CN114316077A - 一种海参多糖的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海参多糖的制备方法，包括步骤：1)将海参粉碎，用水浸泡，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭活酶，离心，取上清液；上清液经中空纤维柱超滤，取超滤截留液，即得海参多糖粗品溶液；2)将步骤1)的海参多糖粗品溶液上阴离子交换层析柱，依次用水和NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液；3)将上述NaCl洗脱液经纳滤膜脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖。海参多糖可用于制备抗凝血药物或保健品，具有预防血栓的功效，对老年人、血栓高风险人群具有良好的辅助预防作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种海参多糖及其制备方法与应用。
技术背景
海参是上等的补品良药,作为功能性食品受到人们的喜爱。近些年,随着保健品行业的迅速发展,以海参为主要原料的保健品也越来越多,同时,对其药用价值及保健功能的研究也更加深入。海参含有多种重要的化学成分，主要包括海参多糖、海参皂苷、海参胶原蛋白、海参多肽及脂类物质等,这些活性成分具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗菌、抗病毒、降血糖及抗凝血等生物活性,可用于预防及辅助治疗某些疾病(韦豪华等，海参化学成分及生物活性研究进展[J]，食品安全质量检测学报，2017，8(06):2054-2061)。
国内外有关研究表明，海参多糖主要有两种：一为海参糖胺聚糖或粘多糖(holothurianglycosaminoglycan，HG)，是由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L岩藻糖组成的分支杂多糖，其相对分子质量在40000-50000；另一种为海参岩藻聚糖(holothurianfucan，HF)，是由L岩藻糖构成的直链匀多糖，相对分子质量在80000-100000。
据相关文献报道，目前海参多糖的常用提取方法主要有溶剂提取法与蛋白酶水解法，蛋白酶水解法是提取海参多糖的理想方法(张红玲等，海参多糖的提取分离与生物活性研究进展[J]，食品安全质量检测学报，2017，8(06):2062-2067)。常用的分离纯化方法主要有分级沉淀法、盐析法、金属络合法、有机盐沉淀法、季胺盐沉淀法和柱层析法等(蔡彬新等，海参多糖的分离纯化方法及其主要生物活性[J]，福建水产，2008(03):70-74)。而柱层析法中强碱性阴离子交换剂可与海参酸性粘多糖进行结合，通过高浓度的盐溶液洗脱分离，从而得到高纯度的海参多糖，此法纯化效果好且操作简单。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种海参多糖的制备方法。通过本发明的制备方法可以提高海参多糖的得率，并且适合工业生产，降低能耗。
为了实现上述目的，本发明提供下技术方案：
一种制备海参多糖的方法，包括以下步骤：
1)将海参粉碎，用水浸泡，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭活酶，离心，取上清液；上清液经中空纤维柱超滤，取超滤截留液，即得海参多糖粗品溶液；
2)将步骤1)的海参多糖粗品溶液上阴离子交换层析柱，依次用水和NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液；
3)将NaCl洗脱液经纳滤膜脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖。
本发明中所述海参通常为干燥海参体壁。海参可以是本领域已知的各种海参，包括但不限于：梅花参(Thelenota ananas)、仿刺参(Apostichopus japonicus)、象牙参(Holothuria fuscopunctata Jaeger)、黄玉参(Stichopus naso)、糙海参(Holothuriascabra)、白底辐肛参(Actinopyga mauritiana)、乌皱辐肛参(Actinopyga miliaris)、海地瓜(Acaudina molpadioides)、蛇目白尼参(Bohadschia argus)、红腹海参(Holothuriaedulis)、黑乳海参(Holothuria nobilis)、玉足海参(Holothuria leucospilota)、中华海参(Holothuria sinica)、荡皮海参(Holothuria sinica)、美国肉参(Isostichopusbadionotus)、巴西参(Ludwigothurea grisea)、绿刺参(Stichopus chloronotus)、巨梅花参(Thelenota anax)等。
优选地，上述步骤1)中，海参粉碎成粗颗粒，然后再浸泡，利于反应的进行。将海参用其8-10倍重量的水浸泡，浸泡时间最好是0.5h或以上，例如1h。
优选地，上述步骤1)中，复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为海参重量的1-2％，pH6.0-7.5，温度50℃-60℃，时间1-2h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为海参重量的0.1％-0.3％，pH6.0-7.0，温度50℃-60℃，时间3-4h。
优选地，上述步骤1)中，离心速度为4000-15000rpm。优选地，离心后的上清液经截留分子量5KD的中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa。更优选地，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
优选地，上述步骤2)中，阴离子交换层析柱的填料为强碱性阴离子交换层析树脂(例如D204阴离子交换树脂)或弱碱性阴离子交换树脂(如DEAE-52纤维素)，更优选强碱性阴离子交换层析树脂。
