CN114317549B - 毒蕈型c型乙酰胆碱受体在飞蝗防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及毒蕈型C型乙酰胆碱受体（C‑typemuscarinic acetylcholine receptor，mAChR‑C）在飞蝗防治中的应用。本发明通过体外注射和喂食转基因作物等方法表明，沉默飞蝗幼虫mAChR‑C基因表达后，出现大量致死和羽化后翅畸形的现象，有效抑制了飞蝗种群数量增长和迁飞危害，表明抑制mAChR‑C基因表达能够达到防治飞蝗的良好效果。培育稳定表达mAChR‑C双链RNA的转基因作物为飞蝗的田间防治提供了一种新方法。

Description

毒蕈型C型乙酰胆碱受体在飞蝗防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及毒蕈型C型乙酰胆碱受体在飞蝗防治中的应用。

背景技术

飞蝗(Locusta migratoria)为迁飞性杂食性害虫，喜食小麦、玉米等粮食作物，是我国乃至世界范围的重要农业害虫。飞蝗之所以容易暴发成灾与其远距离迁飞能力和高繁殖力密切相关。目前，害虫的防治主要是基于化学农药的防治策略，但农药的实施使用不仅易导致害虫抗药性提高，防治成本增高，还造成农药残留，污染生态环境，危害人类健康。因此，寻找替代化学农药的高效性、特异性和可持续性绿色飞蝗防治方法迫在眉睫。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由小分子双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的序列特异性转录后基因沉默现象，具有高效性、特异性等特点，目前逐渐成为一种潜在的害虫防治技术。RNA干扰进行害虫防治的技术关键是筛选获得针对害虫靶标基因具有高干扰效率的dsRNA，而更重要的技术实施难点是如何在田间有效的将dsRNA转入害虫体内，以达到基因沉默和害虫防治的应用效果。以往RNAi介导的害虫防治，常是通过注射、混合饲料饲喂等方法实现基因沉默，但这些方法在田间害虫的防治中应用性较差。2007年首次出现了利用转基因植物表达害虫基因dsRNA来防治棉铃虫的报道。通过转基因植物表达害虫靶标基因dsRNA的方式为害虫的田间治理提供了有效的解决途径。

G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR)为七次跨膜蛋白超家族，介导细胞外信号传导到细胞内，在昆虫机体生理进程的调控中发挥重要作用。通过前期工作，发明人在飞蝗中鉴定到一个编码GPCR蛋白的基因。序列分析比对结果显示，该GPCR与已鉴定的果蝇毒蕈型C型乙酰胆碱受体(C-type muscarinic acetylcholine receptor，mAChR-C)蛋白同源。然而，mAChR-C在昆虫生长发育中的具体作用尚无报道。

发明内容

本发明发现，利用RNA技术干扰mAChR-C表达后，飞蝗幼虫出现大量致死和羽化后翅畸形的现象；另外，本发明采用转基因作物的方法，成功培育出稳定表达mAChR-C双链RNA的玉米植株，饲喂实验表明，飞蝗幼虫取食转基因植株后，靶标基因mAChR-C的表达量下降了79％，导致飞蝗幼虫死亡和羽化后翅畸形，致死率和翅畸形率合计达73.9％，可以有效抑制飞蝗种群数量增长和迁飞扩散。本发明为飞蝗的防治提供了一种新方法，具有较大的应用前景。

本发明采用以下技术方案：

依据飞蝗mAChR-C基因序列，设计合成双链RNA(dsmAChR-C)，将dsmAChR-C注射到飞蝗蜕皮12小时内的五龄幼虫体内，同时以注射绿色荧光蛋白双链RNA(dsGFP)的飞蝗蜕皮12小时内的五龄幼虫为对照组。其中，所述飞蝗mAChR-C基因的序列如SEQ ID NO:1所示，该飞蝗mAChR-C基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，用于合成dsmAChR-C和dsGFP的DNA模板序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。

