CN103981090B - 基因导入芯片及基因导入方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因导入芯片以及基因导入方法，基因导入芯片包括：压电基底、周期性设置在压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在压电基底中部的微腔道；微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因与单分散微泡混合或者嵌设在单分散微泡的脂质体膜层上。周期性设置的多个叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，对单分散微泡进行移动。

Description

基因导入芯片及基因导入方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种基因导入芯片及基因导入方法。

背景技术

长期以来，人类一直对诸如恶性肿瘤、遗传性疾病(如血友病、囊性纤维病、家族性高胆固醇血症等)及感染性疾病(如艾滋病、类风湿等)倾注了大量的精力，然而并未取得理想的结果。上述疾病的发生均与人体内基因的变异或表达异常密切相关，因此最理想的根治手段应是在基因水平上予以纠正。基因治疗理论的提出与不断深入研究，使人类在彻底攻克这类疾病的研究上进入了一个崭新的发展阶段，并取得了长足的进步。基因治疗是指通过生物学、物理学、化学方法，将正常基因或有治疗作用的基因导入人体靶细胞，纠正基因缺陷或功能上的错乱，从而达到治疗疾病的目的。如何高效、安全的将外源物质从细胞外输送至细胞内部是基因治疗的关键。

目前，基因导入方法主要包括病毒性导入、电穿孔及声致穿孔等方法。病毒性基因导入：由于病毒能够主动进入细胞并可将基因信息直接传递给细胞核，病毒导入法具有较高的转运效率，但病毒潜在的免疫原性(immunogenic)和细胞毒性作用(cytotoxiceffects)限制了其在临床中的应用。

电穿孔方法：通过高强度电场的作用，使细胞膜形成瞬态的微孔，这种方法的转运效率相对较低，高强度电场引起的热效应容易引起细胞膜组织断裂导致细胞死亡。

声致穿孔：将大量细胞与微泡同时加入溶液中，并将微泡与细胞摇匀，使微泡均匀散落在细胞之间，利用超声对混合溶液进行辐照，微泡在超声的作用下将会产生空化效应，产生一系列复杂的物理现象，如膨胀，内爆，微声流，微射流，冲击波等，这些极端物理条件将会在细胞表面上形成微孔，导致使细胞膜通透性发生改变，即声致穿孔。研究表明，当在细胞溶液中加入超声造影微泡(粒径为1-10μm的包膜微气泡)，由于微泡在超声作用下会产生径向振动发生稳态或瞬态空化效应，可显著提高细胞膜的开孔效率。稳态空化是指当低能量超声的频率接近微泡的共振频率时，微泡膜产生径向振动，微泡体积发生周期性振荡；瞬态空化是指微泡在较大声压激励下，微泡不断聚集声波能量，微泡会产生振荡、膨胀、收缩以及内爆等一系列动力学过程。Wu等指出当微泡在细胞附近发生瞬态空化时，微泡非对称破碎形成的微激流(microjetting)，声微流(microstreaming)以及冲击波(shockwaves)是导致声致穿孔的重要物理机制(如图1所示)，微激流对应的剪切应力大小直接决定细胞膜完整性及细胞活性【J.WuandW.L.Nyborg,"Ultrasound,cavitationbubblesandtheirinteractionwithcells,"Adv.DrugDeliver_yRev.,vol.60,pp.1103-1116,2008】。Zhou等进一步发现，当微泡与细胞之间距离过大时，微射流对应的剪切应力不足以破坏细胞膜结构的完整性，细胞开孔效率低下【D.M.Hallow,A.D.Mahajan,T.E.McCutchen,andM.R.Prausnitz,"Measurementandcorrelationofacousticcavitationwithcellularbioeffects,"UltrasoundMed.Biol.,vol.32,pp.1111-1122,2006.】。Ohl则发现当微泡与细胞距离过小时，细胞开孔效率虽可得到显著提高，但过大的剪切应力可使贴壁细胞脱离基底，在细胞膜表面形成致死性损伤【C.D.Ohl,M.Arora,R.Ikink,N.DeJong,M.Versluis,M.Delius,andD.Lohse,"Sonoporationfromjettingcavitationbubbles,"Biophys.J.,vol.91,pp.4285-4295,2006】。

