CN114032268A - 获得肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于从原核细胞和/或真核细胞获得肽的方法。所述方法包括以下步骤：a)裂解原核细胞和/或真核细胞并且回收由此获得的蛋白质，b)使用至少一种变性剂使蛋白质变性，c)使用至少一种烷基化剂使变性的蛋白质烷基化，d)使用至少一种蛋白水解酶将在步骤c结束时获得的蛋白质酶促蛋白水解，e)回收在酶促蛋白水解步骤d结束时获得的肽，其中步骤a中所述原核细胞和/或真核细胞的裂解是在低浓度离液剂下的裂解，其中步骤a‑d同时进行，其中在低浓度离液剂下的裂解是通过借助于超声波探头进行的声处理的裂解，其中变性剂是选自三(2‑羧乙基)膦和二硫苏糖醇的硫醇还原剂，且烷基化剂是碘乙酰胺；所述方法在大气压力下进行。
Description
本申请是申请日为2013年05月02日，申请号为201380035027.8，发明名称为“获得肽的方法”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及从原核细胞和/或真核细胞获得肽以用于其随后分析的方法。
这些肽的分析的确可以证明在大量应用中，特别是在生物标记物研究或细菌肽分析中有用，所述应用例如在鉴别、分型、抗性标记物和毒性标记物检测的应用框架内，并且此框架在医学、药学以及农产品领域内。
技术现状
根据现有技术提取并且纯化肽的方案通常非常冗长。此外，这些方法通常手动实施并且复杂。
国际申请WO 2006/031063描述了意图水解多肽的组合物，此水解反应通过使用称为“PCA”的溶液以化学方法获得，所述PCA包括酸(比如纯乙酸)、水易混合的有机溶剂(比如乙腈)和还原剂(比如三(2-羧乙基)膦)。此化学消化在99.9℃下进行两小时。然而，可能为了增加蛋白水解的效率，WO 2006/031063任选地预先采取措施将化学消化这步连接至之前的酶消化步骤。使用经修饰的胰蛋白酶在37℃下进行酶消化步骤12小时，随后热变性步骤(90℃20分钟)。上述化学消化步骤在酶消化这步之后进行(99.9℃2小时)。蛋白质样品的总处理时间因此大于14小时，这表示了无以争辩的主要缺点。此外，WO 2006/031063教导了比常规胰蛋白酶更贵的经修饰的胰蛋白酶的用途。
就其本身而言，国际申请WO 2008/128029公开了蛋白质或肽在溶液中片段化的方法，所述方法包括：在酶消化或化学消化的初始步骤之后，一系列分离和片段化的另外步骤。后者一方面有助于增加片段化方法的总时间，但另一方面需要多种操作，从而致使此方法的自动化极其困难。
专利US 7,622,273描述了意图使经翻译后修饰的多肽或蛋白质变性的方案，这些肽和蛋白质直接结合到蛋白质微阵列，并且所述方案包括化学处理、酶消化或化学消化的步骤以及随后鉴别所述蛋白质微阵列上蛋白质的步骤。化学处理步骤包括所述蛋白质的变性、还原和烷基化，而酶消化步骤包括所述蛋白质的去糖基化和/或去磷酸化以及通过化学蛋白水解或酶蛋白水解的所述蛋白质的消化。所有的反应在蛋白质微阵列上按次序地进行。化学处理步骤持续至少3小时15分并且酶消化步骤持续两小时(参见实例1)，即5小时15分的最小持续时间。尽管这小于常规方法的持续时间—大约24小时—然而仍然不令人满意，特别考虑到临床领域或药学领域中固有的要求。更重要的是，复杂样品(血浆、尿、脑脊液等)在实施此专利公开的方案之前可能需要分级分离策略或消除策略，以使目标蛋白质分离，这因此增加了所述样品的总处理持续时间。
国际申请WO 2011/130521描述了蛋白水解消化的方法，其使用一系列压力循环(例如从5kpsi到35kpsi，即大约从344.74巴到2413.16巴)，以便减少此方法的持续时间。即使此持续时间似乎短于现有技术的方法，但依然，对应于还原步骤(10mM的DTT在37℃下1小时)和烷基化步骤(50mM的碘乙酰胺在环境温度下在黑暗中45分钟)的累积时间不能小于1小时45分。如果这再加上微生物的裂解时间(3分钟，以4500rpm)、还原步骤之前裂解物的操作时间(未指明)以及在压力之下酶消化步骤之前溶液稀释所固有的时间(也未指明)，显然为WO 2011/130521目的的方案的总持续时间不可能小于2小时，其仍然不令人满意。由于使用的高压，则此方法需要能够承受这些高压的难以操作并且昂贵的复杂装置。更重要的是，为了不使实际使用的酶冒失活的风险，在酶消化步骤之前，所述方法需要另外的过滤步骤，以便降低离液剂非常高的浓度(8M尿素)，当在高浓度(从1M起)下使用时，在蛋白质变性步骤使用的离液剂—比如尿素—也将使在酶蛋白水解步骤使用的酶的蛋白质结构变性，并且将具有完全或部分灭活此酶的后果。为了防止这，必需在酶蛋白水解(酶消化)步骤之前进行另外的稀释和/或过滤步骤，这需要另外的时间间隔并且使整个方法的自动化更加复杂。备选方案在于使用能够在高浓度离液剂存在下进行蛋白质消化的基因修饰的酶(例如经修饰的胰蛋白酶)。然而，这些经修饰的酶具有不如天然酶的作用动力学(action kinetics)快速的作用动力学，并且具有比天然酶的采购成本更高的采购成本。
因此，存在开发允许从原核细胞和/或真核细胞获得肽而解决上述问题的所有或部分的方案的需要，所述方案即不需要不必要的稀释步骤的有效、快速、可以容易自动化的方案。
发明公开内容
因此，本发明的目的涉及从原核细胞和/或真核细胞获得肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)裂解原核细胞和/或真核细胞并回收由此获得的蛋白质，
b)使用至少一种变性剂使所述蛋白质变性，
c)使用至少一种烷基化剂使变性的蛋白质烷基化，
d)使用至少一种蛋白水解酶将在步骤c)结束时获得的蛋白质酶促蛋白水解，
e)回收在酶促蛋白水解步骤d)结束时获得的肽，
其中步骤a)中原核细胞和/或真核细胞的裂解是在低浓度离液剂下的裂解。
获得肽的此方法(方案)适用于原核细胞(例如细菌)、真核细胞(人细胞、动物细胞、酵母细胞等)或原核细胞和真核细胞的混合物。
根据优选的实施方案，将使用根据本发明的方法以便从原核细胞、优选地从细菌(革兰氏+或革兰氏-)获得肽。
“变性剂”被理解为能够诱导蛋白质和多肽变性现象的物理的或化学的剂；蛋白质和多肽舍弃其天然状态并且渐渐失去其二级结构、三级结构和四级结构。有时变性可以是可逆的，返回到天然状态是可能的并且蛋白质的活性被恢复。
蛋白质的变性起因于蛋白质依赖于其物理化学环境的敏感性。当通过变性剂来破坏残基之间的相互作用时，蛋白质被变性。多肽链中相邻的氨基酸之间的共价键未断裂。相反地，变性的某些条件可以引起多肽链中非相邻的半胱氨酸残基之间提供蛋白质四级结构整体稳定性的二硫键的断裂。
变性剂如以下来主要区分：
a)物理剂，比如温度；温度的增加的确引起分子中原子的热搅动；这引起像氢键的弱相互作用的断裂，所述氢键使空间结构稳定；
b)化学剂，比如：
-酸和碱；通过改变环境pH，其引起由可电离基团携带的电荷的改变，并因此破坏稳定蛋白质空间结构的离子键和氢键；
-离液剂，比如尿素、胍盐(例如盐酸胍或胍高氯酸锂(guanidine hydrochlorideor lithium perchlorate))；在高浓度下使用，这些化合物大大削弱了蛋白质的氢键(负责维持蛋白质的二级结构、三级结构和四级结构的主要的低能量键)；
-硫醇还原剂，比如2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)；其允许裂解二硫桥，并从而有助于削弱蛋白质的三级结构或四级结构；
-洗涤剂，其通过改变与水性溶剂之间的相互作用起作用(例如十二烷基硫酸钠—以首字母缩略词“SDS”更为所知)。
某些变性剂可以证明为不可逆的，比如重金属(Pb、Hg等)和某些酸(例如HNO3、三氯乙酸等)。
为了本发明的目的，将离液剂区分为所谓的“盐”离液剂，比如胍的盐(或胍盐的盐)(salts of guanidine(or of guanidinium))，和所谓的“非盐”离液剂，比如尿素。
“在低浓度“离液剂”下裂解”被理解为在小于或等于1M、优选地小于或等于100mM的离液剂浓度下裂解。
实际上，在此浓度下，所谓的“离液”剂对蛋白质和多肽不再行使变性活性，从而失去其离液性质。
此技术方案与现有技术中所存在的常规方案形成对照，所述常规方案通常采用大约6M的通常非常高的浓度的离液剂，并且更尤其是胍盐(比如盐酸胍、异硫氰酸胍等)。离液剂并尤其是盐(例如胍盐)的这种浓度大大干扰了酶促蛋白水解，尤其当使用丝氨酸蛋白酶比如胰蛋白酶来进行酶促蛋白水解时。在根据本发明获得肽的方法框架之内，在低浓度离液剂下进行裂解的事实不仅允许改进蛋白水解步骤d)的效率，而且还防止在所述蛋白水解步骤之前必须求助于另外的过滤/稀释步骤。实现的时间节省允许获得比现有技术中所描述的方案明显更快的方案，而其还更易于自动化。
此外，此低浓度的离液剂允许使用天然的蛋白水解酶，而不需要求助于基因修饰的蛋白水解酶，所述基因修饰的蛋白水解酶具有不如天然酶的作用动力学快速的作用动力学，并且具有比天然酶的采购成本更高的采购成本。
根据优选的实施方案，在低的盐浓度下来实现裂解，这意指在小于或等于50mM、优选地小于或等于30mM的盐浓度下进行裂解。
有利地，在非盐离液剂比如尿素不存在下进行低浓度离液剂下的裂解。实际上，根据本发明的方法不需要使用此种非盐离液剂。
对于低浓度离液剂下的裂解，优选使用国际申请WO 02/10333中描述的原核生物和/或真核生物细胞裂解的通用方案，国际申请WO 02/10333的全部内容通过引用并入本专利申请。此通用方案包括原核生物和/或真核生物细胞裂解的方法或者原核生物和真核生物同时细胞裂解的方法，其包括调整以下参数的至少三个：
-相对于大直径的活泼珠(active beads)(裂解珠)，小直径的活泼珠(裂解珠)的质量百分比小于或等于50％，和/或
-相对于处理的生物样品的总质量，包括小直径的珠和/或大直径的珠的混合物或者另外地小直径的珠和/或大直径的珠的裂解(活泼)珠的总质量为50％和100％之间，和/或
-裂解的持续时间为10分钟和20分钟之间，和/或
-用于驱动裂解(活泼)珠的非裂解玻璃珠的数目小于七(7)，和/或-用于驱动裂解(活泼)珠的非裂解铁珠的数目为五(5)和十五(15)之间，这取决于使用的技术：
-声处理，
-机械涡旋，或
-磁涡旋。
优选地，小直径的裂解(活泼)珠具有在90μm和150μm之间、且优选地大约100μm的直径，且大直径的裂解(活泼)珠具有在400μm和600μm之间、且优选地大约500μm的直径。
还优选地，裂解(活泼)珠由玻璃制成。
根据优选的实施方案，还比如申请WO 02/10333中指示的，如果使用机械涡旋技术，此方法包括根据以下参数进行裂解：
-裂解持续时间为11分钟到20分钟、优选地为15分钟到20分钟、且还更优选地为20分钟，
-100μm直径的珠的百分比为小于50％、优选地小于30％、且还更优选地为20％，
-裂解(活泼)珠的总质量大于处理的生物样品的总质量的60％、优选地大于其80％、且还更优选地为其100％，并且
-玻璃珠的数目小于七(7)、优选地等于一(1)。
如果使用磁涡旋技术，优选地，此方法包括根据以下参数进行裂解：
-裂解持续时间为12分钟到20分钟、优选地为15分钟到20分钟、且还更优选地为20分钟，
-100μm的裂解(活泼)珠的总质量大于处理的生物样品的总质量的80％、且优选地为其100％，
-铁珠的数目在五(5)到十五(15)个珠之间、优选地为十(10)个铁珠。
