Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN114470159A - Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用 - Google Patents

Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114470159A
CN114470159A CN202210169826.5A CN202210169826A CN114470159A CN 114470159 A CN114470159 A CN 114470159A CN 202210169826 A CN202210169826 A CN 202210169826A CN 114470159 A CN114470159 A CN 114470159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spag6
plasmid
vector
lentivirus
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210169826.5A
Other languages
English (en)
Inventor
曹晓璐
胡一鸣
张玲
柳赟昊
石玉琴
付国庆
周婷
全超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Original Assignee
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University of Science and Engineering WUSE filed Critical Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority to CN202210169826.5A priority Critical patent/CN114470159A/zh
Publication of CN114470159A publication Critical patent/CN114470159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提出了一种Spag6在缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。本发明构建的Spag6慢病毒载体从动物水平验证明了Spag6能够促进突触蛋白的表达，减轻脑水肿。有望成为临床上治疗缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物。

Description

Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物 中的应用
技术领域
本发明属于药物新用途领域，具体涉及Spag6用于缓解缺血性脑卒中介导的突触损伤药物中的应用。
背景技术
脑卒中(cerebral stroke)又称“中风”，是最常见的高死亡率和高致残率疾病。脑卒中包括缺血性卒中(Cerebral ischemic stroke，CIS)和出血性卒中(Cerebralhemorrhagic stroke，CHS)。现有资料显示，全球每年约有1500万人发生脑卒中，给家庭社会造成严重负担。目前，针对CIS治疗手段主要是在有效时间窗内实施溶栓治疗，尽快恢复血供以防止缺血区域扩散。一旦超过有效时间窗再溶栓治疗，将发生缺血性脑卒中再灌注(CerebralIschemic Stroke-Reperfusion,CIS/R)损伤，其对脑神经的影响往往超过初期急性损伤，并可以继发局限性或广泛性脑水肿，使死亡率增加。现阶段的治疗方式都很难达到理想的效果，预后较差，较多患者难以恢复正常生活。
哺乳动物的精子相关抗原6(Sperm associated antigen 6，Spag6)在大脑、支气管等多个组织表达，是衣藻的PF16同源体，PF16在衣藻运动鞭毛的轴突中心管表达，并参与调节鞭毛运动。Spag6对运动纤毛的功能具有重要调控作用，Spag6缺失会导致小鼠精子鞭毛、支气管上皮细胞和脑室管膜细胞运动纤毛功能缺陷，表现为雄性不育、慢性呼吸道疾病等。近年来，有研究发现Spag6在神经系统中具有潜在的重要作用，已知Spag6缺失可致运动纤毛功能缺陷引发脑水肿。但在CIS/R继发脑水肿过程中，Spag6表达及其调控运动纤毛功能对脑损伤有什么作用，还无相关报道。
发明内容
本发明提出Spag6在缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。解决现有技术中在进行缺铁性脑卒中再灌注治疗中出现的突触损伤问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。
在一些实施例中，药物活性成分为含有Spag6编码基因的慢病毒或腺病毒载体。
在一些实施例中，慢病毒载体采用CV186质粒，且具有Ubi-MCS-3FLAG-SV40-Cherry-IRES-puromycin基因结构。
在一些实施例中，药物为无菌注射溶液形式的剂型。
在一些实施例中，本发明提供一种制备表达Spag6的慢病毒载体的方法，步骤如下：
(1)将Spag6基因插入到CV186质粒上，构建Spag6过表达质粒：提取Hela细胞RNA，逆转录得cDNA，设计Spag6引物：
Spag6l(59908-1)-p1：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，
