CN103923928B - 天山雪莲sikpsaF基因在培育抗逆植物中的应用 - Google Patents
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及一种天山雪莲sikpsaF基因在培育抗逆植物中的应用。本发明从天山雪莲中克隆sikpsaF基因，利用上述基因构、构建植物表达载体pBI121‑sikpsaF，遗传转化获得抗逆转基因植物，通过该基因的过量表达，使植物抗胁迫的性能得到提高，最终获得抗逆能力明显增强的植物。
Description
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到sikpsaF基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗逆效果进行评价，增加植物的抗逆性能。
背景技术：
生长在自然界的植物，无时无刻都在与周围环境进行物质和能量的交换，因此外界环境与植物的生存和发展有着很密切的关系，可以说外界环境决定着植物能否存活(王祖祺和张石城，1994)。外界环境由温度、光照、湿度、土壤成分和周围生物等各类重要因素组成。因此研究植物对外界环境胁迫的耐受性及其抗性具有非常重要的实际意义。而在上述环境因子中温度对植物生存的影响是非常关键的，由于温度过高或者过低都会对植物造成不良的伤害，严重的可能对造成植物的毁灭。低温是影响许多植物产量的一个主要因素。低温胁迫可使植物光合作用降低，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，植物处于饥饿状态，严重影响了植物的正常生长发育，甚至导致死亡(郭子武等，2004)。给农业的生产和发展带来非常大的损失(陈香波等，2001)。同时低温也是农作物季节性和区域性的主要影响因素之一(李先文等，2003)，因此，当前科技工作者急需解决的一个问题就是提高植物的抗寒性。作物的生长和产量往往由于缺水而受到限制，从而给农业经济带来巨大的损失(Chaves et al.，2003；赵福庚等，2004)。为了适应缺水的环境，植物会在基因表达和生理等方面做出积极的响应。
天山雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir)是典型的耐极端低温的珍贵高等植物，生长于海拔2400～4100m处，最高月平均温度3～5℃，最低月平均温度-19～-21℃(Guo etal.，2007；Ma et al.，2011)。与一般抗寒植物不同，雪莲在极端低温下通过积极的生命活动来适应严寒，在雪中能旺盛生长并且开花(杨映根等，1999；黄继红和谭敦炎，2002)。由于气候寒冷，早晚温差悬殊，在这样的严峻环境中，雪莲经过长期的自然选择，进化出适应极端环境条件的生存机制，存在着特异的抗逆基因，而受到学者的广泛关注。
光合作用是农作物产量的物质基础，目前发现光能实际的利用率很低，研究光合作用能量吸收、传递和转换的机理，对其进行调控和高技术改造，无论是对于揭示光合作用，还是对于现代农业、林业生物产量调控，都具有重要理论和实践意义。一切生物光合作用的光能转化都由光反应中心承担，因此对光反应中心结构与功能的研究是最终揭示生物光能转化机理的基础，可为光合遗传生理、光合基因工程与高光效超高产生理育种提供理论基础和技术依据。
光合作用高效的吸能、传能、转能过程是在光合膜上具有一定分子排列空间构象的色素蛋白复合体上进行，并在10-15秒至10-7秒内完成。在分子水平上揭示各种膜蛋白复合体的结构和功能及其相互关系对揭示光合作用光能转化机理具有重要的意义。整合于光合膜上的色素蛋白复合物根据功能通常分为：光系统I(PSI)和光系统II(PSII)中。它催化光形成电子从类囊体膜内的蛋白质体蓝素(Pc)和细胞色素c6转移到类囊体膜外的还原铁氧还蛋白(Fd)或黄素氧还蛋白。psaF(Subunit III of photosystem I reaction center)是唯一已知位于类囊体腔面的蛋白质，其相对分子质量为17kDa，有6个重要的亲水区域，富含赖氨酸。psaF的主要功能是参与质蓝素与PSI的结合和电子传递。当前，关于该基因在植物抗逆性方面的研究还未见报道。
发明内容：
前期从我们建立的天山雪莲cDNA文库中，筛选克隆了一个新的psaF基因，并命名为sikpsaF。为了研究该基因的功能，我们构建了该基因的植物表达载体，并将此基因导入烟草中，提高了烟草的抗逆性。
本发明的一个目的是为植物抗逆育种提供有价值的psaF基因sikpsaF，其发明的目还在于构建植物表达载体：pBI121-sikpsaF，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗逆性，通过该基因的过量表达，使植物的抗胁迫性能得到提高，最终获得抗逆能力明显增强的植物。
本发明的目的是通过以下过程和方法实现的：
本发明所述的从天山雪莲中克隆sikpsaF基因，其序列为<210>1。
本发明的从天山雪莲中克隆sikpsaF基因的过程如下：
提取经低温处理的天山雪莲RNA，并以RNA反转录成的cDNA为模板，利用Primer5.0设计分别带有Xba I和SacI PCR的引物P1和P2进行扩增，得到目的基因；
利用上述基因构建植物表达载体pBI121-sikpsaF；
通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物并对其抗寒性进行功能研究。
本发明不仅得到天山雪莲psaF基因sikpsaF，而且将其构建成的植物表达载体，在转基因植物中研究了该基因在提高植物抗逆性能中的重要功能。这对于揭示雪莲的抗逆机理，丰富植物抗逆分子生物学理论，提高植物的耐胁迫能力，具有重要的意义。