通常，为了本发明的目的，以低浓度离液剂使用任何裂解技术而不需要依赖大约几百巴或甚至数千巴的高压。实际上，本发明的目的之一是详尽阐述有效、快速并且可以借助于标准装置来实施，而不需要使用特别改造的装置以承受高压或甚至非常高的压力的用于获得肽的方案，所述特别改造的装置是使用复杂并且极其昂贵的装置。
根据本发明获得肽的方法在从大气压力到大约一百巴的压力的压力下实施。优选地，所述方法在100巴、优选地小于50巴、有利地小于10巴的压力下实施。根据优选的实施方案，根据本发明的方法在大气压力下进行。
根据本发明的优选实施方案，在低浓度离液剂下的裂解是通过借助于超声波探头实现的声处理的裂解。优选地，通过声处理的此裂解在1000μm玻璃珠和100μm锆珠的混合物的存在下，借助于所述超声波探头来实现。
在通过声处理的裂解框架之内，优选地，将方案应用于通过比如国际申请WO 02/10333(第3页第18-26行)中描述的声处理的裂解，即，使用以下参数：
-裂解持续时间为9分钟到20分钟、优选地为12分钟到18分钟、且还更优选地为15分钟，
-100μm直径的珠的百分比在10％到50％之间、优选地在20％和30％之间、且还更优选地为20％，并且
-裂解(活泼)珠的总质量为处理的生物样品的总质量的50％到100％之间、优选地为其75％和90％之间、且优选地为其80％和85％之间。
关于用于通过声处理裂解的方案的装置和方法学本身，在有利的方式中，使用外部超声波发生器，比如由Hielscher公司销售的小瓶高音超声波发生器(VialTweetersonotrode)。此探头包括以孔穿透的振动块，在所述孔中可以插入小瓶，比如1.5ml体积的Eppendorf小瓶，在该小瓶中引入在3mM硼酸盐的pH 8的缓冲液中悬浮裂解的细胞以及1mm玻璃珠和100μm锆珠(每个50mg)。关闭小瓶，并且然后以额定振幅(对于每个小瓶，取决于其在块中的位置，在5瓦特和10瓦特之间)的50％和100％之间、优选地为100％的振幅以及在40％到60％、优选地为50％的循环比率下，启动超声波发生器持续5分钟到15分钟，优选地10分钟。
通过声处理裂解的方案的选择并非在任何情况下的随意的选择。常常与此相反，申请人已经以惊人的方式发现，当裂解步骤a)为通过声处理的裂解步骤时，根据本发明获得肽的方法的收率更好。
此外，申请人已经发现，预热超声波探头步骤(持续1h的探头的激活，其将整个振动系统的温度提升到95℃)的省略不削弱所述方法的效率。这被证明是完全有利的特征，因为超声波探头的此预热步骤减少了其寿命并且需要另外的能量贡献。
因此，在优选的方式中，超声波探头在通过声处理裂解之前不经受预热步骤。
关于酶促蛋白水解步骤d)，此步骤通过蛋白水解酶的作用来进行，所述蛋白水解酶优选地为丝氨酸蛋白酶，其有利地选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组。优选地，所述蛋白水解酶为胰蛋白酶。
此酶促蛋白水解相对于物理-化学处理(用过氧化氢、溴化氰、三氟乙酸的处理)而言是特别优选的，因为其更大程度地保存蛋白质的结构，其证明更易于控制并且在特定位点(在胰蛋白酶情况下在赖氨酸残基和精氨酸残基的C-端处)裂解肽链。“酶促蛋白水解”被理解为在合适的反应条件下一种或更多种酶的单作用或联合作用。进行蛋白水解的酶被称为蛋白酶，以位点特异的方式裂解蛋白质。实际上，每种蛋白酶通常识别特定的氨基酸序列，在所述特定的氨基酸序列中此蛋白酶总是进行相同的裂解。某些蛋白酶识别单一的氨基酸或两个氨基酸的序列，它们在所述两个氨基酸之间进行裂解，其他蛋白酶识别更长的氨基酸序列。这些蛋白酶可以是内切蛋白酶或外切蛋白酶。尤其可以引用已知蛋白酶，如文件WO 2005/098071中描述的：
-特异性酶，比如：胰蛋白酶，其分裂Arg残基和Lys残基的羧基处的肽键；内溶素，其裂解赖氨酸的-CO基团的肽键；胰凝乳蛋白酶，其水解芳香族残基(Phe、Tyr和Trp)的羧基处的肽键；胃蛋白酶，其在芳香族残基(Phe、Tyr和Trp)的NH2基团处切割；金黄色葡萄球菌的V8菌株的V8蛋白酶，其裂解Glu残基的羧基处的肽键；
-非特异性酶，比如：源自Bacillus thermoproteolyticus的嗜热菌蛋白酶，其水解疏水氨基酸(Xaa-Leu,Xaa-Ile,Xaa-Phe)的NH2基团的肽键；为细菌蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶和链霉蛋白酶，其几乎水解所有的键并且可以在控制的反应条件(酶浓度和反应持续时间)下将蛋白质转化成寡肽。
如果几种蛋白酶的作用模式兼容，则它们可以以同时的方式来使用，或者它们可以被相继使用。在本发明的框架之内，样品的消化优选地通过具有优良的裂解位点选择性的蛋白酶例如胰蛋白酶的作用来进行。
借助于化学试剂或蛋白酶获得肽可以通过溶液中的简单反应来获得。其还可以使用微波炉[1]或者在压力下[16]或者使用超声装置[17]来实施。在这后三种情况下，方案会更加快速。
由酶消化(酶促蛋白水解)获得的肽中，蛋白质的特定肽被称为酶促蛋白水解肽。后者通过质谱法或适于检测这类酶促蛋白水解肽的其他适当的分析技术容易检测。这代表相对于借助于物理-化学处理获得的化学蛋白水解而言的另外优势。
优选地，变性剂是硫醇还原剂，其优选地选自2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三丁基膦和二硫苏糖醇(DTT)，有利地，所述硫醇还原剂是三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇。
优选地，烷基化剂选自由N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的组，优选地，所述烷基化剂是碘乙酰胺(IAA)。
使用根据本发明的方法的参数，酶促蛋白水解步骤d)的最小持续时间，至今为止的限制因素，被大大减少。实际上，在根据本发明获得肽的方法框架之内的此酶促蛋白水解步骤的最小持续时间为大约15分钟(优选地此最小持续时间为5分钟)。在酶促蛋白水解步骤结束时获得肽所需的最小持续时间的减少允许根据本发明获得肽的方法的总持续时间非常显著的减少，因为后者可以在大约仅仅半小时以内来进行。
通常，根据本发明获得肽的方法的总持续时间小于1小时45分钟，优选地小于1小时、有利地小于45分钟，且任选地大约30分钟。
由此获得的显著的时间节省尤其对于临床领域和/或药学领域中固有的要求十分重要。此外，根据本发明获得肽的方法完全适合于复杂样品(血浆、尿、脑脊液等)，所述复杂样品有可能需要另外的分级分离策略或消除策略，以便在实施获得肽的方法之前分离靶蛋白质。因此，就算包括进行这类另外的分级分离策略或消除策略所必需的时间，通过应用根据本发明的方法的这类复杂样品的处理时间与现有技术的方法比较起来仍然非常有利。
在裂解步骤a)之前的原核细胞和/或真核细胞样品的预先纯化处理对本领域技术人员是已知的，并且可以尤其实施离心、过滤、电泳或色谱的技术。这些分离技术可以单独使用或彼此组合使用，以获得多维分离。例如，可以通过经由离子交换色谱法与反相色谱法的联合分离来使用多维色谱法，如T.Fortin等人[2]或H.Keshishian等人[3]所描述的。在这些出版物中，色谱介质可以在柱中或者在筒(固相萃取)中。酶促蛋白水解肽的电泳级分或色谱级分(或者单色谱法或多维色谱法中的保留时间)是每种肽的特征，并且因此这些技术的实施允许选择蛋白水解肽或要被分析的肽。产生的肽的这种分级分离允许随后质谱法分析的特异性的增强。
用于肽的分级分离的电泳技术或色谱技术的替代方案包括特异性纯化N-糖肽类([1]和专利申请WO 2008/066629)。然而，这种纯化仅允许量化已经经历N-糖基化类型的翻译后修饰的肽。目前不是所有蛋白质都被糖基化，这因此限制了其用途。
关于原核细胞和/或真核细胞样品的预先纯化处理，根据本发明的方法优选地在步骤a)之前包括以下另外的步骤：
a’)在15℃和25℃之间、优选地大约20℃的温度下，以3500rpm和4500rpm之间、优选地大约4000rpm的旋转速度离心微生物，持续4分钟和6分钟之间、有利地6分钟的时间段，
a”)去除上清液并且回收包含微生物的沉淀，
a”’)在溶剂中吸附所述沉淀。
有利地，在本发明的框架之内使用的溶剂选自乙腈溶液和包括pH缓冲剂比如碳酸盐离子的水溶液，有利地，所述溶剂是包括碳酸盐离子的水溶液，比如碳酸氢铵的溶液。
对于上述样品的预先纯化处理的步骤，在必要时，方法可以包括：继回收肽的步骤e)之后的所述肽的离心的步骤。举例来说，回收肽的步骤e)可以后跟以下步骤：
e1)在2℃和6℃之间、有利地大约4℃的温度下，使用在13000g和15000g之间、有利地大约14000g的相对离心力离心25分钟和35分钟之间、有利地大约30分钟的持续时间，
e2)回收所有或部分的包括肽的上清液。
根据本发明的第一方面，至少裂解步骤a)和变性步骤b)被相连/同时进行。
根据本发明此第一方面的特定实施方案，步骤a)和步骤b)被相连/同时进行。因此，并与现有技术方法相反，使用裂解时间来变性蛋白质。这允许缩短方法整体的持续时间并且有利于其自动化。
在此特定实施方案的框架之内，变性的蛋白质的烷基化步骤c)在本领域技术人员已知的适于并且能够允许进行所述蛋白质的烷基化处理的温度下进行。此蛋白质的烷基化步骤c)优选地在没有光时并且在10℃和60℃之间、优选地在15℃和25℃之间的温度下，有利地在环境温度下进行。
还在此特定实施方案之内，就其本身而言，酶促蛋白水解的步骤d)在合适的温度下进行，即，也对本领域技术人员已知的允许蛋白质的酶促消化(酶促蛋白水解)的温度。有利地，此蛋白水解步骤d)在30℃和60℃之间、优选地在37℃和55℃之间、有利地大约50℃的温度下进行。
在此特定实施方案中，溶解a)和变性b)的相连(同时)步骤的持续时间在3分钟和7分钟之间、优选地在4分钟和6分钟之间，有利地，所述持续时间为大约5分钟。
此外，并且还在此特定实施方案之内，变性的蛋白质烷基化步骤c)的持续时间也在3分钟和7分钟之间、优选地在4分钟和6分钟之间，有利地，所述持续时间为大约5分钟。
还根据此特定实施方案，所述方法在变性的蛋白质烷基化步骤c)之后包括以下步骤：
c1)分析在所述步骤c)中获得的蛋白质，
并且其中在酶消化步骤d)以相对于步骤c1)中分析的蛋白质重量在1/5和1/15之间、优选地1/8和1/12之间、有利地大约1/10的重量比率(w/w)添加蛋白水解酶。
根据本发明的第二方面，根据本发明的方法的至少步骤a)-c)相连地进行(a)+b)+c))。
根据本发明此第二方面特定的实施方案，步骤a)-c)(裂解、变性和烷基化)相连地(同时地)进行。
根据本发明的第三方面—特别优选的—步骤a)-d)相连地(同时地)进行。
根据本发明的此第三方面—特别优选的—根据本发明的方法的步骤a)-d)相连地进行(a)+b)+c)+d))。
更确切地说，所有步骤a)–d)在相同容器(例如Eppendorf小瓶)中进行，而不需要添加试剂或所述步骤之间的操作。因此，此步骤是可以容易自动化的，就成本降低、限制与错误操作关联的风险、以及减小要被使用的体积(非限制性的列表)而言，这代表主要优势。
在根据本发明的第二方面和第三方面的方法的框架之内，确定不同步骤b)、c)和d)中使用的剂的兼容性、并且更尤其对于变性剂和烷基化剂的兼容性是必要的，烷基化剂具有烷基化步骤b)中引入的变性剂的自然趋势。
优选地，根据本发明的这些第二方面和第三方面：