Spag6l(59908-1)-p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCTGGTAGCTGTCCACCC，
PCR克隆目的基因Spag6，并进行电泳、割胶纯化，用BamHI/AgeI对克隆的目的基因Spag6进行双酶切得到目的基因片段，质粒载体CV186双酶切后回收线性化的载体片段，目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞，用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为KL59908-1；
(2)将Spag6基因整合到慢病毒载体上，构建Spag6过表达慢病毒
Spag6过表达载体构建：用抽提得到的KL59908-1质粒，转化E.coli感受态细胞，进行大量克隆，并抽提KL59908-1质粒，用于慢病毒包装；
慢病毒包装：将携带Spag6的载体质粒KL59908-1与慢病毒包装质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Spag6基因的重组慢病毒，命名为LV-Spag6l(59908-1)，经扩增、纯化、滴度测定获得2×108IU/ml高滴度的Spag6过表达慢病毒。
构建慢病毒并感染至大鼠脑组织，用于调控神经细胞中Spag6的表达。
慢病毒(Lentivirus)载体是以人类克疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以在体内较长期的表达且安全性高。本研究构建的的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所替代，属于假型病毒。
构建Spag6过表达慢病毒：
利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒。
将携带Spag6的载体质粒与慢病毒包装质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Spag6基因的重组慢病毒，命名为LV-Spag6l(59908-1)，经扩增、纯化、滴度测定获得2×108IU/ml高滴度的Spag6过表达慢病毒。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
Spag6能够改善缺血性脑卒中在灌注介导的突触损伤。有望成为临床上用于治疗和改善缺血性脑卒中灌注治疗后引起的突触损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1慢病毒工具载体，载体编号：CV186，元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-Cherry-IRES-puromycin，克隆位点：AgeI、BamHI；
图2慢病毒制备流程示意图；
图3突触相关蛋白的Western blot电泳结果图；
图4突触相关蛋白的Western blot检测结果，*P＜0.05，vs Sham；#P＜0.05，vsMCAO；▲P＜0.05，vs MCAO；n＝5；
图5-1大脑皮层扫描电镜图；
图5-2电镜对大脑中的运动纤毛状态图；
图6大脑TTC染色结果图；
图7大鼠大脑干湿比，*P＜0.05，vs Sham；#P＜0.05，vs MCAO；▲P＜0.05，vs MCAO；n＝5。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1构建Spag6过表达质粒
a.以Hela细胞总RNA为模板逆转录扩增cDNA链(Hela细胞来源于ATCC)
1)收集Hela培养细胞，加入1ml TRIzo制备成细胞悬液。
2)将细胞悬液转移到EP管中，加入0.2ml氯仿/酚，匀混10秒，静置2-3分钟，12000g离心15分钟(2℃～8℃)。
3)吸取水相，加入0.5ml异丙醇，12000g离心10分钟(2℃～8℃)。
4)离心后弃上清加1ml 75％乙醇洗涤，涡旋混匀，然后7500g离心5分钟(2℃～8℃)。
5)加入20ul RNA-free water溶解，得到总RNA。
b.逆转录制备cDNA，用takara逆转录试剂配置以下反应体系：
试剂 用量
5xprimerscriptbuffer 4ul
RT酶 1ul
OligodT 1ul
总RNA 1ug
RNase-freewater 补齐20ul
反应条件：37℃孵育1h，85℃灭活5s
c.以cDNA第一链为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增人源性目的基因Spag6。
Figure BDA0003517158050000051
Figure BDA0003517158050000061
Spag6引物：
Spag6l(59908-1)-p1：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，
Spag6l(59908-1)-p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCTGGTAGCTGTCCACCC。
反应条件：
Figure BDA0003517158050000062
Figure BDA0003517158050000063
d.构建Spag6过表达质粒
1)酶切反应，用BamHI/AgeI对克隆的目的基因Spag6进行双酶切得到目的基因片段。
2)同样用BamHI/AgeI对质粒载体CV186双酶切后回收线性载体。
3)连接反应
Figure BDA0003517158050000071
反应条件：16℃过夜，得到Spag6过表达质粒KL59908-1。
实施例2 Spag6慢病毒载体构建与包装
