CN114306717B - 一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料及其制备方法和应用。从众多海洋生物活性物中，优选生物相容性好、易加工与降解的海洋鱼皮胶原、羧甲基壳聚糖、海藻酸盐，与血小板衍生生长因子PDGF‑BB进行科学组合、优化制备而成。该材料具有高孔隙率、高溶胀比、力学性能良好、对PDGF‑BB缓释控制、无细胞毒性等优点，可显著促进细胞黏附、增殖、迁移与血管形成，有效减轻炎症反应，减少瘢痕增生。该生物医用材料适用范围广，使用方便，可防止细菌感染而无需频繁更换，对促进烧伤、烫伤、切割伤、交通伤、手术伤、战伤、火器伤合并海水浸泡伤、糖尿病性溃疡、炎性溃疡、压力性溃疡和慢性难愈创面再生与修复效果显著。

Description

一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料及其制备方法和应用。

背景技术

大多数皮肤缺损虽可以在1或2周内快速有效愈合，但广泛的全层伤口往往难以修复，会对健康造成严重影响，甚至直接威胁生命。而外伤、溃疡、发炎、烧伤、烫伤、手术及先天性畸形等皮肤缺损与异常，不仅会给患者带来身体的痛苦，而且也会造成心灵创伤。因此，迫切需求开发出一种促愈效果显著的生物医用材料，帮助患者提高生活质量。

海洋生境独特，蕴藏着丰富的生物资源，是寻找珍贵药物的资源宝库。海洋来源高分子材料如无机类(如珊瑚礁基材料)、多糖类(如纤维素、甲壳质、壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、海藻酸盐)和蛋白类(如胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、角蛋白)因具有来源广泛、可塑性强、免疫原性低、不与宗教信仰相冲突等优点，已广泛用于生物医用材料。

目前，利用胶原、壳聚糖制备三维支架用作皮肤敷料已成为热点，海藻酸盐微球在支架上的应用也层出不穷。胶原、壳聚糖、海藻酸盐按照不同的比例、制备方法进行复配，制备出的生物医用材料在理化性能(孔径大小、孔隙率、吸水性、力学强度等)、生物相容性(细胞毒性、血液相容性等)、生理功效(抑菌、消炎、促愈)等方面差异巨大，需不断的进行调整和优化。

本发明针对大面积全层皮肤缺损容易导致严重感染、伤口愈合质量差等问题，制备出一种负载PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。该支架兼具使用方便、保护创面、快速止血、吸收渗液、抑菌、消炎、促进新生组织形成、加速愈合、减少瘢痕增生等优点，可有效促进皮肤组织再生与修复。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料，所述的海洋生物医用材料的理化性质优良，生物相容性好，有显著吸收渗液、抑菌、消炎、促愈等功效。

所述的海洋生物医用材料包含以下原料：胶原、水溶性壳聚糖、海藻酸盐和血小板衍生生长因子(PDGF-BB)。

优选的，所述的胶原、水溶性壳聚糖和海藻酸盐的质量比为(2.5～7.5):(15～25):(2.5～10)，所述的海藻酸盐和PDGF-BB的质量比为1:(0.1×10^-5～1.0×10^-5)。

更优选的，所述的胶原、水溶性壳聚糖和海藻酸盐的质量比为7.5:20:10，所述的海藻酸盐和PDGF-BB的质量比为1:1.0×10^-5。

优选的，所述的胶原为海洋鱼皮胶原，所述的水溶性壳聚糖为羧甲基壳聚糖，所述的海藻酸盐为海藻酸钙。

本发明的另外一个目的是提供一种制备上述的海洋生物医用材料的方法，其包括如下步骤：(1)制备PDGF-BB@海藻酸钙微球；(2)将PDGF-BB@海藻酸钙微球负载在胶原/壳聚糖支架上，冻干制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，即为海洋生物医用材料。

优选的，步骤(1)中所述的PDGF-BB@海藻酸钙微球的制备包括如下步骤：

①将海藻酸钠溶于蒸馏水，制成浓度为2％w/v的海藻酸钠溶液，按质量比加入PDGF-BB，搅匀制成水相；

②取一定体积橄榄油，按1％v/v比例添加吐温80，600～750rpm搅拌1～2h，配制成有机相；

③取100mL有机相，650～700rpm搅拌条件下加入20mL水相，750rpm搅拌1h；

④加入40mL浓度为1％w/v氯化钙溶液，500rpm搅拌1h，加入10mL异丙酮，400rpm搅拌30min，得到混合液；

⑤混合液6000rpm离心5～10min，所得的沉淀分别用异丙酮、蒸馏水交替洗涤2～3次；

⑥冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球。

优选的，所述的PDGF-BB@海藻酸钙微球的粒径为30μm～190μm，包封率为67.35％～76.39％。

优选的，步骤(2)中所述的将PDGF-BB@海藻酸钙微球负载在胶原/壳聚糖支架上的制备方法是：

①将胶原溶于乙酸溶液中，配成浓度为0.5％-1.5％w/v的胶原溶液；

②将水溶性壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为3％-5％w/v的壳聚糖溶液；

③将胶原溶液、壳聚糖溶液按等体积比混合后，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球，于650～700rpm进行磁力搅拌，得到混合液；

④将混合液加入48孔板中，冻干；

⑤支架脱模后，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液浸泡1～2h，蒸馏水洗涤2～3次；

⑥冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，即海洋生物医用材料。

优选的，所述的乙酸溶液的浓度为2％w/v，所述的EDC/NHS溶液中EDC的浓度为0.5mol/L，NHS的浓度为0.5mol/L。

本发明制备的支架网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均匀，孔与孔间通透性良好，PDGF-BB@海藻酸钙微球也均匀分布在孔壁表面且黏附良好。支架吸水性与保水性优良，含水量、力学强度适宜，有利于营养物质、信号分子及代谢物质传递，可为细胞生长、粘附、增殖与分化提供良好的微环境，是一种理化性能优良的生物医用材料。

优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的孔径为20μm～500μm。

优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的压缩模量为1.19MPa

～11.80MPa。

优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的含水量为1.45％～15.88％。

优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的孔隙率为83.43％～95.32％。

优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的溶胀率为75.97％～139.20％。

更优选的，所述PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的孔径为200μm～500μm，压缩模量为(7.03±1.93)MPa，含水量为10.65％±1.43％，孔隙率为94.08％±1.16％，溶胀率为117.30％±4.58％。

