CN103898101B - 利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。本发明首次利用转基因哺乳动物乳腺生物平台大规模高效生产重组人丁酰胆碱酯酶全酶和单体，即不含丁酰胆碱酯酶全酶最后40个氨基酸残基的截断型酶，及丁酰胆碱酯酶单体‑白蛋白融合蛋白。所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒气中毒，有机磷农药中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。

Description

利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯 酶的方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体地涉及利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。

背景技术

在过去的四十年中，基因工程技术的发展突飞猛进。大量基因药品陆续问世，年产值达数十亿美元。

基因工程药物的生产方法可以分为二大类。

第一类方法是将特定的药物基因导入到工程菌或工程细胞中，经细菌或细胞发酵培养，分离纯化得到。这一方法的特点是技术简单，但生产成本高，药物生物学活性不高。

第二类方法是转基因动物制药。所谓转基因动物制药是将药物蛋白基因导入到动物体内(如牛或奶山羊)，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯等工序制成基因工程药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，但是技术较复杂，前期投资较高。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发明，转基因动物制药已成为研发非常活跃的领域。

与基因工程细胞反应器相比，转基因动物制药具有高效益、低成本、高产量、高质量、能耗低、无污染等诸多优点。

西方发达国家已有二十多年转基因动物制药开发历史，技术已趋成熟。最近，美国GTC公司在羊奶中生产的(一种人体抗凝血蛋白)已获欧洲EMEA和FDA批准，进入欧洲和美国市场。这是第一个通过转基因在羊奶中生产的上市药品，对转基因工业界而言具有里程碑意义。中国虽然在此领域的科学研究已取得进展，但工业化则刚刚起步。

胆碱酯酶是一类参与神经递质传递的酯酶总称，其主要功能是在神经胆碱能突触水解乙酰胆碱。此类突触存在于人类、其他脊椎动物及昆虫的神经系统。当这些突触不断发射信号时，肌肉、腺体和神经元会受到刺激或抑制。神经递质乙酰胆碱的作用是传递这些刺激信号，而胆碱酯酶通过水解乙酰胆碱阻止其信号传递。胆碱酯酶抑制物质如有机磷化合物或氨基甲酸酯类杀虫剂及药物能阻止乙酰胆碱水解，造成乙酰胆碱堆积，从而引起神经系统过度活跃。人类和其他动物若接触胆碱酯酶抑制物质，取决于其类型和数量，可造成从轻度如抽搐、颤抖等到严重如呼吸麻痹、惊厥等症状。在极端情况下，引起死亡。

胆碱酯酶可由不同数量的催化和非催化亚基组成。这两种酶都由约600个氨基酸的亚单位组成并糖基化。根据其底物偏好和对选择性抑制剂的敏感性，胆碱酯酶分为两大类。

那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂BW284C51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(AChE)，或乙酰胆碱乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或I型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。

那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(BCHE，EC3.1.1.8)。丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。该酶又称血浆型，血清型，苯甲酰型，虚假型或II型胆碱酯酶，有超过11个同工酶变异体。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。

尽管胆碱酯酶抑制物质对人体产生破坏性影响，但它们也有治疗用途，能治疗老年痴呆症和帕金森氏病，青光眼，多发性硬化症，重症肌无力等。

有机磷化合物在过去50年中应用于战争及作为农药使用使急性和迟发性中毒病例数目持续上升。据估计，每年50-100万农药相关的中毒病例中，死亡人数达19,000人。据统计，2007年中国农药总产量达173万吨，居世界第一位(农药研究与应用2008年第2期)。但是，中国研发的高效、低毒、低残留、环保型农药所占比例较低，杀虫剂在各类农药中所占比重较高，且50%以上是广谱、高毒有机磷杀虫剂。农药大量应用具有较大风险，如由于施用技术不当，环境健康意识不强，过多使用或管理不善而引起的人体急性有机磷农药中毒和农产品农药残留问题，不仅威胁人类健康，还影响到农产品在国际市场的竞争力。

目前治疗有机磷中毒主要为接触后静脉注射或肌肉注射各种药物组合，包括氨基甲酸酯类(如吡啶斯的明)，抗胆碱类药(如阿托品)，胆碱酯酶活化剂如氯解磷定(2-PAM，Protopam)。虽然这类药物治疗能有效防止有机磷农药中毒死亡，但对防止抽搐、行为障碍或永久性脑损伤无效。此外，毒物接触后的药物治疗往往无效，因为即使小剂量有机磷化学战剂可能导致瞬间死亡。这些药物缺点导致胆碱酯酶被用于有机磷农药中毒的预防和治疗研究。人体接触后症状可通过丁酰胆碱酯酶预处理而缓解，因为该酶能在有机磷化合物袭击其生理靶标前中和它们。使用胆碱酯酶作为预防药物已成功在动物包括非人类灵长类动物身上得到证明。例如，应用胎牛血清源性乙酰胆碱酯酶或马血清衍生丁酰胆碱酯酶预处理猕猴，能保护他们抵抗2-5倍LD50高毒性有机磷神经毒剂梭曼的袭击(Pharmacol ExpTher259:633-638,1991；Toxicol Appl Pharmacol117:189-193,1992)。除预防毒剂致死外，这些预处理还能预防梭曼袭击后的行为丧失症状。服用足够外源性人类丁酰胆碱酯酶可以保护小鼠，大鼠和猴子免于多个致死剂量的有机磷化合物毒性袭击(BiochemicalPharmacology42:2465-2474,1993；Toxicol Appl Pharmacol145:43-53,1997；ToxicolSci43:121-128,1998)。纯化的人丁酰胆碱酯酶已被用来治疗人类的有机磷农药中毒，无重大不良免疫或心理反应(Minerva Anestesiol54:337,1998)。

体外和体内有机磷滴定都显示，有机磷抑制酶类和累积剂量的神经毒剂之间存在1:1化学计量比。有机磷毒剂抑制胆碱酯酶是由于毒剂与胆碱酯酶活性中心丝氨酸形成了稳定的具化学计量比(1:1)的共价体。紧接着是平行的竞争反应，称为“老化”，其中受到抑制的胆碱酯酶被转化成一个不能被常用的活化剂再生的形式。这些活化剂，如活性中心定向亲核体(如季铵肟)，通常分离活性中心丝氨酸的羟基磷成分。衰老过程涉及共价结合有机磷基团脱烷基化，并使治疗某些有机磷中毒如梭曼、沙林和DFP变得非常困难。

尽管丁酰胆碱酯酶有因阻止有机磷化合物中毒而作为广泛应用药物的潜能，但由于供应受限目前无法广泛使用。由于提供保护所需的1:1化学计量比，需大量丁酰胆碱酯酶进行有效治疗。目前只能从人血浆中提取。远远不能满足各种需求。

