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CN114196622B - 富勒烯及其衍生物在细胞重编中的应用 - Google Patents

富勒烯及其衍生物在细胞重编中的应用 Download PDF

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CN114196622B CN202111537589.5A CN202111537589A CN114196622B CN 114196622 B CN114196622 B CN 114196622B CN 202111537589 A CN202111537589 A CN 202111537589A CN 114196622 B CN114196622 B CN 114196622B
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Abstract

本发明公开了富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用；包括用于细胞重编程效率的提高、干细胞的自我更新能力的增强、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的制备、疾病模型构建、药物筛选，以及在细胞重编程领域、再生医学领域、干细胞治疗、相关疾病的治疗和药物制备中的应用。

Description

富勒烯及其衍生物在细胞重编中的应用
技术领域
本发明涉及再生医学技术领域，具体涉及提高细胞重编程效率及其增强干细胞自我更新能力领域。
背景技术
干细胞的自我更新和多向分化能力使其在组织器官损伤修复、神经系统疾病治疗、自身免疫性疾病治疗等方面具有重要的应用价值。胚胎干细胞(embryonic stemcells,ESCs)是早期胚胎或者原始性腺中分离出来的一种细胞，可分化为多种类型细胞进而产生各种组织器官。由于牵涉伦理问题，ESCs的应用受到了限制。2006年，ShinyaYamanaka研究小组通过逆转录病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4与c-myc(OSKM)四种因子转入小鼠成纤维细胞，成功将其重编程成为具有和ESCs类似功能的诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)，开创了iPSCs研究时代，并因此与John B.Gurdon教授共同获得了2012年诺贝尔生理医学奖。iPSCs为解决干细胞研究相关的伦理等困境提供了一个可替代方法，因此具有更重要的科研价值和更广泛的临床应用前景。目前，iPSCs在再生医学、疾病模型的制作、疾病发生机制的研究、药物筛选等方面均取得了重大进展，且随着iPSCs的研究深入，人们对干细胞自我更新和多能性的调控机制的认知也更加全面，并指导干细胞更高效和更安全的应用。
现今，iPSCs的临床应用仍然面临许多问题，其中iPSCs制备效率低是这一技术应用于生物医学的主要障碍。Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka的OSKM四因子重编程方法效率非常低，小鼠成纤维细胞重编程效率仅为0.1％，而人成纤维细胞重编程的效率只有0.01％。因此人们一直致力于寻找新的方法来提高重编程效率，缩短重编程时长，并提高其应用安全性。多种提高iPS诱导效率的方法有助于突破iPS技术应用中遇到的瓶颈。目前人们发现一些小分子化合物，例如表观遗传学调节剂(组蛋白去乙酰化酶抑制剂VPA、G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294等)、相关信号通路调节剂(Notch、TGF通路抑制剂等)、iPSCs相关激酶与代谢通路调节剂、维生素C、维持自我更新小分子等，能有效促进细胞重编程进程，提高重编程效率，且大多小分子的使用伴随诱导iPS整个过程。
