CN114025757A - 人源化抗pd-l1抗体 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了结合并阻断PD‑L1的分离的结合分子、包含编码结合分子的氨基酸序列的核酸分子的载体、含有载体的宿主细胞、制备结合分子的方法、含有结合分子的药物组合物以及使用此类抗体、抗体片段和衍生物以及多肽的方法，包括治疗需要刺激免疫应答的疾病(包括癌症)的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月18日提交的美国临时专利申请第62/835,764号的优先权，其公开内容据此以引用方式整体并入本文。
序列表的合并本申请包括经由EFS-Web以ASCII格式提交的，名称为“QLSF003PCT_ST25.txt”的序列表，其大小为158KB，创建日期为2020年4月17日。该序列表的内容据此以引用方式整体并入本文。
发明背景
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种288个氨基酸的细胞表面蛋白分子，并且由人类中的PDCD1基因编码。PD-1是一种I型跨膜蛋白，包含免疫球蛋白可变型氨基外域末端、跨膜区和带有免疫受体酪氨酸抑制基序和免疫受体酪氨酸开关基序的胞质尾(石田等人，1992)。PD-1在pro-B细胞和活化的T细胞中表达，但不在体内静息T细胞上表达。程序性死亡-1(PD-1)作为免疫细胞上的检查点蛋白。它通过与PD-L1(一种PD-1受体的配体)结合来抑制有效的T细胞功能，从而对免疫系统进行负性调节。
PD-1/PD-L1相互作用在自身免疫以及癌症免疫学中发挥重要作用。已在多种癌症(包括黑色素瘤和非小细胞肺癌)中观察到PD-L1表达。诸多研究表明，癌细胞过度表达PD-L1，这有助于它们通过使用PD-1/PD-配体(PDL)通路逃避免疫攻击。基于这些研究的结论，已开发了多种针对PD-1/PDL通路的检查点阻断抑制剂。
PD-1/PD-L1阻断在抗击癌症方面取得了巨大的临床成功。靶向PD-1的Pembrolizumab(Keytruda)和Nivolumab(Opdivo)以及靶向PD-L1的Atezolizumab(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)和Durvalumab(Imfinzi)等多种免疫疗法可有效阻断PD-1和PD-L1之间的结合，从而可逆转T细胞功能障碍。然而，在多种晚期癌症中，单一疗法的客观缓解率仅为20％(Xu-Monette等人，2017)。
因此，针对PD-1和PD-L1的改良疗法是备受关注的领域。此外，现在多种其他免疫疗法(包括单独疗法和联合疗法)也正在临床试验中进行测试。因此，仍然需要更有效的靶向PD-1/PD-L1通路的免疫疗法，包括单独使用和与药物治疗方案中的其他治疗剂联合使用。
发明内容
本公开提供了分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体及其特异性结合人类PD-L1的抗原结合部分。
在本发明的一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:31，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:37。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:13的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:19的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:25的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:7所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:44。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:32，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:38。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:20的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:8所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:33，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:39。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:21的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:27的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:9所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:46。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:34，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:40。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:10所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:47。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:35，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:41。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:17的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:29的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:11所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:48。在一些实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:36，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:42。在优选实施方案中，所述抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分进一步包含：(a)包含SEQ ID NO:18的轻链可变区CDR1；(b)包含SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR2；以及(c)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR3。