(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5x106细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；
(2)转染前2h更换为无血清培养基；
(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(Spag6过表达质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper2.0载体质粒10μg)，相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min；
(4)混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；注：加入过程一定要均匀，尽可能地不要将细胞吹起。
(5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
(6)缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养48-72h。
(7)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(8)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
(9)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Bec kman超速离心机内,设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；
(10)离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；注：该步骤病毒回收会存在一定程度损失，尽可能地避免病毒长时间暴露在室温中。
(11)经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清按要求分装得到包装好的Spag6慢病毒LV-Spag6l(59908-1)。
实施例3动脉栓塞(MCAO)再灌注损伤模型的构建
将直径0.23mm尼龙线一端反复浸入熔化的石蜡约5次，待尼龙线表面石蜡凝固后将栓线浸泡在肝素中30min后烘干备用。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35mL/100g)大鼠后，用皮筋将其仰卧固定在手术台上，取颈部正中切口，剪开筋膜，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露右侧颈总动脉(Common Carotid artery，CCA)和迷走神经并分离。沿着右侧颈外动脉(External Carotid artery，ECA)和颈内动脉(Internal CarotidArtery，ICA)分叉，分离ECA、ICA，结扎ECA。用动脉夹夹住CCA和ICA，在ECA距动脉分叉5mm处用眼科剪剪一小口，将栓线缓慢向ICA插入，至ICA、ECA交叉处时，去掉ICA动脉夹，调整插线角度，继续将线栓缓慢向ICA入颅方向推进，插入深度至18±0.5mm为止。将栓线与ECA结扎固定，松开CCA动脉夹，剪除线栓多余末端，最后缝合筋膜、皮肤。缺血2h后，抽出线栓，结扎ECA近分叉端，假手术组除不插线外，其余手术步骤同模型组。
实施例4慢病毒介导Spag6过表达对缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤的保护作用
SD大鼠利用随机数字表法平均分组，每组10只，利用大脑中动脉栓塞法构建脑缺血再灌注模型，利用Longa’s 5分法进行神经功能评分；取脑组织检测：(1)2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评价脑梗死体积；(2)透射电镜观察大脑皮层突触超微结构改变；(3)高尔基染色观察大脑皮层树突棘形态变化。以此确定Spag6对CIS/R介导的突触可塑性损伤的影响。
慢病毒转染效力实验分组如下：
Figure BDA0003517158050000091
Spag6对脑缺血再灌注介导的突触可塑性损伤的影响分组如下：
Figure BDA0003517158050000092
Figure BDA0003517158050000101
4.1脑室慢病毒注射技术
用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35mL/100g)大鼠后，固定在脑立体定位仪上，用75％酒精擦湿大鼠头顶皮毛，刀片刮出头顶毛发，沿大鼠后颈与双眼连线间矢状面正中线剪开约1cm小口暴露颅骨，用生理盐水棉球稍用力擦拭分离颅骨表面筋膜，调整颅骨面水平，根据前囟、矢状缝、冠状缝等精确定位注射点后，用颅骨钻小心钻开颅骨。用微量注射针吸取一定量的慢病毒溶液后固定于脑立体定位仪上，按大鼠脑立位图谱，向大鼠第三脑室注射病毒，脑室立体定向坐标为：AP＝-1mm，VD＝4.5mm；微量注射器自脑表面垂直进针2.6mm。每分钟注射0.5uL，间隔1min，注射完毕后留针5min，再缓慢退出注射针，缝合伤口，消毒皮肤。待慢病毒充分表达后，可用于构建脑缺血再灌注模型。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35mL/100g)大鼠后，固定在脑立体定位仪上，用75％酒精擦湿大鼠头顶皮毛，刀片刮出头顶毛发，沿大鼠后颈与双眼连线间矢状面正中线剪开约1cm小口暴露颅骨，用生理盐水棉球稍用力擦拭分离颅骨表面筋膜，调整颅骨面水平，根据前囟、矢状缝、冠状缝等精确定位注射点后，用颅骨钻小心钻开颅骨。用微量注射针吸取一定量的慢病毒溶液后固定于脑立体定位仪上，按大鼠脑立位图谱，向大鼠第三脑室注射病毒，脑室立体定向坐标为：AP＝-1mm，VD＝4.5mm；微量注射器自脑表面垂直进针2.6mm。每分钟注射0.5uL，间隔1min，注射完毕后留针5min，再缓慢退出注射针，缝合伤口，消毒皮肤。待慢病毒充分表达后，可用于构建脑缺血再灌注模型。