纳米科学与生物医学的结合已迅速发展成为新的科学研究前沿和热点。由于纳米材料具有很好的可塑性、溶解性、靶向性与生物相容性，且成本更低，因此基于纳米材料开发新的提高重编程效率与安全性的方法逐渐受到人们广泛关注。纳米材料独特的理化性质使其更多的被研究用于靶向和输送载体进而提高iPSCs的安全性，例如用于OSKM四因子输送载体的磷酸钙纳米粒子和G4Arg纳米材料。Daniel Gallego-Perez等人利用纳米技术开发了一种纳米芯片，能结合电场作用将基因转染至体细胞内使其进行重编程。三维培养体系和一定特征的培养基能显著影响重编成过程，而纳米材料在优化三维培养材料和基底材料并提高重编程效率方面具有巨大优势。目前，纳米材料作为一种调节剂用于提高重编程效率的研究还很少。
富勒烯C60在干细胞研究与治疗领域以及细胞重编程领域具有巨大的应用前景。富勒烯C60的超对称结构、丰富的π键电子云等独特的理化性质引起了生物医学领域研究人员的极大兴趣，并开展了大量研究工作。在安全性方面，大量的研究显示富勒烯C60具有很好的生物相容性，能穿过组织屏障并进入细胞，不会引起大鼠体内急性与亚急性毒性，并能逐渐被排出体外。富勒烯C60良好的安全性使其在生物医学领域的潜在应用价值逐渐被发掘，例如癌症治疗、延长小鼠寿命、提高学习与记忆能力、靶向输送等。富勒烯C60在生物体内引发的生物学效应研究对于其在生物医学领域新的功能的开发具有极为重要的指导意义。富勒烯C60引发的生物学过程如细胞内氧自由基调控、抗衰老、细胞自噬等均与细胞重编程以及干细胞生存和分化密切相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效稳定、快速、安全且成本低的提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)诱导效率的方法，及其在干细胞治疗和再生医学相关疾病治疗药物制备中的应用。
本发明是通过以下的技术方案来实现的。
本发明提供一种纳米材料富勒烯及其衍生物在提高细胞重编程效率中的应用。本发明利用富勒烯C60开发一种显著提高细胞重编程效率的新方法。富勒烯C60仅处理OSKM转入的MEF细胞3天，即能显著提高iPS诱导效率，可以缩短整个干细胞和再生医学治疗过程，为临床上个性化干细胞治疗的研究提供了一个新的思路，同时为推动富勒烯C60更加安全有效的用于细胞重编程领域、再生医学领域、疾病的治疗和药物开发等提供了一定的理论依据和参考。
本发明提供一种纳米材料富勒烯及其衍生物在制备iPSCs中的应用；更为具体的为富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用，包括对于利用富勒烯及其衍生物制备多能干细胞和利用富勒烯及其衍生物生产制备用于培养或诱导多能干细胞的试剂或药品等组合物；所述的富勒烯及其衍生物用于提高细胞重编程效率和/或增强干细胞的自我更新能力。
优选地；所述的细胞重编程为转录因子诱导性多能干细胞。
优选地；所述的诱导性多能干细胞为利用重编程因子Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc诱导而成的诱导性多能干细胞。体细胞重编程是将终末分化的体细胞重新回复到类似于胚胎干细胞的多向分化能力的状态。目前细胞重编程的技术主要为体细胞核移植、细胞融合、细胞质孵育、诱导多能干细胞等。其中细胞融合技术产生的四倍体细胞难以应用于临床，因此该技术没有得到推广。而Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka的OSKM四因子重编程方法，不仅能将体细胞重编程为胚胎干细胞样细胞(诱导性多能干细胞，iPSCs)，同时解决了其他重编程方法中细胞来源的伦理问题、免疫排斥问题，克服了宗教和法律等多项限制，在干细胞领域具有极大的研究和应用前景。具体亦可参见文献：Cell,2006,126(4):663–676；Cell,2007,131(5):861–872.；CellStemCell,2009,5(2):135–138。因此可以推断，富勒烯可以对不同技术手段所获得的多能干细胞有相同的作用。