在一个实施方案中，所述抗体或部分包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体或部分包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQID NO:12所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:76的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:78的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:83的氨基酸序列；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID No:99的氨基酸序列，以及重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:100至SEQ ID No:118的氨基酸序列。
通过使免疫原性最小化的修饰，本公开发明的所述抗体可进一步工程化为适合于人类治疗的形式。合适的抗体包括但不限于嵌合抗体和人源化抗体。所述公开的抗体的亲和力、稳定性和特异性也可通过本领域技术人员已知的技术进一步优化。其他形式可涉及所述公开的抗体与其他功能蛋白寡聚、药物缀合和融合。
本公开发明的所述抗体可以是，例如全长抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。可选地，所述公开的抗体可以是抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段和F(ab')2片段、双体、三体、四体、单链可变区片段(scFv)、二硫键稳定性可变区片段(dsFv)和半抗体。可选地，所述公开的抗体可以是双特异性抗体。
在本发明的另一方面，所述抗体或其抗原结合片段对PD-L1具有5×10-8M至1×10-10M或1.32×10-9M至2.68×10-10M的范围内的亲和力(KD)。
在一些实施方案中，所述抗PD-L1拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合并阻断人类PD-L1。因此，所述抗体或抗原结合部分可刺激抗肿瘤免疫应答。在一些实施方案中，所述抗PD-L1拮抗剂抗体或其抗原结合部分结合并阻断非人灵长类PD-L1。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含所述分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分的组合物。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含所述分离的抗PD-L1单克隆拮抗剂抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的转运体的药物组合物。还提供了包含本发明的免疫偶联物和药学上可接受的转运体的组合物。
在本发明的另一方面，还提供了一种包含分离核酸分子的载体，所述分离核酸分子编码所述抗体或其抗原结合部分，以及一种包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含所述核酸分子。
本发明进一步提供了一种使用本公开发明的抗PD-L1拮抗剂抗体来刺激免疫应答的方法。例如，在一个实施方案中，本公开发明提供了一种治疗有需要的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的本公开发明的抗体或抗原结合部分的步骤。
在另一方面，本公开发明提供了一种治疗人类癌症的方法，包括向人类施用有效治疗所述癌症的量的本公开发明的抗PD-L1拮抗剂抗体或抗原结合部分的步骤。
在另一方面，本公开发明提供了一种治疗人类传染病的方法，包括向人类施用有效治疗所述传染病的量的本公开发明的抗PD-L1拮抗剂抗体或抗原结合部分的步骤。
通过以下不应被解释为限制的说明书和各示例，本公开的其他特征和优点将显而易见。本申请中引用的所有参考文献、GenBank条目、专利和已发布专利申请的内容通过引用明确并入本文。
附图说明
示例性实施方案在参考图中示出。本文公开的实施方案和附图视为说明性而非限制性目的。
图1示出抗PD-L1先导候选物与A431细胞上的PD-L1结合。
图2示出抗PD-L1先导候选物阻断HEK293/huPD-L1细胞上的PD-1相互作用。
图3示出抗PD-L1抗体通过SEB刺激增强了IL-2释放。
图4示出在混合淋巴细胞反应测定中PD-L1抗体增强了IFNγ分泌，这表明先导抗PD-L1抗体阻断了PD-1介导的抑制作用。
图5示出在CMV肽特异性回忆反应测定中先导抗体对PD-L1的阻断增强了T细胞产生干扰素γ。
图6示出人源化抗PD-L1先导抗体的热稳定性。
具体实施方式
下面结合系统、组合物和方法对实施方案及其各方面进行描述和说明，这些系统、组合物和方法为示例性和说明性目的，而不是限制范围。
定义
如本文所使用的，术语“包括”或“包含”用于指示对实施方案有用但可包括未指明元素(无论是否有用)的组合物、方法及其各自的组分。本领域技术人员将理解，一般而言，本文中所使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。
除非另有说明，否则在描述本申请的特定实施方案的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”和“所述”以及类似引语可被解释为涵盖单数和复数。本文对数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简略表达方法。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值均并入说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可按任何合适的顺序执行。与本文中的特定实施方案相关的所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本申请并且不对另外要求保护的本申请的范围构成限制。缩写词“e.g.”源自拉丁语exempli gratia，在本文中用于指示非限制性示例。因此，缩写词“e.g.”与“例如”一词同义。本说明书中的任何语言均不应被解释为表示对本申请的实践至关重要的任何未要求保护的元素。
如本文所用的术语“约”是指可测量值，诸如数量、持续时间等，并且涵盖指定值±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化值。
如本文所用的术语“表位”可包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的分子表面基团组成，诸如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。当平衡解离常数≤1μM(优选≤100nM，最优选≤10nM)时，抗体被称为特异性结合抗原。
术语“KD”可以指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
如本文所用的术语“免疫应答”可以指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，这些物质会对有机体造成选择性损伤、破坏或消除有机体中的入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或正常的机体细胞或组织(在自身免疫或病理炎症的情况下)。