除了具有水解有机磷毒素的功效之外，有证据表明，丁酰胆碱酯酶还是可卡因主要解毒酶(Mol Pharmacol55:83-91,1999)。

鉴于丁酰胆碱酯酶的重要药用潜力，研究主要集中利用基因工程方法研发和生产。不同于血浆生产酶类，重组丁酰胆碱酯酶传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险要低很多。据报道，重组丁酰胆碱酯酶已在下列系统中表达：大肠杆菌，显微注射爪蟾卵母细胞(美国专利号5215909)，体外昆虫细胞系及昆虫幼虫体内(BiotechnolAppl Biochem31:225-229,2000)，家蚕(Biochem Pharmacol60:121-126,2000)，以及哺乳动物COS细胞(Biotechnol Appl Biochem31:225-229,2000)和CHO细胞(J Biol Chem268:14329-41,1993；Biochemistry36:786-795,1997；BiochemJ327:747-757,1997；JNeurochemistry74:869-877,2000)。然而，许多基因工程生产的丁酰胆碱酯酶只具备很少或没有体内酶活性，这些表达系统不足以产生足够数量可实际应用的丁酰胆碱酯酶。

此外，虽然有利用转基因山羊奶生产出丁酰胆碱酯酶的研究，但由于转基因山羊是经配子微注射方法而获得，因此不仅周期长而且转基因效率很低，只有5%左右。另外，由于转基因动物所产重组人丁酰胆碱酯酶为四聚体，二聚体和单体的混合物(PNAS104：13603-13608,2007)，不利于质量控制和后续加工，因此产业化难度很大。

综上所述，现有技术中的各种表达或分离纯化系统或者不能生产或分离纯化足够数量具活性的重组人丁酰胆碱酯酶，或者所生产的具活性的重组人丁酰胆碱酯酶产品不均一化，因此本领域迫切需要开发新的高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5'至3'，依次包括可操作性连接(operably linked)的以下元件：

(i)绝缘体片段；

(ii)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列；

(iii)至少一个信号肽编码序列(如酪蛋白信号序列)，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽；

(iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；和

(v)终止密码子；

并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。

在另一优选例中，所述表达盒还包括(vi)任选地位于各元件之间的连接序列。

在另一优选例中，所述表达盒还包括供哺乳动物细胞选择的新霉素，或嘌呤霉素抗性基因。

在另一优选例中，所述的标记基因可位于元件(i)之前、元件(i)与(ii)之间、或元件(v)之后。

在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BCHE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BCHE。

在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：

(i)氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶；

(ii)氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；

(iii)氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白编码序列选自下组：

(i)核苷酸序列如SEQ ID No.:4所示的重组人丁酰胆碱酯酶编码DNA序列；

(ii)核苷酸序列如SEQ ID No.:5所示的人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；

(iii)核苷酸序列如SEQ ID No.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的载体是表达载体。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第二方面所述的载体或染色体中整合有本发明第一方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞经瞬时或稳定转染而表达重组的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：乳腺上皮(MAC-T)细胞，胚胎成纤维细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。

本发明的第四方面，提供了一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，包括步骤：

(i)提供一转基因的非人哺乳动物动物，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有本发明第一方面所述的表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和

(ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。

本发明的第五方面，提供了一种乳汁原料，所述乳汁由非人哺乳动物分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。

在另一优选例中，在所述乳汁中，二聚体、三聚体或四聚体形式的丁酰胆碱酯酶的总含量≤10%，较佳地≤5%，更佳地≤1%，按单体、二聚体、三聚体和四聚体形式的4种丁酰胆碱酯酶的总量计。

在另一优选例中，所述的乳汁是由转基因的非人哺乳动物所分泌，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有本发明第一方面所述的表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁。

在另一优选例中，所述乳汁中，重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的含量≥500mg/L乳汁。

本发明第六方面提供了一种分离或纯化的重组蛋白，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用本发明第四方面所述方法制备的。

本发明第七方面，提供了一种制造药物组合物的方法，该方法包括步骤：

将(i)本发明第六方面所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。

在另一优选例中，所述方法还包括将上述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)肟类药物进行混合，从而形成药物组合物。

在另一优选例中，所述的重组蛋白的用途，用于(i)制备预防和/或治疗有机磷中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物；

在另一优选例中，所述的药物还含有肟类药物。

本发明第八方面，提供了一种制备转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤；

(i)提供一含有本发明第一方面所述的表达盒的载体或来自所述载体的含本发明第一方面所述表达盒的核酸片段；

(ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞；

(iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有本发明第一方面所述的表达盒的细胞，从而获得整合的细胞；

(iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞；

(v)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合蛋白的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物；

其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。

在另一优选例中，所述的物种包括：羊、牛、兔和啮齿动物。

本发明第九方面，提供了一种将本发明第八方面所述的哺乳动物细胞经核移植与去核卵母细胞结合而形成胚胎的方法。

本发明第十方面，提供了一种使转基因哺乳动物在泌乳期分泌丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：

(i)将一个或几个根据本发明第九方面所述的方法所形成并成长的胚胎转移到雌性哺乳动物代孕体，导致该代孕母体分娩出转基因哺乳动物；

(ii)筛选雌性转基因哺乳动物；

(iii)诱导或维持雌性转基因哺乳动物哺乳期；

(iv)从哺乳期哺乳动物提取奶液。

本发明第十一方面提供了一种预防有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效预防剂量。

本发明第十二方面提供了一种治疗有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十三方面提供了一种治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十四方面提供了一种治疗可卡因中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十五方面提供了一种治疗有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十六方面提供了一种治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十七方面还提供了一种治疗可卡因中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。

本发明第十八方面，还提供了产生本发明表达盒的方法，包括将编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白序列与酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列连接以表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，和至少一个提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号序列。本发明还包括含该表达盒DNA序列的非人类哺乳动物胚胎或哺乳动物细胞，包括乳腺上皮细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。

本发明第十九方面，提供了使转基因哺乳动物在泌乳期分泌丁酰胆碱酯酶全酶，或单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括：

(1)将一个或几个根据上述方法所形成并成长的胚胎转移到雌性哺乳动物代孕体，导致该代孕母体分娩出转基因哺乳动物；

(2)筛选雌性转基因哺乳动物；

(3)诱导或维持雌性转基因哺乳动物哺乳期；

(4)从哺乳期哺乳动物提取奶液。本发明还针对一种从上述方法所产生的奶液中分离和纯化丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法。

本发明第二十方面，还提供了一种生产药物成分的方法，包括将转基因哺乳动物所产重组丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白或丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白与药物学可接受的载体或赋形剂相结合。因此，本发明进一步针对预防和治疗有机磷中毒，手术后琥珀胆碱引起的呼吸暂停及可卡因中毒的方法，该方法包括让人体服用足够疗效的上述通过本发明方法产生的药物成分。

本发明第二十一方面，还提供了一种制造药物组合物的方法，包括将转基因哺乳动物所产重组丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与肟类药物结合。因此，本发明进一步针对预防和治疗有机磷中毒，手术后琥珀胆碱引起的呼吸暂停及可卡因中毒的方法，该方法包括让人体服用足够疗效的上述通过本发明方法产生的药物结合体。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中重组人丁酰胆碱酯酶表达构建体质粒示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次利用转基因哺乳动物乳腺生物平台大规模高效生产重组人丁酰胆碱酯酶全酶和单体。本发明方法不仅转化效率高、生产周期短，而且所生产的全酶和单体产品均一，易于进行质量控制和后续加工，因此特别适合大规模产业化应用。在此基础上完成了本发明。