结果表明，当mAChR-C干扰效率为82％时，飞蝗幼虫的死亡率为53.1％，羽化后翅畸形率为18.6％，致死率和翅畸形率合计达71.7％，正常羽化的存活率为28.3％，正常存活率显著低于dsGFP对照组(100％)。

为解析mAChR-C在飞蝗幼虫生长发育过程中的作用，以及沉默mAChR-C表达后导致幼虫死亡和羽化后翅畸形的分子机制，在实施干扰mAChR-C基因表达后，qRT-PCR检测mAChR-C干扰组和GFP对照组中与几丁质合成和降解相关的基因表达情况。结果显示，mAChR-C干扰组几丁质降解相关基因chitinase5-1(CHT5-1)、chitinase5-2(CHT5-2)、chitinase 10(CHT10)，以及几丁质合成相关基因chitinsynthesis 1(CHS1)、UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase 2(UAP2)的mRNA水平显著下降。上述结果表明，mAChR-C参与调控几丁质代谢相关基因的表达，进而影响幼虫生长发育过程中表皮几丁质的代谢。进一步选择mAChR-C干扰组和GFP对照组dsRNA处理后第5天的五龄幼虫表皮，进行组织切片染色，以观察表皮形态。几丁质染色结果表明，dsmAChR-C处理组幼虫与对照组相比，旧表皮厚度显著增加，新表皮厚度显著减少，表明mAChR-C表达沉默后，旧表皮脱落和新表皮形成受到抑制。综上所述，RNAi技术抑制mAChR-C表达后，表皮正常生长受到影响，阻碍了飞蝗幼虫机体正常生长，导致死亡和羽化后翅畸形。

为了验证RNAi技术介导的mAChR-C表达沉默在农作物害虫防治中的应用前景。通过农杆菌转化法将SEQ ID NO:3所示的用于合成dsmAChR-C的模板整合入玉米幼胚基因组中，获得稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因玉米。将转基因玉米的叶片喂食飞蝗五龄幼虫，饲喂实验结果显示，进食野生型玉米叶片的个体，存活率为97.2％，龄期历期为6.2天，羽化后成虫的翅全部正常伸展；而取食dsmAChR-C转基因玉米叶片的个体mAChR-C表达水平相比野生型玉米对照组下降79.0％，死亡率为53.2％，未死亡幼虫龄期历期显著延长为7.2天，羽化的成虫翅畸形率为20.7％，致死率和翅畸形率合计达73.9％，正常蜕皮羽化的存活率为26.1％，存活率显著低于dsGFP对照组(97.2％)。

本发明的有益效果为：

通过体外注射和取食转基因作物等方法均证明，飞蝗幼虫mAChR-C基因表达沉默后，出现幼虫大量致死和羽化后翅畸形的现象，有效抑制了飞蝗种群数量增长和迁飞危害，表明抑制mAChR-C表达能够达到防治飞蝗的良好效果。稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因作物的培育为飞蝗的田间防治提供了一种新方法。

附图说明

图1为表皮组织中双链RNA注射后基因的干扰效率。***表示P<0.001。

图2为干扰mAChR-C表达对幼虫存活率和羽化后翅型的影响。(A)干扰mAChR-C表达后飞蝗幼虫的存活率。(B)干扰mAChR-C表达后幼虫的表型统计。(C)干扰mAChR-C表达后幼虫的五龄龄期统计。(*表示P<0.05；**表示P<0.01)。

图3为dsmAChR-C注射对几丁质代谢基因和表皮几丁质的影响。(A)dsmAChR-C注射后几丁质降解与合成相关基因的表达水平。(B)dsmAChR-C注射后幼虫体壁染色。用碘化丙啶(Propidium iodide，PI)标记细胞核；使用荧光增白剂28(Fluorescent Brightener 28，FB 28)对几丁质进行染色。标尺长度为50μm。正常蜕皮过程中，旧表皮与上皮细胞层分离、脱落并被新的表皮所取代。(C)dsmAChR-C注射后的表皮厚度指数。**表示P<0.01；***表示P<0.001。