4.2大鼠脑组织固定
用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，用4％多聚甲醛心脏灌流固定15min，再用生理盐水灌注10min，取出脑组织，继续在4％多聚甲醛中浸泡24h，可用于石蜡包埋切片。
4.3神经功能评分和TTC染色
构建脑缺血再灌注模型24h后，观察大鼠神经行为学变化，根据Longa’s 5分法评价大鼠神经功能：活动正常，无神经功能缺损为0分；左前肢不能完全伸展为1分；爬行时向左侧转圈为2分；爬行时向左侧倾倒为3分；不能自发行走，意识丧失为4分。造模后将评分1-4分的大鼠纳入研究。TTC染色：在造模24h后，将大鼠麻醉后取脑，在-20℃条件下冷冻30min，将鼠脑从额极向后连续冠状切面，约2mm切一层，将脑片置于1％的TTC溶液中，于37℃避光孵育20min，再置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，用扫描仪扫描获取图像。正常脑组织呈鲜红色，梗死脑组织呈白色。用Image J软件测量每片的梗死面积和总面积，每层梗死体积＝梗死面积×层厚，总的梗死体积即为各层的梗死体积之和。梗死体积百分比＝梗死区体积/大脑总体积×100％。
4.4HE染色
石蜡切片在60℃恒温箱中烤片1h。脱腊水化：二甲苯2×15min→无水乙醇2×5min→90％乙醇5min→70％乙醇5min→50％乙醇5min→蒸馏水5min；苏木素染核：苏木素染色5-10min(具体时长可根据不同组织染色结果和要求调整)→回收染液，自来水冲洗至切片变蓝→用1％的盐酸酒精溶液分色，脱去多余染料→自来水冲洗；伊红染色：将切片放入1％伊红溶液中侵染5-10min；脱水透明：ddH2O洗去伊红染液→经70％、80％、90％乙醇分色及脱水，每次5min→无水乙醇2×3min→二甲苯2×3min；中性树胶封片，室温下长期保存。
结果如图6所示，上调Spag6组可以有效抑制脑水肿的发生。
4.5Western blot检测
(1)组织总蛋白的提取
1)取缺血侧皮层脑组织约50-100mg放入匀浆器中，再加入200-400uLRIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂)，冰浴均浆，直至无大颗粒沉淀为止。将匀浆液移至1.5mLEP管中，冰浴静止约15min充分裂解，移至低温冷冻离心机中12000rpm离心5min。
2)取蛋白上清液分装至0.5mLEP管中，放入-20℃冰箱保存。
(2)组织蛋白含量测定(BCA法)
1)将蛋白标准品(5mg/mL)用RIPA裂解液稀释10倍，即10uL蛋白标准品加入到90uLRIPA裂解液中，按0uL，1uL，2uL，4uL，8uL，12uL，16uL，20uL将稀释后的蛋白标准品加入到96孔板中，再用RIPA裂解液将每孔补液至20uL。
2)取19uLRIPA裂解液加入到96孔板中，再加入1uL目的蛋白，每个样本测定三个复孔。
3)配制BCA工作液：按A液：B液＝50:1配制，每孔需加入200uL BCA工作液，而后在60℃恒温箱中放置30min。
4)利用酶标仪测定OD572，绘制标准曲线，计算目的蛋白浓度。
(3)Western Blot分析
1)上样蛋白准备：取待测蛋白样品(50μg)、SDS Reducing Sample Buffer(5×)6μL至EP管中，补充RIPA裂解液至30μL体系，涡旋震荡混匀，95℃水浴5min使蛋白变性，待冷却至室温后放入-20℃存储备用。
2)制胶：配制12％分离胶：30％Acrylamide mix:8mL，1.5M Tri HCl(PH8.8)：5mL，ddH2O：6.6mL，10％SDS：0.2mL，10％APS:0.2mL，TEMED；0.008mL。混匀后灌入制胶玻璃板中，用1mLddH2O压平液面，室温下凝胶60min。
3)配制5％浓缩胶：30％Acrylamide mix:1mL，1M Tri HCl(PH6.8)：0.75mL，ddH2O：4.1mL，10％SDS：0.06mL，10％APS:0.06ml，TEMED:0.01mL。倒掉分离胶上的水，滤纸吸干，加满浓缩胶后插入5mm孔径梳子，室温凝胶40min，待浓缩胶成型后即可拔出梳子。
4)电泳：将胶板放入到垂直电泳槽中，倒入电泳缓冲液，微量加样器取已制备好的上样蛋白和MAKER加入到上样孔中，每孔25μl。恒压100V电泳至溴酚蓝专移到分离胶底部，停止电泳。
5)电转移：剪与分离胶相同大小的PVDF膜和滤纸，先将PVDF膜用甲醇浸泡数秒，再将PVDF膜和滤纸浸泡在电转液中，按滤纸-PVDF膜-分离胶-滤纸的顺序用电转夹夹好(PVDF膜靠近白色板)，放入电转槽中，倒入电转液，冰浴350mA恒流电转约75min。
6)封闭、孵育抗体：用5％脱脂奶粉浸没PVDF膜，室温摇床封闭2h；倒掉封闭液，加入用封闭液稀释的一抗，4℃孵育过夜，次日于室温下孵育30min后，回收一抗，-20℃保存。用TBST洗膜3×10min，加入封闭液稀释的HRP二抗，室温下摇床孵育2h，用TBST洗3×10min。
7)显色曝光：将ECL发光试剂中的稳定过氧化物酶溶液与增强液按1:1等体积混匀，滴加倒PVDF膜上，待反应数分钟发光明显后，去掉多余的发光底物，用保鲜膜包好，X光胶片压片曝光，显影液、定影液冲洗胶片后晾干，扫描仪扫描。