为提高细胞转染效率，业内提出多种新方法来调控微泡与细胞之间的距离。Fan等在微泡表面偶联上特异性抗体，使靶向微泡通过化学键与特异性细胞结合，黏附于细胞膜表面，然而这种单纯依靠化学键结合的方法难以动态调控微泡与细胞之间的距离【Z.Fan,H.Liu,M.Mayer,andC.X.Deng,"Spatiotemporallycontrolledsinglecellsonoporation,"Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,vol.109,pp.16486-16491,October9,20122012】。Sankin等利用光学诱导击穿机制，在激光焦点处产生气泡并使其空化，通过改变激光焦点位置，调节微泡与细胞之间的距离【G.N.Sankin,F.Yuan,andP.Zhong,"PulsatingTandemMicrobubbleforLocalizedandDirectionalSingle-CellMembranePoration,"Phys.Rev.Lett.,vol.105,p.078101,2010】。Prentice等利用光镊实现了对微泡的空间操控，但由于光镊聚焦范围和聚焦强度需要平衡，很难实现微泡大范围连续操控【P.Prentice,A.Cuschieri,K.Dholakia,M.Prausnitz,andP.Campbell,"Membranedisruptionbyopticallycontrolledmicrobubblecavitation,"Nat.Phys.,vol.1,pp.107-110,2005.】。

传统的声致穿孔方法均是研究微泡与细胞的群体效应，精确性较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种精确性较高的基因导入芯片以及基因导入方法。

一种基因导入芯片，包括：压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道；

所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，所述单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上，所述细胞培养区域用于培养需要进行基因导入的细胞；

周期性设置的多个所述叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对所述单分散微泡进行移动的目的；

通过改变所述射频信号输入的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎。

在一个实施例中，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。

在一个实施例中，所述压电基底为128°YX双面抛光的铌酸锂基底；

所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10μm～100μm。

在一个实施例中，所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。

在一个实施例中，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。

在一个实施例中，所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。

在一个实施例中，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数。

在一个实施例中，所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρR}\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a\sin {\mathrm{\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

一种基因导入方法，包括如下步骤：

提供基因导入芯片，所述基因导入芯片包括压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道，所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，将需要进行基因导入的细胞培养在所述细胞培养区域；

所述单分散微泡制备区利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡简单混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上；

周期性设置的多个所述叉指换能器同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域；以及

通过改变输入射频信号的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎，从而在所述需要进行基因导入的细胞的细胞膜表面形成可逆的微孔，所述需要导入的外源基因随之被导入到所述需要进行基因导入的细胞内。

在一个实施例中，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。

在一个实施例中，所述压电基底为128°YX双面抛光的铌酸锂基底；

所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10μm～100μm。

在一个实施例中，所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。

在一个实施例中，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。

在一个实施例中，所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。

在一个实施例中，将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域的操作中，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数。

在一个实施例中，所述需要导入的外源基因被导入到所述需要进行基因导入的细胞内的操作中，所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρR}\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a\sin {\mathrm{\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

这种基因导入芯片以及基因导入方法中，周期性设置的多个叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对单分散微泡进行移动的目的，从而可以对单一的单分散微泡进行操作，此外，需要进行基因导入的细胞位于微腔道内，从而可以对单一的细胞和单分散微泡进行研究，相对于传统的研究微泡与细胞的群体效应的基因导入方法，精确性较高。