-变性剂是选自三(2-羧乙基)膦和二硫苏糖醇的硫醇还原剂，有利地，所述硫醇还原剂是三(2-羧乙基)膦，并且
-烷基化剂是碘乙酰胺。
实际上，申请人已经以惊人的方式发现，关于本发明的方法，使用TCEP/碘乙酰胺(IAA)对允许获得非常好的收率。
本发明的另外的目的涉及分析原核细胞和/或真核细胞的肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使用根据本发明的方法从所述原核细胞和/或真核细胞获得肽，
ii)分析由此获得的肽，所述分析借助于质谱类型的分析来进行。
举例而言，在微生物学领域中，此分析肽的方法可以是鉴定来自样品的至少一种微生物的方法，例如，包括：鉴别所述微生物并且确定与所述微生物有关的分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性和毒力因子的特性。
另外的实例涉及生物标记物研究，尤其是来自复杂生物样品比如血浆、尿、脑脊液等的生物标记物。
本发明还涉及一种用于从原核细胞和/或真核细胞获得肽的试剂盒，所述试剂盒特别适合于实施根据本发明所述的方法，所述试剂盒包括：
-裂解试剂盒，其允许在低浓度离液剂下来进行原核细胞和/或真核细胞的裂解，优选地为用于通过声处理裂解的试剂盒，
-第一溶液，其包括至少一种变性剂，所述变性剂优选地选自2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤藓糖醇、三丁基膦和二硫苏糖醇，有利地，所述变性剂是三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇，
-第二溶液，其包括至少一种烷基化剂，所述烷基化剂优选地选自任何N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的组，优选地，所述烷基化剂是碘乙酰胺，
-第三溶液，其包括至少一种蛋白水解酶，比如丝氨酸蛋白酶，其优选地选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
以任选的方式，此试剂盒包括用于规定其使用方法的用法说明。
根据优选的实施方案，所述试剂盒包括：
-用于通过声处理裂解的试剂盒，
-第一溶液，其包括变性剂，所述变性剂选自2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤藓糖醇、三丁基膦和二硫苏糖醇，有利地，所述变性剂是三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇，
-第二溶液，其包括烷基化剂，所述烷基化剂包括碘乙酰胺，
-第三溶液，其包括蛋白水解酶，所述蛋白水解酶包括胰蛋白酶。
优选地，裂解试剂盒和第一溶液、第二溶液以及第三溶液适合于并且意图相连(同时)地使用，尤其如以上指示的在根据本发明的第三方面所述的方法的框架之内使用。
本发明的又一目的涉及根据本发明的试剂盒用于实施上述获得肽的方法和/或同样上述的分析肽的方法的用途。
附图简述
在参考以下附图阅读本说明书时，将更好地理解本发明、其功能、其应用以及其优势，其中：
-图1图解地显示了根据现有技术制备微生物样品的方法(P0)，此方法尤其包括在高盐浓度(胍6M-离液剂)下裂解的步骤和胰蛋白酶消化的长步骤；
-图2是显示根据本发明第一方面的方法(P1)的不同步骤的图表；
-图3显示了关于确立牛血清白蛋白(BSA)校准范围的数据，由此在本发明的所述第一方面的框架(P1)之内，允许获得在595nm处测得的光密度(OD)和蛋白质浓度(mg/ml)之间的对应；
-图4、图5和图6呈现了在分别对分析的三种微生物即大肠杆菌EC5(Escherichiacoli EC5)、表皮葡萄球菌SE9(Staphylococcus epidermidis SE9)和白色念珠菌CA16(Candida albicans CA16)的每一种实施方法P1之后获得的结果；
-图7涉及在所述方法P1的框架之内没有预热超声波探头步骤的可能结果的评估；
-图8是显示根据本发明的第三、特别有利的方面的方法(P2)的不同步骤的图表，其中使用的变性剂是TCEP(“P2-TCEP”)；
-图9是显示在P2-TCEP方案结束时对上述三种微生物，即大肠杆菌EC5、表皮葡萄球菌SE9和白色念珠菌CA16的每一种进行的LC-ESI-MS分析结果的图表；
-图10是显示根据本发明的第三、特别有利的方面的方法(P2)的不同步骤的图表，其中使用的变性剂是DTT(P2-DTT)；
-图11是显示在P2-DTT方案结束时对上述三种微生物，即大肠杆菌EC5、表皮葡萄球菌SE9和白色念珠菌CA16的每一种进行的LC-ESI-MS分析结果的图表。
发明详述
以下介绍的实施例允许更好地说明本发明。然而，这些实施例必须无论如何不被看作为以任何方式限制所述发明范围。
实施例1：方案P0
方案P0是用于制备现有技术中为从微生物获得肽的目的而常规使用的样品的方案。此方法P0尤其包括在高盐浓度(胍6M：离液剂)下裂解的步骤以及胰蛋白酶消化的长步骤。P0在下文作为参考被使用，以便评估根据本发明的第一方面(方案1)获得肽的方案的品质/效率。所述方案P0—参考图1在以下描述—持续大约24小时并且包括以下步骤：
-将在皮氏培养皿100上培养的微生物101(比如大肠杆菌型的细菌)的一到三个菌落悬浮放置在小瓶中，所述小瓶包含由100μl 6M盐酸胍、50mM pH 8的Tris-HCl组成的溶液111，并且准许裂解反应110发生大约10分钟的时间；
-在变性/还原步骤120引入包含3.5μl 150mM浓度的DTT的溶液121，以便获得最终5mM的DTT溶液；此变性/还原步骤进行大约30分钟；
-然后通过引入150mM浓度的IAA的溶液131进行烷基化步骤130，并且准许烷基化反应130发生大约45分钟，以便进行封闭(保护)硫醇对变性的蛋白质的作用；
-在胰蛋白酶消化步骤150之前，通过添加500μl包含50mM NH4HCO3的溶液141进行稀释步骤140，以便减少离液剂的高浓度(胍6M)，从而不削弱胰蛋白酶在随后的胰蛋白酶消化步骤150的酶活性；
-通过引入测得为1μg/μL的0.5μl到3μl胰蛋白酶溶液151进行此胰蛋白酶消化步骤150，准许酶消化发生6小时到20小时(允许获得肽153的持续时间)；
-在步骤160中通过添加2μl甲酸161终止所述胰蛋白酶消化150；然后
-分离由此获得的肽171—例如通过离心以消除会妨碍随后的分析步骤的不可溶物质，并且取其样品以便在必要时进行随后的分析(一种或多种分析)步骤。
实施例2：方案P1
根据本发明第一方面的方法—称为“方案P1”或“方法P1”—在以下参考图2描述。
此方案P1允许在通过例如质谱法进行随后的分析步骤之前非常快速地制备样品。方案P1所有步骤的持续时间为大约30分钟。其尤其包括以下必要步骤：
-在DTT的存在下，在超声波下裂解和还原(相连/同时地进行)5分钟，
-烷基化212：在IAA的存在下，在环境温度下并且不搅动，5分钟，
以及
酶促蛋白水解(也称酶消化)214：在胰蛋白酶的存在下，在50℃下15分钟。
如以上指示的，以大约30分钟来进行方案P1，并且给出与通过方案P0(参见实施例1-处理持续时间：24h)对分析的三种微生物，即大肠杆菌EC5(革兰氏-；在下文中指定的“EC5”)、表皮葡萄球菌SE9(革兰氏+；在下文中指定的“SE9”)和白色念珠菌CA16(酵母；在下文中指定的“CA16”)的每一种获得的结果类似的结果(MRM分析)。
设备与方法
2.1使用的产品
·BSA/Sigma/货号A9085-5G/批号：097K1513
·Bradford试剂：“Quick Start Bradford Dye Reagent 1X”/Bio-Rad/
货号500–0205/对照210006065
·甲酸/Fluka/货号：06450
·碘乙酰胺，(IAA)/Sigma/I6125-5G/批号099K5300/MM＝184.96
·DL-1.4-二硫苏糖醇99％，
(DTT)/Acros/165680010/批号A0269816/MM＝154.24
·碳酸氢铵/Sigma/A6141-500g/批号117K0039/MM＝79.06
·氢氧化铵，NH4OH/28％氨水/货号：21190292/MM＝17.03g
·胰蛋白酶/Promega/货号V511(存储于-20℃)
·“悬浮介质”(无菌水)bioMérieux(货号：70640)
·大肠杆菌菌株，ATCC NO.：11775T
·表皮葡萄球菌菌株，ATCC NO.：14990
·白色念珠菌菌株，ATCC NO.：18804
2.2缓冲溶液的制备
·4号缓冲液：50mM碳酸氢铵pH8/在+4℃存储1个月
对于50ml的缓冲液：197.6mg的碳酸氢盐qsp 50ml H2O/pH＝7.9；
添加大约10μl的NH4OH以获得pH＝8
·5号缓冲液：150mM DTT/要临时制备
对于1ml的缓冲液：23.1mg的DTT qsp 1ml4号碳酸氢盐缓冲液
·6号缓冲液：150mM IAA/要临时制备
对于1ml的缓冲液：27.7mg的IAA qsp 1ml4号碳酸氢盐缓冲液
2.3设备
·离心机“APPLI 24”/Prolabo
·1.5ml小瓶“安全锁(Safe Lock)”Eppendorf，货号：0030120.086
·“台式”离心机/Eppendorf/货号5415C
·“舒适型”恒温混匀器/Eppendorf
·酶标仪(595nm)+微孔板+模块
·分光光度计UVIKON+80μl石英比色皿
·培养皿BMX：COS(货号：43041)和SDA (货号：43555)
·DensichekPlus BioMérieux：货号：21250
·“Hielscher”超声波探头；货号：PN-66-NNN
·裂解珠0.1mm(小直径)：“氧化锆/二氧化硅珠”/Roth/N033.1
·裂解珠1mm(大直径)：“1型二氧化硅珠”/1.3mm/货号：
4504/VWR
·电桥(Bridges)/Dutscher/货号：011870A
2.4方案
2.4.1步骤200、202、204、206、208和210
首先，制备5号缓冲液(150mM DTT)和6号缓冲液(150mM IAA 150mM)。
使用“汤匙”铲称重50mg 0.1mm直径的珠(小直径珠)和50mg 1mm直径的珠(大直径珠)，并且将其引入1号小瓶中。小直径和大直径珠的混合物在图2中由数字标号2061表示。
从皮氏培养皿100中取出一至三个菌落110，并且在步骤200中将其悬浮放置在水中。由此获得的悬浮液中细菌的浓度通过常规浊度测定方法(测量550nm处的吸收)来估算。取出对应于1.108CFU的体积的悬浮液，并且然后在步骤202中在环境温度下以4000rpm离心5分钟。在此离心分离步骤202结束时，在步骤204中在100μl的4号缓冲溶液(2号小瓶)中吸附沉淀(EC5、CA16和SE9)，然后仍然在步骤204中添加3.5μl的150mM DTT(5号缓冲液)，以在2号小瓶中获得最终5mM的DTT浓度。应用漩涡2秒(最大功率)以使此2号小瓶的内容物均匀，并且用移液管吸取混合物以便在步骤206中将其转移到含有“小直径”和“大直径”的珠的混合物2061的1号小瓶中。2号小瓶被弃去。
将电桥放置在1号小瓶上，以防止其在通过声处理裂解期间打开。