定义

“丁酰胆碱酯酶”是指一种能水解丁酰胆碱和乙酰胆碱的多肽，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(也称ISO-OMPA)敏感。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。由本发明生产的首选丁酰胆碱酯酶是哺乳动物丁酰胆碱酯酶。首选哺乳动物丁酰胆碱酯酶包括人体丁酰胆碱酯酶。尤其，只要该丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列与人体丁酰胆碱酯酶基本相同。该丁酰胆碱酯酶可由与人体丁酰胆碱酯酶cDNA序列基本相同的核酸序列编码。“丁酰胆碱酯酶”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶多肽盐。

“丁酰胆碱酯酶单体”是指不含四聚体功能域(如缺少了C-末端40个氨基酸残基)的人丁酰胆碱酯酶。

“丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”是指一种能水解乙酰胆碱和丁酰胆碱的丁酰胆碱酯酶单体与白蛋白融合的多肽。由本发明生产的首选融合蛋白是哺乳动物丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白。首选哺乳动物融合蛋白包括人体丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。尤其，只要该融合蛋白的氨基酸序列与人体丁酰胆碱酯酶单体和白蛋白基本相同。此外，融合蛋白的两个构成元件之间可任选地通过连接肽连接，例如通过一种含至少7个氨基酸(包括6个甘氨酸和1个丝氨酸)的寡肽相连接。该融合蛋白可由与人体丁酰胆碱酯酶单体和人体血清白蛋白cDNA序列基本相同的核酸序列编码。较佳地，两个构成元件的编码序列之间直接连接或可通过连接肽的编码序列相连。“融合蛋白”还包括药物学上可接受的融合蛋白的盐形式。

“基本相同”是指一种多肽或核酸序列与参考氨基酸或核酸序列相比表现出至少75%，更好85%或90%以上，最好95%以上的同源性。多肽序列一般至少包含20个氨基酸，更好30-40个以上氨基酸，最好50个以上氨基酸。核酸序列一般至少包含60个核苷酸，更好90个以上核苷酸，最好120个以上核苷酸。在本发明中，“基本相同”的多肽通常可保留或具有≥50%，较佳地≥60%，更佳地≥70%，最佳地≥80%或≥90%或≥100%如100～500%的参考多肽的生物活性。

“重组丁酰胆碱酯酶”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶。“重组丁酰胆碱酯酶”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶多肽盐。

“重组丁酰胆碱酯酶单体”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶单体。“重组丁酰胆碱酯酶单体”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶单体多肽盐。

“重组丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。“重组丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白多肽盐。

“重组DNA序列”指的是一种DNA序列以在自然界中不被发现存在的方式排列，该序列可能会存在于孤立的体外DNA，体内额外染色体DNA，或作为体内基因组DNA的部分。

“表达盒”或“构建体”是指一种包括目标核酸序列或基因序列，能表达合适蛋白，与宿主细胞内提供适当转录和翻译的目标核酸序列成分操作连接。所述成分可能包括启动子，分泌信号序列，加尾信号，内含子序列，绝缘子序列及本发明所述的其他成分。“表达盒”或“构建体”还可包括“载体序列”。“载体序列”是指用本发明重组DNA技术构建的核酸序列以利于表达构建体的克隆和表达。代表性的表达载体类型包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，及酵母人工染色体。

“双顺反子结构”是指任何能表达两个独立翻译蛋白产品的构建体。这两种产品可能会从一个单一的基因双顺反子结构或从两个独立的mRNA翻译而来，每个独立的mRNA由同样的双顺反子结构编码。“聚顺反子结构”是指任何能提供两个以上独立翻译蛋白产品表达的构建体。

“操作性连接”是指一个目标核酸序列和一个或多个调控序列(例如，启动子)物体上联系起来，以便能够在宿主细胞内表达目标核酸序列编码的多肽。

“信号序列”是指一段核酸序列，当被引入到编码多肽的核酸序列，能指导表达该多肽的细胞分泌该多肽(如丁酰胆碱酯酶和/或糖基转移酶)。信号序列最好位于核酸编码序列5'端，这样信号序列的多肽位于翻译多肽的N-末端。“信号肽”是指信号序列翻译的多肽序列。

“乳腺特异性启动子”是指能启动多肽主要在乳腺细胞表达并在乳汁分泌的与编码该多肽核酸序列操作性连接的启动子。优选的乳腺特异性启动子包括(但并不限于)：β-酪蛋白启动子和乳清酸蛋白(WAP)启动子。

“宿主细胞”是指已经过一个或多个本发明表达构建体转染的细胞，包括哺乳动物体外培养细胞和体内细胞。优选的体外培养哺乳动物宿主细胞包括(但并不限于)：MAC-T细胞和BHK细胞。

“转染”是指在宿主细胞中引入一个或多个本发明表达构建体的实施过程，包括(但并不限于)：显微注射，电穿孔，脂质体介导转染，磷酸钙介导转染或病毒介导转染等。本发明表达构建体若已转染至宿主细胞，则称其为“已转染的”。“瞬时转染细胞”是指这样的宿主细胞，在该宿主细胞中引入了表达构建体但没有永久整合到宿主细胞或其后代的基因组，因而随时间推移该表达构建体可被宿主细胞或其后代丢失。“稳定的转染细胞”是指引入宿主细胞的表达构建体已整合到宿主细胞及其后代的基因组。

“转基因”是指任何一个已整合至转染宿主细胞基因组的本发明表达构建体的结构。含有这类转基因的宿主细胞称为“转基因细胞”。这种由部分或全部转基因宿主细胞组成的动物是“转基因动物”。首选转基因动物为转基因哺乳动物(如啮齿动物或反刍动物、或家畜)。由部分转基因宿主细胞组成的动物称为“嵌合体”或“嵌合体动物”。

“肟类”是指含有羰基的醛、酮类化合物与羟胺作用而生成的化合物，在体内能重新激活磷酸化的胆碱酯酶。

1.丁酰胆碱酯酶

如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明的丁酰胆碱酯酶”、或“本发明重组的丁酰胆碱酯酶”指出用本发明转基因动物乳腺生物平台大规模生产出的重组人丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与其他蛋白(如白蛋白)的融合蛋白。

可用于本发明的丁酰胆碱酯酶没有特别限制，可以是来源于任何生物体的丁酰胆碱酯酶，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人。此外，应理解，该术语包括野生型或突变型(包括截断型)的丁酰胆碱酯酶，只要该突变型丁酰胆碱酯酶保留或保持了野生型丁酰胆碱酯酶的解毒活性。

人丁酰胆碱酯酶cDNA序列已被克隆(美国专利号5215909)。此外，美国专利号5248604揭示了人类乙酰胆碱酯酶的非糖基化的变异体。野生型人类丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列，以及几个丁酰胆碱酯酶变异体单一氨基酸的变化，在美国专利号6001625也有披露。

在本发明中，特别优选的是截断型丁酰胆碱酯酶，尤其是去除了C末端的多个lys残基所获得的BCHE，例如截断的、不含C末端最后40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶(简称为“delC40-BCHE”)。因为3个赖氨酸残基处于被删除的40个残基中，生产出的规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化处理的有效性。

实验表明，截断的delC40-BCHE显示与原酶具同样催化性能。

另一种优选方式是截断型丁酰胆碱酯酶与其他蛋白(如白蛋白)形成的融合蛋白。

本发明蛋白由于成分均一，因此特别适合进行后加工或修饰，以便获得改善的性能，其中包括(但并不限于)：聚乙二醇修饰等。

聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能。多肽或蛋白吸附亲水性PEG分子后，能提高水溶性并形成一个屏障，以防止酶降解、肾脏清除、与细胞表面蛋白发生相互作用和形成中和抗体，从而延长多肽或蛋白的半衰期。

