CN114058505B - 新型灌流培养用高密度微载体截留装置和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及贴壁细胞微载体灌流培养领域。具体地说，本发明涉及一种贴壁细胞灌流培养用的高密度微载体截留装置、包含所述装置的贴壁细胞微载体灌流培养系统以及它们的使用方法。本发明的截留装置包括沉降室、与生物反应器连接的管道、微载体截留滤膜、液体反冲装置、空气反冲装置、蠕动泵和与接收器连接的管道。这种新型设计的装置在促进微载体和细胞培养基的分离方面具有高效率，有助于贴壁细胞及微载体的灌流培养。这种截留装置使生物反应器内的培养体积更为灵活，可以进行生物反应器20%‑100%最大培养体积的灌流培养，且这种截留装置可根据生物反应器体积的放大进行线性放大。

Description

新型灌流培养用高密度微载体截留装置和使用方法

技术领域

本发明涉及贴壁细胞微载体灌流培养领域。具体地说，本发明涉及一种贴壁细胞灌流培养用的高密度微载体截留装置、包含所述装置的贴壁细胞微载体灌流培养系统以及它们的使用方法。

背景技术

使用高浓度微载体结合灌流培养工艺，提高接毒时细胞密度，进而提高上游收获液病毒滴度，是疫苗高效生产的一个重要解决方案。当前疫苗公司通常使用贴壁细胞及微载体在玻璃罐或不锈钢罐生物反应器中灌流培养进行疫苗生产。为了有效进行灌流培养，需要对微载体进行截留。常用的截留技术包括过滤、离心、沉降等。在实际应用中，这些技术或装置因效率有限、成本过高、易污染等原因而不令人满意。

美国专利US 5654197提供了一种内置的重力沉降装置用于细胞灌流培养。在这种装置中，通过位于生物反应器内部的沉降室泵出使用过的培养基。沉降室包括中空容器，细胞通过其底部开口以重力沉降的方式回到搅拌的培养基中，不含细胞的使用过的培养基通过顶部开口泵出生物反应器。该装置要求通过底部开口进入沉降室的培养基流体速度明显低于细胞沉降速度。

中国专利申请CN 102337200A提供了一种内置的微载体细胞-培养基分离装置。在该装置中，利用重力沉降原理将微载体细胞与培养基分离。沉降室设计有防扰动隔板，形成小扰动液体环境，利于微载体细胞的沉降。沉降室顶部设计有滤网和液体反冲装置，防止微载体细胞离开沉降室。

日本专利申请JPH06209761提供了一种内置的微载体细胞-培养基分离装置。在该装置中，利用重力沉降原理在管型沉降室中将微载体细胞与培养基分离。管型沉降室经设计以有效形成小扰动液体环境，利于微载体细胞的沉降。

中国专利申请CN 107541464A提供了一种微载体细胞-培养基分离装置。沉降柱中设置有分层漏斗。两个沉降柱联合使用，保持一个沉降柱的培养基-微载体入口高于另一个沉降柱的培养基-微载体入口，通过控制进液流速和出液流速，实现控制液位的功能。

现有技术的微载体细胞-培养基分离装置大多采用内置方式。内置分离装置可以最大程度地保证细胞始终处于生物反应器内设定的生长条件。尽管目前这些分离装置在一定程度上可以实现微载体细胞与培养基的分离，但在放大到几十升或几百升的大体积生物反应器、应用到一次性生物反应器、放置在反应器内部因滤膜堵塞而无法进行更换、以及为避免微载体流失而不能使用较大灌流速率等方面仍然存在着极大的局限性。

因此本领域仍急需开发新的微载体细胞-培养基分离装置，使微载体截留装置为外置设计，便于截留装置更换或设计为一次性的截留装置，并且培养规模可放大以及可连接到一次性生物反应器，以显著提高疫苗、病毒载体、溶瘤病毒等的生产效率，降低生产成本。

发明内容

灌流培养用高密度微载体截留装置

本发明提供了一种新型灌流培养用高密度微载体截留装置。具体地说，所述灌流培养用高密度微载体截留装置是贴壁细胞灌流培养用高密度微载体截留装置。这种新型设计的装置在促进微载体和细胞培养基的分离方面具有高效率，有助于贴壁细胞及微载体的灌流培养。这种截留装置使生物反应器内的培养体积更为灵活，可以进行生物反应器20%-100%最大培养体积的灌流培养。