然后将1号小瓶引入Hielscher超声波探头的孔的一个中(根据供应商，在探头末端处的6个孔被认为是相同的)，并且然后安排5分钟的时间来进行裂解/还原208(设置振幅100/循环1)；小瓶中的混合物的温度达到大约95℃。
1号小瓶借助于通过电桥托住小瓶的“杠杆”被从探头的孔移出，然后在步骤210中通过将此1号小瓶在冰中存储1分钟使其冷却，以便使小瓶中混合物的温度返回到环境温度。
然后使此1号小瓶借助于台式离心机短暂地离心(在步骤210结束时)，以便回收存在于盖中和壁上的液体。
2.4.2烷基化步骤212(通过使用IAA甲基化封闭蛋白质的二硫桥)
在步骤212中将9μl的150mM IAA溶液(6号缓冲液)添加到1号小瓶中，以获得12.5mM的最终摩尔浓度，为了均化，所述1号小瓶然后被涡旋2秒(最大功率)。
在环境温度下在没有光时，准许烷基化反应212进行5分钟。
在此阶段，两种选择是可能的，即：
-方案P1随后是使用预定量的胰蛋白酶的胰蛋白酶消化步骤214(参见以下2.4.4部分)，或者
-在此胰蛋白酶消化步骤214(也称胰酶促蛋白水解)之前进行蛋白质分析213，其在仅用来实施蛋白质分析213的编号3的小瓶中执行，以便按烷基化步骤212结束时分析的蛋白质浓度的函数来估算要在胰蛋白酶消化步骤214添加的胰蛋白酶的量。
2.4.3蛋白质分析213(根据Bradford法)
对以14000rpm持续5分钟离心的裂解物的上清液进行蛋白质分析。因此在第一阶段中，需要涡旋1号小瓶(裂解物的均化)，并且然后用移液管从所述1号小瓶吸取裂解物(常常回收一部分0.1mm珠)，以使此裂解物转移到小瓶(3号小瓶)中，并使此3号小瓶在14000rpm下离心持续5分钟。然后对上清液进行分析。包含剩余珠的3号小瓶被弃去。
蛋白质的量作为BSA的校准范围的函数来估算，该BSA的校准范围在碳酸盐缓冲液中稀释并且与经离心的裂解物平行分析(范围由1mg/ml的BSA溶液以及然后制备0.1/0.2/0.3/0.4/0.6/0.8mg/ml以及1mg/ml溶液确定)。
通过在595nm处读取的光密度(OD)，在微孔板上，在200μl Bradford试剂中，对4μl离心的裂解物的上清液和4μl所述范围的每种溶液进行分析。
图3中示出了校准范围的实例。
2.4.4蛋白质的胰蛋白酶消化214
预先使恒温混匀器在50℃下预热15分钟。
使用临时吸附的胰蛋白酶溶液：一瓶20μg的Promega胰蛋白酶在包含在试剂盒中的20μl吸附溶液中(最终浓度1μg/μL)。
如对本领域技术人员已知的，胰蛋白酶的最大活性发生在7/9的pH处。
如果已经在步骤213中进行蛋白质分析，在步骤214中添加1μg/μl的胰蛋白酶，其中蛋白酶/蛋白质比率按重量计(w/w)为1/10，或者对于10μg蛋白质为1μl(＝1μg)。
相反地，如果在烷基化步骤212和胰蛋白酶消化步骤214之间并未进行这种蛋白质分析213，则在步骤214中以10μL的标准量将1μg/μl的胰蛋白酶引入1号小瓶中。实际上，申请人已经确定，胰蛋白酶的此标准量允许在关于期望的肽分析应用的许多微生物的所有相干条件下获得满意的胰蛋白酶消化。
仍在步骤214中，并且继添加胰蛋白酶之后，涡旋混合物2秒(最大功率)，以用于均化。
然后此混合物在50℃下以850rpm在恒温混匀器中培育15分钟。
2.4.5终止胰蛋白酶消化216
胰蛋白酶消化的终止由步骤216中在1号小瓶中添加甲酸(qsp pH在4以下)来实现。的确，胰蛋白酶在低于4的pH下变得无活性(此现象是可逆的并且胰蛋白酶在pH大于或等于4下变得再次有活性)。
在添加0.5μl的甲酸之前，样品的pH为大约8(用pH计/微管专用探头验证的pH)。在步骤216中添加甲酸之后，样品的pH为大约3。然后涡旋混合物2秒(最大功率)以用于均化。
2.4.6步骤218、220、222和224
由胰蛋白酶消化而产生的肽在上清液中。
用移液管吸取1号小瓶的上清液(常常回收一部分0.1mm珠)，并且在步骤218中使其转移到另一小瓶(4号小瓶)中，并且然后在步骤220中在4℃的温度下以15000g离心30分钟。
然后在步骤222中回收85μl包含肽的上清液，并且在步骤224中将所述上清液引入另一小瓶(5号小瓶)中。5号小瓶被存储在-20℃的冰箱中。
然后通过MRM来分析包含在5号小瓶中的肽，以便确定方案P1的品质/效率(确认结果的步骤)。这些分析结果在以下呈现。
2.5结果确认
如以上指示的，用于获得肽的此方案P1通过MRM来确认。研究的三种微生物(EC5、SE9和CA16)的每一种的结果分别在图4、图5和图6中呈现。
图4显示了用方案P1从1e8 CFU的大肠杆菌EC5获得的肽的MRM模式中分析的结果。实验重复三次(柱EC1、EC2、EC3)并且与从使用方案P0的相同接种物(有阴影线的柱)获得的结果相比较。柱代表在MRM模式中通过LC-ESI-MS分析获得的质谱图中可以正确检测的肽的峰下的面积的总和。此总面积代表获得的信号的强度并且与被分析的溶液中对应的肽的浓度有关联。此面积越大，此浓度越高。图形还指明(由线连接的点)对于已经被选出的分析设置，可能60的总数中正确检测的肽的数目。
第一个图形(图4的上部)示出通过标准化存在于由LC-ESI-MS分析的样品中的蛋白质的量获得的数据。第二个图形(图4的下部)示出通过更改反应产物P1的体积以便分析1e7初始CFU的等同物获得的数据。在此情况下，在峰下的面积的比较允许从不同样品获得的总产率的比较。
总之，看起来：
-对于在检测到的肽的峰下的总累积面积，方法P1是可以再现的，这意味着这些峰的强度总的来说是可以再现的，并且暗示方案的不同步骤的产率是可以再现的，
-就关于EC5检测到的肽的数目而言，此方法等同于参考方法P0(实施例1中介绍的)，
-此方法P1比在方案P0的条件下允许更有效的胰蛋白酶消化，如消化之前等量蛋白质质量的分析P1比P0导致更大的肽信号强度这一事实所证明的。
-相反地，对于在方案开始时同等数量的细菌，肽检测强度对于两种方案是等同的，这将似乎暗示方案P1的预消化步骤比方案P0中的预消化步骤效率低。
图5是在其中研究的微生物是表皮葡萄球菌SE9的情况下，图4中第一个图形(上部中)的等效图形。根据此图5，看来以上在大肠杆菌EC5的情况下得出的结论还在细菌的其他物种—尤其表皮葡萄球菌SE9的情况下有效。当在P0条件下注入的蛋白质的等效质量小于在P1条件下注入的蛋白质的等效质量时，这特别正确。
总之，并且尽管事实是对于P0注入的量较小，但关于SE9的肽的检测，方法P1可以被认为至少等同于P0。
就其本身而言，图6示出了关于CA16的肽的检测：
-对于面积的总和，方法P1是可再现的，并且
-此方法优于参考方法P0。
2.6预热超声波探头步骤的影响
以上详述的方案P1包括通过允许Hielscher”超声波探头在之后用于方案P1的裂解步骤的条件下运转“空”1小时来预热“此探头的步骤。在这些条件下，探头的振动块的温度为大约95℃。此预热步骤对减少超声波探头的寿命敏感，申请人已经力图确定在方案P1的框架之内省略所述预热此超声波探头的步骤的可能结果。如此修改的方案P1被称为P1’。
图7显示了在超声探头的不同操作时间(0、20、40、60、80分钟，时间0分钟对应于在环境温度下足以使振动块不活动的时间之后使用的探头的应用)之后，通过声处理裂解和还原208(参见图2)的步骤之后被分析的蛋白质的量。蛋白质浓度通过Bradford测试来确定并且在图形上示出并且以1e8细菌细胞的μg数表示。
此分析可以通过Bradford法或者通过对本领域技术人员已知的任何其他合适的方法来实施。
在此图7中示出的结果证实没有必要在探头用来获得高品质细菌裂解之前预热探头。
此外，MRM分析还证实，不预热用来进行裂解(方案P1’)的超声波探头的三种菌株EC5、SE9和CA16的胰蛋白酶消化试验给出优于参考方案P0的结果。
除根据本发明用于获得肽的方法固有的优势(参见以上)之外，这些方法允许在通过声处理裂解的框架之内，免除预热超声波探头的现有步骤。这尤其导致所述超声波探头增加的寿命以及能源节省。
实施例3：方案P2
称为“方案P2”(或者“方法P2”)的本发明的第三方面参考图8在以下描述。此方法P2在本发明的上下文之内是特别优选的。
在此实施例3中，使用方法P2来从微生物获得肽。
此方法P2是用于从原核细胞和/或真核细胞非常快速地获得肽的方案，其尤其可以在通过质谱类型的分析步骤之前使用。
正如方案P1，此方案P2也以大约30分钟进行，但将裂解、变性/还原、烷基化和酶消化的步骤合并为单个步骤810。实际上，这些不同的步骤在单个并且相同的小瓶中在50℃下在超声下相连/同时地来进行30分钟。因此，没有必要进行这些步骤之间的手动干预，也没有必要在方法期间添加试剂。因此方案P2易于自动化、避免可能的操作错误并且允许使用较小的体积。此外，其还允许分析比如以上解释的复杂样品(尿、血浆、脑脊液)。
对于分析的三种微生物中的两种：大肠杆菌(革兰氏-)和表皮葡萄球菌(革兰氏+)，在肽的数目上和在累积面积两者上，此方案P2均给出与实施例2中描述的方案P1的结果相似的结果(LC-ESI-MS分析)。
设备和方法
3.1使用的产品
·甲酸/Fluka/货号：06450
·碘乙酰胺，(IAA)/Sigma/I6125-5G/MM＝184.96
·三(2-羧乙基)膦(TCEP)盐酸盐0.5M溶液/Sigma/646547
·碳酸氢铵/Sigma/A6141-500 g/MM＝79.06
·氢氧化铵，NH4OH/28％氨水/货号：21190292/MM＝17.03g
·胰蛋白酶/Promega/货号V511(存储于-20℃)
·“悬浮介质”(无菌水)bioMérieux(货号：70640)
·大肠杆菌菌株，ATCC NO.：11775T
·表皮葡萄球菌菌株，ATCC NO.：14990
·白色念珠菌菌株，ATCC NO.：18804
3.2缓冲溶液的制备
·4号缓冲液：50mM碳酸氢铵pH8/在+4℃下存储1个月
对于50ml的缓冲液：197.6mg的碳酸氢盐qsp 50ml H2O/pH＝7.9；
添加大约10μl的NH4OH以获得pH＝8
·5’号缓冲液：150mM TCEP/要临时制备/在4号缓冲液中稀释
·6号缓冲液：150mM IAA/要临时制备
对于1ml的缓冲液：27.7mg的IAA qsp 1ml4号碳酸氢盐缓冲液
3.3设备
·离心机“APPLI 24”/Prolabo
·1.5ml小瓶；“安全锁”Eppendorf，货号：0030120.086
·“台式”离心机/Eppendorf/货号5415C
·分光光度计UVIKON+80μl石英比色皿
·BMX培养皿BMX：COS(货号：43041)和SDA(货号：43555)
·“Hielscher”超声波探头；货号：PN-66-NNN
·0.1mm的裂解珠(小直径)：“氧化锆/二氧化硅珠”/Roth/N033.1
·1mm裂解珠(大直径)：“1型二氧化硅珠”/1.3mm/货号：
4504/VWR
·电桥/Dutscher/货号：011870A
3.4方案
3.4.1预备步骤800、802、804和806
在实践中，首先，制备5’号缓冲液(500mM TCEP的溶液在4号碳酸氢盐缓冲液中稀释到150mM)和6号缓冲液(在4号碳酸氢盐缓冲液中的27.7mg/ml的IAA)。
然后，使用“汤匙”铲称重50mg的0.1mm直径的珠和50mg的1mm直径的珠，并且将其引入具有1.5ml的容量的小瓶中。如以上指示的，“小直径”珠和“大直径”珠的混合物也在图8中通过数字标号8061来指明。
