CN114106177A - Cd22抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种能够特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段。该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～15，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:16～30。该抗体能够特异性识别CD22，与CD22的亲和力高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及CD22抗体及其应用，更具体地，本发明涉及能够特异性识别CD22抗体或其抗原结合片段、核酸分子、表达载体、重组细胞、嵌合抗原受体、CART细胞、药物组合物、制药用途以及检测CD22的试剂盒。
背景技术
血液肿瘤是中国十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤发病率的第六位。尤其是急性淋巴细胞白血病多发于青少年，是35岁以下人群发病率、病死率最高的恶性肿瘤，其中B-ALL(急性B淋巴细胞白血病)最为常见。
CD22为Ⅰ型跨膜糖蛋白，是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族成员。作为B细胞受体(BCR)的抑制性共受体，CD22对B细胞激活信号具有负性调节作用。CD22能够与包含α-2,6连接唾液酸的糖蛋白配体特异性结合，抗原激活BCR，也使CD22胞质区免疫受体酪氨酸抑制基序中的酪氨酸迅速磷酸化，并激活下游信号分子抑制钙离子内流而减弱BCR信号。CD22参与B细胞的归巢过程。因CD22相对特异地表达于B细胞表面，已成为调节B细胞免疫及治疗某些B细胞肿瘤的良好靶标。
CD22分子量为140kDa，CD22的胞外域包含七个Ig域(residues 20–687AA)，最远端的V-set Ig域在结合α2,6唾液酸(α2,6sia)配体中起主要作用，相连的C2-set Ig域的功能可能是允许V-set Ig域正确折叠。CD22的胞内域包括免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。Ig样结构域1和2包含配体结合区；当六个保守的酪氨酸残基中的一个或多个被磷酸化时，各种效应分子被募集到胞质域。CD22α(647aa)和CD22β(847aa)是CD22的两种亚型，其胞外域分别有5个和7个Ig域，这两种cDNA亚型来源于同一基因的不同拼接。
有研究表明，大约90％的R/R B-ALL病人在接受CART19后获得完全缓解(CR)，尽管有起始响应率很高，但是很多病人出现复发，超过30％的使用Blinatumomab治疗的复发的病人和超过60％的使用过CAR-T19的复发病人为CD19抗原靶点丢失，致使CD19特异性免疫疗法无法识别恶性细胞。这些现象同时也解释了抗原特异性免疫疗法的优势与劣势。而CD22在B-ALL肿瘤和淋巴起始细胞，以及在CART19疗法后CD19阴性复发细胞中都有表达，因此CD22无论是作为单独治疗B细胞系白血病的治疗靶点，还是作为CD19的辅助靶点，都具有良好的使用前景；又因为CART细胞制备成本低，可以立即应用于患者的治疗。
鉴于此，本领域急需发明一种靶向CD22的通用型CART细胞。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种针对CD22的特异性抗体以及靶向CD22的通用型CART细胞。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种能够特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～15，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:16～30。根据本发明实施例的抗体能够特异性识别CD22，与CD22的亲和力高。
GYSITSGYY(SEQ ID NO:1)。
ISYDGSN(SEQ ID NO:2)。
TK(SEQ ID NO:3)。
GYNFTSYW(SEQ ID NO:4)。
IYPGSGNT(SEQ ID NO:5)。
AR(SEQ ID NO:6)。
GYTFSSYW(SEQ ID NO:7)。
ILPGSGST(SEQ ID NO:8)。
AR(SEQ ID NO:9)。
GYTFTDSI(SEQ ID NO:10)。
FYPGSGSI(SEQ ID NO:11)。
ARHE(SEQ ID NO:12)。
GYTFSSYW(SEQ ID NO:13)。
IYPSDSYT(SEQ ID NO:14)。
TR(SEQ ID NO:15)。
GNIHNY(SEQ ID NO:16)。
NAK(SEQ ID NO:17)。
QHFWSTP(SEQ ID NO:18)。
GNIHNY(SEQ ID NO:19)。
NAK(SEQ ID NO:20)。
QHFWSTP(SEQ ID NO:21)。
ENIYSY(SEQ ID NO:22)。
NAK(SEQ ID NO:23)。
QHHYGSP(SEQ ID NO:24)。
SSVNY(SEQ ID NO:25)。
YTS(SEQ ID NO:26)。
QQFTSSP(SEQ ID NO:27)。
KTISKY(SEQ ID NO:28)。
SGS(SEQ ID NO:29)。
QQHNEYPW(SEQ ID NO:30)。
根据本发明的实施例，上述抗体或其抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ IDNO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:13、14和15或者与SEQID NO:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:16、17和18或者与SEQ IDNO:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:19、20和21或者与SEQ ID NO:19、20和21具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:22、23和24或者与SEQ ID NO:22、23和24具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:25、26和27或者与SEQ ID NO:25、26和27具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:28、29和30或者与SEQ ID NO:28、29和30具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别CD22的胞外区。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链框架区序列和轻链框架区序列的至少之一，所述重链框架区序列根据本发明的实施例和轻链框架区序列的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：31～35任一项所示氨基酸序列的重链可变区。
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCTKGGYGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:31)。
QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTSYWINWVKLRPGQGLEWIGDIYPGSGNTNYNEKFKSKATLTVDTSSTTAYMQLSSLASEDSALYYCARRGYLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:32)。