如本文所用，“抗原特异性T细胞应答”可以指通过T细胞特异性抗原刺激T细胞而引起的T细胞应答。T细胞对抗原特异性刺激的应答的非限制性实例包括增殖和产生细胞因子(例如产生IL-2)。
如本文所用的术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或单克隆或多克隆抗原结合片段，其具有Fc(可结晶片段)区或Fc区的FcRn结合片段，本文称之为“Fc片段”或“Fc区”。抗原结合片段可通过重组DNA技术或酶促或完整抗体的化学裂解产生。抗原结合片段尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单区抗体、嵌合抗体、双抗体并且包含至少一部分免疫球蛋白的多肽，该免疫球蛋白足以赋予与该多肽结合的特异性抗原。Fc区包括构成两类或三类抗体的两条重链的部分。Fc区可通过重组DNA技术或通过酶促(例如木瓜蛋白酶裂解)或通过完整抗体的化学裂解产生。
如本文所用的术语“抗体片段”是指仅包含完整抗体的一部分的蛋白质片段，通常包括完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本定义包涵的抗体片段的示例包括：(i)具有VL区、CL区、VH区和CH1区的Fab片段；(ii)Fab'片段，该Fab'片段是在CH1区的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH区和CH1区的Fd片段；(iv)具有VH区和CH1区以及在CH1区C端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；(v)具有抗体单臂VL区和VH区的Fv片段；(vi)由VH区组成的dAb片段(Ward等人，Nature 341，544-546(1989))；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')2片段(二价片段)，包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab'片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)(Bird等人，Science 242:423-426(1988)；以及Huston等人，PNAS(USA)85:5879-5883(1988))；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”，包含连接到同一多肽链中的轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)(参见，例如，EP404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人，Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；(xi)包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人，Protein Eng.8(10):1057-1062(1995)；以及美国专利号5,641,870)。
如本文所用，“单链可变片段”、“单链抗体可变片段”或“scFv”抗体是指由接头肽连接的包含仅重链(VH)和轻链(VL)的可变区的抗体形式。scFv能够表达为单链多肽。scFv保留了其来源的完整抗体的特异性。轻链和重链可按任意顺序，例如，VH-接头-VL或VL-接头-VH，只要保持scFv对靶抗原的特异性即可。
如本文所用，“分离的抗体”可指的是基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合PD-L1蛋白的分离的抗体可基本上不含特异性结合PD-L1蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人类PD-L1蛋白的分离的抗体可能与其他抗原(诸如来自其他物种的PD-L1蛋白)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
可选择、克隆并进一步筛选抗PD-L1拮抗剂抗体产生的细胞，例如杂交瘤，以获得所需的特征，包括健壮生长、高抗体生成和所需的抗体特征。杂交瘤可在同基因动物体内、缺乏免疫系统的动物体内(例如裸鼠)或体外细胞培养物中扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”可以指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力。
如本文所用的术语“重组人类抗体”可指通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，诸如(a)从为人类免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤(如下所述)分离的抗体，(b)从转化为表达人类抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合人类抗体库中分离的抗体，以及(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有可变区，其中，框架和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在特定实施方案中，此类重组人类抗体可经受体外诱变(或者，当使用用于人类Ig序列的动物转基因时，经受体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列虽然衍生自于人类种系VH序列和VL序列并与之相关，但在自然条件下，可能不存在于体内人类抗体种系库中。
术语“同种型”可指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgGl)。抗体可以是免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或衍生自于它们。
在本文中，短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
如本文所用，“特异性结合人类PD-L1”的抗体可以指结合人类PD-L1蛋白(以及可能来自一种或多种非人物种的PD-L1蛋白)但基本上不结合非PD-L1蛋白的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”结合人类PD-L1蛋白，即具有1×10-7M或以下、更优选5×10-8M或以下、更优选3×10-8M或以下、更优选1×10-8M或以下、更优选5×10-9M或以下或甚至更优选1×10-9M或以下的KD。
如本文所用的术语“基本上不结合”蛋白质或细胞可表示其不能结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即以2×10-6M或以上、更优选1×10-5M或以上、更优选1×10-4M或以上、更优选1×10-3M或以上、甚至更优选1×10-2M或以上的KD结合到蛋白质或细胞。