附图说明

图1为空化微泡破碎形成的微激流对应的剪切力促进细胞膜通透性的示意图；

图2为一实施方式的基因导入芯片的结构示意图；

图3为一实施方式的基因导入方法的流程图；

图4为一实施方式的基因导入芯片的实验装置图；

图5a为细胞的荧光图；

图5b为细胞和微泡的荧光图；

图5c为精确调控使得微泡到达细胞所在位置的荧光图；

图6a为微泡作用的有效距离的散点图拟合曲线；

图6b为单细胞可修复声致穿孔的对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

如图2所示的一实施方式的基因导入芯片，包括：压电基底10、多个叉指换能器20以及微腔道30。

压电基底10可以为128°YX双面抛光的铌酸锂基底。

多个叉指换能器20周期性溅射在压电基底10的外周。结合图2，本实施方式中，叉指换能器20为四个，四个叉指换能器20成十字形排列，微腔道30位于四个叉指换能器20中间。

微腔道30设置在压电基底10的中部。本实施方式中，微腔道30为PDMS微腔道，该PDMS微腔道有多个独立并行腔室，每个腔室的直径为10μm～100μm。典型的哺乳动物细胞直径约8μm～50μm，与微腔道30的尺寸相当，能够在微腔道30内实现单细胞的分析和检测。

微腔道30包括单分散微泡制备区32以及细胞培养区域34，单分散微泡制备区32用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与单分散微泡简单混合或者偶联在单分散微泡的脂质体膜层上，细胞培养区域34用于培养需要进行基因导入的细胞。

气体可以为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。

一般来说，制备得到的单分散微泡微泡的粒径范围为2μm～20μm，多分散率小于2％。

具体的，单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个入口进入流道，经喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。

周期性设置的多个叉指换能器20可以同时施加独立的射频信号，从而在微腔道30内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对单分散微泡进行移动的目的。

在一个优选的实施例中，单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数。

通过改变输入射频信号的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎。

单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测单分散微泡的最大膨胀半径；当单分散微泡的最大膨胀半径小于单分散微泡与细胞之间初始距离时，单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔。

根据上述远离，单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρR}\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a\sin {\mathrm{\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

这种基因导入芯片还可以构建高速Micro-PIV系统，将高速CCD配置于荧光倒置显微镜，采用激光脉冲器作为光源，可对微泡瞬态空化产生的微射流流场分布进行精确分析。利用高帧速成像系统对微尺度流场中的示踪粒子进行高时空分辨率、连续多帧成像，然后对连续两帧图像进行互相关处理，获得每一小区域中示踪粒子图像的平均位移矢量，最终得到微尺度流场的二维速度矢量场信息。通过公式τ＝μ(V/h)可进一步得到微射流对应的剪切应力分布，其中τ为微射流引起的剪切应力；μ为液体动态粘度；V为微激流速度；h为微泡与细胞之间的距离。因此，可以通过调整超声声场(频率、波形、强度)、微泡粒径、输入脉冲等物理参量研究微射流流场、剪切应力变化，建立各物理参量与剪切应力之间的关系。

此外，还可以实时量化观测细胞穿孔程度及细胞活性：对培养在微腔道30内的细胞同时标记FDA及PI两种荧光探针。FDA是一种疏水性复合物，它可以穿透完整的细胞膜进入细胞，通过细胞内酯酶催化水解二乙酸酯基团产生具有高强度的荧光产物，其激发和发射波长分别为494nm和521nm。若细胞膜完整，FDA荧光分子将在细胞内积累，发出绿色荧光，因此FDA可作为细胞活力的标签。PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为536nm和617nm，若细胞发生声致穿孔现象，PI会透过细胞膜表面的微孔进入细胞核，与DNA结合表达红色荧光，而细胞表达红色荧光强度直接反映细胞穿孔程度。因此，可对细胞同时标记这两种染料分别检测细胞的声致穿孔程度及细胞活性。最后，采用扫描电镜观察固定在微腔道30内细胞表面及内部微细结构来最终量化声致穿孔的程度。