本发明还有一个目的在于提供一种上述的海洋生物医用材料的应用，该海洋生物医用材料可作为创伤敷料，用于促进皮肤创伤组织的再生与修复。

本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优异的生物相容性。该支架无细胞毒性，可缓慢释放PDGF-BB。与HUVEC细胞共培养6h时，体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进烧伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于深Ⅱ度烧伤、Ⅲ度烧伤切削痂创面，可迅速吸收渗液，为创面提供一个干燥、微酸和低氧环境，有效减少感染，减轻炎症反应，防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进烫伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于深Ⅱ度烫伤、Ⅲ度烫伤创面，可迅速吸收引流创面渗液，提供一个干燥、微酸和低氧环境，减少病原菌感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，加速愈合，减少瘢痕形成。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进切割损伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于切割损伤、手术缝合创面，可有效吸收渗液，减轻炎症反应，促进新生组织形成，加速愈合，减少瘢痕生成。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进交通伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于交通伤清创后的创面，可迅速吸收引流创面渗液，为创面提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，减少病原菌感染，减轻炎症反应，并促进新生组织形成，提高愈合速度，减少瘢痕形成。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进战伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于火器伤(战伤的一种)清创后的创面，可迅速吸收引流创面渗液，提供一个干燥、洁净、微酸和低氧环境，减少病原菌感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，提高创面愈合速度和愈合质量。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进火器伤合并海水浸泡伤皮肤组织的再生与修复。将支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤清创后的创面，可快速吸收渗液，并提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，保护创面减少海水中创伤弧菌等致病菌感染，减轻炎症反应并有效防止创面进一步加深，改善血液循环并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进糖尿病性溃疡的再生与修复。将支架灭菌后，敷于糖尿病性溃疡创面，可提供一个清洁、微酸和低氧环境，有效保护溃疡避免损伤和继发感染，并改善局部缺血和水肿状况，促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进炎性溃疡的再生与修复。将支架灭菌后，敷于炎性溃疡清创后的创面，可提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，减少病原菌感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量。

作为一种可选的实施方案，所述的海洋生物医用材料可用于促进压力性溃疡的再生与修复。将支架灭菌后，敷于压力性溃疡创面，可提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，有效保护溃疡避免损伤和继发感染，减轻炎症反应，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量。

本发明的解决方案是基于发明人对皮肤创伤病理生理学、愈合动力学特点，影响创面愈合的主要因素、不同创面相应的治疗方法，对生物医用材料在理化特性、生物相容性、生理功效等方面的需求，以及对海洋生物功能活性物质功效的了解，结合现代药理学和皮肤创伤修复生物医用材料的研究成就，通过大量创造性实验，从众多功能活性物中，寻找、优选出天然安全、易于加工、可自行降解吸收的胶原、壳聚糖、海藻酸盐、PDGF-BB，进行科学组合，并优化制备工艺，最终获得理化特性、生物相容性良好，抑菌、消炎、促愈等功效显著的海洋生物医用材料及其制备方法。

值得一提的是，作为一种可选的实施方案，本发明制备的海洋生物医用材料的剂型是多孔支架(创伤敷料)，还可按照同样的组成成分和比例，制成水凝胶。该水凝胶兼具可注射性和粘性，能根据特定的创伤形状而紧密贴合创口，有效发挥止血、吸收渗液、持久抑菌、促进创伤修复与再生等功效。

本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益效果：

(1)本发明通过优化PDGF-BB@海藻酸钙制备工艺以及PDGF-BB与海藻酸盐的比例，确保PDGF-BB最高生物学活性、最大包封率的同时，微球大小均匀且适宜。进一步的，将PDGF-BB@海藻酸钙微球负载在胶原/壳聚糖支架上，可克服在皮肤组织修复过程中PDGF-BB与组织液相接触时，扩散速度过快、易被酶类降解、无法长期调控修复过程等难题，有效增加PDGF-BB与皮肤组织的接触面积和时间，使之缓慢、均匀、持久释放，促进创伤愈合与修复。

(2)本发明通过优化PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架各组成成分的比例与制备工艺，确保支架的理化特性、生物相容性优异。制备的支架网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均匀，孔与孔间通透性良好，PDGF-BB@海藻酸钙微球也均匀分布在孔壁表面且黏附良好。支架吸水性与保水性优良，含水量、力学强度适宜，有利于营养物质、信号分子及代谢物质传递，可为细胞生长、粘附、增殖与分化提供良好的微环境。

(3)生物相容性检测结果发现，本发明制得的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞生长状态最好，并可显著提高细胞活性，相较于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组，细胞活性分别提高17.78％以上、25.69％以上。另一方面，本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的细胞黏附能力，以及促进细胞增殖与迁移的活性明显优于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架。此外，本发明制得的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架形成血管的数量与节点显著多于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架。由此可见，本发明制备的支架具有优异的生物相容性，其无毒，可显著促进细胞黏附、生长、增殖、迁移，以及血管形成，是一种理想的生物医用材料，可用于皮肤创伤组织的再生与修复。

(4)皮肤创伤组织再生与修复功效评价结果显示，本发明制得的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组伤口愈合率最高，显著高于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架组和纱布空白组。此外，本发明制得的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组的炎症因子(IL-6、IL-1β、CD68、iNOS)mRNA、蛋白表达量均显著低于其它组，而血管因子(CD31、α-SMA)均显著高于其它组。由此可见，本发明制备的支架具有显著的促进皮肤创伤组织再生与修复的功效。该材料可有效促进细胞增殖、迁移，胶原蛋白和弹性纤维生成，并促进毛细血管新生，还可大幅减少炎症因子生成，加速创面收缩，促进再上皮化及毛囊附属器再生，减少瘢痕形成，有效提高愈合速度和愈合质量。

(5)与PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架、PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架以及EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的对比组比较，本发明的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架试验组在生物活性(促进细胞黏附、增殖、迁移)、生理功效(促进火器伤合并海水浸泡损伤修复等)等方面具有更佳的性能。此外，皮肤创伤组织再生与修复功效评价结果显示，本发明制得的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组伤口愈合率最高，显著高于上述其它的对比组。而炎症因子(IL-6、IL-1β、CD68、iNOS)mRNA、蛋白表达量均显著低于其它对比组，血管因子(CD31、α-SMA)均显著高于其它对比组。由此可见，本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架促进皮肤创伤修复功效最佳。