本发明的截留装置包括沉降室、与生物反应器连接的管道、微载体截留滤膜、液体反冲装置、空气反冲装置、蠕动泵和与接收器连接的管道。

沉降室通常为圆柱体或具有平滑内壁的任意形状，由符合细胞培养要求的各种材料制成，例如塑料、金属、玻璃等。沉降室底部通过管道与生物反应器连接。沉降室顶部设有微载体截留滤膜，其孔径小于微载体的直径，由不锈钢或聚合物等材料制成。沉降室在微载体截留滤膜上方通过管道分别与液体反冲装置和空气反冲装置连接。反冲装置分别由相应的反冲泵或气体质量流量计和连接管道组成。在蠕动泵的作用下，生物反应器中的培养基通过沉降室进入接收器。接收器用于接收从截留装置中泵出的培养基。

微载体在沉降室中受到两个作用力，如图9所示，分别为蠕动泵泵出培养基时流体产生的对微载体向上的推力（F_m）和微载体在沉降室中自身所受的向下的重力（F_e）。在灌流培养中，可控制蠕动泵泵出流速，使沉降室内的培养基处于层流区，此时F_e>F_m，微载体向下沉降。

微载体沉降速度满足斯托克斯（Stocks）公式：

其中µ为微载体沉降速率，d _s 为微载体直径，g为重力加速度，ρ _s 为微载体密度，ρ为培养基密度。根据斯托克斯公式，可计算出微载体的沉降速度，因此可通过调节培养基的泵出速度及沉降室的高度，使绝大多数微载体沉降回流回生物反应器。

因此，当沉降室通过管道与生物反应器连接时，通过控制蠕动泵的泵出流速，使在沉降室中向上的蠕动泵泵出力小于微载体的向下重力，即沉降室内培养基的线性流体速度明显小于微载体的沉降速度，沉降室内的培养基处于层流区，导致微载体向下沉降。

在一个实施方案中，沉降室通过一个或多个倾斜或竖直的管道与生物反应器连接。所述管道与水平面的角度α为约60-90度，例如，约60、约70、约80或约90度，优选约75度。

少量的微载体在到达沉降室顶部时，可通过沉降室顶部的滤膜截留，避免微载体的流失。

微载体截留滤膜由符合细胞培养要求的各种材料制成，例如由不锈钢、玻璃或聚合物等制成。发明人已经发现，通过使用竖直、倾斜或弧形的截留壁，可以在很大程度上使微载体截留在沉降室中而不发生截留滤膜的堵塞。本文使用的术语“截留壁”定义为细胞培养基可以通过但细胞微载体不能通过而保留在沉降室中的任何屏障。优选地，所述截留壁含有孔径小于微载体的直径的一个或多个孔。

在一个实施方案中，微载体截留滤膜呈立体结构，所述立体结构具有一个或多个连续或不连续的竖直、倾斜或弧形的截留壁。这样的立体结构可具有上横截面和下横截面，所述上横截面和下横截面具有相同或不同的形状。例如，上横截面或下横截面的形状可以是圆形、椭圆形、三角形、正方形、长方形、梯形、五边形、六边形以及其它任何规则或不规则的多边形。在进一步的实施方案中，所述上横截面的面积可以小于、等于或大于所述下横截面的面积。在优选的实施方案中，所述上横截面的面积大于或等于所述下横截面的面积。在另一优选的实施方案中，所述下横截面会聚成一个点。在一个实施方案中，所述立体结构的水平壁具有截留作用。在一个特别优选的实施方案中，所述立体结构的水平壁不具有截留作用。微载体截留滤膜不具有水平的截留壁可以显著地防止截留滤膜的堵塞。例如，水平壁由聚合物、玻璃或不锈钢材料制成，其上没有一个或多个孔，不允许任何物质(包括细胞培养基)通过。

在一个具体的实施方案中，微载体截留滤膜呈倒置的锥体结构，即上横截面大于下横截面的立体结构。所述锥体结构可以是圆锥、椭圆锥、三棱锥、四棱锥、五棱锥以及更多棱锥。在一个实施方案中，所述锥体结构是倒置的金字塔立体结构。