术语对IgG抗体具有“高亲和力”可指对于靶抗原具有1×10-6M或以下，优选地1×10-7M或以下，更优选地1×10-8M或以下，甚至更优选地1×10-9M或以下，甚至更优选地1×10-10M或以下的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合可因其他抗体同种型而异。术语“药物制剂”是指其形式允许其中所含活性成分的生物活性有效且不含对将施用该制剂的受试者具有不可接受毒性的额外成分的制剂。
药剂(例如，药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内达到期望的治疗结果的有效量，例如用于治疗疾病、病症、或障碍和/或治疗的药代动力学效果或药效学效果。治疗有效量可因诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及施用的细胞群等因素而异。在一些实施方案中，本发明提供的方法涉及以有效量(例如治疗有效量)施用细胞和/或组合物。
如本文所用的“拮抗性抗体”是通过结合和阻断与抗体结合的配体(例如，PD-L1)来阻断或抑制生物反应的抗体。例如，拮抗剂可与PD-L1结合并阻断PD-L1与PD-1的结合，从而抑制PD-1受体的磷酸化作用或可抑制信号/细胞活化。在一个实施方案中，本发明的抗体是抗PD-L1拮抗剂抗体。
“CDR移植抗体”为包含一个或多个衍生自特定物种或同种型的CDR以及相同或不同物种或同种型的另一抗体的框架的抗体。
“人源化抗体”具有通过一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加而不同于源于非人类物种的抗体的序列，使得当给人类受试者施用时，与非人类物种抗体相比，人源化抗体不太可能诱导免疫应答和/或诱导不太严重的免疫应答。在一个实施方案中，使非人类物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定区中的特定氨基酸产生突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，来自人类抗体的恒定区与非人类物种的可变区融合。在另一个实施方案中，人源化抗体为CDR移植抗体，该CDR移植抗体包含一个或多个衍生自特定物种或同种型的抗体的CDR以及人类抗体框架。在另一个实施方案中，改变非人类抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人类抗体施用于人类受试者时可能的免疫原性，其中，改变的氨基酸残基对于抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或者对氨基酸序列所做的改变是保守的改变，使得人源化抗体与抗原的结合不会显著劣于非人类抗体与抗原的结合。有关如何制备人源化抗体的示例，请参见美国专利号6,054,297、5,886,152和5,877,293。
术语“嵌合抗体”(cAb)是指包含来自一种抗体的一个或多个区以及来自一种或多种其他抗体的一个或多个区的抗体。在一个实施方案中，一个或多个该PD-L1衍生自人类抗PD-L1抗体。在另一个实施方案中，所有CDR均衍生自人类抗PD-L抗体。在另一个实施方案中，来自不止一种人类抗PD-L1抗体的CDR在嵌合抗体中混合并匹配。例如，嵌合抗体可包含来自第一人类抗PD-L1抗体的轻链的CDR1、来自第二人类抗PD-L1抗体的轻链的CDR2和CDR3，以及来自第三抗PD-L1抗体的重链的CDR。在本公开的上下文中，cAb代表与人类抗体的Fc区融合的小鼠单克隆抗体的可变区。在另一个实施方案中，其他组合也是可能的。
术语“受试者”可以指任何人类或非人类动物。受试者可以是男性或女性并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛、马、鸡、兔、小鼠、大鼠、两栖动物和爬行动物，尽管优选哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、羊、狗、猫、牛和马。
可通过使用本领域中的一种或多种成熟的技术对本公开发明的抗体与PD-L1的结合进行评估。例如，在优选实施方案中，抗体可通过ELISA测定进行测试，例如使用重组PD-L1蛋白。其他合适的结合测定包括但不限于流式细胞术测定，其中，抗体与表达人类PD-L1的细胞系反应，诸如已被转染以在其细胞表面上表达PD-L1(例如，人类PD-L1)的Expi293细胞或ExpiCHO细胞。此外或可选地，可以在BIAcore结合测定、Octet Red96(Pall)等中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如，KD值)。
优选地，本公开发明的抗体结合具有5×10-8M或以下的KD的人类PD-L1蛋白，结合具有2×10-8M或以下的KD的人类PD-L1蛋白，结合具有2×10-8M或以下的KD的人类PD-L1蛋白，结合具有5×10-9M或以下的KD的人类PD-L1蛋白质，结合具有4×10-9M或以下的KD的人类PD-L1蛋白质，结合具有3×10-9M或以下的KD的人类PD-L1蛋白质，结合具有2×10-9M或以下的KD的人类PD-L1蛋白质，结合具有1×10-9M或以下的KD的人类PD-L1蛋白质。
本公开涉及结合并阻断PD-L1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分及其用途。在特定实施方案中，本公开发明的抗体衍生自经鉴定的重链和轻链种系序列和/或包含经鉴定的结构特征，诸如包含经鉴定的氨基酸序列的CDR区。本公开提供了本公开发明的分离的抗体、制备此类抗体的方法及其抗原结合部分。本公开还涉及使用抗体的方法，诸如单独使用本公开发明的抗PD-L1抗体或与其他免疫刺激抗体组合来刺激免疫应答。因此，还提供了使用本公开发明的抗PD-L1拮抗剂抗体的方法，例如，包括但不限于治疗人类癌症。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段、药物组合物、核酸、重组表达载体和用于制备此类抗体和片段的宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体来检测人类PD-L1，在体外或体内抑制PD-L1活性以及预防或治疗诸如癌症等疾病的方法。
互补决定区(CDR)被称为轻链可变区和重链可变区中的超变区。可变区的更高度保守部分称为框架(FR)。给定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)可使用上文中Kabat等人；Lefranc等人和/或Honegger和Pluckthun描述的系统来识别。本领域技术人员还熟悉Kabat等人描述的编号系统。(1991,NIH Publication 91-3242,National TechnicalInformation Service,Springfield,Va.)。在这方面，Kabat等人定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将这种“Kabat编号”系统分配给任何可变区氨基酸序列，而无需依赖于序列本身以外的任何实验数据。
