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CN114010666B - 溶瘤病毒、parp抑制剂及pd-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

溶瘤病毒、parp抑制剂及pd-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD‑1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用，通过在I型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF，获得溶瘤病毒oHSV，使溶瘤病毒的安全性提高的同时增强机体免疫反应；通过溶瘤病毒oHSV和Olaparib联合使用，发现二者联用能够使CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD‑1表达量增加，从而引入免疫检查点抑制剂，即PD‑1抗体，使治疗方案在乳腺癌中的疗效进一步提升，进一步通过oHSV、Olaparib与PD‑1抗体联合使用，抑制小鼠乳腺癌原位肿瘤的大小，前两者联合使用的基础上，进一步减少肺部转移灶的数量，显著延长小鼠的生存期。

Description

溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及溶瘤病毒、PARP抑制剂及PD-1抗体在制备抗肿瘤药物中的应用
背景技术
具有独特溶瘤机制的溶瘤病毒为肿瘤的治疗提供了一种新的选择，特别是对于一些常规治疗无响应的肿瘤，溶瘤病毒在肿瘤细胞中复制可以裂解杀伤肿瘤细胞，此外，溶瘤病毒以及裂解释放的肿瘤相关抗原可诱导免疫应答进一步杀伤肿瘤。
由于肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性以及机体免疫系统的影响，单一使用溶瘤病毒在某些肿瘤中难以取得良好的治疗效果，例如首个获得FDA批准的溶瘤病毒T-VEC并不能提升黑色素瘤患者的整体存活率，仅有16.3％接受治疗的患者肿瘤体积在6个月内会持续缩小。这极大的影响的溶瘤病毒的适应症。
溶瘤病毒与其他药物联合使用可以实现优势互补，从而提高肿瘤治疗效果。例如Amgen公司与百时美施贵宝合作开展T-VEC与CTLA-4抗体联合治疗晚期黑色素瘤I期临床结果表明联合治疗的整体应答率显著高于单一药物治疗。另外也文献报道组蛋白去乙酰化酶抑制剂和抗肿瘤血管生成抑制剂等可协同增强单纯疱疹病毒类溶瘤病毒抗肿瘤治疗效果。
中国专利201711478207.X公开一种甲病毒属的M1溶瘤病毒与PARP抑制剂的联合使用，在细胞水平具有提高杀伤肿瘤细胞的功能。该专利是将溶瘤病毒和PARP抑制剂在体外对肿瘤细胞进行杀伤，没有进行体内实验，即在最能反映实际临床情况的动物模型中进行验证，同时对溶瘤病毒的使用数量使用次数使用时间和PARP抑制剂的使用数量使用次数使用时间没有进行探究，另对溶瘤病毒和PARP抑制剂使用后，机体免疫情况的变化也没有进行探究，而这些问题在本方案中均得到了解决。且该专利文献也没有提及与PD-1抗体的联合使用的技术方案。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种抗肿瘤药物组合物，所述组合物包括溶瘤病毒和PARP抑制剂，所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒。
作为本发明的一个实施方式，所述PARP抑制剂为Olaparib，所述Olaparib的分子式为C24H23FN4O3；所述Olaparib的结构式所如式Ι示：
本发明采用PARP抑制剂为Olaparib，Olaparib能够同时抑制PARP1和PARP2的活性，且Olaparib为批准用于临床治疗的药物，安全性和可靠性均已验证。所述组合物还包括PD-1抗体。所述PD-1抗体是针对于人源PD-1和鼠源PD-1的单克隆或多克隆抗体。
所述溶瘤病毒为在I型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF制备而得。所述溶瘤病毒通过包括如下步骤的方法制备获得：
S1.分别扩增HSV-1、ICP34.5基因的两端序列；
S2.使用同源重组的方法，将hGM-CSF、CMV-GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV-GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124；
S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA，并通过酶切连接的方式连接至Lenti-CRISPR-V2载体上，记为Lenti-CRISPR-ICP34.5；
S4.将供体质粒pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti-CRISPR-ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，待细胞完全病变后，收取培养上清；将上清加入至Vero细胞中，数小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；获得插入了hGMCSF、CMV-GFP、4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV-GFP；
S5.以带有Cre片段的质粒为模板，扩增Cre片段，并通过酶切连接的方法连接至pCCL-PGK-eGFP载体上，记为pCCL-PGK-Cre；