从皮氏培养皿100中取出一至三个菌落110，在步骤800中将其悬浮放置在水中。由此获得的悬浮液中细菌的浓度通过常规浊度测定方法(测量550nm处的吸收)来估算。取出对应于1.108CFU的体积的悬浮液，并且然后在步骤802中在环境温度下以4000rpm离心5分钟。在此离心步骤802结束时，在步骤804中在100μl的4号缓冲溶液(2号小瓶)中吸附沉淀(EC5、CA16和SE9)，并且然后仍然在步骤804中添加3.5μl的150mM TCEP(5’号缓冲液)，以在2号小瓶中获得最终5mM的TCEP浓度。应用漩涡2秒(最大功率)以使此2号小瓶的内容物均匀，并且用移液管吸取此混合物以便在步骤806中将其转移到含有8061珠的1号小瓶中。然后2号小瓶被弃去。
3.4.2步骤808、810和812
然后在步骤808中将以下引入到1号小瓶中：
-9μl的150mM的IAA溶液(6号缓冲液)，以便获得12.5mM的最终摩尔浓度；以及
-10μl的1μg/μl胰蛋白酶。
在此之后，为了均化，应用涡旋2秒(最大功率)。
将电桥放置在1号小瓶上，以防止其在通过声处理裂解期间打开。
然后将此1号小瓶引入Hielscher探头的孔的一个中(根据供应商，在探头末端处的6个孔被认为是相同的)，并且然后安排30分钟的时间(设置振幅100/循环0.5)以便允许裂解反应、还原反应、烷基化反应和胰蛋白酶消化反应相连/同时地发生。1号小瓶中的混合物的温度在步骤810达到大约50℃。
然后，1号小瓶借助于通过电桥托住小瓶的“杠杆”从探头的孔移出，然后在步骤812中通过使此1号小瓶在冰中存储1分钟使其冷却，以便使小瓶中混合物的温度返回到环境温度。
总之，主要步骤810允许以下的相连/同时发生：
a.细菌的裂解/蛋白质的还原(TCEP破坏二硫桥)：获得变性的/还原的蛋白质
b.烷基化：通过用IAA甲基化封闭蛋白质的二硫桥的步骤
c.蛋白质的胰蛋白酶消化：获得肽。
3.4.3终止胰蛋白酶消化814
终止胰蛋白酶消化通过在步骤814中在1号小瓶中添加甲酸(qsp pH在4以下)来进行。如以上指示的，使pH降到低于4的事实可逆地使胰蛋白酶的酶活性失活。
在添加0.5μl的甲酸之前，样品的pH为大约8(用pH计/微管专用探头验证的pH)。在步骤814中添加甲酸之后，样品的pH为大约3。然后涡旋混合物2秒(最大功率)，以用于均化。
3.4.4步骤816、818、820和822
在主要步骤810结束时获得的肽在上清液中。因此用移液管吸取后者(常常回收一部分0.1mm珠)并且在步骤816中使其转移到另一个小瓶(3号小瓶)中，并且然后在步骤818中以15000g并且在4℃下离心30分钟。
然后在步骤820中回收90μl包含肽的上清液，并且在步骤820中将所述上清液引入另一小瓶(4号小瓶)中。4号小瓶被存储在-20℃的温度的冰箱中。
3.5结果确认
然后，包含在4号小瓶中的肽通过LC-ESI-MS来分析，以便确定裂解方案P2的品质/效率(确认结果的步骤)。对于研究的三种微生物中的每一种的结果在图9中呈现。所述方案P2根据用作本实施例3中的变性剂TCEP而在此图9中被指定为“P2-TCEP”。
如以上解释的，在此图9中示出的值对应于正确检测的靶向的肽的数目以及在MRM模式中通过LC-ESI-MS获得的质谱中的这些肽的峰之下的累积面积。
如此图9中示出的，对于分析的三种微生物中的两种，即大肠杆菌和表皮葡萄球菌，此方案P2产生与通过以上提到的方案P1获得的结果相似的结果。如以上指示的，根据本发明获得肽的方法(方案)落入制备原核细胞和/或真核细胞的样品用于其随后分析的框架内。
实施例4：使用DTT的方案P2(“P2-DTT”)
用另一变性剂，即DTT更换TCEP来重现以上实施例3的方案P2目标。为了清楚的目的，使用DTT的此方法P2被称为“P2-DTT”。
以下参考图10来描述方案P2-DTT。
对于分析的三种微生物中的两种：大肠杆菌(革兰氏-)和表皮葡萄球菌(革兰氏+)，在肽的数目上和在累积面积两者上，此方案P2-DTT均给出与实施例2中描述的方案P1相似的结果(LC-ESI-MS分析)。
设备和方法
4.1使用的产品
·甲酸/Fluka/货号：06450
·碘乙酰胺，(IAA)/Sigma/I6125-5G/MM＝184.96
·DL-1.4-二硫苏糖醇99％，
·(DTT)/Acros/165680010/批号A0269816/MM＝154.24
·碳酸氢铵/Sigma/A6141-500 g/MM＝79.06
·氢氧化铵，NH4OH/28％氨水/货号：21190292/MM＝17.03g
·胰蛋白酶/Sigma/T0303(存储于-20℃)
·“悬浮介质”(无菌水)bioMérieux(货号：70640)
·大肠杆菌菌株，ATCC NO.：11775T
·表皮葡萄球菌菌株，ATCC NO.：14990
·白色念珠菌菌株，ATCC NO.：18804
4.2缓冲溶液的制备
·4号缓冲液：50mM碳酸氢铵pH8/在+4℃下存储1个月
对于50ml的缓冲液：197.6mg的碳酸氢盐qsp 50ml H2O/pH＝7.9；
添加大约10μl的NH4OH以获得pH＝8
·5号缓冲液：150mM DTT/要临时制备
对于1ml的缓冲液：23.1mg的DTT qsp 1ml4号碳酸氢盐缓冲液
·6号缓冲液：150mM IAA/要临时制备
对于1ml的缓冲液：27.7mg的IAA qsp 1ml4号碳酸氢盐缓冲液
4.3设备
·离心机“APPLI 24”/Prolabo
·1.5ml小瓶；“安全锁”Eppendorf，货号：0030120.086
·“台式”离心机/Eppendorf/货号5415C
·分光光度计UVIKON+80μl石英比色皿
·BMX培养皿：COS(货号：43041)和SDA(参照：43555)
·“Hielscher”超声波探头；货号：PN-66-NNN
·0.1mm裂解珠(小直径)：“氧化锆/二氧化硅珠”/Roth/N033.1
·1mm裂解珠(大直径)：“1型二氧化硅珠”/1.3mm/货号：
4504/VWR
·电桥/Dutscher/货号：011870A
4.4方案
4.4.1预备步骤1000、1002、1004和1006
首先，制备5号缓冲溶液(150mM DTT)和6号缓冲溶液(150mM IAA)。
然后，使用“汤匙”铲称重50mg的0.1mm直径的珠和50mg的1mm直径的珠，并且将其引入具有1.5ml的容量的小瓶中。如以上指示的，“小直径”珠和“大直径”珠的混合物也在图10中通过数字标号10061来指明。
从皮氏培养皿100中取出一至三个菌落110，并且在步骤1000中将其悬浮放置在水中。由此获得的悬浮液中细菌的浓度通过常规浊度测定方法(测量550nm处的吸收)来估算。取出对应于1.108CFU的体积的悬浮液，并且然后在步骤1002中在环境温度下以4000rpm使悬浮液离心5分钟。在此离心步骤1002结束时，在步骤1004中在100μl的4号缓冲溶液(2号小瓶)中吸附沉淀(EC5、CA16和SE9)，然后仍然在步骤1004中添加3.5μl的150mM DTT(5号缓冲液)，以在2号小瓶中获得最终5mM的DTT浓度。应用漩涡2秒(最大功率)以使此2号小瓶的内容物均匀，并且用移液管吸取此混合物以便在步骤1006中将其转移到含有10061珠的1号小瓶中。然后2号小瓶被弃去。
4.4.2步骤1008、1010和1012
然后在步骤1008中将以下引入到1号小瓶中：
-9μl的150mM的IAA溶液(6号缓冲液)，以便获得12.5mM的最终摩尔浓度；以及
-10μl的1μg/μl胰蛋白酶。
在此之后，为了均化，应用涡旋2秒(最大功率)。将电桥放置在1号小瓶上，以防止其在通过声处理裂解期间打开。
然后将此1号小瓶引入Hielscher探头的孔的一个中(根据供应商，在探头末端处的6个孔被认为是相同的)，并且然后安排30分钟的时间(设置振幅100/循环0.5)以便允许裂解反应、还原反应、烷基化反应和胰蛋白酶消化反应相连/同时地发生。1号小瓶中的混合物的温度在步骤1010达到大约50℃。
然后，1号小瓶借助于通过电桥托住小瓶的“杠杆”从探头的孔被移出，并且然后在步骤1012中通过将此1号小瓶在冰中存储1分钟使其冷却，以便使小瓶中混合物的温度返回到环境温度。
总之，主要步骤1010允许以下反应相连/同时地发生：
a.细菌的裂解/蛋白质的还原(DTT破坏二硫桥)：获得变性的/还原的蛋白质
b.烷基化：通过用IAA甲基化封闭蛋白质的二硫桥的步骤
c.蛋白质的胰蛋白酶消化：获得肽。
4.4.3终止胰蛋白酶消化1014
终止胰蛋白酶消化通过在步骤1014中在1号小瓶中添加甲酸(qsp pH低于4)来进行。如以上指示的，使pH降到低于4的事实可逆地使胰蛋白酶的酶活性无效。
在添加0.5μl的甲酸之前，样品的pH为大约8(用pH计/微管专用探头验证的pH)。在步骤1014中添加甲酸之后，样品的pH为大约3。然后涡旋混合物2秒(最大功率)，以用于均化。
4.4.4步骤1016、1018、1020和1022
在主要步骤1010结束时获得的肽在上清液中。因此用移液管吸取后者(常常回收一部分0.1mm珠)并且在步骤1016中使其转移到另一个小瓶(3号小瓶)中，并且然后在步骤1018中以15000g并且在4℃下离心30分钟。
然后在步骤1020中回收90μl的包含肽的上清液，并且在步骤1022中将所述上清液引入另一小瓶(4号小瓶)中。4号小瓶被存储在-20℃的温度的冰箱中。
4.5结果确认
然后，包含在4号小瓶中的肽通过LC-ESI-MS来分析，以便确定裂解方案P2-DTT的品质/效率(确认结果的步骤)。对于研究的三种微生物中的每一种的结果在图11中呈现。
如以上解释的，在此图11中示出的值对应于正确检测的靶向的肽的数目以及在MRM模式中通过LC-ESI-MS获得的质谱中的这些肽的峰之下的累积面积。
如此图11中示出的，对于分析的三种微生物中的两种，即大肠杆菌和表皮葡萄球菌，此使用DTT的方案P2产生与通过以上提到的方案P1获得的结果相似的结果。白色念珠菌获得的对于肽的数目的结果是令人满意的。
此外，证明使用DTT代替TCEP作为变性剂对肽的数目或者对总的累积面积没有明显影响。
如以上指示的，根据本发明获得肽的方法(方案)落入制备原核细胞和/或真核细胞的样品用于其随后分析的框架内。
这些样品的分析可以尤其允许生物标记物研究并且特别可以被应用于比如血浆、尿、脑脊液等的复杂生物样品分析。
在微生物学领域，通过根据本发明的方法获得的肽可以允许鉴定来自样品的至少一种微生物，例如，包括：鉴别所述微生物并且确定与所述微生物有关的分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性和毒力因子的特性。
此鉴定至少一种微生物的方法可以证明在医学、药学或农产品领域中是特别有用的。
分型、对至少一种抗微生物剂的抗性和毒力因子的特性的确定使用作为所述分型、对至少一种抗微生物剂的抗性和毒力因子的特性的标记物的蛋白质、肽和/或代谢物通过质谱法来进行。优选地，质谱法是MS/MS型，有利地，此质谱法是MRM。
优选地，分型、对至少一种抗微生物剂的抗性和毒力因子的产品的确定在相同的质谱装置中同时进行。
最佳地，MS/MS型的质谱以及有利地，MRM型的质谱，可以被设想为来确认微生物的鉴别的确认步骤。
实际上，微生物的鉴定在临床领域中和在工业领域中都是基本的。因此，例如，对抗微生物剂—比如抗生素的抗性的鉴别以及毒力因子的检测是确保患者的最佳治疗的基本要素。类似地，分型对于流行病学研究以及对于防治医院疾病是至关重要的。