在进一步的具体实施方案中，微载体截留滤膜呈倒置的锥体平行延长立体结构、或者圆柱体或长方体或正方体结构。例如，微载体截留滤膜呈倒置的金字塔平行延长立体结构。

在进一步的具体实施方案中，微载体截留滤膜呈球形或半球形立体结构。

微载体截留滤膜的可用结构的上横截面、下横截面和侧视图如图6所示。这些设计增加了截留面积，并且相对于平面截留方式，竖直、倾斜或弧形的截留壁可显著减少微载体对滤膜的贴附。

在另一个实施方案中，液体反冲装置设计为通过反冲泵将微载体截留滤膜上方管道中的培养基反冲回到沉降室。这可冲掉粘附在滤膜上的少量微载体，避免滤膜堵塞现象的发生。

在另一个实施方案中，空气反冲装置设计为通过气体质量流量计借助于无菌空气将截留装置中的所有剩余培养基和微载体压回到生物反应器。这避免了细胞在生物反应器外留置时间过长造成细胞活力下降，并且进一步避免滤膜堵塞现象的发生。

本发明的截留装置充分利用了微载体的重力沉降原理和滤膜截留原理，这改进了微载体和细胞培养基的分离效率。通过本发明截留装置的配置，包括与生物反应器连接的倾斜或竖直管道、特定结构的微载体截留滤膜、液体反冲装置和空气反冲装置，无滤膜堵塞现象，并且对进入沉降室的培养基流体速度具有更多灵活性和选择性。

在一个实施方案中，本发明的截留装置可以部分或全部配置为一次性使用装置，例如由塑料制成。一次性使用装置的选择可基于以下几个方面考虑：即插即用，缩短截留装置准备时间；减少单元操作，不需要设备清洗和消毒灭菌；操作更为方便，简化生产过程控制；提高生产效率；以及节约生产成本。

在另一个实施方案中，本发明的截留装置为重复使用装置，例如由不锈钢或玻璃制成的重复使用装置。

微载体截留方法

本发明提供了一种高密度微载体的截留方法，其通过使用本发明的截留装置实现。具体地，所述方法包括以下步骤：

1、从生物反应器通过与生物反应器连接的管道泵出培养基和微载体到截留装置中；

2、通过截留装置上方的与接收器连接的管道收获培养基到接收器中并在截留装置中重力沉降微载体；

3、通过微载体截留滤膜截留仍保持在培养基中的少量微载体；

4、通过液体反冲装置反冲微载体截留滤膜；以及

5、通过空气反冲装置借助于空气将截留装置中的所有剩余培养基和微载体回压到生物反应器。

在一个实施方案中，所述方法通过自动化控制程序进行。用户可根据每天的灌流速率自由设定自动化控制程序，包括泵出培养基和微载体到截留装置中的速度和时间、培养基收获速度和时间、液体反冲流速和时间，及空气反冲流速和时间。

发明人独特构思了在高密度微载体的截留方法中使用空气反冲程序。通过预先设定空气反冲程序的各种参数，例如空气反冲流速和时间，可以避免细胞在生物反应器外留置时间过长造成细胞活力下降，确保细胞始终处于最佳生长状态。这进一步提高了生产效率。

在一个实施方案中，步骤1-5重复进行一次或多次。

在一个优选的实施方案中，进入截留装置沉降室的培养基的线性流体速度小于微载体的沉降速度。

在当前细胞微载体的重力沉降领域，通常需要在沉降室中培养基的线性流体速度明显小于微载体的沉降速度，否则截留滤膜将会堵塞。通过根据本发明的截留装置的独特配置，克服了本领域的这一必要条件，无滤膜堵塞现象。因此，在另一个实施方案中，进入截留装置沉降室的培养基的线性流体速度可以等于或大于微载体的沉降速度。

细胞微载体灌流培养系统

本发明提供了一种细胞微载体灌流培养系统，包括本发明的细胞微载体截留装置、生物反应器和接收器。

在一个实施方案中，本发明的细胞微载体截留装置与生物反应器通过管道在生物反应器外进行连接(外置)，以便于细胞微载体截留装置的随时更换，这取决于细胞培养周期长短以及细胞微载体截留滤膜的堵塞情况。外置设计便于拆卸清洗，及更换无菌的细胞微载体截留装置，以进一步延长灌流培养时间，提高生产效率。

