CN114409774B

CN114409774B - 广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN114409774B
Application number: CN202210116091.XA
Authority: CN
Inventors: 邵一鸣; 朱彪; 李丹; 王铮; 吴南屏; 郝彦玲
Original assignee: NATIONAL CENTER FOR AIDS/STD CONTROL AND PREVENTION CHINESE CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION; First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: National Center For Aids/std Control And Prevention Chinese Center For Disease Control And Prevention; First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2022-02-07
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2042-02-07
Also published as: CN114409774A

Abstract

本发明公开了一种广谱人源化抗SARS‑COV‑2病毒的单克隆中和抗体，本发明的中和抗体通过单个B细胞流式分选‑抗体基因扩增配对表达技术筛选获得，具有独特的CDR区域，能特异性与SARS‑COV‑2结合并且可以有效中和目前世界卫生组织定义的“值得关切的变异株”（SARS‑CoV‑2 WT，alpha，Beta，Gamma，Delta，Omicron），尤其是中和Omicron变异毒株的IC50均低于0.1μg/mL。本发明还涉及该组中和抗体的制备方法和用途。本发明的4株抗体可以用于针对COVID‑19变异毒株全球流行的紧急预防和或治疗，具有全人源化，高表达，稳定性好的特点，适合产业化。此外，该抗体还可用于制备SARS‑COV‑2病毒检测试剂，发现有效中和抗原表位及开发SARS‑COV‑2重组蛋白及亚单位疫苗。

Description

广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用

技术领域

本发明公开了一种多肽，更具体地，本发明公开一种抗体。

背景技术

新型冠状病毒（SARS Cov-2，也称为2019-nCov）属于正链 RNA 病毒的一种，属于冠状病毒家族的 ß 属，其编码四种结构蛋白：spike (S), envelope(E), membrane (M),nucleocapsid (N)、16 种非结构蛋白及 5-8 种辅助蛋白质。SARS Cov-2利用病毒表面的S 蛋白与宿主细胞受体-血管紧张素转换酶 II（ACE2）进入细胞。S 蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功能单位，即 S1 和 S2 蛋白亚基。S1 可分为 NTD（N-terminal domain）和RBD（Receptor binding site），RBD 区域长约 240 个氨基酸，主要与宿主细胞受体结合，S2 在病毒和细胞膜融合起作用。根据已有的报导，中和抗体主要作用于 RBD 区域，抗体结合于 RBD，阻碍 RBD 与ACE2 的结合，从而阻止病毒感染细胞。

目前国内外均有新冠中和抗体的分离研究报道，采用单细胞分选、抗体基因组深度测序方法，一批针对 RBD 的人源化单克隆抗体被分离出来，如 LYCoV555, REGN-COV2,TY027, CT-P59, JS016, BRII-196, BRII-198 and SCTA01等，这些抗体展现出了较强的体外中和活性（IC50<1μg/ml），在表达 ACE2 的转基因小鼠动物体内也展现出了较好的治疗效果，可以显著降低小鼠肺部的病毒载量。但 SARS-Cov-2 处于不断变异中，一旦感染了中和表位发生变异的病毒，则已有的中和抗体将不再具有中和作用。尤其是Omicron毒株快速流行以来，由于其较强的传播能力和多变异位点，与Alpha、Beta、Gamma和Delta毒株一起被世界卫生组织并列为VOC（Variants of concern, 受关注的变异病毒）。现有上市的单克隆抗体对Omicron中和能力大幅下降，甚至完全失效。因此，有必要分离出更多的强效广谱中和抗体作为备选，才可以更有效地避免病毒发生免疫逃逸。本发明的目的就是提供一组具有广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体，在此基础上提供所述高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新冠病毒病治疗药物中的应用。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体，所述抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如下所示：

（1）SEQ ID NO.1的第25-33、51-57 和96-106位氨基酸以及SEQ ID NO.3的第27-33、51-53、90-94位氨基酸；或者

（2）SEQ ID NO.5的第26-33、51-58和97-115位氨基酸以及SEQ ID NO.7的第27-37、55-57和94-103位氨基酸；或者

（3）SEQ ID NO.9的第26-33、51-58 和97-110位氨基酸以及SEQ ID NO.11的第27-32、50-52、89-97位氨基酸；

（4）SEQ ID NO.13的第26-32、51-58 和97-120位氨基酸以及SEQ ID NO.15的第26-34、52-54、91-100位氨基酸。

在一个优选的实施方案中，所述抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如下所示：

（1）SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.3，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQH9”；或者