附图说明

图1是实施例1制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球扫描电镜图片(A：×100倍；B：×250倍；C：×500倍)。

图2是实施例1-9中制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架扫描电镜图片。(Group1：实施例1，其余如此类推)。

图3是实施例1-9中制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架热重分析结果。(Group1：实施例1，其余如此类推)。

图4是实施例1-9中制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架孔隙率。(G1：实施例1，其余如此类推)。

图5是实施例1-9中制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架溶胀率。(G1：实施例1，其余如此类推)。

图6是实施例8中各组分红外光谱图(a：海藻酸钙微球；b：胶原；c：羧甲基壳聚糖；d：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图7是实施例8不同含量PDGF-BB海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架的体外缓释曲线(S10：PDGF-BB/海藻酸钙＝1.0×10^-5；S50：PDGF-BB/海藻酸钙＝0.2×10^-5；S100：PDGF-BB/海藻酸钙＝0.1×10^-5)。

图8是实施例8中制备的支架细胞毒性(活/死细胞荧光染色，Control：空白对照；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图9是实施例8中制备的支架细胞增殖活性(Control：空白对照；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图10是实施例8中制备的支架促进细胞迁移活性(Control：空白对照；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图11是实施例8中制备的支架促进细胞黏附活性(CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图12是实施例8中制备的支架促进细胞血管生成活性(Control：空白对照；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图13是实施例8中制备的支架处理创面图片(Gauze：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图14是实施例8中制备的支架处理创面皮肤组织HE染色(Gauze：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图15是实施例8中制备的支架处理创面皮肤组织Masson染色(Gauze：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图16是实施例8中制备的支架处理创面第7天皮肤组织免疫组化和免疫荧光染色图片(Gauze：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图17是实施例8中制备的支架处理创面皮肤组织免疫荧光染色和Western Blot图片(Gauze/Control：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

图18是实施例8中制备的支架处理创面第7天皮肤组织Western Blot检测与RT-qPCR分析(Control：纱布；CMC/COL/AlgMs：海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/PDGF：负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架；CMC/COL/AlgMs@PDGF：PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架)。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的方法所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。以下所用原料，除特殊指明外，均为市售。

实施例1

(1)PDGF-BB@海藻酸钙微球制备：将海藻酸钠(从上海麦克林生化科技有限公司购得，纯度98％)溶解在蒸馏水中，配制成浓度为2％w/v海藻酸钠溶液，按质量比1:1.0×10^-5加入PDGF-BB，搅匀制成水相；量取一定体积橄榄油(从上海麦克林生化科技有限公司购得)，按1％v/v比例添加吐温80(从上海麦克林生化科技有限公司购得)，600rpm搅拌2h，配制成有机相；量取100mL有机相，650rpm搅拌条件下加入20mL水相，750rpm搅拌1h，加入40mL浓度为1％w/v的氯化钙(从上海麦克林生化科技有限公司购得)溶液，500rpm搅拌1h，再加入10mL异丙酮(天津市富宇化学试剂厂，AR级)，400rpm搅拌30min，混合液在6000rpm离心5min，所得沉淀分别用异丙酮、蒸馏水交替洗涤3次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球。

(2)海藻酸钙微球制备：制备方法同(1)，只是未添加PDGF-BB。

(3)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原(从上海麦克林生化科技有限公司购得)溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.005g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖(从上海麦克林生化科技有限公司购得，纯度97％)溶于蒸馏水中，配成浓度为0.03g/mL羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.01g/mL，650rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(4)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(3)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(3)相同。

(5)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(3)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(3)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球的扫描电镜图片见图1所示。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径200μm～410μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球包封率为74.7％±1.69％，粒径30μm～190μm，海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(1.51±0.16)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约14.86％±1.02％，孔隙率为87.34％±3.70％，溶胀率为97.08％±3.80％；在第4d时支架释放PDGF-BB速率明显加快，在第5d时释放趋势变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，灭菌后敷于深Ⅱ度烧伤、Ⅲ度烧伤切削痂创面，可迅速吸收引流创面渗液，为创面提供一个干燥、微酸和低氧环境，减少病原菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有显著的促进烧伤创面再生与修复功效。

实施例2

(1)PDGF-BB@海藻酸钙微球制备：将海藻酸钠溶解在蒸馏水中，配制成浓度为2％w/v的海藻酸钠溶液，按质量比1:0.2×10^-5加入PDGF-BB，搅匀制成水相；量取一定体积橄榄油，按1％v/v比例添加吐温80，750rpm搅拌1h，配制成有机相；量取100mL有机相，700rpm搅拌条件下加入20mL水相，750rpm搅拌1h，加入40mL浓度为1％w/v的氯化钙溶液，500rpm搅拌1h，再加入10mL异丙酮，400rpm搅拌30min，混合液在6000rpm离心10min，所得沉淀分别用异丙酮、蒸馏水交替洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球。

(2)海藻酸钙微球制备：制备方法同(1)，只是未添加PDGF-BB。

(3)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.005g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.04g/mL羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.005g/mL，700rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡2h，用蒸馏水洗涤3次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(4)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(3)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(3)相同。

(5)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(3)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(3)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径100μm～300μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球包封率为70.78％±3.43％，粒径30μm～190μm，海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(1.39±0.05)MPa；含水量约10.66％±1.20％，孔隙率为85.85％±2.11％，溶胀率为77.09％±1.12％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于切割损伤、手术缝合创面，可有效吸收渗液，为创面提供一个干燥、微酸和低氧环境，减轻炎症反应，促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，减少瘢痕生成，具有显著的促进切割损伤创面再生与修复功效。

实施例3

(1)PDGF-BB@海藻酸钙微球制备：将海藻酸钠溶解在蒸馏水中，配制成浓度为2％w/v的海藻酸钠溶液，按质量比1:0.1×10^-5加入PDGF-BB，搅匀制成水相；量取一定体积橄榄油，按1％v/v比例添加吐温80，700rpm搅拌1.5h，配制成有机相；量取100mL有机相，700rpm搅拌条件下加入20mL水相，750rpm搅拌1h，加入40mL浓度为1％w/v的氯化钙溶液，500rpm搅拌1h，再加入10mL异丙酮，400rpm搅拌30min，混合液在6000rpm离心8min，所得沉淀分别用异丙酮、蒸馏水交替洗涤3次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球。