S6.将步骤S5制备的pCCL-PGK-Cre质粒转染HEK293T细胞，以MOI＝1.0的剂量加入步骤S4制备的oHSV-GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；将上清加入至Vero细胞中，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；获得插入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV。
优选的，步骤S4具体包括如下步骤：
将供体质粒pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti-CRISPR-ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入HSV-1，待细胞完全病变后，收取培养上清；；以10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF、CMV-GFP、4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV-GFP。
优选的，步骤S5具体包括如下步骤：
将步骤S5制备的pCCL-PGK-Cre质粒转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入步骤S4制备的oHSV-GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；10倍倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV。
进一步，所述溶瘤病毒的用量为10×107-100×107PFU、所述Olaparib的用量为100-1000mg/kg。
进一步，所述PD-1抗体的用量为450μg-750μg。
本发明所述的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物或制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
所述的肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
本发明的另一个目的在于提供一种抗肿瘤用药系统，包括溶瘤病毒和PARP抑制剂，所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒。
所述的PARP抑制剂为抑制PARP活性的物质、或降解PARP的物质、或降低PARP水平的基因工具、或它们的任意组合。
作为本发明的一个实施方式，所述PARP抑制剂为Olaparib，所述Olaparib的分子式为C24H23FN4O3；所述Olaparib的结构式所如式Ι示：
所述溶瘤病毒的制备方法包括如下步骤：
S1.分别扩增HSV-1、ICP34.5基因的两端序列；
S2.使用同源重组的方法，将hGM-CSF、CMV-GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV-GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124；
S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA，并通过酶切连接的方式连接至Lenti-CRISPR-V2载体上，记为Lenti-CRISPR-ICP34.5；
S4.将供体质粒pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti-CRISPR-ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入HSV-1，待细胞完全病变后，收取培养上清；以10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF、CMV-GFP、4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV-GFP；
S5.以带有Cre片段的质粒为模板，扩增Cre片段，并通过酶切连接的方法连接至pCCL-PGK-eGFP载体上，记为pCCL-PGK-eGFP；
S6.将步骤S5制备的pCCL-PGK-Cre质粒转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入步骤S4制备的oHSV-GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；10倍倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV。
所述溶瘤病毒的总用量为10×107-100×107PFU、所述Olaparib的总用量为100-1000mg/kg。
优选的，所述溶瘤病毒的总用量为10×107-100×107PFU、所述Olaparib的总用量为100-1000mg/kg。
所述抗肿瘤用药系统还包括PD-1抗体，所述PD-1抗体的用量为450-750μg。
优选的，所述PD-1抗体的总用量为450-750μg，其中所述PD-1抗体是针对于人源PD-1和鼠源PD-1的单克隆或多克隆抗体。
本发明所述的抗肿瘤用药系统在制备抗肿瘤药物方面的应用也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种插入了miRT124和hGMCSF的溶瘤病毒，使溶瘤病毒的安全性得以提高的同时增强机体的免疫反应；
2)发明人通过一系列实验证明，PARP抑制剂，如Olaparib能够增强溶瘤病毒的复制，从而增强溶瘤病毒的疗效；
3)发明人通过将溶瘤病毒oHSV和Olaparib联合使用，发现二者联用时能够使CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1表达量增加，从而引入免疫检查点抑制剂，即PD-1抗体，使治疗方案在乳腺癌中的疗效进一步提升，oHSV、Olaparib联合使用，减少小鼠乳腺癌肺转移灶的数量；