附图说明：
图1是天山雪莲sikpsaF基因PCR扩增图 Fig1：sikpsaF gene PCR amplified
图2是pGM-sikpsaF和pBI121酶切鉴定图 Fig2：Restriction enzyme digestionidentification of pGM-sikpsaF and pBI121
图3是pBI121-sikpsaF转化GV3101 PCR鉴定 Fig3：PCR identification ofpBI121-sikpsaF-GV3101
图4是pBI121-sikpsaF转化烟草PCR检测 Fig4：PCR identification of pBI121-sikpsaF transformed tobacco
图5是转基因烟草RT-PCR分析 Fig5：RT-PCR analysis on transgenic tobacco
图6是温度处理对不同烟草相对电导率的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 6：Effect of temperature treatment on the Relative conductivity indifferent tobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图7是温度处理对不同烟草相对含水量的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 7：Effect of temperature treatment on the RWC in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图8是温度处理对不同烟草丙二醛的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 8：Effect of temperature treatment on the MDA in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图9是温度处理对不同烟草Fv/Fm的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 9：Effect of temperature treatment on the Fv/Fm in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图10是水分胁迫处理对不同烟草相对电导率的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 10：Effect of drought stress treatment on the Relativeconductivity in different tobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图11是水分胁迫处理对不同烟草相对含水量的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 11：Effect of drought stress treatment on the RWC in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图12是水分胁迫处理对不同烟草丙二醛的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 12：Effect of drought stress treatment on the MDA in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图13是水分胁迫处理对不同烟草Fv/Fm的影响，图中数据为三个重复的平均值±S.E
Fig 13：Effect of drought stress treatment on the Fv/Fm in differenttobacco，Resultasmeans±S.E.(n＝3)
图14是天山雪莲sikpsaF植物表达载体pBI121-sikpsaF的构建流程图
图1中：
1-4：sikpsaF；M：Marker
图2中：
1，2：pGM-sikpsaF；3，4：pBII21；M：Marker III；
图3中：
1：阴性对照；2-3：pBI121-sikpsaF-AGL1；M：Marker
图4中：
1：阴性对照；2-15：pBI121-sikpsaF转化烟草；M：Marker III
图5中：
15：阴性对照；1-14：pBI121-sikpsaF转化烟草；M：Marker III
实施例1：从天山雪莲中克隆到sikpsaF基因
1.1 天山雪莲总mRNA的提取
1)将研钵及所用的器具在180℃烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均使用0.1％的DEPC处理，高压灭菌；
2)取植物幼嫩叶片约0.1g于研钵中，加液氮充分研磨至粉末状；
3)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入1ml的TRNzol提取试剂，充分快速混匀，室温放置3-5min。
4)10000rpm，4℃离心5min，吸上清至一新的离心管，加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀；