(2)海藻酸钙微球制备：制备方法同(1)，只是未添加PDGF-BB。

(3)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.005g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.05g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.0025g/mL，680rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1.5h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(4)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(3)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(3)相同。

(5)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(3)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(3)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径20μm～110μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球包封率为69.25％±1.83％，粒径30μm～190μm，海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(1.20±0.01)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约1.85％±0.23％，孔隙率为88.54％±5.11％，溶胀率为98.40％±4.57％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于火器伤(战伤的一种)清创后的创面，可迅速吸收引流创面渗液，为创面提供一个干燥、微酸和低氧环境，减少病原菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有显著促进火器伤创面再生与修复功效。

实施例4

(1)按照实施例1的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.01g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.03g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.005g/mL，650rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径135μm～500μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(3.72±0.46)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约10.84％±1.22％，孔隙率为90.10％±3.67％，溶胀率为109.80％±9.17％；在第4d时支架释放PDGF-BB速率明显加快，在第5d时释放趋势变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于糖尿病性溃疡创面，可为创面提供一个清洁、微酸和低氧环境，有效保护溃疡避免损伤和继发感染，并改善局部缺血和水肿状况，促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有较好促进糖尿病性溃疡创面再生与修复功效。

实施例5

(1)按照实施例2的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.01g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.0025g/mL，700rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡2h，用蒸馏水洗涤3次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径20μm～110μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(2.22±0.28)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约7.79％±0.82％，孔隙率为91.96％±1.96％，溶胀率为111.10％±8.01％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于炎性溃疡清创后的创面，可为创面提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，减少病原菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有显著促进炎性溃疡创面再生与修复功效。

实施例6

(1)按照实施例3的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.01g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.05g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.01g/mL，680rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1.5h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径200μm～500μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(1.36±0.15)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约11.52％±1.20％，孔隙率为90.68％±3.16％，溶胀率为135.82％±3.38％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于交通伤清创后的创面，可迅速吸收引流创面渗液，为创面提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，减少病原菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有促进创面再生与修复的功效。

实施例7

(1)按照实施例2的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.015g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.03g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.0025g/mL，650rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径20μm～120μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(4.78±0.07)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约2.01％±0.56％，孔隙率为90.14％±2.53％，溶胀率为113.94％±3.44％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于压力性溃疡创面，可为创面提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，有效保护溃疡避免损伤和继发感染，减轻炎症反应，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有显著促进压力性溃疡创面再生与修复功效。

实施例8

(1)按照实施例1的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.015g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.04g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.01g/mL，700rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡2h，用蒸馏水洗涤3次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径200μm～500μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(7.03±1.93)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约10.65％±1.43％，孔隙率为94.08％±1.16％，溶胀率为117.30％±4.58％；在第4d时支架释放PDGF-BB速率明显加快，在第5d时释放趋势变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤的清创后的创面，可快速吸收伤口渗液，为创面提供一个干燥、清洁、微酸和低氧环境，保护创面减少病原菌(创伤弧菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面进一步加深，改善血液循环并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有促进火器伤合并海水浸泡损伤创面再生与修复功效。

实施例9

(1)按照实施例3的方法，分别制备PDGF-BB@海藻酸钙微球、海藻酸钙微球。

(2)PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：将胶原溶于浓度为2％w/v的乙酸溶液中，配成浓度为0.015g/mL的胶原溶液；将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为0.05g/mL的羧甲基壳聚糖溶液；将胶原溶液、羧甲基壳聚糖溶液按1:1体积比混合，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球使其终浓度为0.005g/mL，680rpm磁力搅拌1h，将混合液加入48孔板中，冻干支架脱模后，用EDC/NHS溶液(EDC浓度0.5mol/L，NHS浓度0.5mol/L)浸泡1.5h，用蒸馏水洗涤2次，冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

(3)海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架制备：制备方法同(2)，只是负载的是海藻酸钙微球，海藻酸钙微球用量与(2)相同。

(4)负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架：制备方法同(2)，只是负载的是PDGF-BB，PDGF-BB用量与(2)相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好，孔径200μm～500μm；PDGF-BB@海藻酸钙微球均匀分布在孔壁表面，黏附良好且没有发生团聚；力学强度适宜，压缩模量为(9.64±2.16)MPa；吸水、保水性能良好，含水量约6.35％±0.87％，孔隙率为93.80％±1.52％，溶胀率为120.05％±3.24％；在第7d时支架释放PDGF-BB速率轻微加快，在第9d时释放速度变缓。

该支架无任何细胞毒性，与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞迁移明显，划痕近乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量明显增多；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性显著提高。

综上，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架具有优良的理化特性和生物相容性。支架多孔网络结构紧密、均匀，含水量、吸水性与保水性优良，力学强度适宜，可有效促进营养物质、信号分子及代谢物质传递，促进细胞生长、粘附、增殖、迁移与血管新生，是理想的生物医用材料。

将本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，灭菌后敷于深Ⅱ度烫伤、Ⅲ度烫伤创面，可迅速吸收引流创面渗液，为创面提供一个干燥、微酸和低氧环境，减少病原菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等)感染，减轻炎症反应，有效防止创面加深，并促进新生组织形成，提高创面愈合速度和愈合质量，具有显著促进烫伤创面再生与修复功效。

实施例10

将本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球，分别进行以下检测。

(1)扫描电镜观测形貌：将干燥好的微球用导电胶固定在铜台上，喷金处理后，扫描电子显微镜(SEM)观测微球粒径大小，并采集图像。

(2)包封率检测：量取10mg的PDGF-BB@海藻酸钙微球，加入10mL质量浓度为3％w/v的柠檬酸钠溶液，超声30min，6000rpm离心10min，上清液用ELISA试剂盒检测PDGF-BB的含量(参照试剂盒说明书操作)，并计算包封率(每mg海藻酸钙微球中含有PDGF-BB的含量)。

检测发现，本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球形貌、粒径大小均无显著性差异，粒径约30μm～190μm，微球包封率为67.35％～76.39％。