4)oHSV、Olaparib与PD-1抗体联合使用，抑制小鼠乳腺癌原位肿瘤的大小，并前两者联合使用的基础上，进一步减少肺部转移灶的数量，从而显著延长小鼠的生存期；
5)oHSV、Olaparib与PD-1抗体联合使用，激活机体的免疫系统，使CD45阳性细胞数增加；在不改变CD4+和CD8+T细胞数量的前提上，上调PD-1的表达水平，这也是与免疫检查点抑制剂联合使用增强疗效的原因。
附图说明
图1为溶瘤病毒和Olaparib联合使用时小鼠乳腺癌肺转移灶的数量统计分析图；
图2为溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用时小鼠乳腺癌原位肿瘤的大小结果分析图；
图3为溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用时小鼠乳腺癌肺转移灶的数量结果分析图；
图4：溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用时小鼠CD45+细胞的数量结果分析图；
图5：溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合时小鼠CD4+T细胞PD-1的表达量结果分析图；
图6：溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合时小鼠CD8+T细胞PD-1的表达量结果分析图；
图7：溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著延长小鼠的生存期结果分析图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例中，PARP抑制剂是指化合物Olaparib(中文名：奥拉帕尼)以及相关的能够抑制PARP结合活性、催化活性的化合物；Olaparib的分子式为C24H23FN4O3；结构式如下图所示：
PD-1抗体是指针对于人源PD-1和鼠源PD-1的单克隆或多克隆抗体。
I型单纯疱疹病毒(HSV-1)来自丹麦奥胡斯大学。
以下结合实施例对本发明的技术方案和技术效果作进一步的详细描述。
实施例1
制备溶瘤病毒oHSV
通过改造I型单纯疱疹病毒(HSV-1)获得溶瘤病毒oHSV，具体制备步骤如下：
1)使用PCR的方法分别将HSV-1、ICP34.5基因的两端序列扩增出来；其中HSV-1
(GenBank:JQ780693.1)；ICP34.5的上游碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1；
ICP34.5的下游碱基如序列表中SEQ ID NO.2；
2)再使用同源重组的方法，将hGM-CSF、CMV-GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV-GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为
pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124；其中，hGM-CSF的序列如序列表中SEQ ID NO.3；CMV-GFP的序列如序列表中SEQ ID NO.4；
3)设计针对ICP34.5区域(如序列表中SEQ ID NO.1)的sgRNA(如序列表中SEQ IDNO.6)，并通过Esp3I酶切，T4DNA连接酶连接至Lenti-CRISPR-V2载体上，记为Lenti-CRISPR-ICP34.5；
4)将供体质粒pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti-CRISPR-ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入HSV-1，待细胞完全病变后，收取培养上清；以10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF、CMV-GFP、
4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV-GFP；
5)以带有Cre片段的质粒为模板，扩增Cre片段，并通过BamHI，XhoI双酶切，T4DNA连接酶连接的方法连接至pCCL-PGK-eGFP载体上，记为pCCL-PGK-Cre；
6)将pCCL-PGK-Cre质粒转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI＝1.0的剂量加入oHSV-GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；10倍倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；
以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV。
实施例2
溶瘤病毒oHSV、Olaparib联合使用测试实验
(1)实验材料：
6周龄BALB/C小鼠，小鼠乳腺癌细胞系4T1，RPMI1640培养基，溶瘤病毒oHSV，Olaparib。
(2)实验方法：
A.将5×105的4T1细胞原位注射进入小鼠右侧脂肪垫中；
B.当肿瘤大小达到100mm3的时候，开始进行治疗，其中溶瘤病毒隔日原位注射，每次使用量为5×107PFU，共计注射5次；Olaparib每日腹腔注射，每次使用量为50mg/kg，共计注射10次；
C.在第五次注射溶瘤病毒后第二日，摘除原位肿瘤；
D.在摘除原位肿瘤后第七日，处死小鼠，取出肺脏，在显微镜下观察并记录肺转移灶的数量；
(3)实验结果：
图1结果表明，oHSV与Olaparib联合使用，能够抑制小鼠乳腺癌肺部转移灶的数量。
实施例3
溶瘤病毒oHSV、Olaparib与PD-1抗体联合使用测试实验。
(1)实验材料：