优选地；所述富勒烯及其衍生物由如下方法制备而成：将富勒烯粉末溶于THF溶液中，在搅拌过程加入等体积的水；利用旋转蒸发仪蒸发去除THF及其部分水，至富勒烯及其衍生物浓度40μg/mL。对于水溶性的富勒烯衍生物，可直接溶解于水中获得富勒烯衍生物水溶液。
优选地；所述的富勒烯及其衍生物为C60富勒烯、C70富勒烯、C84富勒烯、C78富勒烯、C76富勒烯中的一种或多种。
优选地；所述的富勒烯及其衍生物为单金属富勒烯、双金属富勒烯、氮化物富勒烯、碳化物富勒烯中的一种或多种。
优选地；所述的富勒烯及其衍生物为羟基化富勒烯、羧基化富勒烯、氨基富勒烯、PEG-富勒烯中的一种或者多种。
结合过往文献(S Zeinab Mousavi,Shohreh Nafisi,Howard IMaibach.Fullerene nanoparticle in dermatological and cosmeticapplications.Nanomedicine.2017,13(3):1071-1087.Gordana AleksandarCarbon nanomaterials:Biologically active fullerene derivatives.SrpArh Celok Lek.2016,144(3-4):222-231.)可知；富勒烯是一类由五元环、六元环等组成的封闭全碳且空心的笼形结构，具有较强的电子亲和性和稳定性，在超导、光学、生物医学、催化等领域均有极大的应用价值。富勒烯包括不同尺寸大小、且物理和化学性质极为相近的富勒烯结构，如C60、C70、C84等。富勒烯空心的笼子里面还有一个独特的位置可供原子占位，在笼内置入其他原子(富勒烯衍生物:内嵌富勒烯)，置入的原子对富勒烯的物理化学性质的影响微妙，但是程度很小。内嵌富勒烯目前有单金属富勒烯、双金属富勒烯、氮化物富勒烯、碳化物富勒烯等。在生物医学应用中，由于富勒烯不溶于水，因此可以通过在其表面增加官能团增强其溶解性(富勒烯衍生物)，如羟基化富勒烯(如C60(OH)n)、羧基化富勒烯、氨基富勒烯、PEG-富勒烯等。
本发明还提供一种制备诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)制备水相悬浮的富勒烯纳米材料溶液；
(2)制备诱导性多能干细胞：将步骤(1)所获得的富勒烯纳米材料溶液加入到诱导性多能干细胞培养体系的培养基中。
优选地，所述的方法包括以下具体步骤：
(1)制备富勒烯C60纳米材料水溶液
取C60粉末置入未开封过的500mL四氢呋喃(THF)有机溶液中，在室温下密封避光搅拌24h后，用0.45μm的膜过滤掉未溶解的C60颗粒；将过滤后的溶液放置在搅拌器上搅拌，同时以1L/min的速度加入同体积的超纯水，混合后的溶液为黄色富勒烯纳米晶体(C60纳米晶体)水相悬浮液，搅拌进行5min，充分混合后，用旋转蒸发仪在55℃将溶液中的THF蒸发掉，再将温度调至80℃蒸发除去多余的水分，使C60纳米晶体水相悬浮液浓缩至50mL。浓度约为40μg/mL。水溶性的富勒烯衍生物C60(OH)n粉末可溶于水形成相应的水溶液。
(2)制备诱导性多能干细胞