本发明生产的重组丁酰胆碱酯酶，可用于治疗和/或预防有机磷农药中毒，神经毒气中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于水解蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。

2.丁酰胆碱酯酶选择

丁酰胆碱酯酶正常情况下形成球状四聚体，分子量约为340kDa。该形式最稳定，首选用于治疗目的。野生型，变异体，和人工丁酰胆碱酯酶可通过根据本发明的转基因哺乳动物而产生。由此产生的丁酰胆碱酯酶具有中和和/或水解有机磷农药，毒气，琥珀酰胆碱，或可卡因的能力。

根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶所包含的氨基酸序列与发现的哺乳动物丁酰胆碱酯酶序列最好基本相同，更好与人丁酰胆碱酯酶序列基本相同。本发明所生产的丁酰胆碱酯酶可为四聚体，三聚体，二聚体，或单体。本发明所产生的丁酰胆碱酯酶最好具有与自然人丁酰胆碱酯酶基本类似的糖基化属性。根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶最好与人血清白蛋白融合以增加其血浆半衰期。

1)四聚体丁酰胆碱酯酶

根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶最好是四聚体形式。该形式更稳定，并具有较长的血浆半衰期，从而增加其疗效。丁酰胆碱酯酶在CHO细胞的重组表达被发现不是以更稳定的四聚体形式存在，而是包括约55%二聚体，10%-30%四聚体和15-40%单体(Biochem J327:747-757，1997)。有研究表明，富含脯氨酸的胶原尾部蛋白的N-末端氨基酸序列可将乙酰胆碱酯酶组装成四聚体(J Biol Chem272:3016-3021,1997；JBiol Chem272:22840-22847，1997)。因此，为了提高根据本发明所产生的丁酰胆碱酯酶的四聚体含量，编码丁酰胆碱酯酶的DNA序列可包含富含脯氨酸附属区域(PRAD)，该区域帮助组装重组丁酰胆碱酯酶亚单位(例如，单体，二聚体和三聚体)从而形成四聚体。该区域最好包括至少6个残基，后跟至少10个脯氨酸残基。一个在本发明中PRAD的实例包括下列氨基酸序列Glu-Ser-Thr-(Gly)3-(Pro)10。该PRAD可能被包括在一个编码PRAD和丁酰胆碱酯酶的双顺反子表达构建体，或在不同的表达构建体。此外，PRAD编码可定向附于丁酰胆碱酯酶编码。本发明还包括在重组丁酰胆碱酯酶混合物中添加合成的(例如，聚脯氨酸)或天然存在的PRAD，以诱导丁酰胆碱酯酶重排为四聚体。

2).非四聚体丁酰胆碱酯酶

虽然四聚体丁酰胆碱酯酶是有机磷中毒预防和治疗的最有效形式，本发明也包括已表明底物活性的其他形式的丁酰胆碱酯酶(例如，单体，二聚体和三聚体)。然而，非四聚体形式丁酰胆碱酯酶在体内不太稳定的观察不能排除它们在体内应用的有效性。非四聚体较高剂量或更频繁在体内给药可以导致满意的治疗结果。

丁酰胆碱酯酶非四聚体可用于许多并不需要在体内给药的场合，如清理用于存储有机磷化合物的场地，以及军事设备有机磷的去污。作为体外应用，这些非四聚体可制成海绵，喷雾剂，清洁溶液或其他材料用于清洁设备和人员。非四聚体也可应用于已暴露于有机磷化合物的人类患者的皮肤和外衣。非四聚体也可以作为障碍物和密封剂用于化学战中军事服装和防毒面具的接缝和关闭处。

此外，生产规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化的有效性。聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能，从而延长重组蛋白的半衰期。

3).产生编码突变体丁酰胆碱酯酶的核酸序列

野生型人丁酰胆碱酯酶氨基酸序列载于编号为6001625的美国专利，该专利还公开了在117位由组氨酸取代甘氨酸残基(定义为G117H)的突变体丁酰胆碱酯酶。该突变体丁酰胆碱酯酶已被证明对由有机磷化合物引起的失活特别耐受(Biochemistry36：786-795，1997)。许多在本领域已知的方法，如PCR，位点定向体外诱变技术，包括连接子插入，嵌套删除，连接子扫描，和寡核苷酸介导的诱变等，可用于在编码丁酰胆碱酯酶核酸序列引入突变。这类突变型丁酰胆碱酯酶，其催化性能，温度分布，稳定性，循环时间和与可卡因或其他底物及/或特定的有机磷化合物的亲和性可发生改变；其四聚体，二聚体或单体形成可增加或减少；或其它所需功能发生改变。在本发明中，可应用这些编码突变型丁酰胆碱酯酶的核酸序列。

一种优选的方法，如核酸序列或DNA的“混洗”(shuffling)，可产生重组编码突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列的资料库，用于产生和识别突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列。将所获资料库在一个合适的宿主细胞系表达以筛选和生产具有所需特性的突变型丁酰胆碱酯酶。

另一种优选的方法，如利用计算机模型进行分子动力学模拟(PNAS102：16656-16661，2005)，可用于模拟能更有效水解有机磷化合物的丁酰胆碱酯酶蛋白结构稳定优化环境，从而发现比野生型丁酰胆碱酯酶更有效催化有机磷化合物的突变型丁酰胆碱酯酶。

4).自然存在的丁酰胆碱酯酶变异体

丁酰胆碱酯酶编码基因在人类有四个主要的等位基因形式和其他25个与遗传缺陷有关的形式(见表1)。四个主要的等位基因形式为Eu，Ea，Ef和Es。Eu为野生具全功能的等位基因，含表型EuEu或UU。Ea等位基因被称为非典型丁酰胆碱酯酶,含纯合子表型(EaEa=AA)的人血清对大多数酶底物只有微弱反应，并显示对地布卡因抑制酶活性抵抗力增加。Ef等位基因也产生较弱酶活性，但呈现对氟化物抑制抵抗力增加。Es与缺乏酶活性(沉默)有关。

某些人群携带非典型丁酰胆碱酯酶编码基因，他们能正常水解乙酰胆碱，但不能水解一种常用麻醉剂，如琥珀酰胆碱。这个问题常见于一种非典型变异体Es，其中3-6%的白人人口为杂合子，约0.05%为纯合子。另一个变型体，E1，导致纯合子血清丁酰胆碱酯酶催化活性完全缺失。携带非典型或沉默丁酰胆碱酯酶编码基因人群手术后可能发生呼吸暂停。因此，该类人群服用重组丁酰胆碱酯酶可减轻或防止长时间手术后呼吸暂停。

5).丁酰胆碱酯酶单体-人血清白蛋白融合蛋白

根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶要实现血浆稳定性和较长半衰期的另一种方法是提供重组丁酰胆碱酯酶单体与人血清白蛋白(HSA)融合。该融合蛋白具有高血浆稳定性和全身均匀分布，具弱免疫原性或无免疫原性。例如，HSA可以通过一个含6个甘氨酸和1个丝氨酸的连接肽融合于丁酰胆碱酯酶N-末端或C-末端。