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLFYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:33)。
KVQLQQSGAGLVKPGASVKLSCKASGYTFTDSILHWLMQRSGQGLEWIGWFYPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAFYFCARHEDGYDGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:34)。
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFSSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTREGHYYGSFGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:35)。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO：36～40任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:36)。
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLTINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:37)。
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:38)。
ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIFWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPFTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:39)。
DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKTISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:40)。
根据本发明的实施例，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的实施例，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1，2或4。进而所述抗体的免疫原性可以得到有效降低。
其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:31和36表示抗体FC2-117的重链可变区和轻链可变区，上述SEQ ID NO:32和37表示抗体FC2-070的重链可变区和轻链可变区，上述SEQ IDNO:33和38表示抗体FC2-153的重链可变区和轻链可变区，上述SEQ ID NO:34和39表示抗体FC2-201的重链可变区和轻链可变区，上述SEQ ID NO:35和40表示抗体FC2-203的重链可变区和轻链可变区。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体。
根据本发明的实施例，所述抗体具有SEQ ID NO:41～50所示的氨基酸序列。
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPPTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCTKGGYGYYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:41)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLTINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTSYWINWVKLRPGQGLEWIGDIYPGSGNTNYNEKFKSKATLTVDTSSTTAYMQLSSLASEDSALYYCARRGYLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:42)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLFYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:43)
ENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIFWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSKVQLQQSGAGLVKPGASVKLSCKASGYTFTDSILHWLMQRSGQGLEWIGWFYPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAFYFCARHEDGYDGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:44)
DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKTISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFSSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTREGHYYGSFGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:45)
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITSGYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLKLNSVTTEDTATYYCTKGGYGYYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:46)
QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTSYWINWVKLRPGQGLEWIGDIYPGSGNTNYNEKFKSKATLTVDTSSTTAYMQLSSLASEDSALYYCARRGYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLTINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:47)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLFYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGSPLTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO:48)
KVQLQQSGAGLVKPGASVKLSCKASGYTFTDSILHWLMQRSGQGLEWIGWFYPGSGSIKYNEKFKDKATLTADKSSSTVYMELSRLTSEDSAFYFCARHEDGYDGFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPAIMSASLGEKVTMSCRASSSVNYIFWYQQKSDASPKLWIYYTSNLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSMEGEDAATYYCQQFTSSPFTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:49)