图4为阳性转基因玉米植株的PCR鉴定。注：Maker：DL1500；mAChR-C表示已整合到玉米基因组上能够稳定表达dsmAChR-C的合成模板。

图5为饲喂转基因玉米对幼虫存活率和羽化后翅型的影响。(A)饲喂转基因玉米后幼虫表皮中mAChR-C基因的干扰效率。(B)饲喂转基因玉米后幼虫的存活率。(C)饲喂转基因玉米后飞蝗的表型统计。(D)饲喂转基因玉米后幼虫的五龄龄期统计。(**表示P<0.01；***表示P<0.001)。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

1.飞蝗毒蕈型C型乙酰胆碱受体基因全长编码序列的获得

基于飞蝗转录组数据库(http://159.226.67.243/)，采用生物信息学方法对飞蝗毒蕈型C型乙酰胆碱受体(mAChR-C)基因的序列进行搜索，获得mAChR-C基因的部分序列。利用primer premier6.0软件针对该部分序列设计cDNA末端快速克隆技术所需的RACE引物，并发往北京六合华大基因科技有限公司合成。

用于cDNA末端快速克隆技术扩增mAChR-C基因的5’和3’端的引物序列如下：mAChR-C-5’RACE(SEQ ID NO:5)：5’-ACCCAAGACCAAAAGTACGACCTGGA-3’；mAChR-C-3’RACE(SEQ ID NO:6)：5’-TGATAGTCTCAGTCGGCTGGATCCTTTC-3’。

选取生长健康的飞蝗成虫(群居型东亚飞蝗种群)，利用Trizol法提取表皮总RNA。按照天根的FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明书，将上述所提总RNA反转录合成第一条cDNA。以此cDNA作为模板，结合如序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的上、下游引物，通过cDNA末端快速克隆技术(按照Clontech公司

RACE 5’/3’试剂盒说明书步骤)扩增获得mAChR-C基因5`端和3`端序列，并将此片段送北京六合华大基因科技有限公司测序(后续所有引物合成和测序均在北京六合华大基因科技有限公司完成)。利用BioEdit软件将飞蝗转录组数据库序列和PCR扩增的序列进行拼接及比对后，获得mAChR-C全长开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，ORF序列全长为1005bp，如SEQ ID NO:1所示；该ORF序列编码334个氨基酸，如SEQ ID NO:2所示。

2.飞蝗mAChR-C双链RNA获得

基于上述所得到的SEQ ID NO:1所示的mAChR-C的ORF序列，采用primerpremier6.0软件设计合成dsRNA的DNA模板的引物，其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。然后送往北京六合华大基因科技有限公司合成。

用于扩增mAChR-C dsRNA模板的引物：

SEQ ID NO:7：5’-GTGCTGCCACAAGCCTATATC-3’；

SEQ ID NO:8：5’-ACCAACAGATGGAGAATGAACC-3’。

以1中反转录合成的cDNA为模板，利用如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的上、下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为(1)预变性95℃，3min；(2)95℃，30s；58℃，30s；72℃，40s，共35个循环；(3)延伸72℃，5min。将PCR扩增获得的单一产物连接入pGEM-T(Tiangen)载体中，获得重组质粒pGEM–T–mAChR-C。测序结果表明，PCR扩增产物大小为202bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

以上述获得的重组质粒pGEM–T–mAChR-C为模板，用带有T7启动子序列的配对引物dsmAChR-C-T7-F/dsmAChR-C-T7-R进行PCR扩增，得到用于合成双链RNA的DNA模板(即两端带有T7启动子的SEQ ID NO:3所示的序列，下划线标记为T7启动子序列)，PCR反应条件为(1)预变性95℃，3min；(2)95℃，30s；58℃，30s；72℃，40s，共35个循环；(3)延伸72℃，5min。使用

SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)试剂盒纯化目的片段。NanoDrop 2000测浓度，并确定其浓度在125～1000ng/μl。

dsmAChR-C-T7-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGTGCTGCCACAAGCCTATATC-3’；

dsmAChR-C-T7-R：

5’-TAATACGACTCACTATAGGACCAACAGATGGAGAATGAACC-3’。

以上述获得的两端带有T7启动子序列的DNA为模板，按照T7RiboMAX^TM ExpressRNAi System(Promega)试剂盒的说明步骤，体外转录合成双链RNA。使用NanoDrop 2000测浓度，放入-20℃待用。