（2）SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQF10”；或者

（3）SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQG6”；或者

（4）SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQG8”。

在一个更为优选的实施方案中，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNO.17所示，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19（kappa链）或者SEQ ID NO.21（lambda链）所示。其中，抗体2YYQH9、抗体2YYQF10和抗体2YYQG6的轻链为kappa链，抗体2YYQG8的轻链为lambda链。

其次，本发明还提供了一种编码上述广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体的多核苷酸，编码所述抗体重链的可变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸组合分别如下所示：

（1）SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.4，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQH9”；或者

（2）SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.8，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQF10”；或者

（3）SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.12，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQG6”；或者

（4）SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.16，具有该技术方案的抗体在本发明中被命名为“2YYQG8”。

在一个优选的实施方案中，编码抗体重链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述轻链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.20（kappa链）或者SEQ ID NO.22（lambda链）所示。其中，抗体2YYQH9、抗体2YYQF10和抗体2YYQG6的轻链为kappa链，抗体2YYQG8的轻链为lambda链。

第三，本发明还提供了一种表达上述广谱人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的载体，所述载体含有上述编码所述抗体重链的可变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸，所述载体可以是基因工程中常规使用的真核表达载体，在本发明的一个具体实施方案中，所述载体为 IgH（重链表达载体）、Igκ（κ轻链表达载体）、Igλ（λ轻链表达载体）（具体参见Tiller et al. Efficient generation of monoclonalantibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expressionvector cloning, J Immunol Methods. 2008 January 1; 329(1-2): 112–124.，本发明通过引用将该现有技术文件并入到本发明的说明书中）。

第四，本发明提供了一种表达上述广谱人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的载体。

所述宿主细胞可以为基因工程中常规使用的真核宿主细胞，在本发明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞为293F细胞。

第五，本发明还提供了一种抗体组合物，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ IDNO.3所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如：

（1）SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7；或者

（2）SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11；或者

（3）SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15。

在另一个可选的实施方案中，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15所示。

在又一个可选的实施方案中，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15所示。

第六，本发明提供了上述广谱人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新型冠状病毒病治疗和/或预防药物中的应用，所述抗体可以开发临床治疗药物，靶向药物、SARS-COV-2重组蛋白及亚单位疫苗。

最后，本发明提供了上述广谱人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用。

本发明提供的广谱人源化高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体通过单个B细胞流式分选-抗体基因扩增配对表达技术筛选获得，具有独特的CDR区域，能与SARS-COV-2特异性结合并且可以有效中和目前多株国际流行病毒Alpha (B.1.1.7), Beta(B.1.351),Gamma(P.1),Delta(B.1.161.2),Omicron(B.1.1.529)其IC50均在0.1μg/mL左右，对世界范围内多个不同的新型冠状病毒代表株具有显著的广谱中和能力，因此本发明提供的抗体可以用于制备COVID-19紧急预防和/或治疗药物，具有全人源化，高表达，稳定性好的特点，适合产业化。此外，该抗体还可用于制备SARS-COV-2病毒检测试剂，用于检测病毒抗原以及用于发现有效中和抗原表位。

附图说明

图1. 生物素化RBD蛋白的效价检测结果图，其中 A为磁珠法检测RBD生物素化效率；B为ELISA法检测生物素化效率；

图2.流式分选RBD特异性B细胞示意图；

图3.抗体针对假病毒的中和能力结果图；

图4.抗体针对活病毒的中和能力结果图；

图5.采用BLI技术检测2YYQH9抗体的抗体-抗原亲和力结果图；

图6.采用BLI技术检测2YYQF10抗体的抗体-抗原亲和力结果图；

图7.采用BLI技术检测2YYQG6抗体的抗体-抗原亲和力结果图；

图8.采用BLI技术检测2YYQG8抗体的抗体-抗原亲和力结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

实施例1：新冠病毒RBD探针的合成、表达和生物素化及染色

1.1依据 Genbank公布的数据（NC_045512），合成携带6×His-Avi（His-His-His-His-His-His-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-Asp-Ile-Thr-Asn-Trp-Leu-Trp-Tyr-ILe-Lys-Lys-Lys）标签的RBD全长基因序列。

