CN103988977A

CN103988977A - 饲用微生态制剂及其制备方法

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Publication number: CN103988977A
Application number: CN201410228604.1A
Authority: CN
Inventors: 杨建平; 赵志军; 刘永祥; 刘延贺; 胡华锋
Original assignee: Henan University
Current assignee: Capareson (jiangsu) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-05-28
Also published as: CN103988977B

Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种饲用微生态制剂及其制备方法。本发明制备方法包括以下步骤：（1）配备嗜酸乳杆菌、酿酒酵母菌和枯草芽孢杆菌；（2）固体培养基制备：将一定量以下原料混合均匀：麸皮、苹果渣、玉米粉、红糖、磷酸氢二钾和硫酸铵；进行灭菌后再加水调节含水量；（3）接种、发酵：采用两次接种、分阶段发酵。本发明饲用微生态制剂的微生物菌种生长良好、数量较多，而且发酵培养基呈酸香味，适口性强，有利于在饲料添加使用。本发明制备方法采用二次接种、分阶段发酵，提供良好的物质条件和生长环境。

Description

饲用微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种饲用微生态制剂及其制备方法。

背景技术

动物微生态制剂的研究与应用，最早可追溯到1947年，Mollgaard首先发现使用乳酸杆菌饲喂仔猪，可有效增加体重并改善身体健康。然而，上世纪中后叶正是抗生素研究、生产和使用的黄金时期，使微生态制剂研究和开发工作处于低潮。近年来，由于养殖业中大量使用抗生素和合成药物，引发动物源食品的安全隐患及环境污染，造成严重的社会、经济和生态问题，微生态制剂又重新成为研究热点。

饲用微生态制剂是作为饲料添加剂直接添加使用的微生态制剂。它不仅能促进动物胃肠道正常微生物区系的建立，增强畜禽免疫力，减少疾病的发生促进生长，提高畜禽日增重，改善畜产品的质量，还能产生多种氨基酸、维生素及一些未知促生物质；还能刺激肠道内免疫功能，及时杀死入侵病菌，又能减少氨及其它腐败物质的产生阻碍有害物质及废物的吸收。

我国农业部于2008年公布了16种可直接使用的微生物饲料添加剂菌种，主要以乳酸菌、粪链球菌、芽孢杆菌、酵母菌、片球菌和光合细菌等为主。目前，我国许多企业已实现饲用微生物活菌制剂产业化生产，并在饲料中应用，但存在应用效果不突出、效果稳定性和重复性差等问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种微生物菌种生长良好、数量较多，而且发酵培养基呈酸香味，适口性强，有利于在饲料添加使用的饲用微生态制剂。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

设计一种饲用微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌种配备：配备嗜酸乳杆菌不小于3х10⁹cfu/L、酿酒酵母菌不小于1х10⁸cfu/L、枯草芽孢杆菌不小于6х10⁹cfu/L；

（2）固体培养基制备：以重量百分比计，将以下原料混合均匀：麸皮75～85%、苹果渣10～20%、玉米粉1～3%、红糖1～3%、磷酸氢二钾0.2～0.8%和硫酸铵0.3～0.8%；进行灭菌后再加水调节含水量至10～15wt%（重量百分比）；

（3）接种、发酵：先将嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1：0.8～1.2的体积比混合，再按相对于固体培养基25~35wt%（重量百分比）的接种量接种于上述固体培养基，于25～30℃下厌氧发酵6～8天后，再按相对于固体培养基8~12wt%（重量百分比）的接种量接入枯草芽孢杆菌，于25～30℃下厌氧发酵2～4天，即得。

对于上述的用微生态制剂的制备方法，步骤（2）所述原料配比为：麸皮80%、苹果渣15%、玉米粉2%、红糖2%、磷酸氢二钾0.5%和硫酸铵0.5%。

对于上述的用微生态制剂的制备方法，在所述步骤（3）中，接种后的固体培养基在固态料袋中进行发酵，所述固态料袋为带有向外透气的单向空气阀门的塑料袋。

由以上所述制备方法获得的饲用微生态制剂。

本发明具有积极有益的效果：

1. 本发明克服传统的技术偏见（多菌种同时接种一次发酵），采用二次接种、分阶段发酵的制备方法，即先接种嗜酸乳杆菌、酿酒酵母菌进行的厌氧发酵有利于产酸、抑制有害杂菌的生长、分解有机物质，进而为二次接种的枯草芽孢杆菌的繁衍，提供良好的物质条件和生长环境。

