸序列：YX2X3SGVPSRFSGSX14SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC；其中，X2为L或R，X3为Q或Y，且X14为G或R。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR3可包含SEQ ID NO:19-21中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR4，其中所述L-FR4可包含SEQ IDNO:73所示的氨基酸序列：FGX3GTKLEIK，其中，X3为G或Q。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述L-FR4可包括SEQ ID NO:22和51中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含框架区L-FR4，其中所述L-FR4可包含SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列：FGQGTKLEIK。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，其中所述VL可包含SEQ IDNO:64所示的氨基酸序列：DIX3MTQSX8X9X10X11X12X13SX15GDRVX20ITCX24ASQHVSX31AX33X34WYQQKPGX42X43PKLLIX49SASYX54X55X56GVPX60RFX63GX65X66SGTDFTX73TIX76SX78QX80EDX83AX85YYCQQX91YX93X94PX96TFGX100GTKLEIK，其中，X3为Q或V，X8为H或P，X9为K或S，X10为F或S，且，X11为L或M，X12为F或S，X13为A或T，X15为I或V，X20为S或T，X24为K或R，X31为N或T，X33为L或V，X34为A或N，X42为K或Q，X43为A或S，X49为H或Y，X54为L或R，X55为Q或Y，X56为S或T，X60为D或S，X63为I、S或T，X65为S或R，X66为G或R，X73为L或F，X76为S或N，X78为L或V，X80为A或P，X83为F或L，X85为T或V，X91为H或Y，X93为I或S，X94为L或T，X96为W或Y，且，X100为Q或G。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，其中所述VL可包含SEQ IDNO:2、10、11、13、33和34中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，其中所述VL可包含SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCX24ASQHVSTAX33X34WYQQKPGKAPKLLIYSASYX54X55SGVPSRFSGSX66SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK，其中，X24为K或R，X33为L或V，X34为A或N，X54为L或R，X55为Q或Y，且，X66为G或R。例如，该序列可以是根据IMGT定义规则确定的序列。
例如，所述的抗原结合蛋白可以包含轻链可变区VL，其中所述VL可包含SEQ IDNO:10、11和13中任一项所示的氨基酸序列。
本申请所述的抗原结合蛋白可以包含轻链恒定区，所述轻链恒定区可以包含人轻链恒定区序列，例如，可以包含人κ轻链恒定区。例如，本申请所述分离的抗原结合蛋白的轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ IDNO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:4和42中任一项所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:5和43中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体重链可变区CDR——HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、所述HCDR2和所述HCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQID NO:7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:6和52中任一项所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:8和53中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含抗体轻链可变区CDR——LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列，且所述HCDR3可包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
例如，在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ IDNO:4和42中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:5和43中任一项所示的氨基酸序列，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:6和52中任一项所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:8和53中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。
在某些情形中，本申请所述分离的抗原结合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，且所述HCDR1、所述HCDR2、所述HCDR3、所述LCDR1、所述LCDR2和所述LCDR3可分别依次包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:13中任一项所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14中任一项所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
本申请所述分离的抗原结合蛋白还可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可以来自人IgG1的恒定区，所述轻链恒定区可以来自人κ轻链恒定区。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:29所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，该分离的抗原结合蛋白可称为HB0030。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:29所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列该分离的抗原结合蛋白可称为HB0031。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:29所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，该分离的抗原结合蛋白可称为HB0032。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:29所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，该分离的抗原结合蛋白可称为HB0033。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQ IDNO:30所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列该分离的抗原结合蛋白可称为900424。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:30所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，该分离的抗原结合蛋白可称为900423。
例如，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述VL可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；且，所述分离的抗原结合蛋白可包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区可包含SEQID NO:30所示的氨基酸序列，且所述轻链恒定区可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，该分离的抗原结合蛋白可称为900428。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合所述TIGIT蛋白，其中所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述参比抗体的轻链可变区可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ IDNO:65所示的氨基酸序列；所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
本申请所述的分离的抗原结合蛋白，能够与参比抗体竞争结合所述TIGIT蛋白，其中所述参比抗体可包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区可以包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述参比抗体的轻链可变区可以包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1可以包含SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列；所述LCDR2可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述LCDR3可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述抗原结合蛋白的氨基酸序列的一部分可以与来自特定物种的抗体中相应的氨基酸序列同源，或者属于特定的类别。例如，抗体的可变区及恒定部分均可以来自一个动物物种(如人)的抗体的可变区及恒定区。在本申请中，所述同源物可以为，与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，本申请所述的抗原结合蛋白)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)能够特异性结合TIGIT抗原。“特异性结合”TIGIT抗原的抗原结合蛋白(例如，抗体)通常可以以约1nM的KD值或更高亲和力(例如，1nM、100pM、10pM、2pM或1pM)结合TIGIT，但不结合缺乏TIGIT序列的其它蛋白。例如，“特异性结合”TIGIT的抗体不结合人CD226、人CD155和人CD112。本申请所述的抗原结合蛋白(例如，抗体)能够特异性结合TIGIT抗原或其标记形式(例如，荧光标记的TIGIT抗原)，但不会结合缺乏TIGIT表位的其它蛋白。抗原结合蛋白(例如，抗体)是否结合TIGIT抗原可使用本领域中已知的任何测定法确定。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)。在某些情形中，本申请所述的TIGIT抗体还可以与猴和/或鼠的TIGIT交叉反应。例如，通过流式分析技术和酶联免疫反应所检测的。如本文所用，“交叉反应性”是指抗体与来自其它物种的同源蛋白反应的能力。
本申请所述的抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)能够抑制TIGIT与CD155配体的结合。阻断实验可以使用竞争法进行检测，例如，将所述的抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与抗原(或，可表达抗原的细胞)和抗原的配体(或，表达配体的细胞)混合，根据可检测标记的的强度(例如，荧光强度或浓度)反应抗原结合蛋白与抗原的配体竞争性结合抗原的能力。例如，如使用流式细胞仪所检测的，本申请所述的抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)阻断TIGIT抗原与CD155配体结合的IC50为约0.1μg/ml-0.05μg/ml。