“微生物分型”被理解为相同物种内几种菌株的区分。分型具有流行病学意义，临床医生了解在患者中分离的菌株与如在其他患者中或在环境中分离的其他表面上相同的菌株是否来自相同来源。这因此允许在医院内或者在食物中毒的情况下来揭示感染的来源。作为细菌中分型特性的标记物的非限制性实例，可以引用呈现如下的特征性的突变的肽，比如大肠杆菌的基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA的转录产物，以及比如金黄色葡萄球菌的基因arc、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL的那些转录产物。作为原生动物中分型特性的标记物的非限制性实例，可以引用溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)和迪斯帕内阿米巴(E.dispar)的几丁质酶基因的产物。作为病毒中分型特性的标记物的非限制性实例，可以引用人免疫缺陷病毒的聚合酶基因的产物。最后，作为酵母中分型特性的标记物的非限制性实例，可以引用白色念珠菌的基因片段aat1a、acc1、adp1、mpib、sya1、vps13和zwf1b的转录产物。
确定对至少一种抗微生物剂的抗性被理解为确定微生物对抗微生物剂破坏的易感性。因此，如果微生物是细菌，可以针对其形成抗性的抗微生物剂是抗生素；如果微生物是原生动物，抗微生物剂是抗寄生虫剂；如果其为病毒，抗微生物剂是抗病毒剂，并且如果其是酵母，抗微生物剂是抗真菌剂。参与抗性机制的蛋白质将根据科以及种而不同。作为对可用于细菌的至少一种抗生素抗性的标记物的非限制性实例，可以引用金黄色葡萄球菌的MecA基因的转录产物，其赋予对甲氧西林的抗性并且允许指示菌株是否是甲氧西林抗性的(MRSA菌株)还是甲氧西林敏感的(MSSA菌株)。还可以引用蛋白质TEM-2，其允许指示大肠杆菌的菌株是否对青霉素是抗性的，而对头孢菌素型或碳青霉烯型的其他种类的抗生素敏感。另一标记物是称作KPC(对于肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)碳青霉烯酶)的酶，其赋予对碳青霉烯类的抗性。对于金黄色葡萄球菌的抗性标记物的另一实例是表达对万古霉素抗性的新陈代谢谱(metabolic profile)，比如Alexander等人在呈递至2009年ASMS会议的公告“Metabolomics-based approach to antibiotic resistance inStaphylococcus aureus(对金黄色葡萄球菌中抗生素抗性的基于代谢组学的方法)”中描述的。作为对至少一种可用于原生动物的抗寄生虫剂抗性的标记物的非限制性实例，可以引用含铁的超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和过氧还蛋白(peroxiredoxin)，其增加的表达赋予对甲硝唑的抗性。作为对至少一种可用于病毒的抗病毒剂抗性的标记物的非限制性实例，可以引用人免疫缺陷病毒的逆转录酶的突变，其赋予对核苷逆转录酶抑制剂降低的敏感性。最后，作为对至少一种可用于酵母的抗真菌剂抗性的标记物的非限制性实例，可以引用白色念珠菌的酶1-3-b-D-葡聚糖合成酶的突变，其赋予对棘球白素(echinocandin)降低的敏感性。作为另外的实例，可以提到对白色念珠菌中唑类抗真菌剂的抗性—尤其氟康唑的抗性。氟康唑的靶是酶羊毛甾醇脱甲基酶，其参与真菌壁的主要成分麦角固醇()的合成。对氟康唑的抗性可能与编码羊毛甾醇脱甲基酶的erg11基因中点突变的出现相关。
“确定微生物的毒力”被理解为评估微生物的病原性、伤害性以及毒力性。作为细菌中毒力标记物的非限制性实例，可以引用存在于金黄色葡萄球菌中的具有两种增效成分(Lukfet LukS)的细胞裂解毒素PVL(Panton-Valentine杀白细胞素)，其是引起皮肤受累(skin involvement)、广泛蜂窝组织炎(extensive cellulitis)、骨髓炎和坏死性肺炎的最具毒性的毒素之一，并且参与病毒超感染。其他实例包括：存在于肺炎链球菌中的自溶素和肺炎球菌溶血素，所述肺炎链球菌是造成呼吸道感染、脑膜炎和菌血症的原因的物种；以及艰难梭菌的毒素A和B，所述艰难梭菌是肠道的共生细菌，其对肠上皮细胞的渗透性造成损害(毒素A)或直接攻击上皮细胞(毒素B)，或者随着时间降低肠道运输和肠道吸收，引起腹泻(毒素A和毒素B的组合作用)。还可以引用存在于大肠杆菌中的志贺毒素Stx1和Stx2作为实例。这两种细胞毒素被认为是肠出血性大肠杆菌的重要毒力因子。这两种细胞毒素造成并发症，比如出血性结肠炎或溶血性尿毒症综合征的原因。作为原生动物中非限制性的毒力标记物，可以引用存在于溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)中的抗氧化剂(Fe-氢化酶2、过氧还蛋白、超氧化物歧化酶)，溶组织内阿米巴是造成痢疾、肝脓肿的原因的物种。作为病毒中毒力标记物的非限制性实例，可以引用人类中最致病的类型1-型人免疫缺陷病毒中的Nef蛋白的变体。最后，作为酵母中非限制性的毒力标记物，可以引用白色念珠菌中的脂肪酶8，白色念珠菌不仅是造成浅表念珠病也是造成败血症性念珠菌病以及弥撒性念珠菌病的原因的物种。应注意，特异性毒力标记物还可用作分型标记物。
能够通过此类型的分析方法来表征的细菌的实例可以引用：
-大肠杆菌，使用TEM-2作为抗性和分型标记物，以及志贺毒素、OmpA作为毒力和分型标记物。
-粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和尿肠球菌(Enterococcus faecium)，使用VanA和VanB用于抗性和分型，以及ESP(肠球菌表面蛋白)用于毒力和分型，或
-金黄色葡萄球菌，使用称作免疫球蛋白G-结合蛋白A的蛋白(也称作蛋白A)用于分型，蛋白PBP2a用于抗性或者甚至分型，以及蛋白PVL用于毒力或者甚至还用于分型。
能够通过以上提到的分析方法来表征的其它微生物可以引用：
-白色念珠菌，使用1,3-b-D-葡聚糖合成酶或者酶羊毛甾醇脱甲基酶作为抗性和分型标记物，以及脂肪酶8作为毒力和分型标记物。
根据本发明的原核细胞和/或真核细胞可以从能够含有靶微生物的任何样品获得。所述样品可以为生物来源，动物、植物或者人。然后其可对应于生物体液样品(例如全血、血清、血浆、尿、脑脊液、器官分泌物)、组织样品或者分离的细胞。此样品在所述微生物的鉴定标记物在分析的样品中可获得的范围内可以如此使用，或者其在分析之前可以根据本领域技术人员已知的方法经受富集、提取、浓缩、纯化、培养类型的制备。
样品可以是工业来源的，或者根据非穷举的列表，空气样品、水样品、取自表面、片或制造的产品的样品、食物来源的产品。在食物来源的样品中，可以非穷举地引用乳制品样品(酸奶，奶酪)、肉、鱼、蛋、水果、蔬菜、水、饮料(奶，果汁，苏打水等)。这些食物来源样品也可以来自调料或准备好的菜肴。最后，食物样品可以来自动物饲料，比如尤其动物餐(animal meals)。
在根据本发明的分析方法中采用的质谱法作为分析和检测不同类型的分子的强大工具对本领域技术人员广泛已知。通常，能够被电离的任何类型分子均可以借助于质谱仪根据其分子量变化来检测。根据要被检测的蛋白质或代谢物源的分子的性质，某些质谱技术可能更加适合。然而，无论何种质谱方法用于检测，检测包括使靶分子电离成为称作分子离子的电离步骤以及获得的分子离子根据其分子量分离的步骤，所述电离步骤在本申请情况下为鉴定标记物的电离步骤。
因此所有质谱仪都包括：
i)意图使存在于待被分析的样品中的标记物电离的电离源，即赋予这些标记物正电荷或负电荷；
ii)意图根据其质量与电荷的比率(m/z)的变化分离电离的标记物或者分子离子15的质量分析仪；
iii)意图测量由分子离子直接产生的或者由从分子离子产生的离子产生的信号的检测仪，如以下详细描述。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来进行使用质谱仪必需的电离步骤。电离源允许使要被分析的分子成为气体状态和离子状态。电离源可以以研究正离子的正模式来使用，或者以研究负离子的负模式来使用。存在一些类型的电离源，并且其将根据需要的结果和分析的分子来使用。尤其可以引用的是：
-电子电离(EI)、化学电离(CI)以及解吸-化学电离(DCI)，
-快速原子轰击(FAB)、亚稳态原子轰击(MAB)或者离子轰击(SIMS，LSIMS)，
-电感耦合等离子体(inductively coupled plasma)(ICP)
-大气压化学电离(APCI)及大气压光化电离(APPI)
-电雾化或电喷雾电离(ESI)
-通过MALDI的激光辅助解吸-电离(MALDI)、表面增强的激光辅助解吸-电离或者在硅上的激光辅助解吸-电离
-通过与亚稳态物质(metastable species)相互作用的电离-解吸(DART)。
特别地，电离可以如下来使用：将包含靶分子的样品引入电离源中，其中分子被电离成气态，并且因此被转换成对应于原始分子的分子离子。电喷雾型电离源(ESI，ElectroSpray Ionisation)允许电离分子，同时引起其从液态转换为气态。然后获得的分子离子对应于以液态存在的分子，在正模式中具有一个、两个或者甚至三个另外的质子或更多个另外的质子，并且因此为一个、两个或者甚至三个电荷或更多个电荷的载体。例如，当靶分子是蛋白质时，借助于以正离子模式运行的电喷雾类型来源，电离在靶蛋白质分级分离之后获得的酶促蛋白水解肽，导致气态的多肽离子并且允许从液态转换为气态[18]，所述多肽离子具有一个、两个或者甚至三个另外的质子或更多个另外的质子，其因此为一个、两个或者甚至三个电荷或更多个电荷的载体。当靶分子或获得的酶促蛋白水解肽预先通过反相液相色谱分离时，此类型的电离源特别适合。然而，存在于样品中的分子的电离收率可以根据存在的不同物种的浓度和性质而变化。这种现象导致对本领域技术人员熟知的基质效应。
MALDI电离源将允许来自固态样品的分子的电离。
在其中根据其质量/电荷比率(m/z)来分离电离的标记物的质量分析仪是对本领域技术人员已知的任何质量分析仪。可以引用的是四极(quadripole，quadrupole)(Q)、3D(IT)或者线性离子阱(LIT)类型的低分辨率分析仪，也称作离子阱；以及高分辨率分析仪，其允许测量分析物的精确质量，并且其特别使用结合至电力区(electrical sector)的磁力区(magnetic sector)、飞行时间(TOF)。
根据其m/z比率分离分子离子可以单次(单一质谱法或MS)采用，或者可以进行几次连续的MS分离。当进行两次连续MS分离时，该分析被称作MS/MS或MS2。当进行三次连续MS分离时，该分析被称作MS/MS/MS或MS3，并且更通常地，当进行n次连续MS分离时，该分析被称作MSn。
在采用几次连续分离的技术中，在检测或分析单一靶分子的情况下的模式SRM(选择的反应监测)或者在检测或分析几个靶分子的情况下的模式MRM(多反应监测)中，特别使用MS2分离。相似地，MRM3模式特别使用MS/MS/MS分离。然后使用所谓的靶向质谱法。
在单一MS模式检测的情况下，检测的是与获得的靶分子相关的分子离子的质量/电荷比率。
在MS/MS模式检测的情况下，与MS分析相比基本上加上两个步骤，这两个步骤是：
i)使分子离子碎裂，然后称作先驱离子，以给出称作第一代碎片离子的离子，以及