接收器是用于接收从截留装置中回收的培养基的任何容器。

在一个实施方案中，细胞微载体灌流培养系统可包括1个或多个本发明的截留装置，例如2个、3个或更多个截留装置。在一个实施方案中，多个截留装置通过单独或共用的管道与生物反应器连接。在另一个实施方案中，多个截留装置通过Y型接头或“多合一”式管道与生物反应器连接。

所述截留装置的尺寸可按比例缩放，既可设计生产小体积截留装置，也可设计生产大体积截留装置。

生物反应器可以是从几升规模小体积生物反应器到几百升规模大体积生物反应器；也可以是重复使用的玻璃罐或不锈钢罐生物反应器，或一次性生物反应器。

当前疫苗公司通常使用贴壁细胞及微载体在多个小型不锈钢生物反应器平行培养进行疫苗生产，不锈钢罐生物反应器需要清洗、灭菌，显著降低了生产效率，同时多个小型生物反应器平行运行，也显著增加了劳动强度和污染风险。一次性生物反应器在抗体药物生产中已得到广泛应用，近几年逐渐进入了疫苗研发和生产领域。使用一次性生物反应器进行疫苗生产已是行业发展的趋势。基于灌流培养高效生产疫苗的需要，设计和开发适用于一次性生物反应器的灌流培养用微载体截留装置，并开发出50-200 L大体积一次性生物反应器的疫苗高效灌流生产工艺就变得非常急迫。本发明的截留装置可与各种规格的一次性生物反应器联合使用，例如Cytiva XDR一次性生物反应器。

在一个实施方案中，所述截留装置可进行贴壁细胞微载体高密度灌流培养，其中所述微载体的浓度范围为3-18 g/L。

细胞微载体灌流培养方法

本发明提供了一种细胞微载体灌流培养方法，其通过使用本发明的细胞微载体灌流培养系统实现。具体地，所述方法包括以下步骤：

1、将细胞和培养基置于生物反应器中进行培养；以及

2、在通过进料泵补加新鲜培养基的情况下，通过本发明的微载体截留方法进行微载体的截留，直到获得足够的细胞培养产物或培养结束。

在一个实施方案中，所述细胞微载体灌流培养方法通过自动化控制程序进行。

在一个实施方案中，在细胞微载体灌流培养系统中使用的细胞微载体截留装置采用外置方式，根据细胞培养周期长短以及微载体截留滤膜的堵塞情况，可方便随时更换。

附图说明

根据附图，结合本发明的具体实施方式，本发明的目的、特征和优点将变得明显。本领域技术人员将理解，附图中各部件的尺寸并非按比例绘制的，而仅仅是为了解释本发明的目的，并非限制本发明的范围。

图1是本发明的灌流培养用高密度微载体截留装置(100)的可供选择的配置示意图。数字含义：1. 截留装置与生物反应器的连接管；2. 沉降室；3. 微载体截留滤膜；4. 蠕动泵(收获泵)；5. 液体反冲泵；6. 气体质量流量计。

图2是包含灌流培养用高密度微载体截留装置(100)的细胞微载体灌流培养系统的示意图。7. 接收器；8. 生物反应器。

图3显示了本发明的细胞微载体灌流培养系统的一个实施方案。

图4显示了本发明的细胞微载体灌流培养系统的另一个实施方案。

图5显示了本发明的截留装置中与生物反应器连接的管道中微载体和细胞培养基的运动方向。A. 微载体的运动方向；B. 培养基的运动方向；C. 重力沉降方向；D. 连接管道侧壁。

图6显示了本发明的截留装置中微载体截留滤膜的各种结构。A. 上横截面的代表性形状；B. 下横截面的代表性形状；和C. 侧视图的代表性形状。

图7显示了Vero细胞在50L和200L生物反应器中的球转球放大培养的结果。

图8显示了Vero细胞在50L生物反应器中使用本发明截留装置进行的灌流培养的结果。

图9显示了微载体在沉降室中受到的两个作用力。

具体实施方式

本发明的改进的装置和方法可与任何灌流生物反应器或连续细胞培养系统组合使用。这样的系统设计可将整个培养过程维持在最佳生长条件来实现细胞的高密度生长。这些系统特别适合于贴壁细胞与微载体结合在搅拌式生物反应器中进行灌流培养。