优选地，上述步骤2)中，阴离子交换层析柱依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、0.5mol/L-2.5mol/L的NaCl溶液(例如0.5、2.0、3.0mol/L NaCl溶液)梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h。优选的，在步骤2)中，阴离子交换层析柱依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、2-3倍柱体积的0.3-0.7mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的1.8-2.4mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集用1.8-2.4mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液；然后用约3mol/L NaCl溶液洗脱以清洗层析柱。更优选地，阴离子交换层析柱依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液、3倍柱体积的2.0mol/L NaCl溶液洗脱，收集用2mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液，洗脱流速为2BV/h；然后用3mol/L NaCl溶液洗脱以清洗层析柱。
优选地，上述步骤2)中，将收集的洗脱液用截留分子量100-500Da的纳滤膜进行脱盐处理，更优选用截留分子量200-500Da的纳滤膜。
优选地，上述各步骤中，所用的水为去离子水。
本发明的另一目的是提供根据上述任一制备方法制备的海参多糖。
本发明还有一个目的是所述制备方法制得的海参多糖在制备药物或保健品或食品中的应用。所述用途可以是本领域已知的海参多糖的各种用途，包括但不限于：抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力等。
本发明的有益效果体现在：1)在海参多糖粗品制备过程中，中空纤维柱超滤步骤可以富集分子量大于5KD的海参多糖粗品；2)在多糖粗品纯化过程中，本发明采用纳滤除盐工艺，与现有的超滤除盐工艺相比，纳滤的分离效果更精细，在除盐时既能保证精准去除可溶性的无机盐，还能避免部分较小分子量多糖样品的流失，从而使海参多糖的得率更高，可达到4％-6％，含量达到65％以上，甚至75％；3)减少了超滤截留液的减压浓缩步骤，可直接用柱层析方法进行纯化脱色处理，避免了大生产时使用有机试剂对环境造成污染，方便工业生产，降低能耗。
具体实施方式
通过实施例进一步详细描述本发明。以下实施例仅用于举例说明的目的，不应理解为对本发明保护范围的任意限制。除非特别说明，实施例中所用的材料、试剂和仪器均为普通市售或常规产品。如无详细说明，实施例中的操作方法均为常规操作方法，例如：海参总多糖含量使用苯酚-硫酸法进行测定，是本领域技术人员熟知的常规方法。
实施例1海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：取干燥梅花参3kg，粉碎成粗颗粒，加入梅花参8倍重量的去离子水浸泡1h，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，其中复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的1％，pH6.0，温度为50℃，时间1h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的0.1％，pH6.0，温度50℃，时间4h。酶解完毕后，煮沸15min灭活酶，6000rpm离心，取上清液；上清液经5KD中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
2)海参多糖的分离纯化：将上述海参多糖粗品溶液均分成两份，分别命名为样1和样2；
样1处理如下：将样1加入预处理后的D204型强碱性阴离子树脂柱(规格
树脂湿体积为100ml)中，依次用2倍柱体积去离子水洗脱、2倍柱体积的0.6mol/L NaCl溶液洗脱、2倍柱体积的2.2mol/L NaCl溶液洗脱、2倍柱体积的3.1mol/LNaCl溶液洗脱(用以清洗柱子)，洗脱流速为2BV/h，收集2.2mol/L NaCl洗脱液；
样2处理如下：将样2加入预处理后的DEAE-52纤维素层析柱(规格
树脂湿体积为100ml)中；依次用2倍柱体积去离子水洗脱、2倍柱体积的0.6mol/L NaCl溶液洗脱、2倍柱体积的2.2mol/L NaCl溶液洗脱、2倍柱体积的3.1mol/LNaCl溶液洗脱(用以清洗柱子)，洗脱流速为2BV/h，收集2.2mol/L NaCl洗脱液；
3)分别将上述两个层析柱的NaCl洗脱液进行100D的纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样1的海参多糖63.452g，得率为4.23％；经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样2的海参多糖57.158g，得率为3.81％。
实施例2海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：取干燥梅花参3kg，粉碎成粗颗粒，加入梅花参9倍重量的去离子水浸泡1h，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，其中复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的1.5％，pH6.5，温度为55℃，时间1.5h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的0.2％，pH6.5，温度55℃，时间3.5h。酶解完毕后，煮沸15min灭活酶，10000rpm离心，取上清液；上清液经5KD中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
2)海参多糖的分离纯化：将上述海参多糖粗品溶液均分成两份，分别命名为样3和样4；
样3处理如下：将样3加入预处理后的D204型强碱性阴离子树脂柱(规格