6周龄BALB/C小鼠，小鼠乳腺癌细胞系4T1，RPMI1640培养基，溶瘤病毒，Olaparib，DNA酶，胶原酶，透明质酸酶，抗小鼠PD-1抗体，抗小鼠CD45抗体，抗小鼠CD4抗体，抗小鼠CD8抗体。
(2)实验方法：
E.将5×105的4T1细胞原位注射进入小鼠右侧脂肪垫中；
F.当肿瘤大小达到100mm3的时候，开始进行治疗，其中溶瘤病毒隔日原位注射，每次使用量为5×107PFU，共计注射5次，溶瘤病毒的总用量为25×107PFU，；Olaparib每日腹腔注射，每次使用量为50mg/kg，共计注射10次，Olaparib的总使用量为10mg；抗小鼠PD-1抗体分别在第三次第五次注射溶瘤病毒以及摘除原位肿瘤后第二日腹腔注射，使用量为每次200μg，共计注射3次；
G.在第五次注射溶瘤病毒后第二日，摘除原位肿瘤，使用DNA酶，胶原酶，透明质酸酶对原位肿瘤进行消化，之后使用抗小鼠PD-1抗体，抗小鼠CD45抗体，抗小鼠CD4抗体，抗小鼠CD8抗体进行孵育，最后使用流式细胞仪检测相关指标；
H.短期实验的处理如下：在摘除原位肿瘤后第七日，处死小鼠，取出肺脏，在显微镜下观察并记录肺转移灶的数量；
生存实验的处理如下：摘除原位肿瘤后，不对小鼠做任何处理，只记录小鼠的生存时间，并绘制生存曲线。
(3)实验结果
如图2所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著抑制小鼠乳腺癌原位肿瘤的大小；
如图3所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著减少小鼠乳腺癌肺转移灶的数量；
如图4所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著增加小鼠CD45+细胞的数量；
如图5所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著增加小鼠CD4+T细胞PD-1的表达量；
如图6所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著增加小鼠CD8+T细胞PD-1的表达量；
如图7所示，溶瘤病毒、Olaparib与PD-1抗体联合使用显著延长小鼠的生存期。
综上所述，发明人通过将溶瘤病毒oHSV和Olaparib联合使用，发现二者联用时能够使CD4+T细胞和CD8+T细胞的PD-1表达量增加，从而引入免疫检查点抑制剂，即PD-1抗体，使治疗方案在乳腺癌中的疗效进一步提升，oHSV、Olaparib联合使用，减少小鼠乳腺癌肺转移灶的数量；
oHSV、Olaparib与PD-1抗体联合使用，抑制小鼠乳腺癌原位肿瘤的大小和肺部转移灶的数量，显著延长小鼠的生存期；同时激活机体的免疫系统，使CD45阳性细胞数增加；并且上调PD-1的表达水平，起到增强免疫检查点抑制剂疗效的作用；最终延长荷瘤小鼠的生存时间。其中oHSV的使用剂量为5x107PFU/鼠，Olaparib的使用剂量为50mg/kg；PD-1抗体的使用剂量为200μg/鼠。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种溶瘤病毒与PARP抑制剂联合使用抑制肿瘤转移的方法
<130> KAG45783
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctgcacgca catgcttgcc tgtcaaactc taccaccccg gcacgctctc tgtctccatg 60
gcccgccgcc gccatcgcgg cccccgccgc ccccggccgc ccgggcccac gggcgcggtc 120
ccaaccgcac agtcccaggt aacctccacg cccaactcgg aacccgtggt caggagcgcg 180
cccgcggccg ccccgccgcc gccccccgcc agtgggcccc cgccttcttg ttcgctgctg 240
ctgcgccagt ggctccacgt tcccgagtcc gcgtccgacg acgacgacga cgactggccg 300
gacagccccc cgcccgagcc ggcgccagag gcccggccca ccgccgccgc cccccgcccc 360
cggtccccac cgcccggcgc gggcccgggg ggcggggcta acccctccca ccccccctca 420
cgccccttcc gccttccgcc gcgcctcgcc ctccgcctgc gcgtcaccgc agagcacctg 480
gcgcgcctgc gcctgcgacg cgcgggcggg gagggggcgc cgaagccccc cgcgaccccc 540
gcgacccccg cgacccccac gcgggtgcgc ttctcgcccc acgtccgggt gcgccacctg 600
gtggtctggg cctcggccgc ccgcctggcg cgccgcggct cgtgggcccg cgagcgggcc 660
gaccgggctc ggttccggcg ccgggtggcg gaggccgagg cggtcatcgg gccgtgcctg 720
gggcccgagg cccgtgcccg ggccctggcc cgcggagccg gcccggcgaa ctcagtc 777
<210> 2
<211> 716
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttacaccc gaggcggcct gggtcttccg cggagctccc gggagctccg caccaagccg 60
ctctccggag agacgatggc aggagccgcg catatatacg cttggagccg gcccgccccc 120