这种基因导入芯片具有如下优点：

1)基因导入芯片具有良好的透光性。基因导入芯片可与常规倒置荧光显微镜兼容，通过荧光标记技术，可实时量化分析细胞的生理状态；

2)微腔道30有多个独立并行腔室，每个腔室的直径大小为10μm～100μm，典型的哺乳动物细胞直径约8μm～50μm，与微腔道30尺寸相当，能够在微腔道内实现单细胞的分析和检测；

3)基因导入芯片性能具有良好的一致性。由于MEMS工艺具有标准化流程，利用MEMS工艺制备的声表面波微流控芯片能够保证器件的可靠性和一致性；

4)利用二维平面驻波的势阱效应将单分散微泡聚集并且捕获在势阱的位置，使其排列成网格结构。通过调节入射声源的相对相位，改变驻波场中势阱的位置，实现了单分散微泡的连续移动。由于单分散微泡移动距离与相对相位呈现良好的线性关系，可对单分散微泡实现可编程、精确操控，移动分辨率可达2.2μm。

综上所述，这种基因导入芯片易于实时分析细胞生理功能、实现单细胞分析，且器件性能具有良好的一致性，在声致穿孔研究中具有独特优势，将有助于精确研究超声对细胞的作用。

如图3所示的一实施方式的基因导入方法，包括如下步骤：

S10、提供基因导入芯片。

基因导入芯片为上述的基因导入芯片，结合图2，包括：压电基底10、多个叉指换能器20以及微腔道30。

压电基底10可以为128°YX双面抛光的铌酸锂基底。

多个叉指换能器20周期性溅射在压电基底10的外周。结合图2，本实施方式中，叉指换能器20为四个，四个叉指换能器20成十字形排列，微腔道30位于四个叉指换能器20中间。

微腔道30设置在压电基底10的中部。本实施方式中，微腔道30为PDMS微腔道，微腔道30有多个独立并行腔室，每个腔室的直径大小为10μm～100μm。典型的哺乳动物细胞直径约8μm～50μm，与微腔道30的尺寸相当，能够在微腔道30内实现单细胞的分析和检测。

微腔道30包括单分散微泡制备区32以及细胞培养区域34，将需要进行基因导入的细胞培养在细胞培养区域34。

S20、单分散微泡制备区32利用流动聚焦原理制备单分散微泡。

单分散微泡制备区32用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因可与所述单分散微泡简单混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上。

气体可以为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。

一般来说，制备得到的单分散微泡微泡的粒径范围为2μm～20μm，多分散率小于2％。

具体的，单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个入口进入流道，经喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡。

S30、周期性设置的多个叉指换能器20同时施加独立的射频信号，从而在微腔道30内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将S20制得的单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，将单分散微泡移动到细胞培养区域34。

在一个优选的实施例中，单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，可表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数。

S40、通过改变输入射频信号的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎，从而在需要进行基因导入的细胞的细胞膜表面形成可逆的微孔，需要导入的外源基因随之被导入到需要进行基因导入的细胞内。

单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测单分散微泡的最大膨胀半径；当单分散微泡的最大膨胀半径小于单分散微泡与细胞之间初始距离时，单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔。

根据上述远离，单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρR}\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a\sin {\mathrm{\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

还可以构建高速Micro-PIV系统，将高速CCD配置于荧光倒置显微镜，采用激光脉冲器作为光源，可对微泡瞬态空化产生的微射流流场分布进行精确分析。利用高帧速成像系统对微尺度流场中的示踪粒子进行高时空分辨率、连续多帧成像，然后对连续两帧图像进行互相关处理，获得每一小区域中示踪粒子图像的平均位移矢量，最终得到微尺度流场的二维速度矢量场信息。通过公式τ＝μ(V/h)可进一步得到微射流对应的剪切应力分布，其中τ为微射流引起的剪切应力；μ为液体动态粘度；V为微激流速度；h为微泡与细胞之间的距离。因此，可以通过调整超声声场(频率、波形、强度)、微泡粒径、输入脉冲等物理参量研究微射流流场、剪切应力变化，建立各物理参量与剪切应力之间的关系。