ii)根据其质量(m/z)2分离称作第一代碎片离子的离子，比率(m/z)1对应于先驱离子的比率(m/z)。
然后检测因此获得的与靶分子相关的第一代碎片离子的质量/电荷比率。术语“第一代碎片离子”被理解为在碎裂步骤后由先驱离子发出的离子，并且其质量与电荷的比率m/z与先驱离子不同。
成对的(m/z)1和(m/z)2被称作跃迁(transition)，并且其代表要被检测的特征性离子。
被检测的以与靶分子关联的特征性离子的选择由本领域技术人员根据标准方法来进行。其选择将有利地导致分析在再现性和可靠性方面尽可能地灵敏、尽可能地特异性及尽可能地稳固。在开发用于选择酶促蛋白水解肽(m/z)1及第一代碎片(m/z)2肽的方法中，所述选择基本上基于反应的强度。更详细的描述可参见V.Fusaro等人[4]。本领域技术人员可使用商购的软件比如出自Applied Biosystems或MRMaid[5]的MIDAS软件和MRM Pilot软件，以允许预测所有可能的跃迁对(transition pairs)。还可以求助于由F.Desiere等人[6]构建的称作PeptideAtlas的数据库，以汇编由科学界描述的肽的所有MRM跃迁。此PeptideAtlas库可以在互联网上免费获得。
选择(例如通过胰蛋白酶消化获得的；参见以上)酶促蛋白水解肽(m/z)1和(m/z)2的可替代的方法包括使用在其它研究期间获得的MS/MS碎裂谱。这些研究可以是例如通过蛋白质组分析发现和鉴别生物标记物的阶段。此方法已经由Thermo Scientific在用户会议期间提出[5]。这允许通过SIEVE软件(Thermo Scientific)从在实验室鉴别的肽中产生候选跃迁列表。对于(m/z)1和(m/z)2的选择，某些标准已经由J.Mead等人[5]详细描述并且在以下详细描述：
·必须避免具有内部裂解位点，即，具有内部赖氨酸或精氨酸的肽，除非所述赖氨酸或精氨酸之后是脯氨酸；
·必须避免具有天冬酰胺或谷氨酰胺的肽，因为它们可以脱氨；
·必须避免在N-末端具有谷氨酰胺或谷氨酸的肽，因为它们可以自发形成环；
·必须避免具有蛋氨酸的肽，因为它们可以被氧化；
·必须避免具有半胱氨酸的肽，因为它们可以在可能的变性、还原和封闭硫醇功能的步骤期间以非再现地方式被修饰；
·具有脯氨酸的肽可以被认为是有利的，因为其在MS/MS下通常产生具有非常占优势的单峰的密集(intense)碎片，然而，非常占优势的单一碎片不允许证实在复杂混合物中跃迁的特性，实际上，仅同时存在一些特征性碎片才允许证实探寻的先驱离子确实被检测；
·避免具有与C末端相邻(位置n-1)的脯氨酸或者在距C末端的第二个位置(位置n-2)的脯氨酸的肽，因为在此情况下，第一代肽碎片的大小通常被认为太小以至于不足以是特异性的；
·优选选择质量大于先驱体的，以提升特异性。为此目的，需要选择放电先驱离子并且选择质量大于先驱的最致密的第一代碎片离子，即具有单电荷的第一代碎片离子。
选择的先驱离子的碎裂在碎裂池中进行，比如三元四极型模型[19]，或者离子阱型模型[20]，或者飞行时间(TOF)型模型[21]，其也允许分离离子。所述碎裂(一次或多次)将通过在电场中通过如下而常规地进行：用惰性气体比如氩气或氮气碰撞；使用强光源，通过光激发或光解离，用电子或自由基物种碰撞；应用电位差，例如在飞行时间管中；或者通过任何其它激活模式。电场的特征决定破裂的强度和性质。因此，例如在四极分析仪中，在惰性气体的存在下施加的电场决定贡献给离子的碰撞能量。此碰撞能量将由本领域技术人员优化，以增加要被分析的跃迁的灵敏性。例如，在Applied Biosystems公司(FosterCity，United States of America)的AB
质谱仪的q2下，可以在5e-V和180e-V之间改变碰撞能量。类似地，碰撞步骤的持续时间以及例如在离子阱中的激发能量将由本领域技术人员优化，以导致最灵敏的分析。例如，在Applied Biosystems公司的AB
质谱仪的Q3下，可以在0.010ms和50ms之间改变被称作激发时间的此持续时间，并且在0和1(任意单位)之间改变激发能量。
最后，以常规方式来实现选择的特征性离子的检测，特别借助于检测仪和加工系统。所述检测仪收集离子并且产生电子信号，所述电子信号的强度依赖于收集的离子的量。然后将获得的信号扩大以便能够通过计算机技术来处理。处理数据的计算机技术装置允许将由检测仪接收的数据转换为质谱。
SRM模式或MRM模式的原理是特异性地选择先驱离子，使其碎裂，然后特异性地选择其碎片离子之一。对于这种应用，通常使用三元四极型装置或者具有离子阱的三元四极混合型装置。
在MS2模式中使用的三元四极分析仪(triple quadrupole)装置(Q1q2Q3)的情况下，为了分析或检测靶蛋白质，第一四极分析仪(Q1)允许根据其质量与电荷的比率(m/z)过滤分子离子，所述分子离子对应于待分析的在预先消化步骤获得的蛋白质的特征性酶促蛋白水解肽。仅具有探寻的酶促蛋白水解肽的质量/电荷比率(称作(m/z)1的比率)的肽被传递至第二四极分析仪(q2)并且发挥先驱离子作用以用于随后的碎裂。q2分析仪允许质量/电荷比率(m/z)1的肽碎裂成第一代碎片离子。所述碎裂通常通过在q2中用惰性气体比如氮气或氩气碰撞前体肽而获得。第一代碎片离子被传递至第三四极分析仪(Q3)，其根据特定的质量与电荷的比率过滤第一代碎片离子，该比率称作(m/z)2。
仅具有探寻的酶促蛋白水解肽的特征性碎片的质量/电荷比率(m/z)2的第一代碎片离子被传递至检测仪来被检测，或者甚至量化。
此操作模式呈现双重选择性，一方面，关于选择先驱离子的选择，另一方面关于第一代碎片离子的选择。SRM或MRM模式的质谱法因此有利于量化。
当本发明方法中采用的质谱法是串联质谱法(MS2、MS3、MS4或MS5)时，可以将一些质谱分析仪连在一起。例如，第一分析仪分离离子，碰撞室(collision cell)允许离子碎裂，并且第二分析仪分离碎片离子。某些分析仪比如离子阱或FT-ICR将几个分析仪组合为一体，并且允许碎裂离子以及直接分析碎片。
根据本发明的优选实施方案，本发明的方法包括以下特征的一个或更多个：
-质谱法，其用于确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性以及毒力因子的特性，是MS/MS型质谱法，具有产生要被检测或量化的分子的特异性碎片以及因此对分析方法带来更高特异性的优势；
-所述MS/MS质谱法是MRM，其具有在质谱仪中使用几十毫秒的分析循环时间的优势，其允许高灵敏性地并且以多元方式检测或量化大量不同分子；
-确定分型、对抗微生物剂的抗性和毒力因子的特性是在相同质谱装置中进行，优选地同时进行，其具有减少分析时间以及设备成本的优势，这也有利于结果的处理和报告。
除了确定分型、对抗微生物剂的抗性及毒力因子的特性之外，还建议鉴别存在于要被分析的样品中的微生物(一种或多种)。
鉴别微生物的方法对本领域技术人员是广泛已知的，如例如通过Murray P.R.等人在Manual of Clinical Microbiology，2007，第9版描述的，并且尤其是：第I卷第III节第15章和第16章，关于细菌和酵母；第II卷第VI节第82章，关于病毒；以及第II卷第X节第135章，关于原生动物。常规鉴别方法的举例，可以引用生物谱的确定，其使用例如Vitek 2鉴别卡(bioMérieux)，或者使用具有基于研究某些基因及其序列的存在的鉴别标准的分子生物学技术。
鉴别可以从在其中实现鉴别的样品中直接进行，或者包含在样品中的微生物可以使用适于要被研究的微生物物种的最佳培养基和最佳培养条件通过对本领域技术人员熟知的方法来培养，如通过Murray P.R.等人在Manual of Clinical Microbiology，2007，第9版第1卷第III节第14章描述的，并且尤其是：第1卷第IV节第21章，关于细菌；第II卷第VI节第81章，关于病毒；第II卷第VIII节第117章，关于酵母；以及第II卷第X节第134章，关于原生动物中。
因此，通常在通过生物化学方法鉴别样品中细菌的情况下，首先需要其以纯的培养物而被获得，例如在琼脂-琼脂上接种之后。在某些情况下可以对要被分析的样品直接应用分子生物学技术(PCR)。
后者可以借助于活性表面从样品直接捕获而被浓缩，而不培养微生物。这种方法已经由W.-J.Chen等人[1]描述，其借助于具有用Fe3O4/TiO2活化的表面的磁珠捕获不同的细菌物种。通过其它方法(means)捕获也是可以的，比如通过凝集素捕获[22]，或者通过抗体捕获[23]，或者通过万古霉素捕获[24]。捕获允许浓缩微生物，并且因此减少或者甚至消除培养步骤。这导致相当大的时间上的节省。
鉴别也可以通过质谱法，根据以上描述的技术来进行，优选地通过MS、通过MS/MS或者通过MS后接MS/MS型的质谱来进行，这些技术组成本发明的实施方案。也在此情况下，样品可以先经受培养步骤，比如在琼脂上接种。
使用通过MS的鉴别方法是有利的，因为其可以在几分钟内进行，并且其需要具有单个分析仪的质谱仪，即不如用于MS/MS中的串联质谱仪复杂的仪器。
使用通过MS后接MS/MS型质谱的鉴别方法也是有利的。其允许确定在MS下观察到的离子的身份，这增加了分析的特异性。
使用通过MRM型的MS/MS的鉴别方法具有比常规MS以及然后MS/MS方法更敏感和更简单的优势。此方法既不需要高效能软件在MS质谱的获得与MS/MS质谱的获得之间处理信息，也不需要改变连接MS与然后的MS/MS质谱的机械参数的设置。
通过MS的鉴别方法可以用电喷雾源在色谱分离之后在原样品上进行，如通过S.Vaidyanathan等人[7]描述的、或者通过R.Everley等人[8]描述的。然后不同的m/z范围允许鉴别生物体。S.Vaidyanathan等人已经使用在200Th和2000Th之间的窗，并且R.Everley等人使用在620Th和2450Th之间的窗。还可以使质谱去卷积(deconvoluted)，以评定与其电荷状态无关的蛋白质质量。R.Everley等人因此利用在大约5000Da和50000Da之间的质量。可选地，通过MS的鉴别方法也可以借助于MALDI-TOF来进行，如Claydon等人[3]以及T.Krishnamurthy和P.Ross[10]描述的。所述分析联合了质谱的获得以及专业软件的解释。这种方法非常简单，并且可以在几分钟内进行。目前此鉴别方法在医学分析实验室中变得普遍[25]。
经由存在于样品中的细菌蛋白通过MS以及然后MS/MS鉴别细菌已经被许多小组广泛应用。例如，可以引用Manes N.等人[11]最近的研究，其研究了肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)的肽组(peptidome)，或者R.Nandakumar等人[12]或L.Hernychova等人[13]的研究，其研究了在用胰蛋白酶消化蛋白质之后细菌的蛋白质组。常规的方法包括：i)获得MS谱，ii)连续选择在MS谱中观察到的具有强信号的各先驱离子，iii)使各先驱离子连续碎裂并且获得其MS/MS谱，iv)通过软件比如Mascot(Matrix Science,London,United Kingdom)或SEQUEST(Thermo Scientific,Waltham,United States of America)询问蛋白质数据库比如SWISS-PROT或NCBI，以鉴别具有对应于观察到的MS/MS谱的高概率的肽。如果鉴别出物种的特征性蛋白质或肽，则此方法可以导致微生物的鉴别。