gaggcgggcc cgccctcgga gggcgggact ggccaatcgg cggccgccag cgcggcgggg 180
cccggccaac cagcgtccgc cgagtcgtcg gggcccggcc cactgggcgg taactcccgc 240
ccagtgggcc gggccgccca cttcccggta tggtaattaa aaacttgcag aggccttgtt 300
ccgcttcccg gtatggtaat tagaaactca ttaatgggcg gccccggccg cccttcccgc 360
ttccggcaat tcccgcggcc cttaatgggc aaccccggta ttccccgcct cccgcgccgc 420
gcgtaaccac tcccctgggg ttccgggtta tgttaattgc ttttttggcg gaacacacgg 480
cccctcgcgc attggcccgc gggtcgctca atgaacccgc attggtcccc tggggttccg 540
ggtatggtaa tgagtttctt cgggaaggcg ggaagccccg gggcaccgac gcaggccaag 600
cccctgttgc gtcggcggga ggggcatgct aatggggttc tttgggggac accgggttgg 660
tcccccaaat cgggggccgg gccgtgcatg ctaatgatat tctttggggg cgccgg 716
<210> 3
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggctgcaga gcctgctgct cttgggcact gtggcctgca gcatctctgc acccgcccgc 60
tcgcccagcc ccagcacgca gccctgggag catgtgaatg ccatccagga ggcccggcgt 120
ctcctgaacc tgagtagaga cactgctgct gagatgaatg aaacagtaga agtcatctca 180
gaaatgtttg acctccagga gccgacctgc ctacagaccc gcctggagct gtacaagcag 240
ggcctgcggg gcagcctcac caagctcaag ggccccttga ccatgatggc cagccactac 300
aagcagcact gccctccaac cccggaaact tcctgtgcaa cccagattat cacctttgaa 360
agtttcaaag agaacctgaa ggactttctg cttgtcatcc cctttgactg ctgggagcca 420
gtccaggag 429
<210> 4
<211> 1520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg 540
ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac cgatccagcc tccggactct 600
agaggatccg gtactcgagg aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag tttagtcttt 660
ttgtctttta tttcaggtcc cgatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 720
ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 780
aattgtaccc gcgggccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 840
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 900
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 960
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 1020
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 1080
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 1140
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 1200
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 1260
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 1320
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 1380
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 1440
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 1500
tggacgagct gtacaagtaa 1520
<210> 5
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtccaatt tactgaccgt acaccaaaat ttgcctgcat taccggtcga tgcaacgagt 60
gatgaggttc gcaagaacct gatggacatg ttcagggatc gccaggcgtt ttctgagcat 120