在特定实施方案中，本发明提供抗PD-L1拮抗剂抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，小鼠抗体或部分包含(a)轻链可变区CDR1，该轻链可变区CDR1包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18，(b)轻链可变区CDR2，该轻链可变区CDR2包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO：24；(c)轻链可变区CDR3，该轻链可变区CDR3包含SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30；(d)重链可变区CDR1，该重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36；(e)重链可变区CDR2，该重链可变区CDR2包含SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42；(f)重链可变区CDR3，该重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48。
在一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66或SEQID NO:67具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:58具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:68、SEQID NO:69或SEQ ID NO:70具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
在又另一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
在又另一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:63具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
在又另一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:64具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:80具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
在又另一个实施方案中，本公开提供了结合PD-L1表位的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列；以及与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:81、SEQ ID No:82或SEQ ID NO:83具有至少95％的同一性的重链可变区氨基酸序列。
鉴于这些抗体Fab中的每一者均可结合人类PD-L1，VH序列和VL序列可“混合和匹配”以产生本发明的其他抗PD-L1结合分子。优选地，当VH链和VL链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列替换为结构相似的VH序列。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列替换为结构相似的VL序列。
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:51的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变区以及包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链可变区以及包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:58的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:76的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:61的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:78的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:63的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的重链可变区并且包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的重链可变区并且包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:80的氨基酸序列；以及轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:83的氨基酸序列，以及轻链可变区，该轻链可变区包含选自SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:54的氨基酸序列。优选的重链和轻链组合包括但不限于：
(a)包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的轻链可变区；
在一些实施方案中，人源化抗PD-L1抗体或其抗原结合部分包含轻链，该轻链包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:99的氨基酸序列，以及重链，该重链包含选自SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:118的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:43所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:44所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:45所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:76中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:46所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:78中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:47所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:80中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含重链，该重链包含如SEQ ID