3.飞蝗mAChR-C双链RNA干扰飞蝗幼虫

3.1飞蝗双链RNA注射

选取蜕皮后12小时内的五龄幼虫为实验材料，随机分为dsmAChR-C处理组和dsGFP对照组(因飞蝗体内不存在绿色荧光蛋白GFP的基因，因此可将其作为阴性对照)，每组28～30头，重复3次。用10μL规格微量进样器将9μg dsmAChR-C从幼虫腹部第三体节注入体内，同时以注射相同剂量dsGFP的幼虫为对照组。将注射后的飞蝗放置于通风良好的金属笼中(25cm×25cm×25cm)饲养，温度为30±2℃，光周期为14L:10D，饲喂新鲜的麦苗和麦麸，每天两次。注射后每天观察并统计幼虫的死亡情况，并在羽化后统计翅畸形率和五龄发育历期。

3.2飞蝗mAChR-C双链RNA干扰效率检测

注射dsRNA 48小时后，分别在dsmAChR-C处理组和dsGFP对照组随机挑取幼虫8头，用以检测mAChR-C双链RNA干扰效率。提取干扰组和对照组飞蝗幼虫的表皮组织总RNA，反转录合成第一链cDNA，按照天根SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green)试剂盒(PF205)说明书方法，以mAChR-C的qRT-PCR上下游引物及β-actin的qRT-PCR上下游引物，在LightCycler 96(Roche)上进行qRT-PCR反应，分别检测目的基因(mAChR-C)和内参基因(β-actin)的表达量，PCR反应条件为(1)95℃预变性10min；(2)95℃，10s；58℃，30s；72℃，30s，共40个循环；(3)溶解曲线分析95℃，60s；65℃，30s；95℃，30s。然后按照2^-ΔΔCt法计算处理组和对照组幼虫表皮中mAChR-C的相对表达量，分析基因沉默效率。结果如图1所示，与dsGFP对照组相比，dsmAChR-C处理组的mAChR-C表达下降了82％，表明mAChR-C基因表达被有效沉默。

qRT-PCR引物：

mAChR-C-qRT-F：5’-CAGAGAAAGTGATATGGGCAACAA-3’；

mAChR-C-qRT-R：5’-GAACTGGCAGGAAGTATAACAAGT-3’。

β-actin-qRT-F：5’-AATTACCATTGGTAACGAGCGATT-3’；

β-actin-qRT-R：5’-TGCTTCCATACCCAGGAATGA-3’。

3.3干扰mAChR-C表达后导致幼虫致死和羽化后翅畸形

双链RNA注射后即开始每天观察飞蝗幼虫的表型直至全部实验幼虫羽化完成。结果显示：dsmAChR-C干扰组的死亡率为53.1％，羽化后翅畸形率为18.6％，正常蜕皮羽化比例为28.3％，显著低于dsGFP对照组的正常蜕皮羽化的存活率(100.0％)，如图2A和2B所示。另外，dsmAChR-C处理组幼虫五龄发育历期显著长于对照组，如图2C所示。

4.mAChR-C在飞蝗羽化过程中的作用机制

为解析mAChR-C在飞蝗幼虫生长发育过程中的作用，以及mAChR-C表达沉默后的致死和翅畸形的分子机制，在实施干扰mAChR-C表达后，通过qRT-PCR检测与几丁质合成和降解相关基因的表达情况，并通过组织切片染色，进一步观察干扰组(dsmAChR-C)和对照组(dsGFP)表皮形态的变化。