1.2经EcoRI和 EcoRV双酶切后重新连接入真核表达载体pDRVI1.0（发明人构建并保存），挑选克隆后经测序无误。

1.3将两探针质粒分别转染293F细胞进行表达，5-6天后离心培养液收取细胞上清，过镍柱纯化抗原蛋白。

1.4使用BirA 500生物素蛋白连接酶试剂盒（BirA500，Avidity）对探针蛋白进行生物素化：

将1mg分子探针蛋白溶解于0.7mL PBS缓冲液中，分别加入0.1mL 10×缓冲液A、0.1mL 10×缓冲液B，再加入4μL BirA 500 酶，混匀，30℃孵育30分钟;将混合物转移至10K浓缩管中，加10mL PBS，离心4000g 15min至剩余体积0.5mL，重复这一操作5次;收集浓缩后的蛋白并测定浓度，存放至-80℃冰箱。

1.5 检测分子探针生物素化活性

采用60微升链霉素标记的琼脂糖+10微克蛋白+500微升PBS置室温振荡器中摇30min，短暂离心，用1ml的PBS洗3次，最后一次尽量将液体吸弃干净，最后剩下大概30微升的琼脂糖，同时准备30微升的SDS凝胶加样缓冲液（100 mM pH6.8 Tris-HCl、 4%SDS、0.2%溴酚兰、20%甘油、200 mM β-巯基乙醇），将琼脂糖和混合缓冲液混在一起，吸取20微升置于100℃,5-10min然后进行 SDS-PAGE电泳;电泳结束后加适量考马斯亮蓝染色1小时后置于振荡器中脱色后观察电泳条带的深浅，判定生物素标记的效率，至少在50%以上可考虑进行荧光标记。

采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测两探针的生物素化活性。用PBS将新冠抗原稀释至2μg/mL，加入96孔ELISA板中，每孔100μL，置于4℃过夜，次日用PBST(含0.05% 吐温20的PBS) 洗3次；每孔加入370μL封闭液（含2% 牛奶和5% FBS的PBS）室温封闭1小时，用PBST(含0.05% 吐温20的PBS) 洗3次；向每孔加入100μL封闭液，第一行每孔再加入25μL稀释好的生物素标记的探针蛋白（生物素化的探针蛋白贮存浓度为50μg/mL，使用前5倍稀释于封闭液中），混匀后从第一行每孔吸出25μL加入到第二行中，混匀后吸出25μL加入到第三行中，依次直至最后一行吸出25μL丢掉（每行之间形成五倍稀释梯度），37℃孵育1小时，用PBST(含0.05% 吐温20的PBS) 洗5次；将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Sigma KPL HRP-SA）1000倍稀释于含有0.05% 吐温20的封闭液中，每孔加100μL，37℃孵育1小时，用PBST洗5次板；每孔加入100μL底物，室温孵育20分钟后每孔加入50μL硫酸终止液立即终止反应，在酶标仪上读数保存。图1为生物素化RBD蛋白的效价检测结果，其中A为磁珠法检测RBD生物素化效率，泳道1-2为链霉亲和素磁珠从10μg生物素后的RBD蛋白中捕获生物素化成功的RBD，泳道3为10 μg生物素化RBD，泳道4为分子量标志；由图1A可以看出，RBD生物素化效率超过50%；B为ELISA法检测生物素化效率，探针的终末浓度（end titer）为0.0032μg/mL。由结果可以看出，RBD的生物素化成功。

1.6 生物素化的探针蛋白进行荧光标记

RBD-Avi探针蛋白用PE（藻红蛋白）进行荧光标记，以备单细胞流式分选时使用。

实施例2:抗SARS-COV-2人源化单克隆抗体的筛选和鉴定

2.1配制细胞裂解液：每孔20μl细胞裂解液，包含0.5μl 去RNA酶，5μl 5×FirstStrand 缓冲液，1.25μL 0.1M DTT，0.0625μl Igepal，13.25μl水，盖好封板膜，4°C冰箱放置待用。