5)10000rpm，4℃离心5min，吸取上层液体至另一新的离心管后，加入600μl预冷的异丙醇，于-20℃沉淀30min；
6)10000rpm，4℃离心10min后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为总RNA。
7)用70％的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30μl ddH2O(DEPC处理)溶解，保存于-20℃备用。
1.2 cDNA第一链的合成
在DEPC处理的0.2ml离心管中加入RNA 5μl，Oligo dT 2μl，ddH2O 5μl后，在75℃水浴10min后迅速置于冰上2min。然后在离心管中加入dNTP(2.5mmol/L)2ul，RnaseInhibitor 1μl，M-MLV-RT反转录酶1μl，DEPC ddH2O 5ul，42℃ 1hr，70℃ 15min后，-20℃保存。
1.3 cDNA第二链的合成及扩增
以天山雪莲cDNA为模板，用P1和P2为引物进行扩增，得到目的基因；同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。
P1为：5′ATGTCGTTCACCATCTCCAC 3′
Xba I
P2为：5′TTAGCCACAAACAAAGTATCG 3′
SacI
PCR反应体系(20μl)为：
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃复性45s，30cycles；72℃延伸1min；72℃总延伸10min。
PCR反应结束后，产物经浓度为1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离后，使用上海生工的琼脂糖凝胶回收试剂盒按照说明书方法回收目的基因，然后将目的片段和克隆载体pGM-T连接并转化，经鉴定正确的命名为pGM-sikpsaF。
实施例2：构建pBI121-sikpsaF基因植物表达载体
用Xba I/SacI双酶切pGM-sikpsaF和pBI121的质粒，回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行连接并转化，经鉴定正确的重组质粒命名为pBI121-sikpsaF。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pBI121之外，还可以选用其他植物表达载体。
实施例3：农杆菌的转化：
3.1 农杆菌感受态的制备
1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于LB液体培养基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于28℃、200rpm振荡培养48h；
2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen(50ug/ml)的LB液体培养基中活化培养至OD600＝0.5-0.8收集菌液，冰浴30min；
3)分装菌液于1.5ml离心管，于4℃，6000rpm离心5min，弃尽上清，收集农杆菌细胞；
4)将沉淀的农杆菌用750ul预冷的0.05mol/LCaCl2重悬，4℃，8000rpm离心5min；
5)弃上清用75ul 0.05mol/lCaCl2(10％甘油)重悬细胞，保存于-70℃。
3.2 植物表达载体转化根癌农杆菌GV3101(冻融法)
1)吸取10μl上述重组载体质粒(约0.5μg/μl)，与75μl GV3101感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min，然后液氮冻存5min；
2)迅速置于37℃水浴2min；
3)加入600μl液体LB培养基(Rif+Gen)，28℃、200rpm振荡培养5h；
4)将上述培养液于6000rpm离心5min，收集农杆菌细胞，弃去500μl液体培养基，剩余100μl重悬细胞；
5)将菌液涂布在含有Kan 50μg/ml，Rif50μg/ml及Gen50μg/ml的固体LB培养基平板上，28℃培养24-48h。
3.3 阳性克隆筛选
挑取若干单菌落，进行菌落PCR，将筛选出的阳性克隆命名为：pBI121-sikpsaF-GV3101。
在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化植物。
实施例5：烟草遗传转化及再生
本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等均可。
本方案中用于转化的方法，可以使用适合于其他靶植物。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
4.1 农杆菌浸染液的制备
1)从-70℃保存的含有：pBI121-sikpsaF农杆菌GV3101甘油管中挑取菌块，接种于5ml附加有Kan 50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen 50μg/ml的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养约30hr；
2)吸取200μl菌液，再用20ml LB液体培养基(Kan 50μg/ml，Rif50μg/ml，Gen 50μg/ml)稀释，28℃，200rpm振荡培养约4hr；
3)活化的菌液培养至OD600＝0.4-0.6时，即为转化用的浸染液。
4.2 浸染