4.1几丁质代谢相关基因的表达情况

利用3.1中获得的dsRNA注射48小时后的干扰组(dsmAChR-C)和对照组(dsGFP)样品，通过qRT-PCR检测mAChR-C基因沉默后5个与几丁质代谢相关基因的表达情况。

qRT-PCR引物：

基因	正向引物(5’-3’)	反向引物(5’-3’)
			CHS1	CTTGAGCCAATTGGTTTGGT	TGAGTTCTGTGGATGCAAGG
UAP2	GTACCTAAATGCTCATGGTGTGGAT	GTCCACCTGGCAAACAACTCCT
			CHT5-1	CATCAAAGCGAAGGGCTACGGC	AGATTAGTGCGTCCTTCGGGCCA
CHT5-2	CAAGGATTATGTGGAGAACC	TCCACAGTGTTTGTTTTCTTTGATT
			CHT10	GCAATTGGTGGTTGGAATGAT	GGTCTAGTCCTTCAAATCCATACTTTTC
β-actin	AATTACCATTGGTAACGAGCGATT	TGCTTCCATACCCAGGATGA

结果如图3所示，几丁质合成酶1(Chitin synthase 1，CHS1)，UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶2(UDP-N-acetylglucosamine phosphorylase，UAP2)，几丁质酶5-1(Chitinse5-1，CHT5-1)、几丁质酶5-2(Chitinse5-2，CHT5-2)、几丁质酶10(Chitinse 10，CHT10)的转录水平显著低于对照组。与几丁质合成相关的基因CHS1和UAP2的转录水平分别下降76.0％和82.0％，与几丁质降解相关的基因CHT5-1、CHT5-2和CHT10的转录水平分别下降58.0％、93.6％和86.1％。该结果表明，mAChR-C参与调控几丁质代谢相关基因的表达，进而影响幼虫生长发育过程中表皮几丁质的代谢。

4.2组织学观察表皮变化

为了进一步检测mAChR-C对表皮几丁质的影响，本实施例利用组织切片染色的方法对注射dsRNA后第5天的干扰组和对照组的飞蝗第3～4节表皮进行显微观察，碘化丙啶(propidium iodide，PI)将细胞核染色(红色)，荧光增白剂28(Fluorescent Brightener28，FB 28)将几丁质染色(蓝色)。结果如图3B和3C所示，干扰组幼虫表皮层中，旧表皮厚度明显高于对照组幼虫，而干扰组幼虫新表皮厚度明显低于对照组。经测量统计，干扰组新表皮平均厚度指数比对照组减少95.0％，而干扰组旧表皮平均厚度指数比对照组显著增高2.5倍，推测旧表皮分解和新表皮合成异常是导致飞蝗死亡、羽化后翅畸形和发育迟缓的原因。

5.mAChR-C双链RNA转基因玉米在防治飞蝗中的应用

5.1构建转化载体

设计含有BamHI和SpeI两个酶切位点的引物，以pGEM–T–mAChR-C质粒为模板，进行PCR扩增，回收纯化PCR产物(即上下游分别含有BamHI和SpeI的SEQ ID NO:3)。通过双酶切和infusion反应，在pWMB006载体上BamHI和SpeI两个多克隆位点处正向、反向各连入dsmAChR-C合成模板的基因片段(SEQ ID NO:3)。连接成功后，转化大肠杆菌、筛选阳性克隆，测序正确的阳性克隆即为pWMB006-mAChR-C重组质粒。

5.2农杆菌介导法构建稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因玉米

使用农杆菌转化法进行玉米转基因操作。玉米遗传转化实验流程如下：

(1)将pWMB006-mAChR-C重组质粒通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。

(2)使用玉米品种KN5855，以新鲜剥离的1mm左右的玉米幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL农杆菌悬浮液的2mL塑料离心管中，30分钟内大约处理未成熟幼胚150个；吸去农杆菌悬浮液，余下玉米胚在管中，然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5分钟。

(3)将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。

(4)共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，之后更换新的筛选培养基筛选培养2周。

(5)将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3～4个月后收获后代种子。该种子即为稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因玉米种子。