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其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:41或46所示氨基酸序列的抗体被称为FC2-117单链抗体，上述SEQ ID NO:42或47所示氨基酸序列的抗体被称为FC2-070单链抗体，上述SEQ ID NO:43或48所示氨基酸序列的抗体被称为FC2-153单链抗体，上述SEQ ID NO:44或49所示氨基酸序列的抗体被称为FC2-201单链抗体，上述SEQ ID NO:45和50所示氨基酸序列的抗体被称为FC2-203单链抗体。其中，SEQ ID NO:41～45所示氨基酸序列的抗体从N端到C端可表示为VL-Link-VH(VL表示轻链可变区，VH表示重链可变区，Link表示连接VL和VH的连接链)，SEQ ID NO:46～50所示氨基酸序列的抗体从N端到C端可表示为VH-Link-VL(VL表示轻链可变区，VH表示重链可变区，Link表示连接VL和VH的连接链)。
根据本发明的实施例，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸分子所编码的抗体或抗原结合片段可特异性靶向结合CD22，亲和力高。
根据本发明的实施例，上述核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
根据本发明的实施例，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:51～55任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:56～60任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:61～70任一项所示核苷酸序列。
GATGTACAGCTTCAGGAGTCAGGACCTGGCCTCGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCTCTCACCTGCTCTGTCACTGGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTACTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAATGGATGGGCTACATAAGCTACGACGGTAGCAATAACTACAACCCATCTCTCAAAAATCGAATCTCCATCACTCGTGACACATCTAAGAACCAGTTTTTCCTGAAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCTACATATTACTGTACAAAAGGGGGCTACGGCTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:51)
CAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAACTTCACCAGCTACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTATCCTGGTAGTGGTAATACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACACATCCTCCACCACAGCCTACATGCAACTTAGTAGCCTGGCCTCTGAGGACTCTGCTCTCTATTACTGTGCAAGACGGGGGTATCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:52)
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATGGGGGCAGCTCGGGCTTTTTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ IDNO:53)
AAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGGGCTGGTGAAACCCGGGGCATCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTCTATTTTACACTGGCTAATGCAGAGATCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGGTGGTTTTACCCTGGAAGTGGTAGTATAAAGTACAATGAGAAATTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCGGACAAGTCCTCCAGCACAGTCTATATGGAGCTTAGTAGATTGACATCTGAAGACTCTGCGTTCTATTTCTGTGCAAGGCACGAAGATGGTTACGACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:54)
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CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTACTGGCTACACATTCAGTAGCTACTGGATAGAGTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTACCTGGAAGTGGTAGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGATGGGGGCAGCTCGGGCTTTTTTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTATGGTAGTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG(SEQ ID NO:68)
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CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGCAGCTACTGGATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAAATATTTATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCCGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGAGGGGCATTACTACGGATCCTTCGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGACCATTAGCAAATATTTGGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAACATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG(SEQ ID NO:70)
其中，在本申请中，上述SEQ ID NO:51和56所示核苷酸序列分别编码FC2-117的重链和轻链的可变区，上述SEQ ID NO:52和57所示核苷酸序列分别编码FC2-070的重链和轻链的可变区，上述SEQ ID NO:53和58所示核苷酸序列分别编码FC2-153的重链和轻链的可变区，上述SEQ ID NO:54和59所示核苷酸序列分别编码FC2-201的重链和轻链的可变区，上述SEQ ID NO:55和60所示核苷酸序列分别编码FC2-203的重链和轻链的可变区。SEQ IDNO:61～65所示核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:41～45所示氨基酸序列的单链抗体，SEQID NO:66～70所示核苷酸序列分别编码SEQ ID NO:46～50所示氨基酸序列的单链抗体。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段表达，进而实现所述抗体或抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。进而实现前面所述的特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段在真核细胞中的表达。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子和/或前面所述的表达载体，或者表达前面所述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段体外表达和大量获得。