随着PDGF-BB含量的增加，微球的包封率略有提升。其中，实施例1制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球包封率为74.7％±1.69％，实施例2制备的微球包封率为70.78％±3.43％，实施例3制备的微球包封率为69.25％±1.83％。

实施例11

为节省PDGF-BB消耗，我们选取本发明制备的海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，分别进行以下表征(PDGF-BB添加与否，不影响其理化性能)。

(1)扫描电镜观测形貌：将干燥好的支架用导电胶固定在铜台上，喷金处理后，扫描电子显微镜(扫描电镜)观测支架孔径大小，并采集图像。

(2)力学性能测试：室温条件下，采用博士

3220高精度生物材料试验机，测试条件为附加力值为225N、线速度为0.5mm/min，对支架(直径10mm，高度4mm～6mm)进行压缩应力和压缩模量测试。

(3)热重分析：称取10mg支架，放置于耐热陶瓷坩埚中，在氮气条件下(升温范围30℃～800℃，升温速率10℃/min)，进行热重分析。

(4)孔隙率检测：采用乙醇位移法，首先称重烘干后的支架质量为M₁，测量支架体积为V，然后将支架完全浸入无水乙醇中，抽真空保持1h，再次称重为M₂。计算支架孔隙率(％)＝(M₂—M₁)/ρV×100％，其中ρ为无水乙醇密度(ρ＝0.79g/cm³)。

(5)溶胀率检测：首先称重干态时支架的质量为M₀，将支架浸泡于PBS缓冲溶液24h后，用滤纸吸干表面水分，再次称重支架质量为M_t，计算支架溶胀率(％)＝(M_t-M₀)/M₀×100％。

(6)红外检测：分别将海藻酸钙微球、胶原、羧甲基壳聚糖、支架，置于60℃烘箱中烘干，进行红外光谱检测。

SEM检测发现，本发明制备的支架网络结构有序，孔洞大小、形状与分布均较均匀，孔与孔间通透性良好。该结构有利于营养物质、信号分子及代谢物质的传递，可为细胞生长、粘附、增殖与分化提供良好的环境。海藻酸钙微球也均匀分布在孔壁表面且黏附良好，微球在支架表面分布均匀没有发生团聚，这将更利于细胞的黏附和增殖(图2)。

同时，我们发现了一个有趣的现象：当胶原用量较低(0.005g/mL)时，支架的孔径随着壳聚糖用量的增加而变小；当胶原用量中等(0.001g/mL)时，支架的孔径随着壳聚糖用量的增加先变小而后又变大；当胶原用量较多(0.015g/mL)时，支架的孔径随着壳聚糖用量的增加而变大。因此，实施例1、6、8、9中制备的支架孔洞最大，孔径约200μm～500μm；实施例2、4中制备的支架孔洞稍小，孔径约100μm～400μm；实施例3、5、7中制备的支架孔洞最小，孔径约20μm～200μm。

力学性能检测发现，本发明制备的支架应变力均>65％。其中，胶原含量对支架的压缩性能影响显著，随着胶原含量的增加，支架的压缩模量也随之增加。在胶原含量较低(0.005g/mL)或中等(0.001g/mL)时，随着壳聚糖含量增加，支架的压缩模量略微减少；在胶原含量较高(0.015g/mL)时，随着壳聚糖含量的增加，支架的压缩模量随之增加。因此，实施例1-3中支架的压缩模量最低，分别为(1.51±0.16)MPa、(1.39±0.05)MPa、(1.20±0.01)MPa；实施例4-6中支架的压缩模量略高，分别为(3.72±0.46)MPa、(2.22±0.28)MPa、(1.36±0.15)MPa；实施例7-9中支架的压缩模量更高，分别为(4.78±0.07)MPa、(7.03±1.93)MPa、(9.64±2.16)MPa。

热重分析检测发现，在室温-100℃时，本发明制备的支架的重量均有不同程度降低。损失重量与其含水量正相关，含水量越高，支架损失质量也越高。因此，在温度为100℃时，实施例1中制备的支架损失重量最高，达14.86％；而实施例3、7、9中制备的支架因其含水量相对较少，所以损失重量也较少，约1.85％、2.01％、6.35％(图3)。

孔隙率检测发现，本发明制备的支架孔隙率均>85％，较大的孔隙率可为细胞生长、营养体液交换提供三维空间，有利于伤口渗液的吸收，以及PDGF-BB的释放。其中，实施例4-9中制备的支架孔隙率高达90％以上(图4)。

溶胀率检测发现，本发明制备的支架均具有良好的吸水、保水能力，能保持营养成分和体液不流失，并为细胞和组织的生长提供适宜的微环境，进而有利于创伤皮肤组织再生与修复。其中，除实施例2制备的支架溶胀率略低(77.09％±1.12％)外，其余支架溶胀率均>95％，其中实施例4-9中制备支架的溶胀率分别为109.80％±9.17％、111.10％±8.01％、135.82％±3.38％、113.94％±3.44％、117.30％±4.58％、120.05％±3.24％(图5)。

红外线检测发现，海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架在3450cm^-1处吸收峰为胶原和羧甲基壳聚糖分子连上的-NH和-OH的伸缩振动重叠的结果；2926cm^-1处吸收峰为海藻酸钙微球、胶原、羧甲基壳聚糖上的-CH2伸缩振动的重叠峰。此处吸收峰均比单独的海藻酸钙微球、胶原、羧甲基壳聚糖在2925cm^-1处吸收峰要高；在1640cm^-1和1570cm^-1处出现较宽的吸收峰，属于酰胺Ⅰ、Ⅱ谱带的吸收峰，提示羧甲基壳聚糖上羧基和胶原的氨基在交联时反应生成了酰胺键；而1440cm^-1为海藻酸钙微球和羧甲基壳聚糖羧基的对称伸缩振动重叠峰(图6)。

综上，本发明制备的支架具有良好的理化特性，其多孔网络结构紧密、均匀，吸水性与保水性优良，含水量、力学强度适宜，可作为优良的生物医用材料，用于创伤皮肤组织的再生与修复。

值得一提的是，本发明制备的支架理化特性与其组成成分胶原、羧甲基壳聚糖的具体用量、配比紧密相关。需通过大量的创造性实验，反复进行调试、优化其配方与工艺，才能使制备的生物医用材料具有优良的理化特性和生物相容性。