树脂湿体积为100ml)中，依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.4mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的1.9mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集1.9mol/L NaCl洗脱液；
样4处理如下：将样4加入预处理后的DEAE-52纤维素层析柱(规格
树脂湿体积为100ml)中；依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.4mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的1.9mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集1.9mol/L NaCl洗脱液；
3)分别将上述两个层析柱的NaCl洗脱液进行200D的纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样3的海参多糖71.104g，得率为4.74％；经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样4的海参多糖64.582g，得率为4.31％。
实施例3海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：取干燥梅花参3kg，粉碎成粗颗粒，加入梅花参10倍重量的去离子水浸泡1h，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，其中复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的2％，pH7.0，温度为60℃，时间2h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为梅花参重量的0.3％，pH7.0，温度60℃，时间3h。酶解完毕后，煮沸15min灭活酶，15000rpm离心，上清液经5KD中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
2)海参多糖的分离纯化：将上述海参多糖粗品溶液均分成两份，分别命名为样5和样6；
样5处理如下：将样5加入预处理后的D204型强碱性阴离子树脂柱(规格
树脂湿体积为100ml)中，依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2mol/L NaCl洗脱液；
样6处理如下：将样6加入预处理后的DEAE-52纤维素层析柱(规格
树脂湿体积为100ml)中；依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2.0mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2.0mol/L NaCl洗脱液；
3)分别将上述两个层析柱的NaCl洗脱液进行500D的纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样5的海参多糖76.813g，得率为5.12％，经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样6的海参多糖71.726g，得率为4.78％。
综合上述三个实施例可得：实施例3的海参多糖得率更高，为优选方案；为考察该方案不同海参的海参多糖得率，取等量的黄玉参和象牙参，按实施例3同法操作。
实施例4海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：取干燥黄玉参3kg，粉碎成粗颗粒，加入黄玉参10倍重量的去离子水浸泡1h，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，其中复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为黄玉参重量的2％，pH7.0，温度为60℃，时间2h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为黄玉参重量的0.3％，pH7.0，温度60℃，时间3h。酶解完毕后，煮沸15min灭活酶，15000rpm离心，上清液经5KD中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
2)海参多糖的分离纯化：将上述海参多糖粗品溶液均分成两份，分别命名为样7和样8；
样7处理如下：将样7加入预处理后的D204型强碱性阴离子树脂柱(规格
树脂湿体积为100ml)中，依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2mol/L NaCl洗脱液；
样8处理如下：将样8加入预处理后的DEAE-52纤维素层析柱(规格
树脂湿体积为100ml)中；依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2.0mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2.0mol/L NaCl洗脱液；
3)分别将上述两个层析柱的NaCl洗脱液进行500D的纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样7的海参多糖61.353g，得率为4.09％；经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样8的海参多糖57.316g，得率为3.82％。
实施例5海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：取干燥象牙参3kg，粉碎成粗颗粒，加入象牙参10倍重量的去离子水浸泡1h，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，其中复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为象牙参重量的2％，pH7.0，温度为60℃，时间2h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为象牙参重量的0.3％，pH7.0，温度60℃，时间3h。酶解完毕后，煮沸15min灭活酶，15000rpm离心，上清液经5KD中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