2.2 样本准备：

（1）新冠感染后康复者PBMCs细胞复苏：将冻存细胞管从液氮拿出后，迅速置于37℃水浴中，待融化至有冰芯时拿出，在生物安全柜中打开，缓慢滴入R10+ Benzonase培养基（1支细胞使用5 mL R10+ Benzonase培养基）。1500 rpm离心10分钟，弃去上清，用残液悬起细胞，加入 10 mL R10，混匀，取50 μl进行细胞计数，1500 rpm离心10分钟；调整细胞浓度：弃去上清，用残液悬起细胞，使用R10培养基调整浓度，向96孔U型板中2.5×10⁶个/孔；

（2）配制 2 mM 的 EDTA/PBS 溶液，下文用 E-PBS 表示；

（3）将96孔细胞板置于离心机内，4 ℃，2000 rpm 离心 3 分钟，弃去上清（生物安全柜内操作，纸巾高压放台内）；

（4）每孔加入50 μl Vivid工作液（配制 Vivid（UV）工作液：1:1000用PBS稀释，混匀），混匀，避光冰上孵育20分钟；

（5）每孔加入150 μl E-PBS，4 ℃，2000 rpm离心3分钟；

（6）弃去上清，加入50 μl胞外抗体混合液（2μl Anti-CD3-Pacific Blue，1.5μlAnti-CD8-Pacific Blue，1.5μl Anti-CD14-Pacific Blue，1μl Anti-CD19-BV510，2μlAnti-CD20-ECD，2.5μl Anti-CD27-APCCy7，5μl Anti-IgG-FITC，2.5μl Anti-IgM-PercpCy5.5，2.5μl Anti-PD-1-PECy7, 1μl Anti-CXCR5-APC-R700, 5μl CXCR3-PECy5, 1μl Anti-CD45RA-BV650, 1μl Anti-CD4-BV605, 5μl Anti-RBD-PE，不足用E-PBS补齐），混匀，避光冰上孵育60分钟；

（7）每孔加入150 μL E-PBS，4 ℃，2000 rpm离心3分钟，弃去上清；

（8）每孔加入200 μL E-PBS，4 ℃，2000 rpm离心3分钟，弃去上清；

（9）每孔加入200 μL E-PBS，混匀，同一样本细胞悬液过滤到同一支流式管内，4℃避光保存供分选；

（10）单染管对照：设置1个未染色管对照（加入1滴补偿微球，200μl E-PBS）和15个单独染色管（每管加入补偿微球1滴，分别加入μl Anti-CD3-Pacific Blue，1.5μl Anti-CD8-Pacific Blue，1.5μl Anti-CD14-Pacific Blue，1μl Anti-CD19-BV510，2μl Anti-CD20-ECD，2.5μl Anti-CD27-APCCy7，5μl Anti-IgG-FITC，2.5μl Anti-IgM-PercpCy5.5，2.5μl Anti-PD-1-PECy7, 1μl Anti-CXCR5-APC-R700, 5μl CXCR3-PECy5, 1μl Anti-CD45RA-BV650, 1μl Anti-CD4-BV605, 5μl Anti-CD4-PE，50μl UV工作液），混匀，避光冰上孵育20分钟后每孔加入150 μl E-PBS，4 ℃，2000 rpm离心3分钟，弃上清，200μl E-PBS重悬。

2.3 单个 B 细胞流式分选：选择CD3^-CD8^-CD14^-CD19⁺CD20⁺CD27⁺IgG⁺IgM^-RBD⁺的细胞进行分选，合计分选到56个细胞。首选圈定出单淋巴细胞群，再圈定出CD3^-CD8-CD14-的活细胞以排除T细胞和巨噬细胞，再圈出CD19⁺CD20⁺的B细胞，再圈定出CD27⁺的记忆B细胞，再圈出IgG⁺IgM^-的B细胞，最后圈出与探针RBD结合的记忆性B细胞。将这些B细胞每孔1个分选入含有以下裂解液体系的96孔板中（表1）。分选结束后，立刻用封口膜封好96孔板，在干冰上凝固，再转移入-80℃冰箱，过夜，第二天进行PCR操作。结果：流式分选的结果如图2所示。

表1. B细胞裂解液体系

。

2.4 利用RT-PCR技术扩增全人源抗体可变区基因

配置如表2所示RT-PCR反应体系，每孔加入6μl，进行RT-PCR反应:

表2. RT-PCR反应体系

；

RT-PCR反应程序设定：42℃反应10min，25℃反应10min，50℃反应50min，94℃反应5min，4度保存。

（1）进行两轮PCR反应，反应体系如下：

第一轮PCR反应体系（表3）补充引物序列（表4）：

表3. 第一轮PCR反应体系

。

表4. 第一轮PCR扩增用引物序列如下：

。

第一轮PCR扩增用引物的扩增目的片段如表5所示：

表5. 第一轮PCR扩增用引物的扩增目的片段

。

第一轮PCR反应程序如表6所示：

表6. 第一轮PCR程序

。

第一轮PCR反应结束后进行第二轮PCR反应，第二轮PCR反应体系如表7所示：

表7.第二轮PCR反应体系

。

第二轮PCR引物序列如表8所示：

表8.第二轮PCR引物序列

。

第二轮PCR扩增用引物的扩增目的片段如表9所示：

表9. 第二轮PCR扩增用引物的扩增目的片段

。

第二轮PCR反应程序如表10所示：

表10.第二轮PCR程序

。

（2）电泳、测序、家系分析

电泳检测二轮PCR产物，将重链和轻链产物直接测序；使用抗体家系基因数据库（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）对测序结果进行分析，设计并合成带有酶切位点的抗体可变区序列（重链：5‘-Age I，3’-Sal I；Kappa链：5‘-Age I，3‘-BsiW I；Lambda链：5‘-Age I，3’-Xho I），共计获得36对重链和轻链配对克隆。

2.5单克隆抗体表达载体构建和质粒转化

将合成的基因用相应的酶进行酶切后再次凝胶电泳回收，使用T4 DNA连接酶将可变区基因与相应载体IgH（重链表达载体）、Igκ（κ轻链表达载体）、Igλ（λ轻链表达载体）（具体参见Tiller et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from singlehuman B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning, J ImmunolMethods. 2008 January 1; 329(1-2): 112–124. ，本发明通过引用将该现有技术文件并入到本发明的说明书中）在16℃连接仪上连接过夜，16°C水浴过夜，转化。将10μL 连接产物加入50μL DH5α感受态细胞中，振动摇匀，冰浴30分钟，42°C水浴热激45秒。离心管放入冰浴2分钟后，加入1mL无抗性的LB培养基，37°C，200rpm振荡培养1小时，4000rpm离心4分钟，将残留菌液涂布在抗性的LB平板上。37°C倒置培养14-16小时。挑取单克隆菌落接种到抗性的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养14-16小时后进行质粒提取（Omega公司的Plasmid Midi Kit）。

2.6 抗体表达和纯化

将293F细胞浓度调整为1.2×10⁶个/ml，培养2小时。配置A液：25ml的opti-MEM加入500μg抗体重链DNA和500μg抗体轻链DNA，B液：25ml的opti-MEM中加入5ml的PEI转染试剂，静置5分钟。将A和B液混合，静置20分钟，逐滴加入1L的293F细胞中，边滴边摇匀，置于8%CO2，37°C下，摇动培养5天。

利用Protein A亲和柱（GE health公司产品）纯化得到抗体。利用NanoDrop2000超微量分光光度计（Thermo公司产品）测定抗体浓度，4°C放置待检测。本步骤从36个抗体轻/重链配对中表达出27个抗体（抗体量>10μg, 抗体浓度>10μg/mL）。

实施例3 抗体对SARS-COV-2假病毒的中和活性测定

3.1 假病毒的包装：人工合成SARS-CoV-2(GenBank: MN908947)的S蛋白基因全长插入pcDNA3.1表达质粒，构建pcDNA-SARS-CoV2-S。带有突变的假病毒突变位点如表11所示，在S基因上引入。

表11. 假病毒突变位点

。

将3×10⁶（300万）个293T/17细胞接种于T75细胞培养瓶，5%CO₂ 37℃培养20-24小时。使用Fugene 6 Transfection Reagent (Promega, Cat#E2691) 进行转染：将30ug质粒pcDNA-SARS-CoV2-S 转染T75培养瓶中的293T细胞，同时加入1.05×10⁶TCID50 的G*ΔG-VSV病毒感染293T，8小时后更换培养基。转染24小时后，收集培养上清并过滤获得SARS-CoV2 S蛋白的假病毒，-80℃冷冻保存。