8)用Image J软件分析胶片灰度值，用目的蛋白与内参β-actin比值计算目的蛋白的相对含量。
结果如图3和图4所示，上调Spag6组的突触蛋白CaMKII、PSD95和p-P38/P38表达量有明显的升高。
4.6投射电镜、扫描电镜观察
取4％多聚甲醛固定后的大鼠右侧大脑皮层S1HL区缺血半暗带约1mm3组织，生理盐水清洗，用2.5％戊二醛二甲砷酸钠固定液固定2-3h，并且用二甲砷酸钠缓冲液清洗2次后，在1％四氯化锇中做好固定、包埋、超薄切片、醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，用透射电镜观察髓鞘和突触超微结构，并拍照记录。
4.7统计学分析
应用SPSS 22.0统计学软件分析,数据以均数±标准差(mean±SD)表示。两独立样本均数比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时用Bonferroni法进行多重比较，不齐时用Dunett’s法。取P<0.05或P<0.01为差异有统计学显著性。结果如图5-1和图5-2所示：
A.对照组，运动纤毛运动方向较一致，极性好，结构完整。
B.手术组，运动纤毛运动方向杂乱，极性差。
C.慢病毒上调Spag6表达，纤毛运动方向一致，极性较好，较之手术组有明显提升。
D.慢病毒下调Spag6表达，纤毛运动方向杂乱无章，表面粗糙，结构杂乱，极性很差，较之Spag6上调的大鼠，损伤十分严重。
4.8将上述实验大鼠猝死后分析大脑含水量，结果如图7所示，脑含水量测定：用10％水合氯醛麻醉大鼠后，立即断头取脑，去掉小脑及低位脑干，用刀片沿冠状缝切取右脑并称其湿重；然后将其放置于烘箱中，100℃烘24h至恒重，称其干重。脑含水量(％)＝(湿重—干重)/湿重×100％，由结果图片可知，造模后大脑含水量明显上升，说明脑水肿程度非常严重，上调Spag6后，脑水肿程度明显下降，下调Spag6后，脑水肿程度较之上调Spag6明显上升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的药物的活性成分为含有Spag6编码基因的慢病毒或腺病毒载体。
3.根据权利要求2所述的慢病毒载体，其特征在于：
所述慢病毒载体采用CV186质粒，且具有Ubi-MCS-3FLAG-SV40-Cherry-IRES-puromycin基因结构。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述药物为无菌注射溶液形式的剂型。
5.一种制备表达Spag6的慢病毒载体的方法，步骤如下：
(1)将Spag6基因插入到CV186质粒上，构建Spag6过表达质粒：提取Hela细胞RNA，逆转录得cDNA，设计Spag6引物：
Spag6l(59908-1)-p1：
AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCCAGCGGCAGGTGCTTC，
Spag6l(59908-1)-p2：TCCTTGTAGTCCATACCGGTCTGTGGCTGGTAGCTGTCCACCC，
PCR克隆目的基因Spag6，并进行电泳、割胶纯化，用BamHI/AgeI对克隆的目的基因Spag6进行双酶切得到目的基因片段，质粒载体CV186双酶切后回收线性化的载体片段，目的基因片段与线性化的载体片段连接后转化E.coli感受态细胞，用菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆送测序，测序无误的克隆进行质粒抽提，命名为KL59908-1；
(2)将Spag6基因整合到慢病毒载体上，构建Spag6过表达慢病毒
Spag6过表达载体构建：用抽提得到的KL59908-1质粒，转化E.coli感受态细胞，进行大量克隆，并抽提KL59908-1质粒，用于慢病毒包装；
慢病毒包装：将携带Spag6的载体质粒KL59908-1与慢病毒包装质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染293T细胞，以质量比3:2:1混合，在细胞内发生同源重组，形成携带Spag6基因的重组慢病毒，命名为LV-Spag6l(59908-1)，经扩增、纯化、滴度测定获得2×108IU/ml高滴度的Spag6过表达慢病毒。
CN202210169826.5A 2022-02-23 2022-02-23 Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用 Pending CN114470159A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210169826.5A CN114470159A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210169826.5A CN114470159A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114470159A true CN114470159A (zh) 2022-05-13

Family

ID=81484281

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210169826.5A Pending CN114470159A (zh) 2022-02-23 2022-02-23 Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114470159A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103432574A (zh) * 2013-08-25 2013-12-11 浙江大学 一种过氧化物酶在制备防治脑血管疾病药物中的应用