表1.人丁酰胆碱酯酶表型结构基础

数字代表信号肽被裂解后成熟野生型人丁酰胆碱酯酶残基的位置。

3.表达盒组装

应用于本发明的基因工程方法系标准已知程序(如“分子克隆实验室手册”第二版等)。这些标准的分子生物学技术，可以用来准备该发明的表达盒。表达盒包含一些必要元件以在选择性宿主细胞内开展目标核酸序列的转录和翻译，包括启动子，翻译产物的分泌信号序列和polyA信号。类似的表达盒也可能含有内含子或非编码基因序列，旨在提高转录和翻译效率及mRNA的稳定性。待表达的核酸序列可以具有其内源性的3'端非编码序列和/或polyA信号，或包含一个外源性3'端非编码序列和/或polyA信号。例如酪蛋白启动子，分泌信号序列，3'端非编码序列和polyA信号，可用于在乳腺宿主细胞内表达丁酰胆碱酯酶。密码子的选择及目标核酸序列的构造设计或选择包含所需宿主细胞内优先使用的密码子，可用于尽量减少早期翻译终止，从而最大限度地表达蛋白。

插入的核酸序列也可能编码便于识别和编码多肽的附加表位标签。编码的附加表位标签可以包括用于特异位点蛋白水解或化学裂解以利于蛋白纯化后附加表位标签去除的识别位点。例如凝血酶裂解位点可以掺入重组丁酰胆碱酯酶和其附加表位标签之间。

本发明构建的旨在宿主细胞内表达重组丁酰胆碱酯酶的表达盒可包括一个或多个以下基本组件。

1)启动子

这些序列对宿主细胞而言可具内源或异源性，可进行修饰，并可提供全能(即表达不受明显外部刺激影响，不属细胞特异)或组织特异性(亦称细胞特异)表达。全能表达启动子序列包括合成的和自然的病毒序列，例如，人巨细胞病毒直接早期启动子(CMV)；猿猴病毒40(SV40)的早期启动子；Rous肉瘤病毒(RSV)；或腺病毒主要晚期启动子。这些启动子赋予与它们操作性连接的核酸分子较高的转录水平。启动子可被修饰，如删除或增加序列，如促进子(巨细胞病毒，SV40，或呼吸道合胞病毒促进子)，或促进子的串联重复序列。包含强壮促进子序列的启动子可增加转录达10-100倍。

对于转基因动物乳腺组织中的特异性表达，启动子序列可衍生自哺乳动物的乳腺特异性基因。适合的乳腺特异性启动子包括：乳清酸性蛋白(WAP)启动子(美国专利号5831141和6268545；Proc Natl Acad Sci USA84：1299-1303，1987)；αS1-酪蛋白(美国专利号5750172和6013857，PCT公开号WO91/08216和WO93/25567)；αS2-酪蛋白，β-酪蛋白(美国专利号5304489；Nucleic Acids Res16：1027-1041，1988)；κ-酪蛋白(Gene174：27-34，1996；Transgenic Res5：271-279，1996)；β-乳球蛋白(Biochem J310：637-641，1995)；和α-乳清蛋白(Eur J Biochem186：43-48，1989；PCT公开号WO88/01648)。

2).内含子

含有内含子序列(即基因组序列)的核酸序列相比无内含子的序列表达量较高。因此，在转录起始位点和转译起始密码子之间及3'末端和转译终止密码子之间，或丁酰胆碱酯酶编码核酸序列内部插入内含子序列可导致该酶较高表达水平。这样的内含子序列，包括5'端剪接位点(供体位点)和3'端剪接位点(受体位点)，至少被100个非编码序列碱基对分开。这些内含子序列可衍生自其启动子被用来驱动丁酰胆碱酯酶表达的基因，自然丁酰胆碱酯酶基因，或其它合适基因的基因组序列。应选择这样的内含子序列，以尽量减少表达盒内重复序列的存在，因为这样的重复序列可增加重组机会，从而造成结构不稳定。这些内含子最好位于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列之内，与自然人丁酰胆碱酯酶基因的内含子/外显子结构类似。

3).信号序列

每个表达盒将另外包括能提供从宿主细胞分泌重组丁酰胆碱酯酶的信号序列。这样的信号序列存在于能分泌其蛋白产物的自然基因。本发明可采用来自于丁酰胆碱酯酶基因，宿主细胞特异性表达基因(例如，酪蛋白)，或另一个其蛋白产物已知分泌基因(例如，人碱性磷酸酶，蜂毒，免疫球蛋白轻链蛋白Igκ，及CD33)，或可合成的信号序列。

4).终止区域

每个表达盒将另外包括核酸序列，该序列包含转录终止和多聚腺苷酸化序列。该序列被链接于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列的3'末端。这些序列可包括其5'端区域驱动丁酰胆碱酯酶表达基因的3'末端和多聚腺苷酸化信号(即山羊β-酪蛋白基因的3'末端)。或者，这样的序列来自于该序列已被证明可以调节转录后mRNA稳定性的基因(例如，那些来自于牛生长激素基因，β-珠蛋白基因，或SV40早期启动子区域的序列)。

5).表达盒其他功能

丁酰胆碱酯酶编码核酸序列在其5'端或3'端非翻译区(UTR)内，和/或在编码的丁酰胆碱酯酶N-末端的区域内可任选地被修饰，以提高表达水平。丁酰胆碱酯酶编码核酸序列内的序列可被删除或突变，以增加分泌和/或避免丁酰胆碱酯酶产品停留于细胞内；例如，作为调节，加上内质网滞留信号或其它分类抑制信号。

此外，表达盒可含位于丁酰胆碱酯酶编码核酸序列5'端和/或3'端，从而提高转导宿主细胞集成率的适当序列(即ITR序列，Mol Cell Biol8：3988-3996，1988)。表达盒还可含具染色质开放或绝缘体活性的核酸序列，从而重复激活链接的转基因组织特异性表达。这样的序列包括基质结合区(MARs)(Mol Repro Dev44：179-184，1996；Proc Natl AcadSci USA89：6943-6947，1992)。另请参见PCT公开号WO95/33841和WO96/04390。

表达盒还包括利于表达结构克隆和繁衍的载体序列。用于本发明并在领域中已知的的标准载体包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体，病毒载体，和酵母人工染色体。载体序列可包含在大肠杆菌中繁衍的复制原点；SV40的复制原点；用于宿主细胞选择的青霉素，新霉素，或嘌呤霉素抗性基因；和/或扩增显性选择标记基因(如二氢叶酸还原酶基因)及其他感兴趣的基因。丁酰胆碱酯酶体外细胞培养长时间表达可通过在哺乳动物宿主细胞使用染色体外自主复制构建体载体序列(例如，EBNA-1和Epstein-Barr病毒oriP)而实现。

用于产生转基因动物的表达盒可在引入宿主细胞前通过限制性核酸内切酶消化线性化。或者，在引入宿主细胞前除去多余的载体序列，引入的线性片段只由丁酰胆碱酯酶编码序列，5'端调节序列(即启动子)，和3'端调节序列(即3'端转录终止和多聚腺苷酸化序列)，及任何侧翼绝缘体或MARs。经这些片段转化的细胞将不含用于原核细胞转化的大肠杆菌复制起源，或编码抗生素耐药蛋白(如青霉素耐药蛋白)的核酸分子。