将原代OG2MEF细胞(GFP-OCT4的MEF细胞)按一定的密度接种于细胞培养皿中，通过Yamanaka诱导法将Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc(OSKM)四种因子通过病毒转染法将其转入OG2 MEF细胞中，转染当天为iPSCs诱导实验第0天。培养条件为37℃，5％CO2。在iPSCs诱导第3天开始，加入富勒烯C60或其衍生物(1-5μg/mL)，每天换液(含富勒烯C60或其衍生物的培养基)，处理原代MEF细胞3天。第6天将处理的细胞转移至滋养层细胞上，每天换液(不含富勒烯的培养基)，第8到14天即可观察到类似ESCs形态的iPSCs克隆。
本发明的有益技术效果在于：发现了富勒烯在诱导iPSCs过程中，能够显著的增加阳性克隆效率，同时还能够提高细胞重编程效率和/或增强干细胞的自我更新能力。
附图说明
图1为水相富勒烯水溶液和SEM表征图；
图2为纳米材料进入小鼠胚胎成纤维细胞生物电镜图；
图3为富勒烯Nano C60及其衍生物C60(OH)n显著提高iPSCs诱导效率图；
图4为iPSCs诱导过程中干细胞标志物GFP-OCT4表达情况图；
图5为iPSCs诱导过程中克隆形成情况图；
图6为iPSCs诱导第16天克隆形成情况与OCT4表达情况图；
图7为富勒烯衍生物C60(OH)n对干细胞克隆形成的影响；
图8为低浓度富勒烯衍生物C60(OH)n减缓EB生长情况图；
图9为富勒烯Nano C60及其衍生物C60(OH)n对干细胞活性的影响；
图10为富勒烯处理后获得的iPSCs的干细胞标志物表达情况；
图11为富勒烯处理后获得的iPSCs体内三胚层分化能力。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种纳米材料富勒烯及其衍生物在细胞重编程效率的提高、干细胞的自我更新能力的增强、诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)的制备，以及在干细胞治疗和再生医学领域相关疾病治疗药物的制备中的应用。具体地，将无修饰的富勒烯C60通过THF溶剂置换法合成由多个C60组成的稳定的水相悬浮的富勒烯C60纳米材料；将水溶性的富勒烯C60衍生物羟基化富勒烯C60(富勒醇C60(OH)n)直接溶于水，制备其水溶液；本发明制备的富勒烯及其衍生物纳米材料可用于提高细胞重编程效率、促进干细胞自我更新能力、iPSCs的制备等。在此基础上完成了本发明。
本发明提供的方法，可由不同种类的富勒烯及其衍生物完成；可作用于的重编程方法，基于Yamanaka的OSKM四因子重编程方法，或者其他三因子、二因子重编程方法，以及其他重编程方法；可作用于多种成体细胞(皮肤细胞、血细胞等)并提高其重编程效率，也可以作用于多种干细胞并增强其自我更新能力，从而能更加高效、安全获得更多的iPSCs，并应用于疾病模型的构建、药物筛选，以及在细胞重编程领域、再生医学领域、干细胞治疗、相关疾病的治疗和药物的制备。
本发明实施例的应用，所述纳米材料包含无修饰的富勒烯C60与羟基化富勒烯C60(富勒醇C60(OH)n)。
本发明实施例的应用，所述无修饰的富勒烯C60和C60(OH)n的合成方法为：
取C60粉末置入未开封过的500mL四氢呋喃(THF)有机溶液中，在室温下密封避光搅拌24h后，用0.45μm的膜过滤掉未溶解的C60颗粒；将过滤后的溶液放置在搅拌器上搅拌，同时以1L/min的速度加入同体积的超纯水，混合后的溶液为黄色富勒烯纳米晶体(C60纳米晶体)水相悬浮液，搅拌进行5min，充分混合后，用旋转蒸发仪在55℃将溶液中的THF蒸发掉，再将温度调至80℃蒸发除去多余的水分，使C60纳米晶体水相悬浮液进行浓缩。浓度约为40μg/mL。水溶性的富勒烯衍生物C60(OH)n粉末可溶于水形成相应的水溶液。
应理解，虽然本发明实施例中的富勒烯及其衍生物为富勒烯C60和C60(OH)n，但是，也可以为其他类型的富勒烯及其衍生物，例如C70、C84、羧基化富勒烯C60、内嵌金属富勒烯等，也可以是多种类型富勒烯混合物。虽然本发明实施例中的富勒烯水相悬浮液的合成方法使用的是THF溶剂置换法，也可以是其他有机溶剂置换法，也可以是其他将其稳定悬浮于水中的合成方法。