NO:48所示的CDR3区，并且包含重链可变区，该重链可变区包含与如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:83中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:25所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:51中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:26所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:58中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:27所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:61中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:28所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:63中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:29所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:64中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO:30所示的CDR3区，并且具有轻链可变区，该轻链可变区包含与如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:54中任一项所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
因此，在某些实施方案中，CDR3区域保持恒定，而可变性可引入重链和/或轻链的剩余CDR和/或框架区域，而抗体或其抗原结合片段保留与PD-L1结合的能力并保留亲本的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，在至少95％同一性(或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％同一性)的重链或轻链内进行的置换是保守性氨基酸置换。“保守的氨基酸置换”是至其中一个氨基酸残基被另一个具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基所置换。一般而言，保守的氨基酸置换基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列因保守置换而彼此不同的情况下，可向上调整序列同一性百分比或相似度以校正置换的保守性质。进行此类调整的手段是本领域技术人员众所周知的。例如，参见通过引用并入本文的Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的示例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)基本侧链：赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链为半胱氨酸和蛋氨酸。除了在化学层面保守的氨基酸之外，置换可包括出现在相关进化保守的人类可变重链序列、人类可变轻链序列以及来自非人类物种的直系同源序列中相似位置的任何氨基酸。
除非另有说明或从上下文中暗示，否则以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明，或从上下文显而易见，否则以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已获得的含义。提供这些定义旨在帮助描述特定的实施方案，而不是为了限制所要求保护的发明，因为本发明的范围仅由权利要求限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
本文中的所有公开刊物均以引用方式并入，其程度与每个单独公开刊物或专利申请被明确且单独地指示以引用方式并入的程度相同。以下描述包括可能有助于理解本发明的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或者任何明确或隐含引用的任何公开刊物是现有技术。
工作实例：
以下示例并非旨在限制本发明的权利要求的范围，而是旨在作为特定实施方案的示例。技术人员想到的示例方法中的任何变化均旨在落入本发明的范围内。
载体构建：
将载体pcDNA3.4TOPO(Invitrogen)连接到包含EcoRI、XhoI和NotI的短多聚接头。所得的质粒通过EcoRI和NotI限制性内切酶消化并通过凝胶电泳纯化。对于重链克隆，我们使用Gibson组装法组装了制备的载体、gblock编码和VH区(IDT)以及在J链和CH1域连接处编码XhoI位点的人类IgG2 gblock。制备并通过EcoRI和XhoI消化质粒以适应所有具有IgG2同种型的人源化重可变(VH)域。所有组装均通过Gibson方法(NEB)完成。通过类似的方法并使用gblock构建轻可变区，以通过编码恒定kappa(Ck)的gblock片段将Vkappa区组装在一起。
蛋白质表达、纯化和结合表征：
使用瞬时表达系统(Thermo Fisher)制备质粒并将其转染到Expi293或ExpiCHO细胞中。简而言之，在1μg质粒DNA总量/毫升培养物将质粒中转染到3e6细胞/毫升细胞中。重链和轻链质粒以1：1的比例混合。培养物在37℃下振荡培养。16小时后，我们将转染增强剂1和转染增强剂2添加到培养物中并继续培养6天。过滤上清液，并使用Octet Red96(Pall)通过IgG定量方案测定蛋白质效价。在ACTA PURE系统上通过Mab Select Sure Protein-A柱纯化对IgG进行纯化，并在PBS中透析一整晚。通过将纯化的抗体装载到抗人类重链(AHC)捕获传感器上并测量三种浓度下PD-L1组氨酸标记的靶标的结合率和解离率，通过OctetRed96对纯化抗体对抗原的亲和力进行表征。(表1)。
表1。如Octet所测定的，将人源化抗PD-L1抗体的单价结合动力学与基准对照组进行比较。
抗PD-L1抗体与表达PD-L1的A431癌细胞的流式细胞术结合分析
在进行FACS分析前两天，在不存在或存在1000U/ml重组人IFN-γ的情况下，将A431癌细胞以30％至60％的汇合率接种到24孔板中以刺激PD-L1表达。在进行FACS分析当天，使用PBS洗涤孔并使用Trypsin/EDTA进行收集。将分离的细胞洗涤两次，使其以5E6个细胞/毫升重悬浮于FACS缓冲液中，并以1E5个细胞/孔等分到96孔板中。在冰上使用5ug/ml抗PD-L1抗体、阳性对照抗体“C1-IgG1”或同种型IgG1对细胞染色45分钟，然后洗涤并使用1:500稀释的羊抗人IgG-AF647进行二次染色。进行最后一次洗涤并添加7-AAD之后，通过流式细胞术对细胞进行分析(图1)。
在hPDL1/HEK293细胞上进行的检测人源化抗PD-L1的PD-1His Tag阻断测定
为了筛选杂交瘤，通过Accutase收集表达hPD-L1的293细胞，并使用FACS洗涤缓冲液以4E6个细胞/毫升使细胞重悬浮。为了比较抗体的阻断能力，我们将30ul细胞/孔(120,000)、30ul的6ug/ml rhPD-1His Tag蛋白(2ug/ml最终浓度)和30ul的连续滴定的抗PDL1抗体混合并在冰上培养20分钟。培养之后，洗涤细胞并使用抗His Tag-APC小鼠IgG1(R&DCat#IC050A)检测结合的PD-1。进行最后一次洗涤并添加7-AAD之后，通过流式细胞术对细胞进行分析。将人源化抗体的阻断能力与使用最终浓度为0.5ug/ml的rhPD-1Fc-biotin的相同测定以及使用Streptavidin-APC(R&D cat#F0050)的检测进行比较(图2)(表2)。
SEB刺激测定