核酸、载体和细胞
在另一个方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子。所述一种或多种核酸分子可编码本申请所述的抗原结合蛋白。例如，所述一种或多种核酸分子中的每一个核酸分子可以编码完整的所述抗原结合蛋白，也可以编码其中的一部分(例如，HCDR1-3、LCDR1-3、VL、VH、轻链或重链中的一种或多种)。
本申请所述的核酸分子可以为分离的。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组DNA技术制备的核酸分子。
在本申请中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码所述抗体、其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于，采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸PCR，具体操作可参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York N.Y.，1993。
在另一个方面，本申请提供了一种或多种载体，其包含本申请所述的一种或多种核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。所述表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。在本申请中，适当的启动子可包括，例如用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分可与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，其可包含或不包含另外的内含子。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。
在另一个方面，本申请提供了宿主细胞，所述宿主细胞可包含本申请所述的一种或多种核酸分子和/或本申请所述的一种或多种载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如电穿孔、lipofectine转染、lipofectamin转染等。
制备方法
在另一个方面，本申请提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
任何适于产生单克隆抗体的方法都可用于产生本申请的抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)。例如，可以用连接或天然存在的TIGIT同源二聚体或其片段免疫动物。可以使用合适的免疫接种方法，包括佐剂、免疫刺激剂、重复加强免疫接种，可以使用一种或多种途径。
任何合适形式的TIGIT都可以作为免疫原(抗原)，用于产生对TIGIT特异的非人抗体，筛选所述抗体的生物学活性。激发免疫原可以是全长的成熟人TIGIT，包括天然的同源二聚体，或含单个/多个表位的肽。免疫原可以单独使用，或与本领域已知的一种或多种免疫原性增强剂组合使用。免疫原可以由天然来源纯化，或者在遗传修饰的细胞中产生。编码免疫原的DNA在来源上可以是基因组或非基因组的(例如cDNA)。可以使用合适的遗传载体表达编码免疫原的DNA，所述载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、质料和非病毒载体。
生产本申请的抗人TIGIT抗体的示例性方法描述于实施例1。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在本申请中，抗体是IgG抗体，使用IgG1亚型。可以通过用下文实施例中描述的生物学测定筛选抗体实现必需恒定结构域序列的优化，以产生所需生物学活性。同样，任一类轻链都可以在本文的化合物和方法中使用。具体地说，κ、λ链或其变体在本申请的化合物和方法中是可以用的。
人源化本申请的抗人TIGIT抗体的示例性方法描述于实施例2。
本申请的抗原结合蛋白或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该核酸分子引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本申请还涉及包含上述的适当核酸分子以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。例如，动物细胞可以包括(但并不限于)：CHO-S、CHO-K1、HEK-293细胞。
本申请中所述的用重组DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本申请的核酸分子所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，用常规培养基在合适的条件下培养。通常，在适合本申请抗原结合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本申请的抗原结合蛋白。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如流式细胞分选技术(FACS)、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。
药物组合物
另一方面，本申请还提供了一种组合物。在某些情形中，所述的组合物可以是药物组合物，它含有本申请的抗原结合蛋白或其融合蛋白或其ADC或相应的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常可以为约5-8，例如，pH可以为约6-8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本申请所述的抗原结合蛋白也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗，比如，所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
本申请所述的药物组合物可直接用于结合TIGIT蛋白分子，因而可用于预防和治疗TIGIT相关的疾病。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本申请的药物组合物可以含有安全有效量(如0.001-99wt％，0.01-90wt％，或0.1-80wt％)的本申请所述的抗原结合蛋白以及药学上可接受的佐剂(可包括载体或赋形剂)。这类载体可以包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本申请所述的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重至约5毫克/千克体重。此外，本申请所述的抗原结合蛋白还可与其他治疗剂一起使用。
本文所述的抗原结合蛋白或药物组合物可以符合良好医疗实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、单个患者的临床病状、病症的病因、药剂递送部位、施用方法、施用排程和医学从业者已知的其他因素。治疗剂(例如，抗TIGIT抗体)无需但任选地与一种或多种当前用来预防或治疗所考虑的病症的药剂一起配制和/或同时施用。此类其他药剂的有效量取决于制剂中存在的治疗剂(例如，抗TIGIT抗体)的量、病症或治疗的类型以及以上论述的其他因素。这些药剂通常可以凭经验/临床上确定为适当的任何剂量且通过凭经验/临床上确定为适当的任何途径加以使用。与单个治疗相比，可减少组合治疗中施用的抗体的剂量。通过常规技术易于监测此疗法的进展。
方法和用途
另一方面，本申请提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞和/或所述药物组合物在制备药物中的用途。所述药物用于预防、缓解和/或治疗TIGIT相关的疾病。在某些情形中，所述TIGIT相关的疾病可以是T细胞功能障碍性病症。T细胞功能障碍体现在T细胞耗尽，是通过增强NK细胞和激活T细胞，增强机体免疫活性实现对疾病的治疗或延迟或缓解。例如，所述TIGIT相关的疾病可以是肿瘤、癌症或感染性病症。例如，所述TIGIT相关的疾病可以是CD155阳性或PVR阳性的肿瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症，包括肿瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症等。在某些情形中，所述肿瘤可以选自下组：乳腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肾癌、黑色素瘤、T淋巴瘤、胰腺癌。例如，所述肿瘤为结肠癌。例如，本申请所述的抗原结合蛋白可以抑制选自下组的肿瘤动物模型的肿瘤生长：乳腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肾癌、黑色素瘤、T淋巴瘤和胰腺癌。
本申请的抗原结合蛋白可以抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤细胞增殖。在某些实施方式中，所述肿瘤包含结肠癌。在某些实施方式中，所述肿瘤或癌症为TIGIT表达异常的肿瘤或癌症。本申请还提供了以下描述的检测生物样品中TIGIT表达的方法。在某些情形中，所述方法包括使生物样品与本申请所述的抗原结合蛋白在容许所述抗原结合蛋白结合TIGIT的条件下接触，和检测在所述抗原结合蛋白与TIGIT之间是否形成复合物。例如，所述肿瘤或癌症为与非肿瘤或癌症样品相比，TIGIT表达升高的肿瘤或癌症。此类方法可以是体外或体内方法。本申请所述抗原结合蛋白可用于例如免疫测定中，所述免疫测定包括例如免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、免疫印迹(例如，蛋白质印迹)、流式细胞术(例如，FAGS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些情形中，例如当TIGIT为用于选择患者的生物标记时，所述抗原结合蛋白用来选择适于用本申请所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白进行的疗法的受试者。本申请还提供了所述抗原结合蛋白在诊断患有病症(例如，癌症或免疫功能失调)的受试者的方法中的用途，所述方法包括：通过使样品与本申请的所述抗原结合蛋白接触并检测结合的所述抗原结合蛋白和/或融合蛋白的存在来确定获自受试者的样品中TIGIT的存在或表达水平。
例如，在结肠癌小鼠模型中，本申请所述的抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)能够减缓肿瘤生长。
本申请的抗原结合蛋白可用于检测应用，例如用于检测样本，从而提供诊断信息。
在本申请中，所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本申请使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本申请中使用的活检可以包括例如通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本申请中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本申请还提供了一种指含有本申请的抗原结合蛋白的试剂盒。在某些情形中，所述的试剂盒还可以包括容器、使用说明书、缓冲剂等。例如，本申请的原结合蛋白可以固定于检测板。
本申请还提供了以下实施方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH中的至少一个CDR，所述VH包含SEQID NO:55所示的氨基酸序列。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL中的至少一个CDR，所述VL包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1×10-10M或更低的KD值结合TIGIT蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振法测定；
2)在FACS测定中，能够阻断CD155与TIGIT的结合；和
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
5.根据实施方案4所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
6.根据实施方案4-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