3.2中和实验：

在一块96孔板中每孔加入100μL梯度稀释的抗体稀释液随后，用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴ TCID50/mL，于第3-11列每孔加50 μL，使假病毒的加入量为650TCID50/孔。将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃、5%CO₂)孵育1小时。当孵育时间至半小时，取出准备好的Vero细胞，吸弃培养基，加入PBS缓冲液清洗细胞，弃去PBS，加入胰酶-EDTA消化离心后，加入完全培养基重悬细胞，细胞计数。将细胞悬液稀释至2×10⁵个/mL。孵育至1小时，向96孔板中每孔加100 μL细胞，使每孔细胞为2×10⁴个。将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃、5%CO₂培养 28 小时。从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150 μL上清，然后加入100μL荧光素酶检测试剂，室温避光反应2分钟。反应结束后，于平板振荡器震荡混匀，放入多功能读板机中读取发光值。计算中和抑制率：根据中和抑制率结果，计算抗体的IC50。

从43个测试抗体中，我们筛选出4株针对新冠WT、Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron均有高效中和能力的抗体，2YYQH9, 2YYQF10, 2YYQG6, 2YYQG8针对WT毒株的中和能力分别为0.039μg/mL，0.110μg/mL，0.057μg/mL，0.008μg/mL，对Omicron毒株的中和能力分别为0.029μg/mL，0.050μg/mL，0.059μg/mL和0.084μg/mL。详细中和结果见图3。这些结果均小于0.1μg/mL，中和宽度为100%，体现出了较强的中和活性。

实施例4：抗体对活病毒的中和实验

提前1天将Vero-E6细胞按照25000/孔的细胞数接种于48孔板，用含10%FBS和双抗的MEM培养基培养。

抗体配置：用含5%FBS和双抗的MEM培养基稀释抗体。按照48孔板最终体积500μL/孔、每个浓度3个复孔计算，每个浓度的抗体配置750μL（250μL /孔），按照实际作用浓度的2倍配置抗体。从最高浓度开始，按照一定倍数（如3倍）进行倍比稀释。同时，设置相应的阳性和阴性对照。将配置好的抗体加入48孔板，带入P3实验室。

将新冠病毒储存液按照MOI=100比例用含5%FBS的MEM培养基稀释，按照1：1的体积比将病毒液（250μL /孔）加入配置好的抗体，37℃孵育3小时。将对数生长期的Vero-E6细胞板上清吸净，加入孵育好的抗体病毒混合液（500μL /孔），37℃培养7天。后续检测：观察细胞病变，推算中和百分比为50%的中和抗体的浓度。3种单抗均能有效中和野生株活病毒（Genbank No: MN908947），2YYQG6, 2YYQG8中和野生株能力最强，IC50可达到0.039μg/mL。2YYQH9, 2YYQF10, 2YYQG6, 2YYQG8均能有效中和Beta、Gamma和Delta活毒株。详细中和活病毒结果见图4。抗体的中和宽度均达到100%。

实施例5 抗原-抗体亲和力动力学测定

利用Octet Red 96系统（Fortebio, USA）和链霉亲和素传感器，采用BLI技术对SWB8、LHC11、LHD2、LHD7蛋白的亲和力进行检测，用PBST（含有0.02%吐温20和0.1%牛血清白蛋白的PBS）将SARS-Cov-2 Omicron的生物素化RBD（South Africa/CERI-KRISP-K032195/2021）稀释至1μg/mL的浓度，然后固定到链霉亲和素生物传感器（Sartorius AG，Germany）上60秒。在用PBST进行60秒洗涤步骤后，将生物传感器探针浸入含有连续稀释抗体（500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM和7.8125nM）的孔中并结合120秒，然后进行300秒解离步骤。KD值采用数据分析软件9.0中的1:1结合模型计算。得出2YYQF10的亲和力常数为0.874nM，2YYQH9, 2YYQG6和 2YYQG8与RBD的亲和力常数KD均<0.001 nM（0.001 nM为BLI技术测定的亲和力下限），结果如图5-8所示。显示这4个抗体针对RBD具有极强的亲和力。