1)超净工作台上将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成1cm2大小的方块，放入菌液中，振荡浸染10min；
2)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；
3)在共培养基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶盘均匀地摆放在滤纸上；在26℃暗培养条件下共培养2-3天。
4.3 抗性愈伤组织筛选及出芽诱导
将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA 2.0mg/L+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb500mg/L的烟草诱导选择培养基上，叶盘伤口充分接触培养基。每15-20天转接一次，转接1-2次以后，叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养直至诱导出丛生芽。
4.4 转化植株的生根培养和移栽
待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAA 0.3mg/L+Kan 50mg/L+Cb500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养。
转基因烟草15天左右开始有根生成，待根系发达时，将根系生长良好的转化植株，去除封口膜，室温环境中进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭石∶腐质土＝2∶1)中，26℃，16hr 40μmol·m-2·s-1光照，70％相对湿度条件下培养，前2-3天需遮阴、避光、保湿。
实施例5：转基因烟草的分子检测
5.1 转基因烟草的PCR鉴定
5.1.1 烟草DNA的提取(SDS法)
1)取0.1g新鲜叶片，用玻棒在1.5ml离心管内充分研磨；
2)加入400μl提取缓冲液，充分混匀，12000rpm离心5min；
3)小心吸取300μl上清液，加入300μl异丙醇，室温沉淀20min，12000rpm离心10min，收集沉淀；
4)将沉淀充分风干，加400μl TE溶解沉淀；
5)加入400μl氯仿/异戊醇(24/1)，充分混匀，静置20min，12000rpm离心10min；
6)小心吸取上清，加入40μl 3M NaAC(pH5.2)，800μl无水乙醇，-20℃沉淀过夜；
7)4℃，12000rpm离心15min，弃上清；
8)70％酒精洗涤两次，吹干后用30μl ddH2O溶解。
5.1.2 转基因烟草的PCR鉴定
以提取的转化基因的烟草DNA为模板，用P1和P2为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照，扩增体系如实施例2。如图4所示。
5.2 转基因烟草的RT-PCR检测
5.2.1 待检测植株总RNA的提取
TIANGEN公司的TRNzol总RNA提取试剂提取已鉴定的转基因烟草和未转化的烟草总RNA，方法同实施例1。
5.2.2 cDNA第一链的合成
方法同实施例1。
5.2.3 cDNA第二链的合成及扩增
在PCR反应管中加入cDNA第一链反应产物1μl，5×Taq buffer 4μl，MgCl2(25mM)1.0μl，dNTP(2.5mM)0.5μl，上下游引物(25μmol)各0.5μl，ddH2O补足至20μl，反应条件同实施例1。如图5所示。
实施例6：冷冻胁迫下烟草生理指标的测定
选取野生型和3个转基因株系烟草各3株，移栽至深18cm、直径20cm的花盆中，放置于25℃、16小时光照的培养室内，65d后放入4℃、0℃、-2℃、-3℃和-4℃的低温恒温培养箱(LTI-700，Japan)内进行冷冻胁迫，每个温度梯度胁迫2h，记录各处理阶段烟草的表型变化并对其生理指标进行测定。采用称重法测定叶片的相对含水量(Lara et al.2003)；采用便携式荧光仪(DUAL-PAM-100，walz，Germany)对PS Ⅱ光化学最大量子效率Fv/Fm进行测定(Krause and Weis1991)；采用分光光度计(UV-160A，Shimadzu Scientific Instrument，Japan)对丙二醛(MDA)含量(Du and Bramlage，1992)进行测定，采用电导仪(EC 215Conductivity Meter，Markson Science，lnc.，Del Mar，CA，USA)对叶片的相对电导率进行测定(Lutts et al.1996)。如图6-9。
实施例7：水分胁迫下烟草生理指标的测定
选取生长旺盛、大小一致的转基因和野生型植株幼苗各4株，分2行移栽至长50cm、宽35cm、深15cm的塑料盆中。充分浇水使之成活，待幼苗生长形态相近后进行水分胁迫。对其叶片的相对含水量、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、相对电导率和PS Ⅱ光化学最大量子效率进行检测(李合生，2003)。如图10-13。
Claims (2)
1.一种从天山雪莲中克隆的sikpsaF基因在培育抗寒或抗旱转基因烟草中的应用，其特征在于，所述基因序列为序列表中序列1所示，基因cDNA全长774bp，编码区705bp，编码234个氨基酸，5’非编码区0bp，3’非编码区69bp。
2.权利要求1中所述的基因序列构建的植物表达载体在通过遗传转化获得抗寒或抗旱转基因烟草中的应用。
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