8.根据实施方案7所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案7-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:4和42中任一项所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案7-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案7-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:5和43所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案2-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中所述LCDR1包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案12所述的分离的抗原结合蛋白，所述LCDR1包含SEQ ID NO:6和52中任一项所示的氨基酸序列。
14.根据实施方案12-13所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR2包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
15.根据实施方案12-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
16.根据实施方案12-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述LCDR3包含SEQ ID NO:8和53中任一项所示的氨基酸序列。
17.根据实施方案3-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其与参比抗体竞争结合所述TIGIT蛋白，其中所述参比抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述参比抗体的重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述HCDR2包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列；所述HCDR3包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列，所述参比抗体的轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列；所述LCDR2包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；所述LCDR3包含SEQ IDNO:66所示的氨基酸序列。
18.根据实施方案2-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包括框架区L-FR1，L-FR2，L-FR3，和L-FR4。
19.根据实施方案18所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1的C末端与所述LCDR1的N末端直接或间接相连，且所述L-FR1包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案18-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR1包含SEQ ID NO:15、16、44和45中任一项所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案18-20中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2位于所述LCDR1与所述LCDR2之间，且所述L-FR2包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案18-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR2包含SEQ ID NO:17、18、46和47中任一项所示的氨基酸序列。
23.根据实施方案18-22中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3位于所述LCDR2与所述LCDR3之间，且所述L-FR3包含SEQ ID NO:72所示的氨基酸序列。
24.根据实施方案18-23中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR3包含SEQ ID NO:19、20、21、48、49和50中任一项所示的氨基酸序列。
25.根据实施方案18-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4的N末端与所述LCDR3的C末端相连，且所述L-FR4包含SEQ ID NO:73所示的氨基酸序列。
26.跟据实施方案18-25中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述L-FR4包含SEQ ID NO:22和51中任一项所示的氨基酸序列。
27.根据实施方案2-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQID NO:64所示的氨基酸序列。
28.根据实施方案2-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VL包含SEQID NO:2、10、11、13、33和34中任一项所示的氨基酸序列。
29.根据实施方案1-28中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区来自人κ轻链恒定区，且所述人κ轻链恒定区包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案1-29中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包括框架区H-FR1，H-FR2，H-FR3，和H-FR4。
31.根据实施方案30所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1的C末端与所述HCDR1的N末端直接或间接相连，且所述H-FR1包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。
32.根据实施方案30-31中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR1包含SEQ ID NO:23和35中任一项所示的氨基酸序列。
33.根据实施方案30-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2位于所述HCDR1与所述HCDR2之间，且所述H-FR2包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。
34.根据实施方案30-33中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR2包含SEQ ID NO:24-26、36和37中任一项所示的氨基酸序列。
35.根据实施方案30-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3位于所述HCDR2与所述HCDR3之间，且所述H-FR3包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
36.根据实施方案30-35中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR3包含SEQ ID NO:27、38和39中任一项所示的氨基酸序列。
37.根据实施方案30-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4的N末端与所述HCDR3的C末端相连，且所述H-FR4包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。
38.根据实施方案30-37中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述H-FR4包含SEQ ID NO:28、40和41中任一项所示的氨基酸序列。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQID NO:55所示的氨基酸序列。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述VH包含SEQID NO:1、9、12、14和32中任一项所示的氨基酸序列。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包括人IgG1恒定区，且人IgG1恒定区包含SEQ ID NO:29-30中任一项所示的氨基酸序列。
43.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
44.载体，其包含根据实施方案43所述的核酸分子。
45.细胞，其包含根据实施方案43所述的核酸分子或根据实施方案44所述的载体。
46.制备实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方案45所述的细胞。
47.药物组合物，其包含实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案43所述的核酸分子、实施方案44所述的载体和/或实施方案45所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
48.实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案43所述的核酸分子、实施方案44所述的载体、实施方案45所述的细胞和/或实施方案47所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗TIGIT相关疾病。
49.根据实施方案48所述的用途，所述TIGIT相关疾病为T细胞功能障碍性病症。
50.根据实施方案48-49中任一项所述的用途，所述TIGIT相关疾病为肿瘤。
51.根据实施方案50所述的用途，所述肿瘤为结肠癌。
52.抑制CD155与TIGIT结合的方法，所述方法包括施用实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
53.预防、缓解或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用实施方案1-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
本申请还提供了以下的实施方案：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，所述HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:42所示，且所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:43所示；其包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:52所示，所述LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，且所述LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:53所示。
2.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，其中所述VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
3.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL，其中所述VL包含SEQ ID NO:33-34所示的氨基酸序列。
4.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，且所述分离的抗原结合蛋白包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
(1)VH：SEQ ID NO:32，VL：SEQ ID NO:33，和