(6)提取T0代玉米叶片基因组DNA，经PCR检测后，获得了阳性植株，如图4所示，取阳性植株进行下一步的饲喂实验。

5.3稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因玉米防治飞蝗效果检测

喂食稳定表达mAChR-C双链RNA的转基因玉米叶子，观察分析对飞蝗五龄幼虫生长发育的影响。

(1)选取蜕皮后12小时内的五龄幼虫，每组17～20头，重复3次。从鉴定为阳性的植株上剪取叶片，细致清洁后喂食幼虫，同时以喂食野生型玉米叶片的幼虫为对照组。

(2)根据幼虫的数量喂食适量玉米叶片，并保持玉米叶片充足。

(3)喂食48小时后，分别在处理组(喂食转基因玉米)和对照组(喂食野生型玉米)随机挑取幼虫5头，收集其表皮组织，qRT-PCR检测饲喂转基因玉米后飞蝗表皮组织中mAChR-C的表达量(即检测基因干扰效率)。检测方法同3.2。

(4)从喂食当天起，每天观察记录转基因玉米喂食组和野生型玉米喂食组幼虫死亡、发育历期和羽化后畸形的表型。

结果显示：取食转基因玉米叶片的幼虫mAChR-C表达水平下降79％，如图5A所示；进食野生型玉米叶片的个体，存活率为97.2％；喂食转基因玉米幼虫死亡率为53.2％，羽化后翅畸形率为20.7％，致死率和翅畸形率合计达73.9％，正常蜕皮羽化的存活率为26.1％，如图5B和5C所示；取食转基因玉米叶片的幼虫龄期显著长于取食野生型玉米对照组，喂食转基因玉米幼虫龄期为7.2天，显著长于喂食野生型玉米幼虫(6.2天)，如图5D所示。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大学