另外，用于转染宿主细胞的表达盒限制性消化酶消化片段可包括丁酰胆碱酯酶编码序列，5'端和3'端调控序列，和任何侧翼绝缘体或MARs，这些序列可与编码抗生素抗性蛋白的核酸序列链接以用于转染真核细胞的抗性选择(如通过新霉素或嘌呤霉素)。

4.转染细胞系体外生成

本发明的表达盒可被体外转染入宿主细胞中。体外宿主细胞最好是哺乳动物细胞系，包括BHK-21，MDCK，Hu609，MAC-T(美国专利号5227301)，R1胚胎干细胞，胚胎癌细胞，COS或HeLa细胞。

哺乳动物细胞体外培养方法在领域里早已建立(Animal Cell Culture:APractical Approach 3rd Edition.J Masters，ed Oxford University Press and BasicCell Culture 2nd Edition.Davis，JM ed Oxford University Press，2002)。转染技术在领域里早已成熟，包括电穿孔，显微注射，脂质体介导的转染，磷酸钙介导的转染，或病毒介导的转染等。进行稳定转染宿主细胞操作，最好是用本发明制备的表达盒，将无载体序列的线性表达构建体DNA导入。转染的体外细胞系可进行表达盒整合和拷贝数的筛选，如细胞系的基因组DNA通过PCR和/或Southern印迹分析。

瞬时和稳定转染的细胞系可用于评估本发明所述表达盒，及分离重组丁酰胆碱酯酶和/或糖基转移酶蛋白。含全能启动子的表达盒可转染任何哺乳动物细胞系。若表达盒含组织特异性启动子，宿主细胞系应与之兼容。稳定转染的细胞系还可用于产生转基因动物。

5.表达盒的评估

使用本发明所述表达盒在产生转基因动物之前，可应用体外细胞培养转染系统确定该表达盒功能。表达盒的遗传稳定性能，重组蛋白的分泌程度和重组蛋白物理和功能属性亦可在转基因动物产生之前评估。含全能启动子的表达盒可转染任何哺乳动物细胞系。若表达盒含乳腺特异性启动子，可转染乳腺上皮细胞。转染细胞培养物介质可用Western印迹分析或生化活性测定(Ellman活性测定；Biochem Pharmacol7：88-95，1961)直接测试分泌蛋白的存在，以确定依据本发明所建丁酰胆碱酯酶编码表达盒而转染的细胞系是否生产重组丁酰胆碱酯酶。凡某个细胞系经稳定转染并已被证明生产活性重组蛋白，该细胞系可用于大规模重组蛋白培养和纯化，亦可用于产生转基因动物。

6.转基因哺乳动物的产生

非人类转基因哺乳动物的产生方法早已在相关领域建立(TransgenesisTechniques.Murphy et al，eds，Human Press，Totowa，New Jersey，1993；GeneticEngineering of Animals.A Puhler，Ed.VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，New York，1993；Transgenic Animals in Agriculture.Murray et al，eds，Oxford UniversityPress,1993)。例如，产生转基因小鼠(Manipulating the Mouse Embryo.2nd Edition，Hogan，et al，Cold Spring Harbor Press，1994；Mouse Genetics and Transgenics:APractical Approach.Jackson and Abbott，eds，Oxford University Press，2000)，转基因奶牛(美国专利号5633076)，转基因猪(美国专利号6271436)，和转基因山羊(美国专利号5907080)的有效方法已建立。这些方法的优选例将在下面段落进行总结。

可用体外稳定转染宿主细胞产生转基因动物。其中所述宿主细胞是多能性或全能性的，可用于桑椹胚聚集或囊胚注射以产生嵌合动物。首选多能性/全能性的稳定转染宿主细胞包括原生生殖细胞，胚胎干细胞，胚胎瘤细胞等。桑椹胚聚集法是将稳定转染宿主细胞与非转基因桑椹胚阶段胚胎聚集。囊胚注射法是将稳定转染宿主细胞引入到非转基因囊胚阶段胚胎的囊胚腔。然后，经聚集或注射的胚胎被转移到一个假孕母性以怀孕和嵌合体分娩。其生殖细胞系含转基因宿主细胞的嵌合动物可用于繁衍全转基因的非嵌合后代。

另外，这样稳定转染的宿主细胞可用作核移植供体转移至卵母细胞受体(Nature385：810-813，1997)。核移植所用稳定转染宿主细胞，并不需要是多能或全能性。比如，可以使用稳定转染的胚胎成纤维细胞(Science280：1256-8，1998；Biol Reprod64：849-856，2001)。卵母细胞受体在核移植前需去核。核移植后，卵母细胞被转移到一个假孕母性以怀孕和分娩。所产后代为全转基因(即非嵌合)。

转基因在动物，组织或相关细胞基因组DNA中的存在，及转基因拷贝数可通过在相关领域中公认的技术包括杂交和PCR技术而确认。

一些转基因方法会导致嵌合动物的产生。在嵌合动物中，部分转基因宿主细胞中所述表达构建体的启动子处于活动状态(例如，乳腺WAP启动子)，从而表达所需的重组丁酰胆碱酯酶。嵌合动物可被用于特性描述或分离重组丁酰胆碱酯酶。嵌合动物的生殖细胞可用于繁衍并产生全转基因的非嵌合后代。

直接通过转基因方法产生，或通过嵌合动物繁衍的全转基因后代可被用于繁殖以维持转基因品系，及特性描述或分离重组丁酰胆碱酯酶。由乳腺特异性启动子驱动的转基因表达可诱导和维持转基因动物哺乳期；所收集的乳汁可用于重组酶的纯化和特性描述。对于转基因雌性，可通过怀孕或服用激素诱导哺乳期。对于转基因雄性，可通过服用激素诱导哺乳期(Biotechnology12：699-702，1994)。哺乳期通过持续收集乳汁而维持。

7.重组丁酰胆碱酯酶的纯化

重组丁酰胆碱酯酶可应用普鲁卡因胺亲和层析方法从分泌丁酰胆碱酯酶转染细胞体外培养液和转基因动物表达丁酰胆碱酯酶乳腺乳汁中分离(Biochemistry36：786-795，1997)。

从培养液纯化时，在应用普鲁卡因胺分析柱程序前将培养液离心或过滤以除去细胞碎片。培养液也可通过超滤浓缩。

从乳汁纯化时，在应用普鲁卡因胺分析柱程序前，可通过常规方法(如使用切向流系统)来去除酪蛋白和脂肪。为提高重组丁酰胆碱酯酶纯度，可应用一些附加步骤如蓝色琼脂糖CL-6B层析或过硫酸铵分馏加离子交换层析。酶的纯度可通过反相HPLC评估。纯化后的重组丁酰胆碱酯酶可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300区分四聚体和单体。