(2)VH：SEQ ID NO:32，VL：SEQ ID NO:34。
5.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1×10-10M或更低的KD值结合TIGIT蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振法测定；
2)在FACS测定中，能够阻断CD155与TIGIT的结合；和
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
6.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
7.根据实施方案6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
8.根据实施方案6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
9.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人κ轻链恒定区。
10.根据实施方案9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述人κ轻链恒定区包含SEQID NO:31所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
12.根据实施方案11所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包括人IgG1恒定区，且所述人IgG1恒定区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
13.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
14.载体，其包含根据实施方案13所述的核酸分子。
15.细胞，其包含根据实施方案13所述的核酸分子或根据实施方案14所述的载体。
16.制备实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据实施方案15所述的细胞。
17.药物组合物，其包含实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案13所述的核酸分子、实施方案14所述的载体和/或实施方案15所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
18.实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、实施方案13所述的核酸分子、实施方案14所述的载体、实施方案15所述的细胞和/或实施方案17所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗TIGIT相关疾病，所述TIGIT相关疾病为结肠癌。
19.实施方案1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白在制备试剂中的用途，所述试剂用于抑制CD155与TIGIT结合。
20.分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
实施例1抗人TIGIT的小鼠单克隆抗体——原始抗体的制备方法
1.1制备产生鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞
制备鼠源单克隆抗体的方法采用Kohler和Milstein 1975年发明的杂交瘤制备技术(Nature，1975，256：495-497)。首先将人TIGIT带有鼠Fc标签蛋白(ACRO，#TIT-H5253)与弗氏佐剂乳化，然后对BALB/c、CD1、C57BL/6每个品系各5只小鼠进行多点皮下免疫。三轮免疫后取血清用ELISA法检测效价，FACS检测结合活性及功能活性，挑选最佳小鼠取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。经过HAT筛选杂交瘤多克隆细胞，采用ELISA、FACS方法，筛选出特异性结合人TIGIT且可以阻断TIGIT-CD155结合的多克隆细胞株后进行单克隆化，再次使用ELISA、FACS方法筛选特异性结合的单克隆细胞株，并检测了与猴、小鼠TIGIT结合力，通过FACS筛选出阻断TIGIT-CD155与TIGIT-CD122结合的单克隆抗体，后续进行细胞功能学活性检测，并对筛选出的单克隆细胞株进行亲和力(Biacore)筛选，最终得到表达人TIGIT抗体的单克隆杂交瘤细胞株进行序列分析，筛选数据列举见表1。
表1.杂交瘤筛选数据
Figure BDA0003521056070000341
Figure BDA0003521056070000351
经过高通量筛选，最终得到的单克隆杂交瘤细胞株具有高亲和力，可以与人和猴都具有结合活性，对TIGIT的两个配体CD155及CD122同时具有阻断功能，并且具有生物活性。将以上表1中的杂交瘤细胞株进行人源化改造。
实施例2抗TIGIT抗体可变区基因序列克隆以及人源化
2.1杂交瘤细胞中抗体的可变区基因克隆
基于TAKARA的5’RACE技术原理，克隆出由杂交瘤细胞株表达的小鼠抗体可变区的cDNA序列。简言之，用SMARTer 5’RACE合成试剂盒(TAKARA，#634859)按说明书合成重链和轻链的可变区基因特异性cDNA。用PCR引物修饰cDNA序列的5’和3’端，所述引物设计成为分别在重链和轻链可变区cDNA上增加合适的前导序列，使所得PCR产物能够通过无缝克隆的方法克隆到现有重组抗体表达的重链载体pHB-Fc和轻链载体pHB-Cκ上。pHB-Fc表达载体上含有人IgG1重链恒定区基因序列，其中CH2上带有抗体ADCC knock out(KO)效应的L234A和L235A(Eu编码)突变；pHB-Cκ载体上含有人κ轻链恒定区基因序列。将重链和轻链可变区PCR扩增产物通过In-fusion克隆试剂(TAKARA,#639650)克隆到表达载体上，并转化到E.coliDH5α大肠杆菌感受态细胞(益生生技，#FYE607-80VL)中。通过挑选单克隆菌落进行Sanger测序，经分析获得抗体可变区序列。其中B3/29F6表达的抗TIGIT抗体可变区序列如下：
B3/29F6 VH SEQ ID NO:1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
B3/29F6 VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
其中，下划线区为CDRs(按照IMGT定义，序列分别如下)：
表2.鼠源抗TIGIT抗体CDR序列
Figure BDA0003521056070000361
2.2IgG1野生型嵌合表达载体构建
IgG1野生型为嵌合抗体和ADCC KO型嵌合抗体共用相同的轻链载体，不同之处在于所用含有人重链恒定区序列的载体上重链CH2的234和235位氨基酸，ADCC KO型为A234/A235，野生型为L234/L235。IgG1野生型嵌合重链表达载体的方法与2.1中所述表达载体构建方法原理相同，即通过含有前导序列的引物PCR扩增重链可变区基因，再用无缝连接方法克隆到含有人重链恒定区序列(CH2为L234/L235)的载体上，完成IgG1野生型嵌合表达载体的构建。
2.3嵌合抗体的表达
2.1和2.2中所得表达载体经过大肠杆菌扩增，用去内毒素质粒抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，#DP117)制备足量质粒，用于瞬时转染表达嵌合抗体。表达所用的宿主细胞为CHO-S细胞(赛默飞，#R80007)。通过将制备所得的两种重链载体分别和轻链载体一起，与聚醚酰亚胺(PEI，Polysciences，#24765-1)混合形成脂质体复合物后，转染CHO-S细胞，放入培养箱中培养5-7天。离心收集细胞培养液上清，通过Protein A亲和层析柱纯化得到ADCC KO型人鼠嵌合抗体(编号为900424)和IgG1野生型人鼠嵌合抗体(蛋白编号900445)。
按照上述方法得到的嵌合抗体VH和VH序列分别如下：
900423和900428VH SEQ ID NO:32
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNRLEWMGYISYSGAPRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLSFVTTEDTATYYCASLGTDYYAMDYWGQGTSVIVSS
900424VH SEQ ID NO:1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWIWIRQFPGNKVEWMGYITSSGSTSYNPSLKSRISFTRDTSKNQFFLQLTSVTTEDTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTSVTVSS
900424VL SEQ ID NO:2
DIVMTQSHKFMSTSIGDRVSITCKASQHVSTAVAWYQQKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFTGSRSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYITPYTFGGGTKLEIK
900423VL SEQ ID NO:34
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFIGRGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK
900428VL SEQ ID NO:33
DIVMTQSHKFMFTSVGDRVSITCKASQHVSNAVAWYQQKPGQSPKLLIHSASYRYTGVPDRFTGRGSGTDFTFTINSVQAEDLAVYYCQQYYSLPWTFGGGTKLEIK
其中，900424的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示，900423的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示，900428的重链恒定区氨基酸为SEQ ID NO:30所示。轻链恒定区均为人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:31)。
2.4鼠源抗人TIGIT抗体的人源化——人源化抗体的制备方法
抗体的人源化采用以下方法。将抗体的可变区序列与NCBI IgBlast数据库中的可用序列比较，通过鉴定和分析，最终确定了适合在其上构建CDR移植重链和轻链的人源构架区(FR区)。
改造时，根据人抗体FR区保守的氨基酸残基以及抗体FR区中重要的氨基酸残基，设计改造位点，对嵌合抗体的重轻链的可变区分别进行人源化突变设计，利用PCR技术扩增并构建人源化点突变抗体表达质粒。将人源化点突变抗体表达质粒分别经CHO-S细胞表达，纯化后得到人源化抗体蛋白。利用ELISA，Biacore和流式细胞术等检测方法，对人源化抗体的受体结合能力，功能抑制活性和ADCC效应等指标进行筛选，获得了四个性能优异的人源化抗TIGIT抗体。所获得人源化抗TIGIT抗体的VH和VL序列下所示：
900461和900464VH SEQ ID NO:9
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKGLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900461VL SEQ ID NO:10
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900464和900476VL SEQ ID NO:11
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTALAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900466VH SEQ ID NO:12
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGKKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
900466VL SEQ ID NO:13
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQHVSTAVNWYQQKPGKAPKLLIYSASYRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYITPYTFGQGTKLEIK
900476VH SEQ ID NO:14
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSITSDYAWIWIRQPPGNKLEWIGYITSSGSTYYNPSLKSRVTFSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARLDFGNYGGAMDYWGQGTLVTVSS
其中，下划线区为CDRs(按照IMGT定义)，900461，900464，900466和900476分别为四个人源化抗体蛋白编号，对应项目编号为HB0030、HB0031、HB0032、HB0033。
其中，HB0030的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示，HB0031的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示，HB0032的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示，HB0033的重链恒定区氨基酸序列为SEQ ID NO:29所示。轻链恒定区均为人κ轻链恒定区(SEQ ID NO:31)。
实施例3嵌合抗体及人源化抗体的检测
3.1测试TIGIT抗体对表达人TIGIT的细胞结合活性
嵌合抗体900324、900423、900424、900428，人源化抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033与表达人TIGIT的细胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，华博生物)的结合活性检测。
所有嵌合抗体、人源化抗体均用含1％BSA的PBS溶液(1％BSA/PBS)稀释至20μg/ml，每孔20μL加入96孔U型板中，同步设定阴性对照(只加1％BSA/PBS)。取对数生长期内表达人TIGIT的细胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，华博生物)悬液，离心(1000rpm×5min)弃培养液，用1％BSA/PBS重悬至活细胞密度为1×106/mL，每孔20μL(2×104个细胞)加入已有抗TIGIT抗体的96孔U型板中室温反应30min。将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤1遍，加入1:200稀释的PE-羊抗人-Fc(JacksonImmunoResearch，#109-115-098)，室温避光反应15min；将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤3遍，最终用每孔100μL 1％BSA/PBS重悬，用流式细胞仪(BD，#CantoⅡ)检测PE通道的荧光强度。
嵌合抗体结合活力结果见图1及表3，人源化抗体结合活力结果见图2及表4，其中900324为CHO细胞瞬时表达的来自基因泰克公司的抗人TIGIT抗体Tiragolumab，其轻重链可变区序列与专利申请WO2015009856A2中的抗体10A7的序列相同。结果表明嵌合抗体与人源化抗体均与表达人TIGIT的细胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，华博生物)有很好的亲和力，且亲和力相当。
表3.抗TIGIT嵌合抗体对人TIGIT结合活性
抗体 900428 900424 900423 900324
EC50(μg/mL) 0.075 0.053 0.06 0.124
表4.抗TIGIT人源化抗体对人TIGIT结合活性
抗体 900324 HB0030 HB0031 HB0032 HB0033
EC50(μg/mL) 0.08994 0.04661 0.05806 0.07847 0.0514
3.2测试TIGIT抗体阻断TIGIT抗原和TIGIT分子结合的实验(竞争法)
将抗原huCD155-moFc(ACROBiosystems，#CD5-H5254)用含1％BSA的PBS溶液(1％BSA/PBS)稀释至40μg/ml，每孔10μL加入96孔U型板中，与系列稀释的抗TIGIT抗体按体积比1:1混合均匀，同步设定阳性对照(只加CD155-moFc)。取对数生长期内表达人TIGIT的细胞(CHOK1-huTIGIT-2A3，华博生物)悬液，离心(1000rpm×5min)弃培养液，用1％BSA/PBS重悬至活细胞密度为1×106/mL，每孔20μL(2×104个细胞)加入CD155-moFc与抗TIGIT抗体混匀的96孔U型板中室温反应30min。将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤1遍，加入1:300稀释的Alexa488-羊抗鼠-Fc(JacksonImmunoResearch，#115-545-071)，室温避光反应15min；将反应后的96孔U型板用1％BSA/PBS重悬，离心(300g×3min)弃上层液，如此洗涤3遍，最终用每孔100μL1％BSA/PBS重悬，用流式细胞仪(BD，#CantoⅡ)检测FITC通道的荧光强度。
嵌合抗体结合活力结果见图3及表5，人源化抗体结合活力结果见图4及表6。结果表明嵌合抗体和人源化抗体对人的CD155具有显著的阻断作用，且阻断作用力相当。
表5.抗TIGIT嵌合抗体对人TIGIT与其配体CD155结合的阻断活性
抗体 900428 900424 900423 900324
IC50(μg/mL) 0.069 0.062 0.065 0.174
表6.抗TIGIT人源化抗体对人TIGIT与其配体CD155结合的阻断活性
抗体 900324 HB0030 HB0031 HB0032 HB0033
IC50(μg/mL) 0.1349 0.05733 0.06653 0.0919 0.05598
3.3人源化单克隆抗体的亲和性检测
本试验使用SPR方法测定抗原-抗体结合动力学及亲和力。采用BIOCORE(GE，#Biacore8K)。Sereis S Sensor Chip ProteinA芯片(GE，#29-1275-56)室温平衡20～30min，将芯片装入仪器。用平衡缓冲液将抗体样品稀释至实验工作浓度，2～8℃密封备用。用平衡缓冲液HBS-EP(10x)(GE，#BR-1006-69)稀释抗原，组氨酸标记(His-Tag)的人TIGIT蛋白(huTIGIT，ACRO Biosystems，#TIT-H52H3)，稀释抗原20nM起始2.5倍稀释度5个浓度梯度，并设置2个零浓度(即平衡缓冲液)和最低浓度重复。pH1.5甘氨酸溶液(GE，#BR100354)再生芯片。采用捕获法多循环动力学程序分析样品，选用对应的分析程序对数据分析，确认无明显reference binding，选用Kinetics，1:1binding modle，拟合分析，获得样品的动力学参数。
检测结果如表7所示。与huTIGIT的亲和力常数(KD(M))结果显示，本申请的人源化单克隆抗体HB0030的亲和力接近10-11数量级，具有极强的亲和力。
表7.人源化Mab-TIGIT抗体与hu TIGIT亲和力检测结果
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
HB0030 3.17E+06 1.85E-04 5.83E-11
实施例4动物体内药效试验
本实验研究了抗人TIGIT抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033在免疫检测点人源化小鼠BALB/c-hPD1/hTIGIT皮下接种CT26.WT结肠癌肿瘤模型中的药效。
本实验取用小鼠结肠癌细胞CT26.WT细胞，收集对数生长期的CT26.WT细胞，去除培养液并用PBS洗两次后接种(荷瘤前、荷瘤后CT26.WT细胞存活率分别为：98.57％及98.28％)，接种量：5×105/100μL/只。接种后第11天，平均肿瘤体积达到94.02mm3时，小鼠根据肿瘤体积随机分组，每组8只。分组当天定义为D0天，并于D0、D3、D7、D10、D14、D17进行给药，开始给药后，于D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23观测肿瘤大小并称量小鼠体重。瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。结果如图5所示。
观察图5实验结果，可见本申请的抗TIGIT人源化单克隆抗体HB0030、HB0031、HB0032、HB0033在单独给药10mg/kg时具有明显的肿瘤抑制效果。
进一步的研究了HB0030与对照抗体Tiragolumab在10mg/kg的剂量下，对免疫检测点人源化小鼠BALB/c-hPD1/hTIGIT皮下接种CT26.WT结肠癌肿瘤模型中的药效。
本实验取用小鼠结肠癌细胞CT26细胞，收集对数生长期的CT26细胞，去除培养液并用PBS洗两次后接种(荷瘤前、荷瘤后CT26细胞存活率分别为：98.51％及97.250％)，接种量：5×105/100μL/只，接种第12天，平均肿瘤体积达到80.33mm3时，小鼠根据肿瘤体积随机分组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于D0、D3、D7、D10、D14、D17进行给药，开始给药后，于D0、D2、D4、D6、D8、D10、D13、D15、D17、D20、D23观测肿瘤大小并称量小鼠体重。瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。结果如图6所示。
观察图6结果可知，本申请的抗TIGIT抗体HB0030与对照抗体Tiragolumab比较，表现出更好的肿瘤抑制效果。
本研究中所有组小鼠治在接种后24天，小鼠体重均无明显变化。
序列表
<110> 华博生物医药技术（上海）有限公司；上海华奥泰生物药业股份有限公司
<120> 抗TIGIT的抗体、其制备方法和应用
<130> 0151-PA-001.DIV1
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 VH
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Val Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 VL
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR1
<400> 3
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR2
<400> 4
Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HCDR3
<400> 5
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR1
<400> 6
Gln His Val Ser Thr Ala
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR2
<400> 7
Ser Ala Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LCDR3
<400> 8
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0031 VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 VL
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0031和HB0033 VL
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0032 VH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0032 VL
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0033 VH
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 L-FR1
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 16
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0031、HB0032和HB0033 L-FR1
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0032 L-FR2
<400> 17
Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0031和HB0033 L-FR2