根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种嵌合抗原受体。根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区以及CD8铰链区，所述单链抗体特异性识别CD22；跨膜区，所述跨膜区包括免疫共刺激因子跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激因子胞内段以及CD3ζ链；其中，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区如前面所描述的。发明人发现，表达根据本发明实施例的嵌合抗原受体CART细胞可特异性靶向CD22阳性肿瘤细胞，对CD22阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果优，对正常细胞的安全性更高。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种CART细胞。根据本发明的实施例，所述CART细胞表达前面所述的嵌合抗原受体。根据本发明实施例的CART细胞可特异性靶向CD22阳性肿瘤细胞，对CD22阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果优，对正常细胞的安全性更高。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物含有前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体、前面所述的重组细胞、前面所述的嵌合抗原受体或前面所述的CART细胞中的至少之一。根据本发明实施例的药物组合物中所包含的抗体或表达的抗体能够特异性的靶向结合CD22，所包含的CART细胞对CD22阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果优，对正常细胞的安全性更高。
在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的CART细胞或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。
根据本发明的实施例，所述癌症为B淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在本发明的第九方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞、前面所述的嵌合抗原受体、前面所述的CART细胞或前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于杀伤CD22阳性的肿瘤细胞。根据本发明实施例的药物对于CD22阳性的肿瘤细胞有非常好的特异性杀伤功能。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种检测CD22的试剂盒。根据本发明的实施例，所述检测CD22的试剂盒包括前面所述的抗体。前面所述的CD22抗体能够特异性靶向结合CD22，根据本发明实施例的试剂盒可以实现CD22的特异性检测，如当抗体结合有荧光基团时，可以采用荧光检测装置实现对CD22的定位或实时检测。
在本发明的第十一方面，本发明提出了前面所述的抗体、前面所述的核酸分子、前面所述的表达载体或前面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD22或者诊断CD22相关的疾病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的抗体亲和力ELISA检测结果；
图2是根据本发明实施例的抗体亲和力Fortebio检测结果；
图3是根据本发明实施例的FACs检测抗体与肿瘤细胞系的结合的检测结果；
图4是根据本发明实施例的CD22抗体特异性结合B细胞的结果；
图5是根据本发明实施例的质粒结构示意图；
图6是根据本发明实施例的CART细胞阳性率检测结果；
图7是根据本发明实施例的Beckmanc cou LTER流式细胞仪检测各靶细胞凋亡比例的检测结果；以及
图8和图9是根据本发明实施例的各孔上清IL-2及IFN-γ浓度的ELISA检测结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
抗体
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。
在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。
本发明利用CD22胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗CD22的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与CD22抗原特异性结合，从而可以靶向性治疗肿瘤等疾病。
在一些实施方案中，本发明提供了一种能够特异性识别CD22的抗体或者抗原结合片段，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～15，轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:16～30。在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏CD22抗体或者与CD22抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代，例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO：31～35任一项所示氨基酸序列的重链可变区和具有如SEQ ID NO：36～40任一项所示氨基酸序列的轻链可变区。发明人通过抗体序列比对数据库(NCBI、IMGT)可得到上述抗重链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:1～15所示)和轻链可变区序列的CDR区(如SEQ ID NO:16～30所示)。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:31～35所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:36～40任一项所示氨基酸序列相比，具有保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。
在一些优选方案中，本发明提供了一种抗CD22抗体，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1，2或4。进而所述抗体的免疫原性可以得到有效降低。在一些优选方案中，本发明提供了一种抗CD22单链抗体，该抗体具有SEQ ID NO:41～50所示的氨基酸序列。
核酸分子、表达载体、重组细胞
在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的核酸分子，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。