实施例12

将本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，分别进行以下生物相容性评价。

(1)PDGF-BB体外缓释测定：称取10mg的PDGF-BB@海藻酸钙微球，加入10mL的PBS缓冲溶液，37℃摇床120rpm摇荡，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天时，分别取1mL的PBS溶液(然后补加等量的PBS溶液)，用ELISA试剂盒检测PDGF-BB的含量(参照试剂盒说明书操作)，并绘制体外释放曲线。

(2)浸提液制备：根据国标GB/T16886.12，按0.1g/mL比例，将支架浸没于完全培养基中，37℃摇床浸提24±2h。将获得的浸提液进行各项检测。

(3)细胞毒性检测(免疫荧光染色)：在支架浸提液与L929细胞共同孵育24h、48h时，吸取细胞培养液，加入死活细胞双染试剂，40℃避光15min后，采用荧光显微镜观察L929细胞活、死状态。激发/发射滤片设定为488nm/530nm观察活细胞(绿色)，530nm/580nm观察死细胞(红色)。

(4)细胞活性检测(CCK8法)：将L929细胞消化稀释成单细胞悬液，按细胞浓度2×10³个/100μL加入96孔板中，待细胞完全贴壁且状态良好情况下，每孔加入100μL支架浸提液，于37℃孵育24h、48h时，每孔加入10μL的CCK8检测溶液，再次孵育30min～40min后，利用酶标仪在450nm处检测OD值，并计算细胞活性。

(5)细胞迁移活性检测(划痕实验)：将L929细胞接种至24孔板(每孔2×10⁴个细胞)中，37℃培养24h后，用20μL移液枪枪头划伤单层细胞，PBS洗涤除去细胞碎片后，加入支架浸提液共同孵育0h、2h、4h、8h、24h时，分别拍照并计算细胞迁移率。

(6)细胞黏附活性检测(扫描电镜观测)：将L929细胞接种至48孔板(每孔5×10⁴个细胞)中，加入支架共同孵育24h，将培养细胞对应孔板取出，弃去培养基，PBS洗涤2次后，加入扫描电镜固定液浸没材料表面，固定4h，吸弃固定液，酒精脱水2次，45℃烘干，喷金处理后，扫描电镜观察细胞形态。

(7)血管形成活性检测(细胞成管实验)：将4℃预冷的matrigel基底胶用枪头混匀，与无血清培养基对半稀释后，接种至96孔板中，每孔有50μL混合液，4℃静止5min后，37℃条件下形成胶。在已形成胶的96孔板中，每孔分别加入100μL的HUVEC细胞悬液(细胞浓度为1×10⁵个/mL)，37℃培养至细胞完全贴壁时，加入支架浸提液，共孵育24h后，除去培养基，加入1×活细胞染色剂AM，显微镜下观察着色情况，随后洗去染色剂，加入PBS溶液，荧光显微镜下观察并拍照。

PDGF-BB体外缓释检测发现，本发明的支架可实现细胞因子如PDGF-BB的高效负载与可控释放。支架负载PDGF-BB含量越高，释放速率越快。其中，当PDGF-BB与海藻酸盐质量比较低(S100：0.1×10^-5；S50：0.2×10^-5)时，支架PDGF-BB释放速率与趋势基本相同，在第7d时，PDGF-BB释放速率轻微加快，进入第9d时，PDGF-BB释放速度放缓。当PDGF-BB与海藻酸盐质量比较高(S10：1.0×10^-5)时，在第4d时支架PDGF-BB释放速率明显加快，在第5d后变缓，在第7d时，PDGF-BB释放趋势与S50、S100相似，但释放量明显高于S50和S100(图7)。

细胞毒性检测发现，本发明制备的支架均无细胞毒性。支架与L929细胞共培养24h后，细胞贴壁形态良好，死亡数量极少。随后细胞不断增殖，在48h时生长状态更好，死亡细胞数量比空白对照组少(图8)。

值得一提的是，我们将实施例1-9制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，与其对应的海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架进行对比。意外发现，与细胞共孵育24h时，各组细胞死亡数量均较少，无明显差异。然而共孵育48h时，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞生长状态最好，死亡细胞数量明显少于其它两个处理组(海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架)。

细胞活性检测发现，本发明制备的支架在与细胞共培养24h时，与对应的海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组相比，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞活性无明显差异。然而，与细胞共培养48h时，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞活性明显高于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组，分别提高17.78％以上、25.69％以上。说明本发明制备的支架可显著提高细胞活性(图9)。

细胞迁移活性检测发现，本发明制备的支架可显著促进细胞的增殖与迁移。与细胞共培养8h时，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞开始明显增殖与迁移，划痕变小，但与负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组无显著差异。在与细胞共培养24h时，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的细胞划痕几近消失。可明显判断出，本发明制备的支架促进细胞增殖与迁移的活性，明显优于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组和空白对照组(图10)。

细胞黏附活性检测发现，本发明制备的支架具有良好的生物相容性，可提供充足营养供给，使大量细胞粘附在微球和支架孔壁表面。PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架细胞黏附能力，略优于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架(图11)。

细胞血管形成活性检测发现，本发明制备的支架具有显著提高细胞体外血管生成的能力，可有效促进创伤皮肤组织再生与修复。PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架与细胞共孵育6h时，即形成明显的网状血管结构，形成血管的数量与节点显著多于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架处理组和空白对照组(图12)。

综上，本发明制备的支架具有优异的生物相容性，其无毒，可显著促进细胞黏附、生长、增殖、迁移，以及血管形成，是一种理想的生物医用材料，可用于创伤皮肤组织的再生与修复。

实施例13

将本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，分别进行创伤皮肤组织再生与修复功效评价(以全层皮肤组织切割损伤为例)。

(1)皮肤损伤造模：取180只SD大鼠称重，分别用3％戊巴比妥钠(60mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠，用动物剃毛器剔除背部皮肤毛发，暴露皮肤分别用碘酒和75％酒精消毒，用经蒸汽灭菌的组织剪将背部进行全层皮肤组织切除，在其背部造成4个直径为12mm的创面，4个创面分别对应于纱布空白组(Gauze)、海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组(CMC/COL/AlgMs)、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架(CMC/COL/PDGF)、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架(CMC/COL/AlgMs@PDGF)。用上述4种灭菌材料分别覆盖背部的4个创面，并覆盖市售透明膜敷料(Tegaderm膜，3m，MN)后，将大鼠放回笼中单独饲养，每3天更换1次创伤敷料。