<400> 18
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 19
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 L-FR3
<400> 19
Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 20
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0031和HB0033 L-FR3
<400> 20
Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0032 L-FR3
<400> 21
Tyr Arg Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 L-FR4
<400> 22
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR1
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0031 H-FR2
<400> 24
Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0032 H-FR2
<400> 25
Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0033 H-FR2
<400> 26
Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 27
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR3
<400> 27
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR4
<400> 28
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人IgG1恒定区野生型
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 30
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人IgG1恒定区突变
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人kappa轻链恒定区
<400> 31
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428VH
<400> 32
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ala Pro Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Phe Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Gly Thr Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900428VL
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Phe Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Asn Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423VL
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Phe Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln His Val Ser Asn Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423、900424和900428 H-FR1
<400> 35
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr
20 25
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 H-FR2
<400> 36
Trp Ile Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Val Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 H-FR2
<400> 37
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 38
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 H-FR3
<400> 38
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Phe Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 H-FR3
<400> 39
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Ser Phe Val Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 40
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 H-FR4
<400> 40
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 H-FR4
<400> 41
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 HCDR2
<400> 42
Ile Ser Tyr Ser Gly Ala Pro
1 5
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 HCDR3
<400> 43
Ala Ser Leu Gly Thr Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 L-FR1
<400> 44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 L-FR1
<400> 45
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Phe Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 L-FR2
<400> 46
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 L-FR2
<400> 47
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
His
<210> 48
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900428 L-FR3
<400> 48
Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Arg Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 49
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 L-FR3
<400> 49
Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Arg Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 50
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423 L-FR3
<400> 50
Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Arg Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423、900424和900428 L-FR4
<400> 51
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 LCDR1
<400> 52
Gln His Val Ser Asn Ala
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 LCDR3
<400> 53
Gln Gln Tyr Tyr Ser Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0031 VH; HB0032 VH; HB0033 VH
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa = Gly或Lys
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Phe Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Phe Gly Asn Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 VH; HB0030和HB0031 VH; HB0032 VH; HB0033 VH; 900423和900428VH
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa = Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(36)
<223> Xaa = Ile或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa = Phe或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> Xaa = Gly、Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)..(46)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ile或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(53)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(58)
<223> Xaa = Pro或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(59)
<223> Xaa = Arg、Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(70)
<223> Xaa = Phe或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa = Arg或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(82)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> Xaa = Ala或Glu
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(98)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa = Asp或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> Xaa = Phe或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> Xaa = Asp或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> Xaa = Asn或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (105)..(105)
<223> Xaa = Gly或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(106)