本发明筛选到4株新型冠状病毒单克隆抗体，对其重链和轻链的基因扩增产物进行测序，获得抗体的重链和轻链的基因编码序列和氨基酸序列如下：

抗体2YYQH9的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第25-33、51-57 和96-106位氨基酸所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，氨基酸序列如SEQID NO.3所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3的第27-33、51-53、90-94位氨基酸所示。

抗体2YYQF10的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO.5的第26-33、51-58和97-115位氨基酸所示；轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，氨基酸序列如SEQID NO.7所示，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7的第27-37、55-57和94-103位氨基酸所示。

抗体2YYQG6的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.9的第26-33、51-58 和97-110位氨基酸所示；轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11的第27-32、50-52、89-97位氨基酸所示。

抗体 2YYQG8的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，其中，重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13的第26-32、51-58 和97-120位氨基酸所示；轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，其中，轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15的第26-34、52-54、91-100位氨基酸所示。

上述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.20（kappa链）所示，或者SEQ ID NO.22（lambda链）所示。抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19（kappa链）或者SEQ ID NO.21（lambda链）所示。其中，抗体2YYQH9、抗体2YYQF10和抗体2YYQG6的轻链为kappa链，抗体 2YYQG8的轻链为lambda链。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属第一医院

<120> 广谱人源化抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ile Arg Asn

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Tyr Pro Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ala Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Tyr Gly Asp Tyr Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggggt caccgtcatt cgcaactaca tgacctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt atttatcccg gtggtactac atactacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacagtt ccaagaacac gctgtatctt 240

caaatgaaca gcctgagagc cgaggacgcg gccgtatatt tctgtgcgag agcctacggt 300

gactactact ttgacctctg gggccaggga accctgctca ccgtctcctc t 351

<210> 3

<211> 104

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Met Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asp Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Ala Phe Thr Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100

<210> 4

<211> 312

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

gaaatggtta tgacgcagtc tccagccagc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcgtgca gggccagtca gggtgttgac agcagctact tagcctggta ccagcagaag 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatgtat ggtgcatcca gcagggccac tggcattcca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtatgggaca gacttcactc tcaccatcag cagagtggag 240

cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag gtagcgttca cttttggcca ggggaccaag 300

gtggagatca aa 312

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Phe Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ser Tyr Glu Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Met Thr Pro Tyr Tyr Ala Tyr Phe Trp Gly Asn Tyr Arg Ala

100 105 110

Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaggaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata catcttcacc gactacttta tgcattgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttcagtg gatgggatgg atcaacccta atagtggagg cacaagctat 180

gaacagaagt ttcagggcag gatcaccatg accagggaca cgtccatcag cacaatctat 240

ttggagttga gcagcctgag atctgacgac acggccgtct attactgtgc gcgaatgact 300

ccgtattatg cttacttttg gggaaattat cgtgcctttg acttctgggg ccagggaagc 360

ctggtcaccg tctcctca 378

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Asn Tyr Val Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

gatattgtga tgactcagtc tccattctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagcca gagcctcctg tatagtaatg gaaacaacta tgtggattgg 120

tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atttggcttc ttatcgggcg 180

tccggcgtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctct acaaacccca 300

ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaga 336

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ala Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Phe Glu Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ala Trp Asn Gly His Ser Met Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Ser Gly Ser Gly Trp Arg Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gaagtgcagc tggtggaggc tgggggaggg ttggtacagc ctggcacgtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cagctttttt gagtatgcca tgcactgggt ccggcaacct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcaagt attgcttgga atggtcatag catgggctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac tcggccttat attactgtgc aaaagcgagt 300

ggcagtggct ggcgatacgg cttggacgtc tggggccagg ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

gacatccaga tgacccagtc tccattctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattacc aactatttaa gttggtatca gcagaaacca 120

ggcaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacacat tttactttca ccgtcagcag cctgcagccg 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacac tatgataatc tcccctacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagattaa a 321

<210> 13

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Glu Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ile Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Phe Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Gly Phe Ile Gly Tyr Cys Ser Gly Ser Asp Cys Pro Asp

100 105 110

Ala Val Val Ala Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 14

<211> 393

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

caggtgcagc tggtgcaatc tgagtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg cttctggaaa caccttcatt aagtatgcta tgaattgggt gcgacaggtc 120

cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcaatacga acactgggaa cccaacgttt 180

gcccagggct tcacaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctatcag cacggcatat 240

ctacagatca gtagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagggcggga 300

ttcataggat attgtagtgg tagtgactgc ccggacgctg tcgttgctgc ttttgatatc 360

tggggccaag ggacaatggt caccgtctct tca 393

<210> 15

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Gln Phe Val Val Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Arg Tyr