为此，本发明还提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述分离核酸分子具有如SEQ ID NO:51～55任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:56～60任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:61～70所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子与上述SEQ ID NO:51～55所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:56～60所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:61～70所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:51～55或者SEQ ID NO:56～60或SEQ IDNO:61～70所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:31～35和SEQ IDNO:36～40相似的氨基酸或与SEQ ID NO:41～50相似的氨基酸序列，从而能够与CD22抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。
在一些优选实施方式中，所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO:51～55所示的重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO:56～60所示的轻链可变区的核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的核酸分子。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如Plasmid-X质粒。
本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为CHO细胞等。
嵌合抗原受体、CAR T细胞
本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，CAR是结合基于抗体的针对期望的抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体-激活细胞内结构域以产生展示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
表达CAR的T细胞被称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外区、跨膜区和胞内区。
本发明的实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可通过本领域已知的方法获得。CAR可以通过制备多肽或蛋白质的任何合适的方法制备。从头合成多肽和蛋白质的合适的方法描述在参考文献，如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,OxfordUniversity Press,Oxford,United Kingdom,2000；Peptide and Protein DrugAnalysis,Reid,R.编辑,Marcel Dekker Inc.,2000；Epitope Mapping,Westwood等编辑,OxfordUniversity Press,Oxford,United Kingdom,2001；和美国专利5,449,752中。另外，多肽和蛋白质可利用标准的重组方法使用本文描述的核酸重组产生。参见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborPress,ColdSpring Harbor,NY 2001；和Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing Associates以及John Wiley&Sons,NY,1994。此外，本发明的一些CAR(包括其功能部分和功能变体)可分离自和/或纯化自诸如植物，细菌，昆虫，哺乳动物如大鼠、人等的来源。分离和纯化方法为本领域熟知的。可选地，本文描述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可通过诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide TechnologiesCorp.(Gaithersburg,MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)的公司商业合成。在这方面，可合成、重组、分离和/或纯化本发明的CAR。
测试抗原结合至本发明CAR的任何功能部分的能力的方法为本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，例如，放射性免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，如Janeway等,下文和美国专利申请第2002/0197266A1号)。
本发明还包括在本发明范围内的是本文描述的本发明CAR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指具有与亲本CAR大量的或显著的序列同一性或相似性的CAR、多肽或蛋白质，所述功能变体保留了CAR变体的生物活性。功能变体涵盖，例如，本文描述的CAR(亲本CAR)的那些变体，其保留了能够以与亲本CAR类似的程度、以与亲本CAR相同的程度或以比亲本CAR更高的程度识别靶细胞。关于亲本CAR，功能变体的氨基酸序列与亲本CAR的氨基酸序列可，例如，具有至少约30％、约50％、约75％、约80％、约90％、约98％、约99％或更高的同一性。
功能变体可，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守性氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是不会干扰或抑制功能变体的生物活性的非保守性氨基酸置换。非保守性氨基酸置换可以增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本CAR相比有所增加。
本发明CAR的氨基酸置换优选为保守性氨基酸置换。保守性氨基酸置换为本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被交换为具有相同或类似化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸置换。例如，保守性氨基酸置换可为将酸性/带负电荷的极性氨基酸置换为另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸置换为具有非极性侧链的另一氨基酸(如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Tip、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸置换为另一碱性/带正电荷的极性氨基酸(如Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷的氨基酸置换为具有极性侧链的另一不带电荷的氨基酸(如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β分支侧链的氨基酸置换为具有β分支侧链的另一氨基酸(如，Ile、Thr和Val)、具有芳族侧链的氨基酸置换为具有芳族侧链的另一氨基酸(如，His、Phe、Trp和Tyr)等。
本发明的实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸为本领域已知的，并且包括例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、Ν',Ν'-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸、以及α-叔丁基甘氨酸。