8.丁酰胆碱酯酶特点检测分析

所述检测方法可用来从转染细胞培养液和转基因动物乳汁中分析重组丁酰胆碱酯酶活性，稳定性，结构特征，以及体内功能。体外丁酰胆碱酯酶活性检测各种方法已在领域公知(J Biol Chem253：361-366，1978；Biochemistry36：786-795，1997；BiotechnolAppl Biochem31：226-229，2000；Biochem J327：747-757，1997)。通过使用Ellman活性测定待测样品是否存在重组丁酰胆碱酯酶活性(Biochem Pharmacol7：88-95，1961)。通过非变性的4-30%聚丙烯酰胺梯度凝胶与2mM二乙氧膦酰硫胆碱碘化物作为底物染色可估算丁酰胆碱酯酶活性水平(Biochemistry36：786-795，1997)，这种方法是一种采用2MM丁酰硫代胆碱作为底物的变形实验(J Histochem Cytochem12：219，1964)。使用这些方法以丁酰硫代胆碱或乙酰硫代胆碱作为底物，丁酰胆碱酯酶的催化活性包括Km，Vmax，和Kcat值可被确定。其他在领域中已知的方法亦可被用于评估胆碱酯酶功能包括电测法，分光光度法，色谱法，和辐射方法等。纯化后的重组丁酰胆碱酯酶可用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300区分四聚体和单体。丁酰胆碱酯酶的四聚体，二聚体和单体的相对含量，也可通过非变性的4-30%聚丙烯酰胺梯度凝胶与2mM二乙氧膦酰硫胆碱碘化物作为底物染色估算(Biochemistry36：786-795，1997)。一些单克隆抗体可用于重组丁酰胆碱酯酶功能域的特性描述。可以使用竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)定量样品中丁酰胆碱酯酶蛋白的浓度。此方法是基于将多克隆兔抗人丁酰胆碱酯酶抗体耦合到生物素，其中生物素化的抗体与固化丁酰胆碱酯酶抗原的结合被附加的标准或测试样品竞争性地抑制。生物素化抗体量与试验样品中丁酰胆碱酯酶浓度成反比。重组丁酰胆碱酯酶特性可进一步被在本领域中熟知的标准技术包括N-末端测序，碳水化合物含量测定(尤其是末端唾液酸含量)，胰蛋白酶和碳水化合物定位，和体外稳定性测定。例如，可分析重组丁酰胆碱酯酶单糖和寡糖基团的成份，分布和结构(Biochemistry36：7481-7489，1997)。

重组丁酰胆碱酯酶样品对有机磷中毒或可卡因毒性潜在的临床有效性可在体外和体内进行评估。例如，潜在底物梭曼，沙林和塔崩的体外有机磷酸酐水解酶活性可在pH稳态下使用含重组丁酰胆碱酯酶溶液测量。重组丁酰胆碱酯酶中和VX和二乙氧膦酰硫胆硷的活性可在微量滴定板使用修饰的Ellman方法进行测量，以OP化合物替换丁酰硫代胆碱作为底物。丁酰胆碱酯酶催化水解可卡因的效应可用经温度平衡后240nm Gilford分光光度计记录(Mol Pharmacol55：83-91，1999)。

重组丁酰胆碱酯酶样品在体内的半衰期和对有机磷中毒的保护作用可在动物模型中评估，如啮齿类或灵长类动物(Toxicol Applied Pharm145：43-53，1997；JPharmacolExp Ther259：633-638，1991；Pharmacol Biochem Behav46：889-896，1993；BiochemPharmacol41：37-41，1991；Life Sciences72：125-134，2002)。重组丁酰胆碱酯酶血液峰浓度可经动物肌内注射后被测定(Biochem Pharmacol45：2465，1993)。同样，重组丁酰胆碱酯酶样品在体内的半衰期和对可卡因毒性的保护作用可在动物模型中评估(J Toxicol ClinToxicol34：259-266，1996；Toxicol Appl Pharmacol145：363-371，1997)。一旦重组丁酰胆碱酯酶制剂在体内的稳定性和有效性已在动物模型中证实，这种制剂可用于治疗各种病况，包括有机磷中毒，琥珀酰胆碱诱导的手术后睡眠呼吸暂停，或可卡因中毒等。

9.应用

本发明所涉及的丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与白蛋白的融合蛋白，可用于预防和治疗神经毒气中毒，有机磷农药中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。

暴露于有机磷化合物可以导致各种各样的症状，这取决于化合物的毒性，所涉及化合物的浓度，曝露的途径，及持续曝露的时间。在轻度曝露情况下，可能会出现如疲劳，虚弱，头晕，流涕，支气管分泌物增加，恶心，视力模糊等症状。中度症状可能包括胸闷，头痛，出汗，流泪，流涎，大汗，呕吐，视野狭窄，及肌肉抽搐等。严重症状包括腹部绞痛，不自主排尿和腹泻，肌肉震颤，抽搐，步态蹒跚，瞳孔缩小，血压下降(异常低的血压)，心跳缓慢，呼吸困难，昏迷，甚至死亡。有机磷中毒的严重病例只出现在持续每天吸收有机磷农药后，或暴露于毒性最大的有机磷化学战剂。当有机磷农药中毒的症状开始出现，一般不可能判断中毒是否轻微或严重。在许多情况下，当出现皮肤污染时，症状可迅速从轻微发展至严重，即使污染区域被清洗。一些毒性最大的有机磷化合物被用作神经毒剂包括塔崩(GA)，甲基对硫磷，沙林(GB)，VX，梭曼(GD)，二异丙基氟磷酸，及PB。这些化合物很容易通过皮肤吸收，并可被吸入或摄入。无论引入途径如何，神经毒剂中毒的症状通常相似。

一些最常用的有机磷农药包括乙酰甲胺磷(乙酰甲胺磷)，丙硫特普杀虫剂，谷硫磷(Guthion)，克百威(呋喃丹，F制剂)，硫磷(Trithion)，毒虫畏(Birlane)，毒死蜱(Dursban，Lorsban)，蝇毒磷(Co-Ral)，巴毒磷(Ciodrin，Ciovap)，育畜磷(Ruelene)，吸磷(Systox)，二嗪(Spectracide)，敌敌畏(DDVP,Vapona)，百治磷(Bidrin)，乐果等。常用的氨基甲酸酯类农药包括涕灭威(Temik)，恶虫(Ficam)，合杀威，甲萘威(西维因)，克百威(呋喃丹)，伐虫脒(Carzol)，甲硫威(Mesurol)，灭多威(Lannate，Nudrin)，杀线威(Vydate)，抗蚜威(pinmicarb，Pirimor)和残杀威(Baygon)。

本发明提供了一种有机磷中毒的治疗方法，包括给所需对象(如病人)施用治疗有效剂量的本发明的重组丁酰胆碱酯酶。本发明还提供了治疗和改善因暴露于有机磷化合物而导致的症状，以及预防因暴露于这些化合物而出现症状的方法。这些方法涉及在曝露于有机磷化合物之前、之中、或之后，给受试者施用有效剂量的重组丁酰胆碱酯酶。

本发明还涉及用于治疗手术后琥珀酰胆碱诱导呼吸暂停和可卡因中毒的方法。这些方法包括给手术后琥珀酰胆碱诱导呼吸暂停或可卡因中毒病人施用有效剂量的重组丁酰胆碱酯酶。

本发明具有以下主要优点：

(1)药品高活性，人源化。由于转基因动物体系属高等真核生物体系，解决了转译后修饰的问题，保证了药品的生物学活性。此外，基因来源于人，解决了异体排斥问题。

(2)高产量，高质量。转基因动物以乳腺作为生物反应器应用多，效果好。奶天然蛋白总量在3%左右，其主要乳蛋白含量占总蛋白二分之一。因此，可获得高产量和高纯度的转入蛋白。这有助于降低制药成本，简化纯化工作。并且由于纯化步骤减少,生物药品活性易于保持,质量提高。