(2)创面拍照(测算愈合率)：在第4、7、14、21天，观察创面愈合情况，用照相机拍照，使用IPP 6.0软件对创伤面积进行测算。随后，将大鼠进行安乐死，取创伤皮肤组织，进行以下检测。

(3)组织病理学检测：取皮肤组织石蜡切片，分别进行HE染色、Masson染色，显微镜镜检并采集图像，利用Image J软件测算皮肤组织表皮层、真皮层厚度以及胶原蛋白等含量。

(4)免疫组化染色：取皮肤组织，分别进行免疫组化染色(按照相应试剂盒说明书操作)，镜检并采集图像，利用Image J软件测算皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6含量。

(5)免疫荧光染色：取皮肤组织，分别进行免疫荧光染色(按照相应试剂盒说明书操作)，镜检并采集图像，利用Image J软件测算皮肤组织中各蛋白(炎症因子iNOS、CD68、MPO，新生血管蛋白α-SMA、成熟血管蛋白CD31)的表达量。

(6)蛋白免疫印迹检测：取皮肤组织，提取总蛋白(按照相应提取试剂盒说明书操作)后，分别采用western blotting技术，结合镜检、图像采集，检测皮肤组织中iNOS、CD68、MPO、IL-1β、IL-6、α-SMA、CD31蛋白表达情况，并利用Image J软件测算皮肤组织中各蛋白的表达量。

(7)RT-qPCR检测：取皮肤组织，提取mRNA(按照相应提取试剂盒说明书操作)后，分别采用qRT-PCR技术，结合镜检、图像采集，检测皮肤组织中iNOS、CD68、MPO、IL-1β、IL-6、α-SMA、CD31 mRNA表达情况，并利用Image J软件测算皮肤组织中各mRNA的表达量。

本发明制备的支架处理创面图片见图13，支架处理创面皮肤组织HE染色见图14，支架处理创面皮肤组织Masson染色见图15，支架处理创面皮肤组织免疫荧光染色、WesternBlot、RT-qPCR结果见图16-18。

研究发现，在第4d时，所有支架处理组皮肤均已结痂，可见明显的新生鳞状上皮层，以及大量的胶原纤维和少量新生血管；而纱布空白组皮肤仍有轻微炎症，无上皮层生成。支架处理组皮肤伤口愈合率明显高于纱布空白组，其中PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组伤口愈合率最高(44.33％±7.09％)，高于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组(30.89％±8.55％)、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架组(41.33％±9.59％)和纱布空白组(19.62％±8.80％)。

在第7d时，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组可见成束的胶原以及完整的再生上皮组织，其伤口愈合率最高(66.84％±4.84％)，高于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组(58.44％±6.88％)、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架组(62.49％±9.47％)和纱布空白组(56.43％±5.02％)。此外，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的皮肤组织中，炎症因子(IL-6、IL-1β、CD68、iNOS)mRNA、蛋白表达量均显著低于其它组，而血管因子(CD31、α-SMA)均显著高于其它组。

支架处理创面第7天皮肤组织免疫组化和免疫荧光染色结果见图16，支架处理创面第7天皮肤组织Western Blot检测与RT-qPCR分析结果见图17-图18。

在第14d时，所有组均能观察到大量胶原沉积，新生组织形成。其中，PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组胶原沉积数量最多，分布最均匀，血管因子(CD31、α-SMA)表达量也显著高于海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组、负载PDGF-BB的胶原/壳聚糖支架组和纱布空白组。

在第21d时，所有支架处理组皮肤胶原沉积数量均远超纱布空白组，胶原取向和分布均很有规律，与正常皮肤组织结构无显著差异。

由此可见，本发明制备的海洋生物医用材料具有显著的促进皮肤创伤组织再生与修复的功效。该材料可有效促进细胞增殖、迁移，胶原蛋白和弹性纤维生成，并促进毛细血管新生，还可大幅减少炎症因子生成，加速创面收缩，促进再上皮化及毛囊附属器再生，减少瘢痕形成，有效提高愈合速度和愈合质量。

对比例1

与实施例8相比，除了将胶原替换为丝素蛋白外，其它与实施例8相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架，孔洞分布不均匀、孔径较大(200μm～600μm)，海藻酸钙微球不均匀地分布在孔壁表面，有些甚至发生团聚；压缩模量为(5.95±2.20)MPa；含水量约8.97％±1.52％，孔隙率为95.32％±1.61％，溶胀率为110.35％±5.21％。

该支架与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性略有提高；但与L929成纤维细胞共培养8h时，仍可见较明显的细胞划痕；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量较少。将该支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤的清创后的创面，虽有一定的改善血液循环、促进新生组织形成功效，但其吸收伤口渗液容量有限，提高创面愈合速度、改善愈合质量也不十分明显。

综上，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架相比，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架在理化特性方面虽无显著差异，但在生物活性(促进细胞黏附、增殖、迁移)与促进皮肤创伤组织再生与修复功效方面，均明显不如实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

对比例2

与实施例8相比，除了将羧甲基壳聚糖替换为透明质酸外，其它与实施例8相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架，孔洞分布不均匀、孔径适中(100μm～400μm)，海藻酸钙微球不均匀地分布在孔壁表面；压缩模量为(3.69±1.95)MPa；含水量约11.25％±2.17％，孔隙率为92.98％±1.77％，溶胀率为120.01％±2.98％。

该支架与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成明显；与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性提高明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞划痕几乎消失；但与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量适中。将该支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤的清创后的创面，创面渗液虽可被迅速吸收，但由于支架抑菌功效不显著，无法有效保护创面减少病原菌感染，在减轻炎症反应、提高愈合速率、改善愈合质量方面均表现不佳。

综上，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架相比，本实施方式制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架在理化特性、生物相容性方面虽无显著性差异，但在促进皮肤创伤组织再生与修复功效方面，均明显不如实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

对比例3

与实施例8相比，除了将海藻酸钙微球替换为明胶微球外，其它与实施例8相同。

本实施方式制备的PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架，在三维孔洞分布、力学强度、吸水保湿性、溶胀率方面，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架无差异。但该支架在第2d时释放PDGF-BB速率明显加快，在第3d时释放趋势变缓。