CN106544421A (zh) * 2016-10-21 2017-03-29 武汉科技大学 Spag6基因作为卵巢肿瘤诊断和治疗标志物的用途
CN113813260A (zh) * 2021-11-10 2021-12-21 武汉科技大学 罗沙司他用于缓解缺血性脑卒中介导的突触损伤的用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103432574A (zh) * 2013-08-25 2013-12-11 浙江大学 一种过氧化物酶在制备防治脑血管疾病药物中的应用
CN106544421A (zh) * 2016-10-21 2017-03-29 武汉科技大学 Spag6基因作为卵巢肿瘤诊断和治疗标志物的用途
CN113813260A (zh) * 2021-11-10 2021-12-21 武汉科技大学 罗沙司他用于缓解缺血性脑卒中介导的突触损伤的用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI XIAOFEI ET AL: "Spag6 Mutant Mice Have Defects in Development and Function of Spiral Ganglion Neurons, Apoptosis, and Higher Sensitivity to Paclitaxel", SCIENTIFIC REPORTS *
WENJING MA ET AL: "HDAC4 Knockdown Alleviates Denervation-Induced Muscle Atrophy by Inhibiting Myogenin-Dependent Atrogene Activation", FRONT CELL NEUROSCI *
YAP YI TIAN ET AL: "The Ancient and Evolved Mouse Sperm-Associated Antigen 6 Genes Have Different Biologic Functions In Vivo", CELLS *
周佳君;丁美萍;刘建仁;: "实验性脑积水的发病机制及其相关基因的研究进展", 浙江大学学报(医学版) *
赵玉洁等: "缺血性脑卒中致脑室运动纤毛功能障碍诱发脑水肿", 安徽医科大学学报 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210355171A1 (en) Adeno-associated virus having a variant capsid protein, and use thereof
CN109640946A (zh) 通过基因编辑策略进行hiv-1的负反馈调节
JP7332474B2 (ja) ミオミキサーにより促進される筋細胞融合に関連する組成物および方法
CN109600992A (zh) 治疗或预防阿尔茨海默病和相关病况的方法
CN109966281A (zh) PAO作为Pi4KIIα抑制剂在制备治疗创伤后应激障碍药物中的应用
CN111770762A (zh) 对由细胞内蛋白运输缺陷引起的骨骼疾病的治疗
WO2020215968A1 (zh) 一种高效感染支持细胞和毛细胞的aav载体
CN114470159A (zh) Spag6在制备缓解缺血性脑卒中再灌注介导的突触损伤药物中的应用
CN116790610B (zh) 一种治疗骨科疾病的基因及以aav为载体的基因治疗药物
CN111494634A (zh) 一类治疗慢性疼痛的核酸药物
CN110863012A (zh) 一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用
CN116334004A (zh) RVG-Exo-miR-3059-5p在治疗脑卒中的用途
JP2023051914A (ja) 網膜疾患を予防又は治療するための、有効成分としてｃｃｎ５を含む医薬組成物
CN111686124B (zh) miR-486-3p在制备治疗SAH导致的神经炎症产品中的应用
CN108148901A (zh) Tfeb作为脑卒中生物标记物及治疗靶点的应用
US20110301228A1 (en) Gene therapy vector for treatment of steroid glaucoma
CN104288781A (zh) miR-329在制备预防和/或治疗缺血性眼部疾病的药物中的应用
CN110684805B (zh) 神经导向因子Sema基因重组慢病毒载体在制备治疗骨关节炎药物中的应用
WO2023078099A1 (zh) 一种用于治疗神经损伤疾病的基因药物
CN113769095B (zh) 神经调节素1促进皮肤创面修复的方法及其应用
WO2020223933A1 (zh) 高效感染支持细胞的aav突变体
Alsalloum et al. Culture of human retinal explants as an ex vivo model for retinal gene therapy
CN108969539A (zh) 宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用
CN113648418B (zh) Apelin-APJ抑制剂在制备治疗血睾屏障损伤药物中的应用
WO2024011817A1 (zh) c-Rel特异性核糖核酸在抑制角膜移植排斥方面的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220513