2. 所采用固体培养基原料来源广泛，原料成分配伍合理，有利于有益菌株的生长繁殖。

3. 本发明方法能使微生物菌株生长良好、数量多，而且发酵培养基呈酸香味，适口性强，有利于在饲料添加使用。饲料中添加饲用微生态制剂，可提高育肥猪日增重，提高饲料转化率。

4. 本发明微生态制剂能促进动物肠道正常微生物区系的建立，增强畜禽免疫力，减少疾病的发生，促进生长，提高畜禽日增重，改善畜产品的质量，还能产生多种氨基酸、维生素及一些未知促生物质；还能刺激肠道内免疫功能，及时杀死入侵病菌；又能减少氨及其它腐败物质的产生，阻碍有害物质及废物的吸收，减少对养殖环境的危害。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所涉及的试验方法或分析方法，如无特别说明，均为常规方法，所用试剂如无特别说明，均为市售。

实施例1 种液制备：

1. 菌种来源

嗜酸乳杆菌来源：中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心CGMCC，植物乳杆菌植物亚种，AS1.2707；枯草芽孢杆菌来源：中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心CGMCC，枯草芽孢杆菌枯草亚种，AS1.2163；酿酒酵母菌来源：中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心CGMCC，酿酒酵母，AS2.3875。

2. 酿酒酵母菌液

2.1斜面菌种：培养基：酵母膏1wt%、蛋白胨2wt%、葡萄糖2wt%、琼脂2wt%。0.1Mpa灭菌20min，无菌接种，28℃培养48h。

2.2三角瓶摇床培养：培养基：葡萄糖2wt%、尿素0.5wt%、硫酸铵1wt%、酵母膏0.5wt%。0.1Mpa灭菌20min，无菌接种，28℃摇床培养48h，摇床转速140rpm。

2.3 100L种子罐培养：菌种培养基：豆芽汁培养基：取10wt%黄豆芽加水煮沸30min，过滤除去固体部分，添加10wt%蔗糖，定容。0.1Mpa灭菌20min，火焰接种，28℃培养48h，通气量：0.4vvm。

2.4 0.5T发酵罐培养：发酵培养基为豆芽汁培养基，0.1Mpa灭菌20min，28℃培养48h，通气量：0.5vvm。培养结束酵母菌细胞浓度大于10⁸cfu/mL。

3. 嗜酸乳杆菌液

3.1 培养基：斜面培养基：MRS培养基；

种子培养基：酵母膏0.5wt%、蛋白胨1.25wt%、葡萄糖2.5wt%、牛肉膏2.5wt%、吐温80 0.1wt%，pH6.5~7.0。

3.2 发酵培养基原料

胡萝卜汁：市售胡萝卜，加入2倍体积水，用组织捣碎机捣碎，过滤后离心取上清液；西红柿汁：市售西红柿，95°C热烫5min，加入等量水，用组织捣碎机捣碎，过滤后离心取上清液；酵母膏：BR级生化试剂；葡萄糖：食品级；CaCO₃、KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaOH、NaNO₃：化学纯。

3.3 缓冲盐

KH₂PO₄ 1wt%、K₂HPO₄ 1wt%、NaNO₃ 0.5wt%配制成混合盐，再用NaOH调pH为6.8。

3.4 发酵培养基

酵母膏1wt%、葡萄糖1.2wt%、胡萝卜汁5wt%、西红柿汁5wt%、KH₂PO₄ 0.05wt%、K₂HPO₄ 0.05wt%，pH6.5~7。

3.5 主要设备

LDZM-60KCS型立式压力蒸汽灭菌锅；BNT-9272A型电热恒温培养箱；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台；FA1104型电子天平；THZ-82B型气浴恒温振荡器；PHS-3C型电子pH计；TP10-20型蠕动泵；50-500L镇江东方发酵罐。

3.6 发酵培养方法

一级摇瓶种子培养：取嗜酸乳杆菌斜面菌种接入装50mL种子培养基的250mL三角瓶中，置于37℃，140r/min恒温振荡器培养24h。

二级摇瓶种子培养：以5%接种量将一级摇瓶种子接入装有200mL种子培养基的1000mL三角瓶中，置于40℃，140r/min的恒温振荡器上培养48h。

50L自动控制发酵罐分批补料发酵培养：按发酵罐实际工作体积30L配制发酵培养基，0.1MPa，30min灭菌，冷却至42℃，接入二级摇瓶种子。发酵培养期间控制空气流速0.8vvm，搅拌转速160r/min，温度40℃；发酵培养时通过自动流加20%CaCO₃稳定pH6.8~7.0；补料的流加方式为三段式：0~12h不补料，为分批培养，12~26h补料培养，26~60h不补料。