术语“高密度微载体截留装置”、“细胞微载体截留装置”、“微载体截留装置”、“截留装置”或“装置”在本文中可互换使用。

术语“微载体结合的细胞”、“细胞微载体”、“微载体细胞”或简称“细胞”在本文中可互换使用，包括任何细胞，例如植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可贴附在微载体上在搅拌悬浮培养基中生长，并且可以在未搅拌的培养基中以合理的沉降速度通过重力沉降。更具体地，微载体结合的细胞是贴壁细胞，通常是哺乳动物细胞，其结合到微载体颗粒上。所述微载体颗粒例如为玻璃、聚苯乙烯、明胶、葡聚糖或纤维素珠，例如市售可得的Cytodex-1微载体、Cytodex-3微载体或Cytopore微载体。

本发明的灌流培养用高密度微载体截留装置的原型可根据图1进行描述。本发明的原型是用于微载体培养的外部独立的沉降装置，其它相关装置是位于生物反应器中的装置或与生物反应器外部物理连接的装置。作为外部装置，本发明的原型(100)通过一个或多个倾斜或垂直的管道(1)与生物反应器连接。原型本体，即沉降室(2)，通常为圆柱体或具有平滑内壁的任意形状，由符合细胞培养要求的各种材料制成。一个截留滤膜(3)安装在沉降室(2)内部的顶部，以防止微载体泵出沉降室。在沉降室(2)的顶部并且在截留滤膜(3)的上方具有分别与多个泵连接的多个管道。在蠕动泵(4)的作用下，生物反应器中的细胞微载体和培养基进入沉降室(2)，并且培养基通过截留滤膜(3)离开沉降室，进入接收器。反冲泵(5)具有液体反冲功能，其在截留滤膜(3)上方进行液体反冲以防止该截留滤膜堵塞。气体质量流量计(6)和与其连接的管道具有空气反冲功能，其通过空气将沉降室中的所有培养基和微载体通过管道(1)压回到生物反应器。

图1所示的原型可与自动化控制程序联合使用。自动化控制程序是一种用于循环周期性操作的精确控制程序，包括但不限于以下子程序：

1、从生物反应器泵出培养基和微载体到沉降装置原型中；

2、收获培养基；

3、在原型中沉降微载体；

4、微载体截留滤膜截留少量残留在培养基中的微载体；

5、液体反冲截留滤膜；以及

6、通过空气将所有培养基和微载体压回到生物反应器。

任选地，本发明的原型包括用于精确和灵活培养体积自动化控制的天平/测压元件。

图2显示了本发明的细胞微载体灌流培养系统的实例。原型(100)通过管道(1)与生物反应器(8)流体连接。生物反应器(8)可以是大规模生物反应器。或者，生物反应器(8)是一次性生物反应器。这些生物反应器是本领域技术人员众所周知的，并包括许多市售可得的产品，例如Cytiva XDR一次性生物反应器。

在蠕动泵(4)的作用下，生物反应器中的培养基通过沉降室(2)进入接收器(7)。之后，接收器(7)中的培养基可经过本领域已知的分离和纯化操作，例如离心、过滤、色谱分离等，得到目标产物。

在该实例中，反冲泵(5)定期运行，在截留滤膜(3)上方进行液体反冲以防止该截留滤膜堵塞。另外，气体质量流量计(6)定期运行，通过空气将沉降室中的所有培养基和微载体通过管道(1)压回到生物反应器(8)。

本发明的截留装置与生物反应器和接收器通过管道连接，它们之间是可更换分离/连接的。这即是说，本发明的截留装置可独立于生物反应器和接收器而存在。在一个实施方案中，细胞微载体灌流培养系统可包括1个或多个截留装置，例如2个、3个或更多个截留装置。图3和4示出了截留装置与生物反应器的不同连接方式。在图3中，多个截留装置(201,202,…)通过单独的管道(101,102,…)与生物反应器(801)连接。在图4中，多个截留装置(201,202,…)通过“多合一”式管道(101)与生物反应器(801)连接。不同的连接方式为本发明的截留装置的配置提供了灵活性。本领域技术人员可根据联合使用的生物反应器型号、生产效率、培养条件等合理地选择相应的配置方式。