本发明实施例的应用，所述富勒烯C60及其衍生物作用于Yamanaka的OSKM四因子重编程过程并提高重编程效率的方法为：
将原代OG2MEF细胞按一定的密度接种于细胞培养皿中，通过Yamanaka诱导法将Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc转染至MEF细胞中，转染当天为iPSCs诱导实验第0天，第6天将细胞转移至滋养层细胞上，第8到14天即可观察到类似ESCs形态的iPSCs克隆。在iPSCs诱导实验第3天开始，加入不同浓度的富勒烯C60及其衍生物，仅处理原代MEF细胞3天，之后第6天将细胞转移至滋养层细胞上，观察iPSCs克隆形成情况，分析iPSCs诱导效率。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，1-40wt％)的本发明的纳米材料或者其作用后获得的iPSCs，以及药学上可接受的载体、小分子、或者药物等。
通常，可将本发明的富勒烯及其衍生物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的纳米材料或者其作用后获得的iPSCs以及药学上可接受的载体、小分子或者药物等。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
iPSCs的临床应用仍然面临许多问题，其中iPSCs制备效率低是这一技术应用于生物医学的主要障碍。Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka的OSKM四因子重编程方法效率非常低，小鼠成纤维细胞重编程效率仅为0.1％，而人成纤维细胞重编程的效率只有0.01％。因此人们一直致力于寻找新的方法来提高重编程效率，缩短重编程时长，并提高其应用安全性。
本发明的目的在于提供一种更加简单、快速、高效、安全的提高细胞重编程效率的方法，富勒烯及其衍生物处理OSKM转入的成体细胞3天，之后撤去富勒烯及其衍生物，即能显著提高iPS诱导效率，可以缩短整个干细胞和再生医学治疗过程，尽力保证了产生的iPSCs的安全性，突破了上述方法的局限性，进一步丰富了提高细胞重编程效率的方法。且本发明方法是基于纳米材料开发的方法，能大规模生产和长时间保持，可实现精确的位点修饰和标记，具有很好的稳定性，对运输条件要求宽松，同时其免疫原性小、组织渗透性好等。该发明进一步加速了提高细胞重编程效率的药物成药过程。
本发明提供的富勒烯及其衍生物提高细胞重编程效率的方法，为临床上个性化干细胞治疗的研究提供了一个新的方法，同时提供了一种富勒烯C60更加安全有效地在iPSCs制备、疾病模型构建、药物筛选、细胞重编程领域、干细胞治疗、再生医学领域相关疾病的治疗和药物开发等中的应用。
以下通过具体较佳实施例结合附图对本发明的应用作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
1)富勒烯及其衍生物水溶液制备、表征以及进细胞能力鉴定
合成的稳定悬浮于水中的纳米材料水溶液图片(图1左)和SEM图片(图1右)表明，分散于水中的富勒烯C60纳米材料粒径大小为100nm左右(由多个C60形成的纳米结构)。羟基化富勒烯C60(富勒醇C60(OH)n)为水溶性富勒烯衍生物，由单个C60结构表面修饰多个羟基基团形成。细胞生物电镜(TEM)实验结果表明，富勒烯C60纳米材料能进入小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞(图2右图的左上箭头所示黑色斑点)。
2)富勒烯及其衍生物提高细胞重编程效率能力分析
在iPS诱导过程中，根据MEF细胞中iPSC克隆形成情况(图3)以及干细胞标志物GFP-OCT4表达情况(图4)，发现富勒烯C60及其衍生物能显著增加iPSC克隆数目，提高重编程效率，并具有一定的浓度梯度效应。