3.7 活菌总数测定

采用MRS培养基，梯度稀释混合平板培养活菌计数法。通过本试验证明在50L发酵罐中，控制生产工艺参数空气流速0.8vvm，搅拌转速160r/min，温度40℃条件下，培养12h后对罐内流加补料，补料量为胡萝卜汁160 mL/L、西红柿汁160 mL/L、缓冲盐100mL/L，嗜酸乳杆菌数量大于3×10⁹cfu/mL。

4. 枯草芽孢杆菌液

4.1 培养基原料

豆粕粉：市售豆粕，粉碎过40目筛；红糖：市售；牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖：均为BR级生化试剂； KH₂PO₄、K₂HPO₄、NaOH、NaCl、MgSO₄：化学纯。

4.2 培养基

斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；种子培养基：牛肉膏0.5wt%、蛋白胨1.25wt%、葡萄糖2.5wt%；pH6.5~7.0。

4.3 复合盐

KH₂PO₄ 2wt%、K₂HPO₄ 2wt%、MgSO₄ 1wt%配制成混合盐，再用NaOH调pH为6.8。

4.4 发酵培养基

豆粕粉 1wt%、红糖 1.2wt%、KH₂PO₄ 0.05wt%、K₂HPO₄ 0.05wt%，pH6.5~7。

4.5 主要设备

4.6 发酵培养方法

一级摇瓶种子培养：取枯草芽孢杆菌斜面菌种接入装100mL种子培养基的250mL三角瓶中，置于37℃，160r/min恒温振荡器培养24h。

二级摇瓶种子培养：以2wt%接种量将一级摇瓶种子接入装有200mL种子培养基的1000mL三角瓶中，置于37℃，140r/min的恒温振荡器上培养24h。

50L自动控制发酵罐分批补料发酵培养：按发酵罐实际工作体积30L配制发酵培养基，0.1MPa，30min灭菌，冷却至40℃，接入二级摇瓶种子，接种量为5wt%。发酵培养期间控制空气流速1.2vvm，搅拌转速160r/min，温度37℃；补料的流加方式为三段式：0~12h不补料，为分批培养，12~32h补料培养，32~48h不补料。

4.6 活菌总数测定

采用牛肉膏蛋白胨培养基，梯度稀释混合平板培养活菌计数法。

通过本试验证明在50L发酵罐中，控制生产工艺参数空气流速1.2vvm，搅拌转速160r/min，温度37℃条件下，培养12h后对罐内流加补料，补料量为豆粕粉10 g/L、红糖10 g/L、复合盐20mL/L，是枯草芽孢杆菌流加补料最佳组合。发酵培养后，枯草芽孢杆菌数量大于6×10⁹cfu/mL。

实施例2

本实施例饲用微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌种配备：配备嗜酸乳杆菌32.1х10⁸cfu/L、酿酒酵母菌1х10⁸cfu/L、枯草芽孢杆菌61.5х10⁸cfu/L；

（2）固体培养基制备：以重量百分比计，将以下原料混合均匀：麸皮80%、苹果渣15%、玉米粉2%、红糖2%、磷酸氢二钾0.5%和硫酸铵0.5%；进行灭菌后再加水调节含水量至12wt%，分装至固态料袋（带有向外透气的单向空气阀门的塑料袋）；

（3）接种、发酵：先将嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1：1的体积比混合，再按相对于固体培养基30wt%的接种量接种于上述固体培养基，于30℃下厌氧发酵7天后，再按相对于固体培养基10wt%的接种量接入枯草芽孢杆菌，于30℃下厌氧发酵3天，即得。

实施例3

本实施例饲用微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌种配备：配备嗜酸乳杆菌3х10⁹cfu/L、酿酒酵母菌不小于1.1х10⁸cfu/L、枯草芽孢杆菌不小于6х10⁹cfu/L；

（2）固体培养基制备：以重量百分比计，将以下原料混合均匀：麸皮75%、苹果渣20%、玉米粉1%、红糖3%、磷酸氢二钾0.2%和硫酸铵0.8%；进行灭菌后再加水调节含水量至10wt%，分装至固态料袋（带有向外透气的单向空气阀门的塑料袋）；

（3）接种、发酵：先将嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1：0.8的体积比混合，再按相对于固体培养基25wt%的接种量接种于上述固体培养基，于25℃下厌氧发酵8天后，再按相对于固体培养基8wt%的接种量接入枯草芽孢杆菌，于25℃下厌氧发酵4天，即得。