药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。
本文提供的抗CD22抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗CD22抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
当然，本文中的抗CD22抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述CD22抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用CD22抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗CD22抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗CD22抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括CD22相关疾病，例如癌症等等。当然本文提供的抗体也可以用于上述疾病的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。
这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，B淋巴细胞白血病或B细胞淋巴瘤。
在利用本发明所提供的抗CD22抗体或CART治疗上述疾病时，可以将本发明提供的抗抗CD22抗体或CART细胞提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗上述疾病的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的抗体或其抗原结合片段CART细胞。
本发明的优势：
1)本发明通过免疫小鼠获得了全新的CD22抗体，该抗体亲和力高，特异性强，并且基于该序列构建的CART细胞在体外对于CD22阳性的肿瘤细胞有非常好的特异性杀伤功能。
2)基于本发明获得的抗体序列开发的CART可以特异的杀伤CD22阳性的肿瘤细胞，可以应用于B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者的免疫治疗；现有的临床结果显示，针对B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者，免疫细胞治疗疗效优于目前的治疗手段，对于B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者的治疗起到极大地推动作用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1靶向CD22抗体的获得
人CD22胞外段缀合His标签(以下简称h CD22-His，ACRO，CD2-H52H8)腹腔注射BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心)100μg/200ul/周/只/次，免疫3周后每周取小鼠尾血并检测血清中CD22抗体的表达；选择血清中CD22抗体表达量高的小鼠取脾细胞与瘤细胞(SP20，ATCC HB-12546)融合形成融合子，融合子培养10-14天后选择培养上清中表达CD22抗体融合子进行单克隆；选择表达CD22抗体的单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，培养7-10天后收集细胞培养液纯化获得CD22抗体，对获得的5个CD22候选抗体进行测序，其测序结果如下所示：
轻链可变区氨基酸序列(黑体字加下划线示出了CDR序列)：
FC2-070:
FC2-117:
FC2-153：
FC2-201：
FC2-203：
重链可变区氨基酸序列(黑体字加下划线示出了CDR序列)：
FC2-070:
FC2-117:
FC2-153：
FC2-201:
FC2-203:
实施例2CD22抗体的筛选
1)抗体亚型检测：
不同抗体针对CD22亲和力的测定是通过ELISA方式检测的，具体做法如下：
将hCD22-His包被在96孔酶联包被板中，浓度为2ug/ml，100uL/孔，10ug/ml的抗体与重组蛋白结合，使用二抗anti Mouse IgG1-HR、anti Mouse IgG2a-HRP、anti MouseIgG2b-HRP、anti Mouse IgG3-HRP、anti Mouse IgG-HRP、anti Mouse IgM-HRP并显色，检测各抗体OD450值(具体操作步骤为一般ELISA操作步骤)。S-HCL-1为mIgG2b亚型CD22商业化抗体；RFB-4为mIgG1亚型CD22商业化抗体；M971为为mIgG1亚型CD22人源化抗体，具体序列和信息可以公开查找到，抗体由深圳市菲鹏治疗股份有限公司合成。结果显示CD22抗体Fc2-070为mIgG2b亚型，Fc2-117为mIgG1亚型，Fc2-153为mIgG1亚型，Fc2-201为mIgG2b亚型，Fc2-203为mIgG1亚型。
2)亲和力检测：
不同抗体针对CD22亲和力的测定是通过ELISA、Fortebio和FACs三种方式检测的，具体做法如下：
抗体亲和力ELISA检测：将h CD22-His包被在96孔酶联包被板中，浓度为2ug/ml，100uL/孔，3倍梯度稀释的抗体与抗原结合，检测各抗体EC50(具体操作步骤为一般ELISA操作步骤)。M971为7表位CD22人源化抗体，具体序列和信息可以公开查找到，抗体由深圳市菲鹏治疗股份有限公司合成。结果如下图1所示，结果显示CD22抗体M971、Fc2-070、Fc2-117、Fc2-153、Fc2-201、Fc2-203 EC50处于同一水平。
抗体亲和力Fortebio检测，利用带ProA biosensor，先Loading Buffer,再hCD22-His 5ug/mL,然后分别Loading6个抗体，分别检测6个抗体的KD，Kon和Kdis；具体操作步骤为一般用过Fortebio仪器的实验人员可以理解，检测结果如下图2所示。
FACs检测抗体与肿瘤细胞系的结合：
K562细胞为人慢性髓系白血病细胞，K562-CD22细胞为构建过表达CD22细胞细胞系，具体检测方法如下：收获细胞，PBS洗涤1次，PBS重悬，1E+6细胞/ml/200ul，抗体梯度稀释后与细胞4℃孵育30min，抗体起始浓度为10ug/ml，3倍稀释，共9个梯度，其后与PE标记的抗小鼠IgG第二抗体孵育，洗涤2次，Beckmanc cou LTER流式细胞仪检测，如下图3所示RFB-4、Fc2-070、Fc2-117、Fc2-153、Fc2-201、Fc2-203与K562和K562-CD22细胞有浓度梯度依赖的结合。
3)CD22抗体特异性
CD22抗体特异性流式检测，取志愿者PBMC 5.0*10^5cells/组，分别加入鼠单抗、同型对照、阳性对照抗体，终浓度10ug/ml，4℃孵育30min；PBS洗2次，加入二抗Goat antiMouse IgG-PE 4℃孵育30min；PBS洗2次，加入anti-hCD19-APC抗体，4℃孵育30min后，PBS清洗一次，Beckmanc cou LTER流式细胞仪检测，检测结果如下图4所示，Fc2-070、Fc2-117、Fc2-153、Fc2-201、Fc2-203流式检测特异性结合B细胞。
实施例3构建CD22 CART细胞并进行体外功能验证