3)富勒烯及其衍生物推进细胞重编程进程能力分析
在iPS诱导过程中，根据MEF细胞中iPSC克隆形成情况(图5，左侧为具体图片右侧为统计结果)以及GFP-OCT4表达情况(图6)，发现富勒烯C60及其衍生物处理组更早出现细胞克隆，以及表达OCT4的iPSC克隆，且克隆尺寸显著大于对照组。该结果表明富勒烯及其衍生物具有显著推进细胞重编程进程的能力。
4)富勒烯及其衍生物对干细胞自我更新能力和增殖能力影响分析
图8中A，EB悬滴培养第7天后显微镜观察拍照；B是A的EB大小的统计分析，即抑制干细胞分化。通过克隆形成实验(图7)、EB体外分化(图8)与细胞增殖实验(图9为富勒烯Nano C60(A)及其衍生物C60(OH)n(B)对干细胞活性的影响)分析发现富勒烯C60及其衍生物处理后干细胞克隆数目显著增多、EB分化缓慢，而干细胞增殖能力无显著变化，表明富勒烯C60及其衍生物对干细胞自我更新能力具有一定的促进作用，但是对干细胞增殖能力无显著影响。
5)富勒烯及其衍生物处理产生的iPSCs的鉴定以及多能性分析
通过干细胞标志物分析(图10)、畸胎瘤实验(图11)对富勒烯C60及其衍生物处理后获得的iPSC细胞系进行鉴定以及多能性分析，发现富勒烯C60及其衍生物处理后获得的iPSC细胞系具有一定的干细胞特性，并具有很好的多向分化能力。
本发明的主要优点包括：
1)本发明中所用的富勒烯及其衍生物制备条件和步骤简单，易于操作和人工化改造，具有产业化合成的前景；
2)本发明中所用的富勒烯及其衍生物可实现精确的位点修饰和标记，具有很好的稳定性，对运输条件要求宽松，同时其免疫原性小、组织渗透性好等。
3)本发明中所开发的富勒烯及其衍生物提高细胞重编程的方法，作用时间非常短暂(仅作用于成体细胞小于或等于3天)即能产生很好的提高重编程效率的能力。
4)本发明中开发的方法极大缩短了整个干细胞和再生医学治疗过程，以及提高重编程效率的药物成药过程，用于iPSCs制备、疾病模型构建、药物筛选以及干细胞治疗或再生医学相关疾病的治疗等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
制备富勒烯C60纳米材料水溶液：取C60粉末置入未开封过的500mL四氢呋喃(THF)有机溶液中，在室温下密封避光搅拌24h后，用0.45μm的膜过滤掉未溶解的C60颗粒；将过滤后的溶液放置在搅拌器上搅拌，同时以1L/min的速度加入同体积的超纯水，混合后的溶液为黄色富勒烯纳米晶体(C60纳米晶体)水相悬浮液，搅拌进行5min，充分混合后，用旋转蒸发仪在55℃将溶液中的THF蒸发掉，再将温度调至80℃蒸发除去多余的水分，使C60纳米晶体水相悬浮液浓缩。浓度约为40μg/mL。水溶性的富勒烯衍生物C60(OH)n粉末可溶于水形成相应的水溶液。
以THF溶剂替换法制备了水相悬浮的富勒烯C60纳米材料(图1左)，通过HPLC的方法鉴定了其溶液浓度约为40μg/mL，通过扫描电镜(SEM)鉴定其粒径大小为100nm左右(图1右)(由多个C60形成的纳米结构)。羟基化富勒烯C60(富勒醇C60(OH)n)为水溶性富勒烯衍生物，由单个C60结构表面修饰多个羟基基团形成。C60(OH)n水溶液用于后续实验。为了获得原代MEF细胞用于后续iPSCs诱导实验，将OCT4启动子驱动GFP报告基因转基因(OG2)小鼠(雄性)和野生型C57小鼠(雌性)交配，雌鼠怀孕后12.5天分离胎鼠的OG2MEF原代细胞并进行扩大培养，细胞长满后可直接用于iPSCs诱导实验。通过TEM电镜分析，发现富勒烯C60纳米材料能进入原代MEF细胞(图2)。
实施例2