实施例4

本实施例饲用微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌种配备：配备嗜酸乳杆菌3.5х10⁹cfu/L、酿酒酵母菌1.5х10⁸cfu/L、枯草芽孢杆菌6.2х10⁹cfu/L；

（2）固体培养基制备：以重量百分比计，将以下原料混合均匀：麸皮85%、苹果渣10%、玉米粉3%、红糖1%、磷酸氢二钾0.7%和硫酸铵0.3%；进行灭菌后再加水调节含水量至15wt%，分装至固态料袋（带有向外透气的单向空气阀门的塑料袋）；

（3）接种、发酵：先将嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1：1.2的体积比混合，再按相对于固体培养基35wt%的接种量接种于上述固体培养基，于30℃下厌氧发酵6天后，再按相对于固体培养基12 wt %的接种量接入枯草芽孢杆菌，于30℃下厌氧发酵2天，即得。

实施例5 猪场试验

试验设计：试验采取单因素、多重复对照试验法。选取同日龄、体重接近的健康断奶仔猪120头，随机分为6组，其中5个试验组，1个对照组，每组设两个重复，每个重复10头。设预饲期7天，预饲期内对猪进行驱虫和喂料、饮水、排便习惯适应性训练管理，而后进入正式试验期。试验期间，对断奶后育肥猪进行比对试验，在试验组饲料中添加2wt%的本发明实施例1所得饲用微生态制剂，在对照组饲料中添加常规量金霉素，仔猪自由采食、自由饮水，并做好采食量和称重记录，试验期为30天。

试验地点：濮阳江都绿色养殖场（生长期），辉县市绿宝养殖有限公司（保育期）。

试验结果：两次试验平均日增重分别提高0.132kg和0.079kg，料肉比分别降低0.166和0.3。主要原因是大量有益微生物在猪的消化道内和饲料中繁殖时生成大量的生物活性物质，特别是维生素和酶，有营养和增强消化的作用。在育肥猪饲料中添加本发明饲用微生态制剂能增加猪对常见疾病的抵抗力，减少猪感冒和猪胃肠炎的发生。微生态制剂中的微生物能对肠道中的不良代谢产物起到转化和消除作用，特别是减轻尿粪臭味。

表1 濮阳江都绿色养殖场试验结果

注：试验时饲料价格：2.8元/kg，微生态价格：6元/kg，毛猪价：16元/kg。

表2 辉县市绿宝养殖有限公司试验结果

注：试验时饲料价格：3元/kg，微生态价格：6元/kg，毛猪价：16元/kg。

实施例6 猪舍有害气体（NH₃、H₂S）试验:

试验地点：武汉市明翔牧业有限公司。

试验设计：试验选取所处环境一致的同向、同竖排的6幢猪舍，猪舍内的所有硬件设施一致，猪的存栏量一致，通风、光照条件一致。其中4幢猪舍作为试验组，在试验组饲料中添加2wt%本发明实施例1所得饲用微生态制剂，2幢猪舍作为对照组，在对照组饲料中添加常规量抗生素(土霉素)。试验期为30天，到期后分舍测定空气中NH₃、H₂S的浓度，统计出试验组和对照组的平均NH₃浓度和H₂S浓度，见表3。

表3 猪舍内NH₃、H₂S的浓度（mg/m³）

试验结论：由表3可知，试验组猪舍内NH₃、H₂S的浓度显著降低，舍内臭味明显下降。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1. 一种饲用微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（2）固体培养基制备：以重量百分比计，将以下原料混合均匀：麸皮75～85%、苹果渣10～20%、玉米粉1～3%、红糖1～3%、磷酸氢二钾0.2～0.8%和硫酸铵0.3～0.8%；进行灭菌后再加水调节含水量至10～15wt%；

（3）接种、发酵：先将嗜酸乳杆菌和酿酒酵母菌菌种按1：0.8～1.2的体积比混合，再按相对于固体培养基25～35wt%的接种量接种于上述固体培养基，于25～30℃下厌氧发酵6～8天后，再按相对于固体培养基8～12wt%的接种量接入枯草芽孢杆菌，于25～30℃下厌氧发酵2～4天，即得。

2. 根据权利要求1所述的用微生态制剂的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述原料配比为：麸皮80%、苹果渣15%、玉米粉2%、红糖2%、磷酸氢二钾0.5%和硫酸铵0.5%。

3. 根据权利要求1所述的用微生态制剂的制备方法，其特征在于：在所述步骤（3）中，接种后的固体培养基在固态料袋中进行发酵，所述固态料袋为带有向外透气的单向空气阀门的塑料袋。

4. 由权利要求1～3任一项所述制备方法制得的饲用微生态制剂。