还可以实时量化观测细胞穿孔程度及细胞活性：对培养在微腔道30内的细胞同时标记FDA及PI两种荧光探针。FDA是一种疏水性复合物，它可以穿透完整的细胞膜进入细胞，通过细胞内酯酶催化水解二乙酸酯基团产生具有高强度的荧光产物，其激发和发射波长分别为494nm和521nm。若细胞膜完整，FDA荧光分子将在细胞内积累，发出绿色荧光，因此FDA可作为细胞活力的标签。PI是一种DNA结合性染料，其激发和发射波长分别为536nm和617nm，若细胞发生声致穿孔现象，PI会透过细胞膜表面的微孔进入细胞核，与DNA结合表达红色荧光，而细胞表达红色荧光强度直接反映细胞穿孔程度。因此，可对细胞同时标记这两种染料分别检测细胞的声致穿孔程度及细胞活性。最后，采用扫描电镜观察固定在微腔道30内细胞表面及内部微细结构来最终量化声致穿孔的程度。

下面为具体实施例。

实施例1

如图4所示的一实施例的基于基因导入芯片的实验装置图，所需的设备包括：信号发生器、功率放大器、显微镜、CCD、基因导入芯片、电脑等。

利用信号发生器产生射频信号，接入放大器放大后，连接到基因导入芯片。利用幅值较低的连续正弦信号移动微泡，利用瞬间高压脉冲击碎微泡，使细胞穿孔，实现基因转染的目的。

图5a～图5c描述了精确移动微泡至细胞所在的区域的过程。利用DII亲脂性染料与微泡磷脂膜结合，产生红色荧光，利用DAPI染料与细胞核结合，细胞发出蓝色荧光，如图5a所示。对基因导入芯片施加连续正弦型号，微泡被捕获在驻波声场中节点位置，而细胞又有质量较大黏附在基因导入芯片底部，保持静止。通过交接正交方向上两对换能器之间的相对相位，每次调节10°，微泡逐渐向细胞靠近，如图5b所示。最终当微泡到达细胞所在的位置，停止调节相对相位，细胞与微泡的位置重合，两种荧光发生混叠，如图5c所示。

图6a为微泡的有效作用距离的散点图拟合曲线，图6b为单细胞可修复声致穿孔的对比图。

首先，将细胞种植在基因导入芯片内培养。其次，在基因导入芯片的腔道内灌注微泡，利用驻波声场精确调控微泡与细胞之间距离，利用高强度脉冲将微泡击碎，实现细胞穿孔与基因转染。多次试验后得到微泡的有效作用距离的多个散点，拟合后得到图6a。

PI是一种小分子染料，被广泛认为是一种理想的基因药物模型。当细胞膜完整时，PI不能穿透细胞膜，达到细胞核，应此细胞不会被染色。只有当细胞膜受到一定破坏，PI才能与DNA结合产生红色荧光。

结合图6b，细胞A在微泡破碎的有效距离范围内，产生了红色荧光，表明细胞膜产生孔隙，同时细胞A与细胞B均产生绿色荧光，表明细胞A与B均保持活性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种基因导入芯片，其特征在于，包括：压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道；

所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，所述单分散微泡制备区用于利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因与所述单分散微泡混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上，所述细胞培养区域用于培养需要进行基因导入的细胞；

周期性设置的多个所述叉指换能器可以同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，达到对所述单分散微泡进行移动的目的；

通过改变所述射频信号输入的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎；

所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡；

所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数；

所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρ}R\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a{\mathrm{sin\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

2.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。

3.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述压电基底为128°YX双面抛光的铌酸锂基底；

所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10μm～100μm。

4.根据权利要求1所述的基因导入芯片，其特征在于，所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。

5.根据权利要求4所述的基因导入芯片，其特征在于，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。

6.一种基因导入方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供基因导入芯片，所述基因导入芯片包括压电基底、周期性设置在所述压电基底外周的多个叉指换能器以及设置在所述压电基底中部的微腔道，所述微腔道包括单分散微泡制备区以及细胞培养区域，将需要进行基因导入的细胞培养在所述细胞培养区域；