<120> C型乙酰胆碱受体在飞蝗防治中的应用

<130> 无

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> locusta migratoria

<400> 1

atgtcaggac cttccaatga aaccttgttg gggaactatt caacagaaac tgaagacgag 60

atattatttg gaatgccaga gaaagtgata tgggcaacaa ttgatggggc cctgatgata 120

ccaatattag cagggaacat cataacaatc tgtgcaattt tatggtgtcg acgtctgtca 180

agtgtactat cgaaccagtt tatcttgaac ttggcaatat cggatttgtt agtaggtcta 240

tttttgccat atcacatggc attctcaata atcactgaac tgaacaagta caagaacacc 300

tgtttactgc ggtttatact tgttatactt cctgccagtt cttcaatata taatctcata 360

gcaattgcta ctgataggta tatttctatt gtgtacccac tacattattc aacatacatg 420

acagcaagga aagccttact gatagtctca gtcggctgga tcctttctgc cattgtatca 480

acaatgccaa gctattggaa taaatacagt gcagacaagg catgtttggt tgacaatgtg 540

ctgccacaag cctatatcat aggtatcatc acaccagcat ttgttctggt gctgatagcc 600

atgttggtac tttactggcg aatatggaag gaagcttcag aacaagccag aagacttcga 660

aatgttacaa actctcactc agattggaaa tctgtccagg tcgtactttt ggtcttgggt 720

tcattctcca tctgttggtt accctacttc acagtcatct gttgccgcgt agctggtgca 780

aaatcttata catccttcat ggtttataaa gcagcatttt ctatggggat ggccaactcg 840

tgcataaatc cactgattta tgcatggaaa aacaccgaat ttaagaatgc ttttagaaat 900

atacttcatt gtaaatcacc aaaccgagca gatcatctac tagaaactat aactacacat 960

actgaactgc atactattga cagctcatgt ggaggtttca attaa 1005

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> Locusta migratoria

<400> 2

Met Ser Gly Pro Ser Asn Glu Thr Leu Leu Gly Asn Tyr Ser Thr Glu

1 5 10 15

Thr Glu Asp Glu Ile Leu Phe Gly Met Pro Glu Lys Val Ile Trp Ala

20 25 30

Thr Ile Asp Gly Ala Leu Met Ile Pro Ile Leu Ala Gly Asn Ile Ile

35 40 45

Thr Ile Cys Ala Ile Leu Trp Cys Arg Arg Leu Ser Ser Val Leu Ser

50 55 60

Asn Gln Phe Ile Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Val Gly Leu

65 70 75 80

Phe Leu Pro Tyr His Met Ala Phe Ser Ile Ile Thr Glu Leu Asn Lys

85 90 95

Tyr Lys Asn Thr Cys Leu Leu Arg Phe Ile Leu Val Ile Leu Pro Ala

100 105 110

Ser Ser Ser Ile Tyr Asn Leu Ile Ala Ile Ala Thr Asp Arg Tyr Ile

115 120 125

Ser Ile Val Tyr Pro Leu His Tyr Ser Thr Tyr Met Thr Ala Arg Lys

130 135 140

Ala Leu Leu Ile Val Ser Val Gly Trp Ile Leu Ser Ala Ile Val Ser

145 150 155 160

Thr Met Pro Ser Tyr Trp Asn Lys Tyr Ser Ala Asp Lys Ala Cys Leu

165 170 175

Val Asp Asn Val Leu Pro Gln Ala Tyr Ile Ile Gly Ile Ile Thr Pro

180 185 190

Ala Phe Val Leu Val Leu Ile Ala Met Leu Val Leu Tyr Trp Arg Ile

195 200 205

Trp Lys Glu Ala Ser Glu Gln Ala Arg Arg Leu Arg Asn Val Thr Asn

210 215 220

Ser His Ser Asp Trp Lys Ser Val Gln Val Val Leu Leu Val Leu Gly

225 230 235 240

Ser Phe Ser Ile Cys Trp Leu Pro Tyr Phe Thr Val Ile Cys Cys Arg

245 250 255

Val Ala Gly Ala Lys Ser Tyr Thr Ser Phe Met Val Tyr Lys Ala Ala

260 265 270

Phe Ser Met Gly Met Ala Asn Ser Cys Ile Asn Pro Leu Ile Tyr Ala

275 280 285

Trp Lys Asn Thr Glu Phe Lys Asn Ala Phe Arg Asn Ile Leu His Cys

290 295 300

Lys Ser Pro Asn Arg Ala Asp His Leu Leu Glu Thr Ile Thr Thr His

305 310 315 320

Thr Glu Leu His Thr Ile Asp Ser Ser Cys Gly Gly Phe Asn

325 330

<210> 3

<211> 202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgctgccac aagcctatat cataggtatc atcacaccag catttgttct ggtgctgata 60

gccatgttgg tactttactg gcgaatatgg aaggaagctt cagaacaagc cagaagactt 120

cgaaatgtta caaactctca ctcagattgg aaatctgtcc aggtcgtact tttggtcttg 180

ggttcattct ccatctgttg gt 202

<210> 4

<211> 260

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttcaaaatt agacacaaca ttgaagatgg aagcgttcaa cttgcagacc attatcaaca 60

aaatactcca attggcgatg gccctgtcct tttaccagat aaccattacc tgtccacaca 120

atctaccctt tccaaagatc ccaacgaaaa gagagatcac atgatctatt ttgagtttgt 180

aacagctgct gcgattacac atggcatgga tgaattatac aaataaatgt atagacttca 240

agttgacact aacgtgtccg 260

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acccaagacc aaaagtacga cctgga 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgatagtctc agtcggctgg atcctttc 28

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtgctgccac aagcctatat c 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

accaacagat ggagaatgaa cc 22

Claims (2)

1.基于毒蕈型C型乙酰胆碱受体基因合成的双链RNA在抑制飞蝗新表皮合成和旧表皮降解、以及几丁质代谢中的应用，其特征在于，用于合成所述双链RNA的DNA模板的序列如SEQ ID NO:3所示。

2.基于毒蕈型C型乙酰胆碱受体基因合成的双链RNA在抑制几丁质代谢相关基因表达中的应用，其特征在于，用于合成所述双链RNA的DNA模板的序列如SEQ ID NO:3所示，所述几丁质代谢相关基因为CHS1、UAP2、CHT5-1、CHT5-2、CHT-10。

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