将原代OG2 MEF细胞按一定的密度接种于细胞培养皿中，通过Yamanaka诱导法(Cell,2006,126(4):663-676.)将Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc转染至MEF细胞中，转染当天为iPSCs诱导实验第0天，第6天将细胞转移至滋养层细胞上，第8到14天即可观察到类似ESCs形态的iPSCs克隆。在iPSCs诱导实验第3天开始，加入不同浓度的富勒烯C60及其衍生物，处理原代MEF细胞3天后，第6天将细胞转移至滋养层细胞上，观察iPSCs克隆形成情况，分析iPSCs诱导效率。更具体操作可以为：制备诱导性多能干细胞；将原代OG2 MEF细胞(GFP-OCT4的MEF细胞)按一定的密度接种于细胞培养皿中，通过Yamanaka诱导法将Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc(OSKM)四种因子通过病毒转染法将其转入OG2 MEF细胞中，转染当天为iPSCs诱导实验第0天。培养条件为37℃，5％CO2。在iPSCs诱导第3天开始，加入富勒烯C60或其衍生物(1-5μg/mL)，每天换液(含富勒烯C60或其衍生物的培养基)，处理原代MEF细胞3天。第6天将处理的细胞转移至滋养层细胞上，每天换液(不含富勒烯的培养基)，第8到14天即可观察到类似ESCs形态的iPSCs克隆。
通过AP染色与克隆观察(图3)以及干细胞标志物OCT4表达情况(图4中灰色部分)，发现无修饰的水相悬浮的富勒烯C60纳米材料与羟基化修饰的富勒烯C60(OH)n均能显著增加克隆数目，提高iPSCs诱导效率，并具有一定的浓度梯度效应。在多种诱导条件尝试与摸索中，我们发现低浓度的富勒烯C60(1μg/mL)在诱导实验第三天开始连续处理3天MEF细胞即能显著提高诱导效率。
实施例3
在诱导过程中，第6天将处理的MEF细胞转移至滋养层细胞上，第7天开始观察iPSCs克隆形成情况(图5)，发现C60(OH)n能显著促进iPSCs克隆的形成，且克隆尺寸显著大于对照组。为了进一步分析富勒烯促进诱导过程的能力，降低侵染原代MEF细胞的包装了四因子的病毒滴度，减缓诱导过程以便于进一步观察。通过干细胞标志物OCT4表达情况，发现C60(OH)n处理组MEF细胞形态改变快于对照组(图5)，且更先表达OCT4蛋白(图6)。以上结果表明富勒烯C60具有促进细胞重编程进程的作用。
实施例4
富勒烯C60及其衍生物对重编程进行具有一定的促进作用，然而对重编程后产生的干细胞自我更新能力和增殖能力的影响还不是很清楚。根据文献(J Orthop Res 2012,30(7):1051-1057.)显示，富勒烯C60具有抑制干细胞分化的能力。在胚胎干细胞E14培养过程中，发现C60(OH)n处理的干细胞克隆数目显著高于对照组(图7A和B；A是干细胞克隆形成情况显微镜观察；B是A图克隆数目统计；C是A图克隆大小分析)，而克隆的大小无显著性差异(图7C)。将iPSCs与C60-iPSCs消化成单细胞后加入EB培养基，悬滴培养7天后收集EB，通过显微镜观察EB大小与形态差异，发现C60(OH)n能显著减缓EB分化生长(图8)。这些数据表明富勒烯C60及其衍生物能显著促进干细胞的自我更新能力。通过CCK8细胞活性实验(图9)，发现富勒烯C60及其衍生物对干细胞增殖能力无显著影响。
实施例5
将iPSCs诱导过程中无处理(对照组)和低浓度羟基化富勒烯C60处理产生的iPSCs进行细胞系构建。在iPSCs诱导第10-14天，挑取iPSCs诱导中对照组和富勒烯C60处理组GFP阳性的iPSCs单克隆，消化成单细胞后，转移至预先铺好滋养层细胞的24孔板中，随后进行扩大培养并建立iPSCs细胞系(iPSCs和C60-iPSCs)，大概传4-6代后，用于后续的实验。C60-iPSCs细胞系与对照组均表达干细胞特异性标志物蛋白(图10)。为了进一步分析iPSCs与C60-iPSCs多向分化能力，将iPSCs与C60-iPSCs单细胞悬液注射至裸鼠皮下，定期观察小鼠畸胎瘤大小，发现iPSCs与C60-iPSCs细胞系均能在体内形成畸胎瘤。通过免疫组化分析(图11)，发现两组的畸胎瘤均具有分化成三胚层的能力。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