图5显示了与生物反应器连接的管道中微载体和细胞培养基的运动方向。左小图显示了沉降室通过竖直的管道与生物反应器连接，此时管道与水平面的角度α为90度。右小图显示了沉降室通过倾斜的管道与生物反应器连接(α<90度)。具体地，如图5中所示，管道内细胞微载体沿A方向沉降回到生物反应器，而培养基沿B方向离开沉降装置得以收获。在α<90度的情况下，细胞微载体因为重力而沿箭头C的方向聚集在管壁D附近，使得细胞微载体沿管壁D向下沉降。在这种情况下，细胞微载体在与生物反应器连接的管道中的沉降更加容易。因此，在优选的实施方案中，α<90度。在任何一种情况下，沉降室顶部的滤膜截留都能避免微载体的流失。这为生产过程提供了更多选择性。

在灌流培养过程中，截留滤膜具有堵塞的风险。本发明的截留装置通过采用不同角度的连接管道结合可调节的出液流速，使绝大多数微载体经一段时间沉降后流回到生物反应器，可显著减少沉降室中微载体的浓度，减少微载体对截留滤膜的堵塞。

本发明的微载体截留装置的截留滤膜采用独特的立体结构以增加截留面积，提高截留效率并防止堵塞。截留滤膜的各种立体结构的上横截面(A)、下横截面(B)和侧视图(C)显示于图6中。形状A、B和C可以各种合适的形式组合以构成本发明的截留滤膜立体结构。截留滤膜可以呈倒置的锥体结构，即上横截面大于下横截面的立体结构。所述锥体结构可以是圆锥、椭圆锥、三棱锥、四棱锥、五棱锥以及更多棱锥。在一个实施方案中，所述锥体结构是倒置的金字塔立体结构。在进一步的实施方案中，微载体截留滤膜可以呈倒置的锥体平行延长立体结构、或者圆柱体或长方体或正方体结构。例如，微载体截留滤膜呈倒置的金字塔平行延长立体结构。在进一步的实施方案中，微载体截留滤膜呈球形或半球形立体结构。这些设计增加了截留面积，并且相对于平面截留方式，倾斜、竖直或弧形的截留壁可显著减少微载体对滤膜的贴附。

此外，液体反冲程序可冲掉粘附在滤膜上的少量微载体，避免滤膜堵塞现象的发生。空气反冲程序可将微载体在较短的时间回压到生物反应器，避免了细胞在生物反应器外留置时间过长造成细胞活力下降，并且进一步避免滤膜堵塞现象的发生。通过使用原型设计产品及细胞培养灌流实验证实，本微载体截留装置设计无滤膜堵塞现象，且对细胞活力无影响。

本发明的装置解决了高密度微载体灌流培养的问题，尤其适用于大规模生物反应器和一次性生物反应器。该装置已在Cytiva Fast Trak实验室及合作实验室进行测试，用Vero细胞和微载体成功地进行高密度微载体灌流培养，并将Vero细胞微载体灌流培养工艺成功放大到50 L一次性生物反应器，用来进行狂犬疫苗生产。

在具体的实验中，使用Vero细胞和Cytodex-1微载体，比较了50 L和200 L XDR生物反应器中细胞微载体分批换液培养方式与50 L XDR生物反应器中细胞微载体灌流培养方式的培养结果。

在细胞微载体分批培养中，通常使用较低的微载体浓度。对于Vero细胞，通常使用2-3 g/L的Cytodex-1微载体浓度，更高的微载体浓度需要专门控制环境条件或经常更换培养基。发明人采用3 g/L Cytodex-1微载体和XDR50生物反应器培养Vero细胞，通过优化培养条件，细胞密度只能达到3 × 10⁶个细胞/ml（图7，第4天）。通过微载体球转球放大培养，将Vero细胞培养放大到XDR200生物反应器，细胞密度仍然只能达到3 × 10⁶个细胞/ml（图7，第8-9天）。较低的微载体浓度和有限的营养物补充方式，使整个培养不能获得更高细胞密度，进而影响到接毒后收获液中的病毒滴度。

利用本发明的灌流培养用新型微载体截留装置与XDR50生物反应器结合，使用Cytodex-1微载体进行Vero细胞灌流培养。微载体浓度可以提高到12-18 g/L，使细胞密度超过8 × 10⁶个细胞/ml（图8，第6天）。通过灌流培养将细胞密度提高几乎3倍，实现疫苗在一次性生物反应器中的高效生产。