该支架与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性提高明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞划痕几乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量增多；但与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成不明显。将该支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤的清创后的创面，可快速吸收伤口渗液，保护创面减少病原菌感染，但其改善血液循环、促进血管新生效果不明显(可能与其生长因子突释有关)。

综上，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架相比，本实施方式制备的PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架在理化特性方面虽无显著性差异，但在生长因子缓释控制、生物活性(血管形成)与促进皮肤创伤组织再生与修复功效方面，均明显不如实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

对比例4

与实施例8相比，除了将PDGF-BB替换为EGF外，其它与实施例8相同。

本实施方式制备的EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，在三维孔洞分布、力学强度、吸水保湿性、溶胀率、生长因子缓释控制方面，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架无差异。

该支架与L929成纤维细胞共培养48h时，细胞活性提高明显；与L929成纤维细胞共培养8h时，细胞划痕几乎消失；与L929成纤维细胞共培养24h时，细胞黏附数量增多；但与HUVEC细胞共培养6h时，细胞体外血管形成不够明显。将该支架灭菌后，敷于火器伤合并海水浸泡损伤的清创后的创面，可快速吸收伤口渗液，保护创面减少病原菌感染，但其改善血液循环、促进血管新生、减轻炎症反应等效果均不明显。

综上，与实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架相比，本实施方式制备的EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架在理化特性方面虽无显著性差异，但在生物活性(促进血管形成)与促进皮肤创伤组织再生与修复功效方面，均明显不如实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

对比例5

按照实施例13的实验方法，将实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，与对比例1-4中制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架、PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架、EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架，进行功效评价。

研究发现，在第4d时，实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架组伤口愈合率最高(46.11％±5.36％)，高于对比例制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架(38.33％±5.95％)、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架(36.42％±7.36％)、PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架(41.53±7.59％)、EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架(38.21％±6.83％)。

在第7d时，实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组可见成束的胶原以及完整的再生上皮组织，其伤口愈合率也最高(68.46％±5.01％)，高于对比例制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架(58.52％±6.02％)、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架(60.11％±7.23％)、PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架(61.58±5.97％)、EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架(60.88％±8.36％)。此外，实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组的皮肤组织中，炎症因子(IL-6、IL-1β、CD68、iNOS)mRNA、蛋白表达量均显著低于其它组，而血管因子(CD31、α-SMA)均显著高于其它组。

在第14d时，实施例8制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架处理组胶原沉积数量最多，分布最均匀，血管因子(CD31、α-SMA)表达量也显著高于对比例制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/丝素蛋白/壳聚糖支架、PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/透明质酸支架、PDGF-BB@明胶微球/胶原/壳聚糖支架、EGF@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

由此可见，本发明制备的PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架促进皮肤创伤修复功效最佳。

综上所述，本发明制备的海洋生物医用材料具有显著的促进皮肤创伤组织再生与修复的功效。该材料可有效促进细胞增殖、迁移，胶原蛋白和弹性纤维生成，并促进毛细血管新生，还可大幅减少炎症因子生成，加速创面收缩，促进再上皮化及毛囊附属器再生，减少瘢痕形成，有效提高愈合速度和愈合质量。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1. 一种皮肤创伤修复海洋生物医用材料，其特征在于，包含以下原料：海洋鱼皮胶原、羧甲基壳聚糖、海藻酸钙和PDGF-BB；所述的海藻酸钙和PDGF-BB以PDGF-BB@海藻酸钙微球存在，所述的海洋鱼皮胶原、羧甲基壳聚糖和海藻酸钙的质量比为(2.5~7.5):( 15~25):(2.5~10)，所述的海藻酸钙和PDGF-BB的质量比为1:(0.1×10^-5~1.0×10^-5)。

2.根据权利要求1所述的皮肤创伤修复海洋生物医用材料，其特征在于，所述的皮肤创伤修复海洋生物医用材料为支架类材料，其孔径为20 ~500 μm，压缩模量为1.19~11.80MPa，含水量为1.45~15.88%，孔隙率为83.43~95.32%，溶胀率为75.97~139.20%。

3.一种制备权利要求1或2所述的皮肤创伤修复海洋生物医用材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：包括以下步骤：

（1）将胶原溶于乙酸溶液中，配成浓度为0.5%-1.5% w/v的胶原溶液；

（2）将水溶性壳聚糖溶于蒸馏水中，配成浓度为3%-5% w/v的壳聚糖溶液；

（3）将胶原溶液、壳聚糖溶液按等体积比混合后，加入PDGF-BB@海藻酸钙微球，于650~700 rpm进行磁力搅拌，得到混合液；

（4）将混合液加入48孔板中，冻干；

（5）支架脱模后，用EDC/NHS溶液浸泡1~2 h，蒸馏水洗涤2~3次；

（6）冻干，制得皮肤创伤修复海洋生物医用材料，即PDGF-BB@海藻酸钙微球/胶原/壳聚糖支架。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的PDGF-BB@海藻酸钙微球的制备包括如下步骤：

（1）将海藻酸钠溶于蒸馏水，制成浓度为2% w/v的海藻酸钠溶液，按质量比加入PDGF-BB，搅匀制成水相；

（2）取一定体积橄榄油，按1% v/v比例添加吐温80，600~750 rpm搅拌1~2 h，配制成有机相；

（3）取100 mL有机相，650~700 rpm搅拌条件下加入20 mL水相，750 rpm搅拌1h；

（4）加入40 mL 浓度为1% w/v氯化钙溶液，500 rpm搅拌1 h，加入10 mL异丙酮，400rpm搅拌30 min，得到混合液；

（5）混合液6000 rpm离心5~10 min，所得的沉淀分别用异丙酮、蒸馏水交替洗涤2~3次；

（6）冻干，制得PDGF-BB@海藻酸钙微球。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的PDGF-BB@海藻酸钙微球的粒径为30~190 μm，包封率为67.35~76.39%。

6.权利要求1所述的皮肤创伤修复海洋生物医用材料在制备创伤敷料，用于促进皮肤创伤组织的再生与修复的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的皮肤创伤包括烧伤、烫伤、切割伤、交通伤、手术伤、战伤、火器伤合并海水浸泡伤或慢性难愈创伤。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的慢性难愈创伤包括糖尿病性溃疡、炎性溃疡或压力性溃疡。

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