在本发明中，发明人以富勒烯C60与其衍生物C60(OH)n以及Yamanaka的四因子细胞重编程方法为例，说明低浓度的富勒烯及其衍生物作用于成体细胞小于或等于3天即能显著提高重编程效率、推进重编程进程，并稳定、高效、安全获得iPSCs。该方法提供了一种通过短暂在重编程起始阶段作用的纳米材料来加速细胞重编程效率的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用；所述的细胞重编程为转录因子诱导性多能干细胞；所述的富勒烯及其衍生物为 C60 富勒烯、羟基化富勒烯 C60(OH)n 中的一种或多种。
2.如权利要求 1 所述的富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用，其特征在于：所述的富勒烯及其衍生物用于提高细胞重编程效率。
3.如权利要求 1 所述的富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用，其特征在于：所述的诱导性多能干细胞为利用重编程因子 Oct4、Klf4、Sox2 和 c-Myc 诱导而成的诱导性多能干细胞。
4.如权利要求 1 所述的富勒烯及其衍生物在细胞重编程中的应用，其特征在于：所述富勒烯及其衍生物由如下方法制备而成：将富勒烯粉末溶于 THF 溶液中，在搅拌过程加入等体积的水；利用旋转蒸发仪蒸发去除 THF 及其部分水，至富勒烯及其衍生物浓度 40 μg/mL。
5.一种制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）制备水相悬浮的富勒烯纳米材料溶液；所述的富勒烯纳米材料为 C60 富勒烯纳米材料、羟基化富勒烯 C60(OH)n 纳米材料中的一种或多种的；（2）制备诱导性多能干细胞：将步骤（1）所获得的富勒烯纳米材料溶液加入到诱导性多能干细胞培养体系的培养基中。
6.如权利要求 5 所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：（1）制备水相悬浮的富勒烯纳米材料溶液：取富勒烯 C60 粉末置入未开封过的 500 mL 四氢呋喃有机溶液中，在室温下密封避光搅拌 24 h 后，用 0.45 µm 的膜过滤掉未溶解的富勒烯C60 颗粒,将过滤后的溶液放置在搅拌器上搅拌，同时以 1 L/min 的速度加入同体积的超纯水，混合后的溶液为黄色富勒烯纳米晶体，获得富勒烯 C60 纳米晶体水相悬浮液，搅拌进行 5min，充分混合后，用旋转蒸发仪在 55℃将溶液中的 THF 蒸发掉，再将温度调至 80℃蒸发除去多余的水分，至浓度为 40 μg/mL,获得富勒烯 C60 纳米材料溶液；或者，将水溶性的富勒烯 C60 衍生物，将其直接溶于超纯水中，获得富勒烯 C60 纳米材料溶液；（2）制备诱导性多能干细胞：将原代 GFP-OCT4 的 MEF 细胞接种于细胞培养皿中，通过 Yamanaka诱导法将 Oct4、Klf4、Sox2 和 c-Myc（OSKM）四种因子通过病毒转染法将其转入细胞中获得iPSCs；转染当天为 iPSCs 诱导实验第 0 天；培养条件为 37 摄氏度，5% CO 2 ；在 iPSCs诱导第 3 天开始，加入由步骤（1）所获得的富勒烯 C60 纳米材料溶液至浓度为 1-5 μg/mL；每天更换含 1-5 μg/mL 富勒烯 C60 纳米材料溶液的培养基，处理原代MEF 细胞 3天；第 6 天将处理的细胞转移至滋养层细胞上，每天更换不含富勒烯的培养基，第8到14天即可获得类似ESCs形态的iPSCs克隆。
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