具体地，本发明的细胞微载体灌流培养系统支持在50L生物反应器中用12 g/LCytodex-1微载体灌流培养Vero细胞22天，使细胞密度超过8 × 10⁶个细胞/ml。前7天为细胞灌流培养生长时段，后15天为灌流培养狂犬疫苗收毒时段。在整个运行中，细胞微载体的保留率为100%。

Claims (22)

1.一种灌流培养用高密度微载体截留装置，所述装置包括沉降室、与生物反应器连接的管道、微载体截留滤膜、蠕动泵和与接收器连接的管道，其特征在于：所述装置还包括液体反冲装置和空气反冲装置，其中微载体截留滤膜设置在沉降室顶部，沉降室在微载体截留滤膜上方通过管道分别与液体反冲装置和空气反冲装置连接，并且在蠕动泵的作用下，生物反应器中的培养基通过沉降室进入接收器。

2.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述灌流培养用高密度微载体截留装置是贴壁细胞灌流培养用高密度微载体截留装置。

3.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述沉降室通过一个或多个倾斜或竖直的管道与生物反应器连接，所述管道与水平面的角度α为60-90度。

4.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述微载体截留滤膜呈立体结构，所述立体结构具有一个或多个连续或不连续的竖直、倾斜或弧形的截留壁。

5.根据权利要求4所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述立体结构具有上横截面和下横截面，所述上横截面和下横截面具有相同或不同的形状。

6.根据权利要求5所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述上横截面的面积大于或等于所述下横截面的面积。

7.根据权利要求5所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述下横截面会聚成一个点。

8.根据权利要求4所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述立体结构的水平壁可具有或不具有截留作用。

9.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述装置部分或全部地配置为一次性使用装置。

10.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述装置为重复使用装置。

11.根据权利要求1所述的灌流培养用高密度微载体截留装置，其特征在于所述灌流培养用高密度微载体截留装置与生物反应器通过管道在生物反应器外进行连接；在运行过程中，若滤膜出现堵塞情况，便于灌流培养用高密度微载体截留装置的随时更换。

12.一种高密度微载体的截留方法，其特征在于通过使用权利要求1-10中任一项所述的灌流培养用高密度微载体截留装置实现，包括以下步骤：

i) 从生物反应器通过与生物反应器连接的管道泵出培养基和微载体到截留装置中；

ii) 通过截留装置上方的与接收器连接的管道收获培养基到接收器中并在截留装置中重力沉降微载体；

iii) 通过微载体截留滤膜截留仍保持在培养基中的少量微载体；

iv) 通过液体反冲装置反冲微载体截留滤膜；以及

v) 通过空气反冲装置借助于空气将截留装置中的所有剩余培养基和微载体回压到生物反应器。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述方法通过自动化控制程序进行。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于步骤i) – 步骤v)重复进行一次或多次。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于截留装置沉降室中培养基的线性流体速度小于微载体的沉降速度。

16.一种细胞微载体灌流培养系统，其特征在于包括权利要求1-10中任一项所述的灌流培养用高密度微载体截留装置、生物反应器和接收器。

17.根据权利要求16所述的系统，其特征在于所述系统包括1个或多个所述灌流培养用高密度微载体截留装置。

18.根据权利要求16所述的系统，其特征在于所述灌流培养用高密度微载体截留装置的尺寸可按比例缩放。

19.根据权利要求16所述的系统，其特征在于所述生物反应器是重复使用生物反应器或一次性生物反应器。

20.根据权利要求16所述的系统，其特征在于所述生物反应器是从几升规模小体积生物反应器到几百升规模大体积生物反应器。

21.根据权利要求16所述的系统，其特征在于所述灌流培养用高密度微载体截留装置可进行贴壁细胞微载体高密度灌流培养，其中所述微载体的浓度范围为3-18 g/L。

22.一种细胞微载体灌流培养方法，其特征在于通过使用权利要求16-21中任一项的细胞微载体灌流培养系统实现，包括以下步骤：

i) 将细胞和培养基置于生物反应器中进行培养；以及

ii) 通过权利要求12-15中任一项的方法重复进行微载体的截留一次或多次，直到获得足够的细胞培养产物或培养结束。