2)海参多糖的分离纯化：将上述海参多糖粗品溶液均分成两份，分别命名为样9和样10；
样9处理如下：将样9加入预处理后的D204型强碱性阴离子树脂柱(规格
树脂湿体积为100ml)中，依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2mol/L NaCl洗脱液；
样10处理如下：将样10加入预处理后的DEAE-52纤维素层析柱(规格
树脂湿体积为100ml)中；依次用3倍柱体积去离子水洗脱、3倍柱体积的0.5mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的2.0mol/L NaCl溶液洗脱、3倍柱体积的3mol/L NaCl溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集2.0mol/L NaCl洗脱液；
3)分别将上述两个层析柱的NaCl洗脱液进行500D的纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样9的海参多糖53.742g，得率为3.58％；经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样10的海参多糖50.259g，得率为3.35％。
对比例1海参多糖的制备
1)海参多糖粗品的提取：称取2kg干燥梅花参(同实施例3批次)，粉碎成粗颗粒，加入海参重量10倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的2％，pH7.0，温度55℃，时间5h；酶解完毕后，煮沸灭活酶，管式离心机12000rpm离心，取上清液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)至原体积的22％，再次管式离心机14000rpm离心，时间15min，取上清液；上清液第一次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为0.5M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为60％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第二次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀；沉淀用适量纯水溶解，进行第三次盐析醇沉：上清液中加入乙酸钾(使乙酸钾终浓度为1.0M)，以及乙醇(使乙醇终浓度为40％)，管式离心机离心取沉淀，沉淀再用无水乙醇洗涤两次，挥干乙醇后得227.4g海参多糖粗品，得率为11.37％。
2)将上述海参多糖粗品用纯水溶解，上D204型阴离子层析柱(OH-)，依次用3倍柱床体积的纯水和0.5、1.0、2.0、3.0mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集用2.0mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。
3)将上述收集的洗脱液进行5KD的中空纤维柱超滤脱盐处理，收集超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085MPa)，冷冻干燥，得样11的海参多糖72.4g，海参多糖得率为3.62％。
对比例2海参多糖的制备
海参多糖粗品的提取：称取2kg干燥梅花参(同实施例3批次)，粉碎成粗颗粒，加入海参重量10倍的纯水，用木瓜蛋白酶酶解，酶解条件为：酶添加量为海参重量的3％，pH6.5，温度60℃，时间2h；后续操作同对实施3；经D204型强碱性阴离子树脂柱纯化处理的样12的海参多糖32.17g，得率为3.22％；经DEAE-52纤维素层析柱纯化处理的样13的海参多糖30.26g，得率为3.03％。
取上述5个实施例的10个海参多糖样品和对比例1、2的样品，同时用常规的苯酚-硫酸法测海参总多糖含量；其海参多糖得率与海参总多糖含量见表1。
表1海参中海参多糖得率及总多糖含量
从实施例可以看出，1)实施例3的海参多糖得率更高，为优选方案，且采用D204型强碱性阴离子树脂柱纯化得到的海参多糖的得率和含量均由于DEAE-52纤维素层析柱纯化所得；2)从不同海参原料对比研究来看，梅花参所得海参多糖的得率和含量略高于黄玉参及象牙参；3)在多糖粗品的纯化过程中，与现有的超滤除盐工艺相比，本发明采用纳滤膜脱盐处理，既能保证精准去除可溶性的无机盐，还能避免部分较小分子量多糖样品的流失，从而使得海参多糖的得率更高，可达到3.35％-5.12％，含量达到65％以上，甚至75％，取得良好的效果。
以上实施例仅是对本发明的举例说明。本领域技术人员在本发明基础上可以进行修饰和改进，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种制备海参多糖的方法，包括步骤：
1)将海参粉碎，用水浸泡，依次用复合蛋白酶、风味蛋白酶酶解，酶解完毕后，煮沸灭活酶，离心，取上清液；上清液经中空纤维柱超滤，取超滤截留液，即得海参多糖粗品溶液；
2)将步骤1)的海参多糖粗品溶液上阴离子交换层析柱，依次用水和NaCl溶液洗脱，收集NaCl洗脱液；