所述单分散微泡制备区利用流动聚焦原理制备单分散微泡，所述单分散微泡包括脂质体膜以及包覆在所述脂质体膜内的气体，需要导入的外源基因与所述单分散微泡简单混合或者偶联在所述单分散微泡的脂质体膜层上；

周期性设置的多个所述叉指换能器同时施加独立的射频信号，从而在所述微腔道内形成一个二维平面驻波场，利用驻波声场势阱效应将所述单分散微泡捕获在驻波势阱位置，通过调节输入信号的相位，改变驻波声场中势阱位置，将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域；以及

通过改变输入射频信号的幅值、脉冲持续时间和脉冲重复频率提高输入能量，激励所述单分散微泡产生剧烈的膨胀、收缩直至破碎，从而在所述需要进行基因导入的细胞的细胞膜表面形成可逆的微孔，所述需要导入的外源基因随之被导入到所述需要进行基因导入的细胞内；

所述单分散微泡制备区包括两个入口、流道和喷嘴，气体和含有外源基因的脂质体溶液分别从两个所述入口进入所述流道，经所述喷嘴聚焦后形成稳定的锥形，锥形顶端的气体因不稳定在所述喷嘴处汇合并形成具有壳层结构的单分散微泡；

将所述单分散微泡移动到所述细胞培养区域的操作中，所述单分散微泡的移动距离与输入射频信号的相对相位具有良好的线性关系，表达为：

其中，Δx，Δy分别为单分散微泡在X与Y方向上的位移，φx与φy分别为所述叉指换能器在X与Y方向上的相对相位，λ为声表面波波长，n为叉指换能器相位由0°调整到360°的重复次数；

所述需要导入的外源基因被导入到所述需要进行基因导入的细胞内的操作中，所述单分散微泡在声波作用下，将会产生径向运动，若激励声场频率与强度恒定，且声波波长远大于所述单分散微泡的半径，利用理想气泡振动的非线性常微分方程可得到所述单分散微泡的半径随时间变化曲线，推测所述单分散微泡的最大膨胀半径；当所述单分散微泡的最大膨胀半径小于所述单分散微泡与细胞之间初始距离时，所述单分散微泡破碎形成的微射流将不断的弯曲、拉伸细胞膜，最终导致细胞膜表面产生可逆的微孔；所述单分散微泡的作用范围满足如下关系式：

$\mathrm{\ρ}R\stackrel{\·\·}{R}+\mathrm{\ρ}\frac{3}{2}{\stackrel{\·}{R}}^2=(\frac{2\mathrm{\σ}}{R_0}+P_0-P_v){\left(\frac{R_0}{R}\right)}^{3\mathrm{\Γ}}+P_v-P_0-\frac{2\mathrm{\σ}}{R}-4\mathrm{\η}\frac{\stackrel{\·}{R}}{R}-P_a{\mathrm{sin\ω}}_{a}t,$

其中，R₀为单分散微泡的初始半径，R为单分散微泡的运动半径，ρ为液体密度，σ为液体表面张力，P₀为大气压，P_v为水蒸汽压，P_a为超声声压，η为液体黏滞度。

7.根据权利要求6所述的基因导入方法，其特征在于，所述叉指换能器为四个，四个所述叉指换能器成十字形排列，所述微腔道位于四个所述叉指换能器中间。

8.根据权利要求6所述的基因导入方法，其特征在于，所述压电基底为128°YX双面抛光的铌酸锂基底；

所述微腔道为PDMS微腔道，所述PDMS微腔道含有多个独立并行的腔室，每个所述腔室的直径为10μm～100μm。

9.根据权利要求6所述的基因导入方法，其特征在于，所述气体为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气或全氟化物。

10.根据权利要求9所述的基因导入方法，其特征在于，所述全氟化物为全氟丙烷或全氟丁烷。