根据又另一实施方案，所述至少一种微生物的鉴别通过常规鉴别方法来进行的，并且本发明的方法包括证实所述至少一种微生物的鉴别的另外步骤，所述证实步骤根据以上描述的用于鉴别微生物的技术通过质谱法来进行。
根据特定的实施方案，证实步骤的质谱法是MS/MS型质谱法，优选地为MRM。
使用质谱法的优势之一在于这样的事实，即其尤其可用于量化分子，在本申请情况下是具有分型、对至少一种抗微生物剂的抗性的性质的标记物。为此目的，使用与靶分子的量成比例的检测的电流强度。由此测量的电流强度可用作允许确定存在的靶分子的量的定量测量，其特征在于其以国际单位系统(SI)mol/m3或kg/m3类型，或者这些单位的倍数或约数，或者SI单位的通常导数(usual derivative)，包括其倍数或约数表示。作为非限制性实例，单位比如ng/ml或fmol/l是表征定量测量的单位。
然而，校准对能够使对应于由检测的离子诱导的电流强度的测量的峰面积与要被分析的靶分子的量相关是必需的。为此目的，在本发明的框架之内，可以进行在质谱法中常规使用的校准。MRM分析借助于外部标准、或者优选地借助于比如T.Fortin等人[2]描述的内部标准来进行常规校准。在其中靶分子是允许分析感兴趣的蛋白质的酶促蛋白水解肽的情况下，定量测量与靶酶促蛋白水解肽以及因此的感兴趣的蛋白质的量之间的相关性通过相对于要被分析的量为已知的校准信号校准测量的信号来获得。所述校准可以借助于校准曲线来进行，所述校准曲线例如通过连续注射不同浓度的校准酶促蛋白水解肽(外部校准)获得或者以优选的方式通过使用重肽作为内部标准的内部校准获得，例如根据以下详述的AQUA、QconCAT或PSAQ方法。“重肽”被理解为对应于酶促蛋白水解肽的肽，但其中一个或更多个碳12(12C)原子由碳13(13C)代替，和/或一个或更多个氮14(14N)原子由氮15(15N)代替。
使用重肽作为内部标准(AQUA)也已经在专利申请US 2004/0229283中提议。原理是人工合成具有包括比通常的天然同位素重的同位素的氨基酸的酶促蛋白水解肽。这种氨基酸例如通过用碳13(13C)代替某些碳12(12C)原子，或者通过用氮15(15N)代替某些氮14(14N)原子来获得。由此合成的人工肽(AQUA)具有与天然肽完全相同的物理化学性质(除了较高质量之外)。其通常在经由质谱法分析的上游以给定浓度添加到样品，例如在引起感兴趣的样品的蛋白质裂解的处理与在该处理步骤之后获得的肽的分级分离之间进行。因此，AQUA肽与待分析的天然肽在肽的分级分离时共纯化。这两种肽因此被同时注射到质谱仪中用于分析。它们然后在电离源中经受相同的电离率(ionization yield)。天然肽与AQUA(其浓度已知)的峰面积的比较允许计算天然肽的浓度，从而确定要被分析的蛋白质的浓度。AQUA技术的改良已经由J.-M.Pratt等人[14]以QconCat名称提议。此改良也在专利申请WO2006/128492中描述。其包括并置不同AQUA肽以及产生重重组蛋白质形式的人工多肽。用包含重同位素的氨基酸来合成重组蛋白质。以此方式，可以获得用于以较少成本校准几种蛋白质的同时分析的标准。QconCAT标准在开始时、在引起蛋白质裂解的处理的上游以及在蛋白质分级分离、变性、还原以及然后封闭蛋白质的硫醇官能团的步骤之前添加，如果这些步骤存在的话。因此，QconCAT标准经受与天然蛋白质相同的引起蛋白质裂解的处理循环，其允许考虑引起蛋白质裂解的处理步骤中的收率。实际上，天然蛋白质的处理、特别是消化可以是不完全的。在此情况下，使用AQUA标准将导致小于估计的天然蛋白质的量。因此对于绝对分析，考虑引起蛋白质裂解的处理的收率可能是重要的。然而，V.Brun等人[15]已经示出，有时QconCAT标准不精确地再现处理收率、特别是通过天然蛋白质的消化的处理收率，这无疑地归因于QconCAT蛋白质的不同三维构象的事实。
于是，V.Brun等人[33]提议使用称作PSAQ并且在专利申请WO 2008/145763中描述的方法。在此情况下，内部标准是重组蛋白质，其具有与天然蛋白质相同的序列，但是已经被合成为具有重氨基酸。所述合成用重氨基酸来离体进行。此标准具有与天然蛋白质严格相同的物理化学性质(除了较高的质量之外)。其在开始时在蛋白质分级分离步骤(当所述步骤存在时)之前添加。因此在蛋白质分级分离步骤时，其与天然蛋白质共纯化。其具有与天然蛋白质相同的处理收率，尤其通过消化处理时。如果进行肽分级分离步骤的话，在裂解之后获得的重肽也与天然肽共纯化。这两种肽因此被同时注射到进质谱仪中，以被量化分析。它们在电离源中经受相同的电离收率。在PSAQ方法中，天然肽与参考肽的峰面积的比较允许计算要被分析的蛋白质浓度，其考虑了分析方法的所有步骤。
所有这些技术，即AQUA、QconCAT或PSAQ或者用于通过质谱法分析以及尤其用于MRM分析或MS分析的任何其他校准技术均可以被用来进行校准。
本申请提供了以下内容：
1.一种从原核细胞和/或真核细胞获得肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)裂解原核细胞和/或真核细胞并且回收由此获得的蛋白质，
b)使用至少一种变性剂使所述蛋白质变性，
c)使用至少一种烷基化剂使变性的蛋白质烷基化，
d)使用至少一种蛋白水解酶将在步骤c)结束时获得的蛋白质酶促蛋白水解，
e)回收在酶促蛋白水解步骤d)结束时获得的肽，
其中步骤a)中所述原核细胞和/或真核细胞的裂解是在低浓度离液剂下的裂解。
2.根据项目1所述的方法，其中所述在低浓度离液剂下的裂解在小于或等于1M、优选地小于或等于100mM的离液剂浓度下进行。
3.根据项目1或2所述的方法，其中所述在低浓度离液剂下的裂解在不存在非盐离液剂比如尿素时进行。
4.根据项目1到3中的一项所述的方法，其中所述在低浓度离液剂下的裂解是通过借助于超声波探头进行的声处理的裂解。
5.根据项目4所述的方法，其中所述超声波探头在通过声处理裂解之前不经受预热步骤。
6.根据项目1到5中的一项所述的方法，其中所述蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶，其优选地选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
7.根据项目1到6中的一项所述的方法，其中所述变性剂是硫醇还原剂，其优选地选自2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤藓糖醇、三丁基膦和二硫苏糖醇，有利地，所述硫醇还原剂是三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇。
8.根据项目1到7中的一项所述的方法，其中所述烷基化剂选自由N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的组，优选地，所述烷基化剂是碘乙酰胺。
9.根据项目1到8中的一项所述的方法，其中对应于所述蛋白水解步骤d)的最小持续时间为大约15分钟。
10.根据项目1到9中的一项所述的方法，其中至少步骤a)和步骤b)相连地进行。
11.根据项目1到10中的一项所述的方法，其中至少步骤a)-步骤c)相连地进行。
12.根据项目1到11中的一项所述的方法，其中至少步骤a)-步骤d)相连地进行。
13.根据项目11或12所述的方法，其中：
-所述变性剂是硫醇还原剂，其选自三(2-羧乙基)膦和二硫苏糖醇硫醇还原剂，有利地，所述硫醇还原剂是三(2-羧乙基)膦，并且
-所述烷基化剂是碘乙酰胺。
14.根据项目1到13中的一项所述的方法，所述方法在低于100巴、优选地小于50巴、有利地小于10巴的压力之下进行。
15.根据项目1到14的一项所述的方法，所述方法在大气压力下进行。
16.一种分析原核细胞和/或真核细胞的肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使用根据项目1到15中的一项所述的方法从所述原核细胞和/或真核细胞获得肽，
ii)分析由此获得的所述肽，所述分析使用质谱类型的分析方法进行。
17.用于从原核细胞和/或真核细胞获得肽的试剂盒，所述试剂盒特别适于进行根据项目1到15中的一项所述的方法，所述试剂盒包括：
-裂解试剂盒，其允许在低浓度离液剂下来进行原核细胞和/或真核细胞的裂解，优选地为用于通过声处理裂解的试剂盒，
-第一溶液，其包括至少一种变性剂，所述变性剂优选地选自2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、二硫赤藓糖醇、三丁基膦和二硫苏糖醇，有利地，所述变性剂是三(2-羧乙基)膦或二硫苏糖醇，
-第二溶液，其包括至少一种烷基化剂，所述烷基化剂优选地选自任何N-乙基马来酰亚胺、碘乙酰胺和M-生物素形成的组，优选地，所述烷基化剂是碘乙酰胺，
-第三溶液，其包括至少一种蛋白水解酶，比如丝氨酸蛋白酶，所述蛋白水解酶优选地选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
18.根据项目17所述的试剂盒用于进行根据项目1到16中的一项所述的方法的用途。
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Claims (8)
1.一种从原核细胞和/或真核细胞获得肽的方法，所述方法包括以下步骤：
a)裂解原核细胞和/或真核细胞并且回收由此获得的蛋白质，
b)使用至少一种变性剂使所述蛋白质变性，
c)使用至少一种烷基化剂使变性的蛋白质烷基化，
d)使用至少一种蛋白水解酶将在步骤c)结束时获得的蛋白质酶促蛋白水解，
e)回收在酶促蛋白水解步骤d)结束时获得的肽，
其中步骤a)中所述原核细胞和/或真核细胞的裂解是在低浓度离液剂下的裂解，
其中步骤a)-d)同时进行，
其中所述在低浓度离液剂下的裂解是通过借助于超声波探头进行的声处理的裂解，
其中：
-所述变性剂是选自三(2-羧乙基)膦和二硫苏糖醇的硫醇还原剂，并且
-所述烷基化剂是碘乙酰胺；
所述方法在大气压力下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)-d)在相同容器中进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述在低浓度离液剂下的裂解在小于或等于1M、优选地小于或等于100mM的离液剂浓度下进行。
4.根据权利要求1到3中的一项所述的方法，其中所述在低浓度离液剂下的裂解在不存在非盐离液剂比如尿素时进行。
5.根据权利要求1到4中的一项所述的方法，其中所述超声波探头在通过声处理裂解之前不经受预热步骤。
6.根据权利要求1到5中的一项所述的方法，其中所述蛋白水解酶是丝氨酸蛋白酶，其优选地选自由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶组成的组，有利地，所述蛋白水解酶是胰蛋白酶。
7.根据权利要求1到6中的一项所述的方法，其中对应于所述蛋白水解步骤d)的最小持续时间为大约15分钟。
8.一种分析原核细胞和/或真核细胞的肽的方法，所述方法包括以下步骤：
i)使用根据权利要求1到7中的一项所述的方法从所述原核细胞和/或真核细胞获得肽，
ii)分析由此获得的所述肽，所述分析使用质谱类型的分析方法进行。
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