在X-Vivo 15培养基(Lonza cat#04-744Q)中将新鲜的PBMC稀释至2E6个细胞/毫升。将200ng/ml(2x)的SEB(Millipore cat#324798)添加到PBMC。通过将100ul的稀释的抗体和100ul的PBMC/SEB抗原混合物添加到96孔平底板中，使用抗体对细胞进行处理。在37℃下培养48小时之后，使用ELISA试剂盒(R&D Systems)对上清液的IL-2进行分析(图3)。
混合淋巴细胞反应测定
使用密度梯度离心法(Miltenyi Biotec)使PBMC从人血沉棕黄层分离，并用PBS洗涤4次。从PBMC中分离出CD4+T细胞(Miltenyi Biotec cat#130-096-533)并使其以4E6个细胞/毫升重悬浮于X-Vivo 15培养基中。
单核细胞衍生的树突细胞由阳性选择的CD14+单核细胞(单核细胞分离试剂盒II，Cat no.130-091-153，Miltenyi Biotec)产生。将细胞以5E5个细胞/毫升接种在补充有10％胎牛血清(FBS)的完整RPMI-1640培养基中，并培养7天。在第0天、第2天和第5天，将重组人(rh-)IL-4(1000U/ml)(R&D Systems)和rh粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rh-GMCSF)(500U/ml)(R&D Systems)补充到培养物中。在第7天收集未成熟的DC并将其重悬浮于5ml的RPMI-1640、10％FBS培养基中。将细胞与20ug/ml丝裂霉素C(Roche REF 10107409001)偶尔混合并在37℃下培养1小时，然后洗涤并在X-Vivo15培养基中重悬浮至4E5个细胞/毫升。
在96孔平底板中，我们以2倍浓度混合50ul DC细胞(2E4个DC/孔)、100ul的连续稀释的抗PD-L1抗体和对照组，并以1:10的比例混合50ul纯化的CD4+T细胞(2E5 CD4+T细胞/每孔)(DC：T细胞)。将板培养5天，通过ELISA分析上清液的IFNg释放(R&D Systems)(图4)。
采用抗PDL1治疗的体外CMV抗原回忆反应
对来自CMV+供体(Astarte Biologics)的解冻的PBMC进行计数，并将其以2E6个细胞/毫升重悬浮在含有β-巯基乙醇(1:1000)的AIM-V培养基中。在96孔平底板中，我们混合100ul CMV+PBMC(2E5个细胞/孔)、50ul的5ug/ml CMV抗原(Astarte cat#1004)和50ul连续稀释的抗PDL1抗体以及对照组。将板培养4天，通过ELISA分析上清液的IFNg释放(R&DSystems)(图5)。
人源化抗PDL1抗体的蛋白质热转移
将十(10)ug/ml抗PD-L1抗体与2ul 50X蛋白质热转移染料和PBS混合至100ul的最终体积。将样品等分到PCR 96管板中，共四份(25ul/孔)。在Applied Biosystems StepOneReal-Time PCR仪器上采用从22℃至95℃每1分钟5秒变化1℃的连续温度梯度测量蛋白质热转移反应。采用导数法分析Tm(图6)。
Claims (47)
1.权利要求如下：
一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:43。
2.一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:44。
3.一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:45。
4.一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:46。
5.一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:47。
6.一种分离的抗PD-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区CDR3，所述重链可变区CDR3包含SEQ ID NO:48。
7.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:31，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:37。
8.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:32，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:38。
9.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:33，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:39。
10.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:34，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:40。
11.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:35，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:41。
12.根据权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步分别包含重链可变区CDR1，所述重链可变区CDR1包含SEQ ID NO:36，以及重链可变区CDR2，所述重链可变区CDR2包含SEQ ID NO:42。
13.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:13的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:19的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:25的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
14.根据权利要求8所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:20的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
15.根据权利要求9所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:21的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:27的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
16.根据权利要求10所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:28的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
17.根据权利要求11所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:17的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:29的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