acctggaaaa tgcttctgtc cgtttgccgg tcgtgggcgg catggtgcaa gttgaataac 180
cggaaatggt ttcccgcaga acctgaagat gttcgcgatt atcttctata tcttcaggcg 240
cgcggtctgg cagtaaaaac tatccagcaa catttgggcc agctaaacat gcttcatcgt 300
cggtccgggc tgccacgacc aagtgacagc aatgctgttt cactggttat gcggcggatc 360
cgaaaagaaa acgttgatgc cggtgaacgt gcaaaacagg ctctagcgtt cgaacgcact 420
gatttcgacc aggttcgttc actcatggaa aatagcgatc gctgccagga tatacgtaat 480
ctggcatttc tggggattgc ttataacacc ctgttacgta tagccgaaat tgccaggatc 540
agggttaaag atatctcacg tactgacggt gggagaatgt taatccatat tggcagaacg 600
aaaacgctgg ttagcaccgc aggtgtagag aaggcactta gcctgggggt aactaaactg 660
gtcgagcgat ggatttccgt ctctggtgta gctgatgatc cgaataacta cctgttttgc 720
cgggtcagaa aaaatggtgt tgccgcgcca tctgccacca gccagctatc aactcgcgcc 780
ctggaaggga tttttgaagc aactcatcga ttgatttacg gcgctaagga tgactctggt 840
cagagatacc tggcctggtc tggacacagt gcccgtgtcg gagccgcgcg agatatggcc 900
cgcgctggag tttcaatacc ggagatcatg caagctggtg gctggaccaa tgtaaatatt 960
gtcatgaact atatccgtaa cctggatagt gaaacagggg caatggtgcg cctgctggaa 1020
gatggcgatt agtaa 1035
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggagccggc ccggcgaact 20

Claims (5)

1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于：包括溶瘤病毒和PARP抑制剂，所述溶瘤病毒选自I型单纯疱疹病毒，所述PARP抑制剂为Olaparib，所述Olaparib的分子式为C24H23FN4O3；所述Olaparib的结构式所如式Ι示：
所述溶瘤病毒为在I型单纯疱疹病毒中插入miRT124和hGMCSF制备而得；
所述溶瘤病毒通过包括如下步骤的方法制备获得：
S1. 分别扩增HSV-1的ICP34.5基因的两端序列；
S2. 使用同源重组的方法，将hGM-CSF、CMV-GFP、4xmiRT124和ICP34.5两端序列，以及质粒pCMV-GFP连接起来，形成完整的供体质粒，记为pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124；
S3.设计针对ICP34.5区域的sgRNA，并通过酶切连接的方式连接至Lenti-CRISPR-V2载体上，记为Lenti-CRISPR-ICP34.5；
S4.将供体质粒pUL34.5-hGM-CSF-lox2272-CMV-eGFP-lox2272-4xmiRT124和靶向ICP34.5的Lenti-CRISPR-ICP34.5质粒共同转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI=1.0的剂量加入HSV-1，待细胞完全病变后，收取培养上清；以10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察荧光蚀斑，并挑取荧光蚀斑；经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF、CMV-GFP、4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV-GFP；
S5.以带有Cre片段的质粒为模板，扩增Cre片段，并通过酶切连接的方法连接至pCCL-PGK-eGFP载体上，记为pCCL-PGK-Cre；
S6.将步骤S5制备的pCCL-PGK-Cre质粒转染HEK293T细胞，24小时后，以MOI=1.0的剂量加入步骤S4制备的oHSV-GFP，待细胞完全病变后，收取培养上清；10倍比稀释的方法，将上清加入至Vero细胞中，48小时后，观察无荧光蚀斑，并挑取无荧光蚀斑；以上述方法经过多轮纯化，获得插入了hGMCSF和4xmiRT124的HSV-1，记为oHSV。
2.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述溶瘤病毒的用量为10×107-100×107 PFU、所述Olaparib的用量为100-1000mg/kg。
3.根据权利要求1所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述组合物还包括PD-1抗体。
4.根据权利要求3所述抗肿瘤药物组合物，其特征在于：所述PD-1抗体的用量为450µg-750µg。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物或制剂中的应用；所述肿瘤为乳腺癌。
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