3)将上述NaCl洗脱液经纳滤膜脱盐处理，收集纳滤截留液，减压浓缩并冷冻干燥，即得海参多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，海参用其8-10倍重量的水浸泡，浸泡时间为0.5h或以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，复合蛋白酶酶解条件为：酶添加量为海参重量的1-2％，pH6.0-7.5，温度50℃-60℃，时间1-2h；风味蛋白酶酶解条件为：酶添加量为海参重量的0.1％-0.3％，pH6.0-7.0，温度50℃-60℃，时间3-4h。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，离心速度为4000-15000rpm；离心后的上清液经截留分子量5KD的中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15MPa；超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；重复补水2次后停止超滤，取超滤截留液即为海参多糖粗品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，阴离子交换层析柱的填料为强碱性阴离子交换层析树脂或弱碱性阴离子交换树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，阴离子交换层析柱依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、0.5mol/L-2.5mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中，阴离子交换层析柱依次分别用2-3倍柱体积的去离子水、2-3倍柱体积的0.3-0.7mol/L的NaCl溶液、2-3倍柱体积的1.8-2.4mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集用1.8-2.4mol/L NaCl溶液洗脱时的洗脱液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中，将收集的洗脱液用截留分子量100-500Da的纳滤膜进行脱盐处理。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的方法制备的海参多糖。
10.根据权利要求9所述的海参多糖在制备抗高血脂症、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、提升免疫力的药物或保健品或食品中的用途。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115894734A (zh) * | 2022-12-02 | 2023-04-04 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 高效低污染的海参蒸煮液提取海参多糖的方法 |
| CN118085121A (zh) * | 2024-04-29 | 2024-05-28 | 北京三元食品股份有限公司 | 一种提高乳低聚糖中的唾液酸乳糖含量的方法及制备的低聚糖粉、食品 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120309710A1 (en) * | 2010-12-14 | 2012-12-06 | Dalian Haiyantang Biology Co.,Ltd. | Compound sea cucumber preparation and manufacturing method thereof |
| CN105695545A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-22 | 集美大学 | 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法 |
| CN106117382A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 一种海参多糖分离及精制的方法 |
| CN106539090A (zh) * | 2016-11-27 | 2017-03-29 | 威海蓝印海洋生物科技有限公司 | 一种海参多糖口服液 |
| CN111393537A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-10 | 潍坊悦龙堂海洋科技有限公司 | 一种海参中生物活性物质的提取方法 |
-
2020
- 2020-09-30 CN CN202011065884.0A patent/CN114316077A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120309710A1 (en) * | 2010-12-14 | 2012-12-06 | Dalian Haiyantang Biology Co.,Ltd. | Compound sea cucumber preparation and manufacturing method thereof |
| CN105695545A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-22 | 集美大学 | 一种海参岩藻聚糖硫酸酯和海参糖蛋白的制备方法 |
| CN106117382A (zh) * | 2016-06-29 | 2016-11-16 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 一种海参多糖分离及精制的方法 |
| CN106539090A (zh) * | 2016-11-27 | 2017-03-29 | 威海蓝印海洋生物科技有限公司 | 一种海参多糖口服液 |
| CN111393537A (zh) * | 2020-04-08 | 2020-07-10 | 潍坊悦龙堂海洋科技有限公司 | 一种海参中生物活性物质的提取方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115894734A (zh) * | 2022-12-02 | 2023-04-04 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 高效低污染的海参蒸煮液提取海参多糖的方法 |
| CN115894734B (zh) * | 2022-12-02 | 2024-02-23 | 大连深蓝肽科技研发有限公司 | 高效低污染的海参蒸煮液提取海参多糖的方法 |
| CN118085121A (zh) * | 2024-04-29 | 2024-05-28 | 北京三元食品股份有限公司 | 一种提高乳低聚糖中的唾液酸乳糖含量的方法及制备的低聚糖粉、食品 |
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