复苏表达Fc2-070、Fc2-117、Fc2-153、Fc2-201、Fc2-203的杂交瘤细胞株，正常培养72h后，裂解细胞提取RNA(提取试剂盒:TOYOBO LIFE SCIENCE,货号836700)提取步骤按说明书。逆转录获得cDNA(逆转录试剂盒:TOYOBO LIFE SCIENCE,货号11141ES10)，PCR扩增(针对Mouse IgG1和IgG2b序列的特异性引物)获得抗体序列并进行测序验证，测序结果如实施例一中部分序列所示，测序后将Fc2-070、Fc2-117、Fc2-153、Fc2-201、Fc2-203抗体的scFv序列构建在慢病毒载体上获得CAR质粒，对应CarT质粒编号为Fc2-070(pCDHF49)、Fc2-117(pCDHF54)、Fc2-153(pCDHF55)、Fc2-201(pCDHF53)、Fc2-203(pCDHF52)质粒结构示意如图5所示。利用293T细胞包装慢病毒，获得的慢病毒按MOI＝5:1感染T细胞制备CART细胞(二抗APC Goat anti Mouse IgG(H+L)或荧光抗原hCD22-FITC流式检测慢病毒滴度和慢病毒感染T细胞制备CART细胞方法可以通过公开途径获取)，然后进行体外功能验证结果显示本发明获得CD22抗体scFv序列构建的CART细胞体外功能与阳性对照抗体M971 scFv序列构建的CART细胞功能一致。
2)CART细胞阳性率检测
取5*10E+05cells的T细胞或CarT细胞，去磁珠后，在100ulPBS体系中加入2ul荧光抗原hCD22-FITC室温避光孵育15min，孵育完成后PBS清洗一次，200ul PBS重选细胞上流式检测细胞阳性率，检测结果如图6所示。
3)CART细胞体外功能评价
取靶细胞为K562，Nalm6，共2种靶细胞各3*10E+06cells，先利用cytocalceinTMviolet 550对靶细胞进行染色，1*10E+05cells/100ul/孔；效应细胞(CAR+CART，T细胞为对照)与靶细胞按照0.25:1，1：1，5：1及10：1加入96孔板中混匀，终体积200ul，共培养8h后并将细胞混匀离心，上清利用Human IL-2与Human IFN gamma ELISA ELISA试剂盒检测IL-2及IFN-γ，沉淀部分用100ul binding buffer重悬，300g离心5min，添加2.0ul APC-Annexin V和1.2ul PI染料，避光孵育15min，添加100ul binding buffer重悬，Beckmanccou LTER流式细胞仪检测各靶细胞凋亡比例如图7所示，ELISA检测各孔上清IL-2及IFN-γ浓度如图8图9所示。其中K562为CD22阴性细胞，Nalm6为CD22阳性细胞。结果显示，CAR-pCDHF49、CAR-pCDHF54、CAR-pCDHF55、CAR-pCDHF53、CAR-pCDHF52比CarT-M971对正常细胞的杀伤效果低，更安全；且CAR-pCDHF54在与CarT-M971基本相同的细胞因子分泌能力下，CAR-pCDHF54对CD22阳性靶细胞有相较阳性对照CarT M971更强的特异性杀伤效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种能够特异性识别CD22的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：
重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～15，
轻链可变区CDR序列：SEQ IN NO:16～30。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:13、14和15或者与SEQ ID NO:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:16、17和18或者与SEQ ID NO:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:19、20和21或者与SEQ ID NO:19、20和21具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:22、23和24或者与SEQ ID NO:22、23和24具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:25、26和27或者与SEQ ID NO:25、26和27具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:28、29和30或者与SEQ ID NO:28、29和30具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:16、17和18或者与SEQ IDNO:16、17和18具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:19、20和21或者与SEQ IDNO:19、20和21具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:22、23和24或者与SEQ IDNO:22、23和24具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:25、26和27或者与SEQ ID NO:25、26和27具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者
分别如SEQ ID NO:13、14和15或者与SEQ ID NO:13、14和15具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列和分别如SEQ ID NO:28、29和30或者与SEQ ID NO:28、29和30具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ IDNO：31～35任一项所示氨基酸序列的重链可变区；
任选地，所述抗体具有如SEQ ID NO：36～40任一项所示氨基酸序列的轻链可变区；
任选地，所述抗体含有重链恒定区和轻链恒定区的至少之一，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体；
任选地，所述抗体的轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG1，2或4。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体、多聚体抗体、CDR移植抗体或小分子抗体；
任选地，所述抗体为单链抗体；
任选地，所述单链抗体具有SEQ ID NO:41～50所示的氨基酸序列；
任选地，所述小分子抗体包括Fab抗体、Fv抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA；
任选地，所述核酸分子具有如SEQ ID NO:51～55任一项所示核苷酸序列或具有SEQ IDNO:56～60任一项所示核苷酸序列或具有SEQ ID NO:61～70任一项所示核苷酸序列。
9.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区以及CD8铰链区，所述单链抗体特异性识别CD22；
跨膜区，所述跨膜区包括免疫共刺激因子跨膜区；以及
胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激因子胞内段以及CD3ζ链；
其中，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区如权利要求1～6任一项所限定的氨基酸序列。
10.一种CART细胞，其特征在于，表达权利要求9所述的嵌合抗原受体。
11.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～6任一项所述的抗体、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9所述的嵌合抗原受体或权利要求10所述的CART细胞中的至少之一。
12.权利要求1～6任一项所述的抗体、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9所述的嵌合抗原受体、权利要求10所述的CART细胞或权利要求11所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防癌症。
13.一种检测CD22的试剂盒，其特征在于，包括权利要求利要求1～6任一项所述的抗体。
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