<223> Xaa = Gly或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (116)..(116)
<223> Xaa = Leu或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (118)..(118)
<223> Xaa = Ile或Thr
<400> 55
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Tyr Ala Trp Xaa Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Glu Trp
35 40 45
Xaa Gly Tyr Ile Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Xaa
65 70 75 80
Leu Xaa Leu Xaa Xaa Val Thr Xaa Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Xaa Val Xaa Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 HCDR2; 900423和900428 HCDR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Pro或Thr
<400> 56
Ile Xaa Xaa Ser Gly Xaa Xaa
1 5
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423和900428 HCDR3; 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 HCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Asp或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Phe或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Asp或Gly
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Asn或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Gly或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Gly或不存在
<400> 57
Ala Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR1; 900423、900424和900428 H-FR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Asp或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa = Glu或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa = Ser或Thr
<400> 58
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Xaa
20 25
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0031 H-FR2; HB0032 H-FR2; HB0033 H-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Gly或Lys
<400> 59
Trp Ile Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Xaa Xaa Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0031 H-FR2; HB0032 H-FR2; HB0033 H-FR2;
900424 H-FR2; 900423和900428 H-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ile或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Phe或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Lys或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Gly、Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ile或Met
<400> 60
Trp Xaa Trp Ile Arg Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa Xaa Glu Trp Xaa Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 61
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR3; 900423和900428 H-FR3;
900424 H-FR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Arg、Ser或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Phe或Ile
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Arg或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = Ala或Glu
<400> 61
Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Xaa Leu Xaa Leu Xaa Xaa Val Thr Xaa Xaa Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 H-FR4; 900424 H-FR4;
900423和900428 H-FR4
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Ile或Thr
<400> 62
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Xaa Val Ser Ser
1 5 10
<210> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 VL; HB0031和HB0033 VL; HB0032 VL
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa = Ala或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Xaa = Leu或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> Xaa = Gln或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa = Gly或Arg
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Gln His Val Ser Thr Ala
20 25 30
Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424 VL; HB0030 VL; HB0031和HB0033 VL; HB0032 VL;
900423VL; 900428VL
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gln或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = His或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Lys或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = Asn或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa = Ala或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = His或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> Xaa = Leu或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (55)..(55)
<223> Xaa = Gln或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa = Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa = Ile、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (65)..(65)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa = Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (76)..(76)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (78)..(78)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> Xaa = Thr或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(91)
<223> Xaa = His或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa = Ile或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(94)
<223> Xaa = Leu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(96)
<223> Xaa = Trp或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(100)
<223> Xaa = Gly或Gln
<400> 64
Asp Ile Xaa Met Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Xaa Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Gln His Val Ser Xaa Ala
20 25 30
Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Xaa Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly
50 55 60
Xaa Xaa Ser Gly Thr Asp Phe Thr Xaa Thr Ile Xaa Ser Xaa Gln Xaa
65 70 75 80
Glu Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Xaa
85 90 95
Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 LCDR1; 900423和900428 LCDR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Asn或Thr
<400> 65
Gln His Val Ser Xaa Ala
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900424、HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 LCDR3; 900423和900428 LCDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = His或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Ile或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = Leu或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Trp或Tyr