20 25 30

Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Phe Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Phe Lys Phe Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Val Gly Ser

85 90 95

Tyr Thr Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 16

<211> 330

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

cagtttgtgg tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt cgttataact ttgtctcctg gtaccaacaa 120

cacccaggca aagcccccaa actcatgatt tttgatgtca gtaagcggcc ctcaggggtc 180

cccgatcgct tctctggctt caagtttggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc tgctcatatg tgggcagcta cacggaggtg 300

ttcggcggag ggaccaaggt gaccgtctta 330

<210> 17

<211> 328

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

1 5 10 15

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

20 25 30

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

35 40 45

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

85 90 95

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

100 105 110

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

115 120 125

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

130 135 140

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

145 150 155 160

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

165 170 175

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

180 185 190

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

195 200 205

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

210 215 220

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

225 230 235 240

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

245 250 255

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

260 265 270

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

275 280 285

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

290 295 300

Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys

305 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 18

<211> 984

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 60

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac ccgtgacggt gtcgtggaac 120

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 180

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 240

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 300

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 360

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 420

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 480

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 540

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 600

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 720

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 780

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 840

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 900

gggaacgtct tctcatgctc cgtgctgcat gaggctctgc actcccacta cacgcagaag 960

agcctctccc tgtctccggg taaa 984

<210> 19

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

1 5 10 15

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

20 25 30

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

35 40 45

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

50 55 60

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

65 70 75 80

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

85 90 95

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 20

<211> 315

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60

gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc taccccagag aagccaaagt gcagtggaag 120

gtggacaacg ccctgcagag cggaaacagc caggaaagcg tgacagagca ggattccaag 180

gattccacat acagcctgag cagcacactg acactgtcca aggccgacta cgagaagcac 240

aaggtgtacg cctgcgaagt gacacaccag ggactgtcct cccctgtgac aaagagcttc 300

aacagaggag aatgc 315

<210> 21

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

1 5 10 15

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

20 25 30

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

35 40 45

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

50 55 60

Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

65 70 75 80

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

85 90

<210> 22

<211> 273

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

agtgaggagc ttcaagccaa caaggccaca ctggtgtgtc tcataagtga cttctacccg 60

ggagccgtga cagtggcctg gaaggcagat agcagccccg tcaaggcggg agtggagacc 120

accacaccct ccaaacaaag caacaacaag tacgcggcca gcagctacct gagcctgacg 180

cctgagcagt ggaagtccca cagaagctac agctgccagg tcacgcatga agggagcacc 240

gtggagaaga cagtggcccc tacagaatgt tca 273

Claims

1. 一种人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如下所示：

2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如下所示：

（1）SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.3；或者

（2）SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7；或者

（3）SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11；或者

（4）SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15。

3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.19或者SEQID NO.21所示。

4. 一种编码权利要求2或3所述人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体重链的可变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸组合分别如下所示：

（1）SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.4；或者

（2）SEQ ID NO.6以及SEQ ID NO.8；或者

（3）SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.12；或者

（4）SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.16。

5. 根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码所述抗体的重链恒定区的多核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，编码所述抗体的轻链恒定区的多核苷酸序列如SEQ IDNO.20或者SEQ ID NO.22所示。

6.一种表达权利要求2或3所述人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述编码所述抗体重链的可变区的多核苷酸以及编码所述抗体轻链的可变区的多核苷酸。

7.一种表达权利要求2或3所述人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为293F细胞。

9. 一种抗体组合物，其特征在于，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.3所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如：

（1）SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7；或者

（2）SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11；或者

（3）SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15。

10. 一种抗体组合物，其特征在于，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.7所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15所示。

11. 一种抗体组合物，其特征在于，所述组合物含有第一抗体和第二抗体，所述第一抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.11所示，所述第二抗体重链的可变区以及轻链的可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.15所示。

12.权利要求1-3任一所述的人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新型冠状病毒病治疗和/或预防药物中的应用。

13.权利要求1-3任一所述的人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体在制备新型冠状病毒检测试剂中的应用。