18.根据权利要求12所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其进一步包含
(a)包含SEQ ID NO:18的轻链可变区CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR2；以及
(c)包含SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR3；
其中，所述抗体或部分与人类PD-L1特异性结合。
19.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
20.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
21.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
22.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:8所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
23.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
24.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:9所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
25.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
26.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:10所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
28.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:11所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
29.根据权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的轻链可变区氨基酸序列以及与SEQ ID NO:12具有至少95％同一性的重链可变区氨基酸序列。
30.根据权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与如SEQ ID NO:12所示的序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
31.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:67的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
32.根据权利要求2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:68至SEQ ID NO:70的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
33.根据权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:71至SEQ ID NO:76的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:59至SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
34.根据权利要求4所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:77至SEQ ID NO:78的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:62至SEQ ID NO:63的氨基酸序列。
35.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:79至SEQ ID NO:80的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:64的氨基酸序列。
36.根据权利要求6所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:83的氨基酸序列，以及轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
37.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含轻链，所述轻链包含选自SEQ IDNO:84至SEQ ID No:99的氨基酸序列，以及重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:100至SEQID No:118的氨基酸序列。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分为Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体或双特异性抗体。
39.根据权利要求1-37中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
40.根据权利要求1-37中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体为免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgE、IgA或IgD分子。
41.根据权利要求39所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
42.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含与治疗剂链接的根据权利要求1-41中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-41中任一项所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的转运体。
44.一种刺激受试者的免疫应答的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求43所述的药物组合物以刺激所述受试者的免疫应答的步骤。
45.一种治疗受试者的传染病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求43所述的药物组合物以治疗所述传染病的步骤。
46.一种治疗受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求43所述的药物组合物以治疗所述癌症的步骤。
47.根据权利要求1-41中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对PD-L1的亲和力(KD)为5×10-8M至1×10-10M。
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