<400> 66
Gln Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 67
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0031、HB0032和HB0033 L-FR1; HB0030 L-FR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser
20 25
<210> 68
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 L-FR1; HB0031、HB0032和HB0033 L-FR1;
900424 L-FR1; 900423和900428 L-FR1
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gln或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = His或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Lys或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu或Met
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Phe或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Ala或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa = Ile或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Lys或Arg
<400> 68
Asp Ile Xaa Met Thr Gln Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Xaa Ile Thr Cys Xaa Ala Ser
20 25
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0032 L-FR2; HB0031和HB0033 L-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ala或Asn
<400> 69
Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030和HB0032 L-FR2; HB0031和HB0033 L-FR2;
900424 L-FR2; 900423和900428 L-FR2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Ala或Asn
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Lys或Gln
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa = His或Tyr
<400> 70
Xaa Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Xaa
<210> 71
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 L-FR3; HB0031和HB0033 L-FR3; HB0032 L-FR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Leu或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gln或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Gly或Arg
<400> 71
Tyr Xaa Xaa Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Xaa Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 72
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HB0030 L-FR3; HB0031和HB0033 L-FR3; HB0032 L-FR3;
900428 L-FR3; 900424 L-FR3; 900423 L-FR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = Leu或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gln或Tyr
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Asp或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ile、Ser或Thr
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa = Arg或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Gly或Arg
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> Xaa = Asn或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa = Leu或Val
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa = Ala或Pro
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Xaa = Phe或Leu
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> Xaa = Thr或Val
<400> 72
Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Val Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly Xaa Xaa Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Xaa Thr Ile Xaa Ser Xaa Gln Xaa Glu Asp Xaa Ala
20 25 30
Xaa Tyr Tyr Cys
35
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 900423、900424和900428 L-FR4; HB0030、HB0031、HB0032和HB0033 L-FR4
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Gly或Gln
<400> 73
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10

Claims (20)

1.分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，所述VH包含HCDR1，HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，所述HCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:42所示，且所述HCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:43所示；其包含轻链可变区VL，所述VL包含LCDR1，LCDR2和LCDR3，其中，所述LCDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:52所示，所述LCDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，且所述LCDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:53所示。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH，其中所述VH包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含轻链可变区VL，其中所述VL包含SEQ ID NO:33-34所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，且所述分离的抗原结合蛋白包含选自下述的任意一组氨基酸序列：
(1)VH：SEQ ID NO:32，VL：SEQ ID NO:33，和
(2)VH：SEQ ID NO:32，VL：SEQ ID NO:34。
5.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其具有下述性质中的一种或多种：
1)能够以1×10-10M或更低的KD值结合TIGIT蛋白，其中所述KD值通过表面等离子体共振法测定；
2)在FACS测定中，能够阻断CD155与TIGIT的结合；和
3)能够抑制肿瘤生长和/或肿瘤细胞增殖。
6.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
8.根据权利要求6所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
9.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体轻链恒定区，且所述抗体轻链恒定区包括人κ轻链恒定区。
10.根据权利要求9所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述人κ轻链恒定区包含SEQ IDNO:31所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体重链恒定区，且所述抗体重链恒定区包括人IgG恒定区。
12.根据权利要求11所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体重链恒定区包括人IgG1恒定区，且所述人IgG1恒定区包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。
13.分离的一种或多种核酸分子，其编码权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
14.载体，其包含根据权利要求13所述的核酸分子。
15.细胞，其包含根据权利要求13所述的核酸分子或根据权利要求14所述的载体。
16.制备权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括在使得权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白表达的条件下，培养根据权利要求15所述的细胞。
17.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体和/或权利要求15所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。
18.权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白、权利要求13所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求15所述的细胞和/或权利要求17所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗TIGIT相关疾病，所述TIGIT相关疾病为结肠癌。
19.权利要求1-12中任一项所述的分离的抗原结合蛋白在制备试剂中的用途，所述试剂用于抑制CD155与TIGIT结合。
20.分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含SEQIDNO:9所示的氨基酸序列，且所述VL包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
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