(3)高效益，低成本。经测算，利用细胞培养方法生产1克药物蛋白，成本需800-5000美元，而利用转基因动物只需0.02-0.5美元。奶牛每年可产纯蛋白40公斤，奶山羊2.5-5公斤，家兔0.1公斤。所以产量高，单位成本低。

(4)低耗能，无污染。动物乳腺生物反应器生产药品是一个处在控制条件下洁净的畜牧业，不会消耗大量能源，无工业有害排泄物。

(5)降低大动物转基因费用，缩短转基因动物生产周期。本发明先将目的基因预先转入到体细胞中，然后从转染细胞中挑选具有最佳整合位点的细胞用于克隆，不仅可选择表达量合适的细胞系作为克隆核供体，而且可大幅缩短制备转基因动物的时间。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明涉及的氨基酸及核苷酸序列说明如表2所示：

表2序列说明

*信号肽位于第1-15位。

实施例1.转基因表达盒的构建和准备

实验步骤：

(i)将质粒pUC19(Promega)经SacI和BamHI内切酶切割，连接到来自鸡β-珠蛋白基因上游区域的绝缘体片段(Proc Natl Acad Sci USA94：575-80，1997)。该绝缘体片段是使用含SacI，SacII，NotI，SalI位点和部分鸡β-珠蛋白基因上游区域DNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:7(5'GAC ACT GAG CTC CAC CGC GGA CTG CGG CCG CTC GTC GAC GGG ACAGCC CCC CCC CAA AGC CCC CAG3')，和含BamHI，XhoI位点及部分鸡β-珠蛋白基因上游区域DNA序列的反式引物如SEQ IDNO.:8(5'AGC GTC GGA TCC ACT TGC GTC CTC GAG GCC CCATCC TCA CTG ACT CCG TCC TGG AGT TG3')，从鸡基因组DNA经PCR扩增而来。该PCR产物被分成两部分，并用SacI-XhoI或SalI-BamHI分别切割，然后通过SalI/XhoI位点兼容性连接在一起形成一个2.4kb的绝缘体片段，SacI和BamHI分别位于片段的两端。

(ii)使用含XhoI和部分山羊β-酪蛋白启动子5'端DNA序列的顺式引物如SEQIDNO.:9(5'ACG CGT CTC GAG GGC TAG CCA CGT GAG CGC TAA AAC CCG GGA AAA AGT GGAAGC GGC CAT3')和位于山羊β-酪蛋白启动子外显子2下游和ATG密码子之前含BamHI和AgeI位点的反式引物SEQ ID NO.:10(5'GCT ATC GGA TCC AGC TAG GCT ACC GGT GCT CTC GATTCC TGT GAA TGG GAA GAT GAG3')，以从山羊血液分离的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，从而获得了6.7kb的扩增产物，该扩增产物含有山羊β-酪蛋白启动子包括β-酪蛋白基因5'端未转录区域直至外显子2。所得到的6.7kb长PCR产物接着通过XhoI-BamHI酶切被克隆到上述含绝缘体片段的pUC19质粒。

(iii)用AgeI-BamHI酶切上述含绝缘体和β-酪蛋白启动子的pUC19质粒，并与经AgeI-BamHI酶切的6.1kb PCR产物连接，从而形成pUC19In/bCN质粒。该PCR产物包括外显子7和β-酪蛋白基因3'端，是使用含AgeI，ApaI位点和部分山羊β-酪蛋白外显子7DNA序列的顺式引物如SEQ ID NO.:11(5'AAG CAT ACC GGT ACT CGT ACG GGG CCC TGA GTT TAG GACCCT TCC CTA TTC TTG TAA GTC3')和含BamHI，NotI，SalI，AscI位点及部分β-酪蛋白基因3'端DNA序列的反式引物SEQ ID NO.:12(5'TAA GCA GGA TCC GCG GCC GCA GAG CTC GGCGCG CCC AAT ATT CCA TAG CTT CTT AGG AAA C3')，从山羊基因组DNA扩增而来。

(iv)应用含AgeI位点，山羊β-酪蛋白信号序列(斜体字)和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA序列的顺式引物SEQ ID NO.:13(5'ATA TTA CCG GTA GAA GAT GAC ATC ATAATT GCA AC3')，及含ApaI位点和部分人丁酰胆碱酯酶cDNA3'端序列的反式引物如SEQ IDNO.:14(5'CTA TGA GGG CCC GCG ATC GCT ATT AAT TAG AGA CCC ACA CAA CTT TCTTTC3')，经PCR扩增，从人丁酰胆碱酯酶cDNA克隆(ATCC＃65726)获得人丁酰胆碱酯酶cDNA。该1.7kb PCR产物被克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega公司)的AgeI-ApaI位点。经测序验证后，经AgeI-ApaI消化从而获得丁酰胆碱酯酶基因插入子。纯化后的丁酰胆碱酯酶基因插入子经AgeI-ApaI位点连接至pUC19In/bCN质粒以生成pIn/BCN/BCHE质粒。

(v)Neo片段可在3'端与pIn/BCN/BCHE质粒连接以生成最终的pIn/BCN/BCHE/Neo质粒，或插入绝缘体片断和山羊β-酪蛋白之间以生成pIn/Neo/BCN/BCHE质粒(图1)。

实施例2.转基因种羊的产生

从第27-30天的羊胚胎中分离出胚胎细胞，主要含胚胎成纤维细胞，并在Dulbecco改良Eagle培养液中经38°C，5%二氧化碳培养，辅以20%胎牛血清(FBS)和20微克/毫升庆大霉素。当细胞达70%融合时，经0.05%胰蛋白酶-EDTA处理，收集细胞，计数，用10%DMSO和90%FBS等份冻结。少量细胞置于玻片进行细胞遗传学分析。解冻染色体正常的冷冻细胞用于转染转基因表达构建体DNA以产生稳定细胞系。稳定细胞系通过脂质介导的基因转移法而产生。

实施例1的上述转基因表达盒(即pIn/BCN/BCHE/Neo质粒)DNA片段，包含绝缘体，山羊β-酪蛋白启动子，人丁酰胆碱酯酶cDNA序列，β-酪蛋白基因3'端和Neo片段，经切割和纯化后根据制造商的说明使用脂质转染到细胞中，并经G418筛选。经PCR，DNA印迹和FISH分析筛选出合适稳定克隆(单整合位点，6-10基因拷贝)，供核移植(NT)使用。筛选过的羊胚胎成纤维细胞置于24或96孔内经DMEM+10%FBS培养，直至100%融合。然后用低浓度血清培养液(DMEM+0.5%FBS+20微克/毫升庆大霉素)置换，细胞经38°C，5%二氧化碳培养4-8天直至核移植。核移植前，供体细胞经0.05%胰蛋白酶-EDTA处理，清洗2次，与含1%BSA EmCare培养液混合。

10-15卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，每个在50毫升覆盖矿物油的成熟培养液中经38°C，5%二氧化碳培养。成熟培养液包含M199辅以小牛LH(0.02单位)，小牛FSH(0.02单位)，雌二醇-17β(1微克/毫升)，0.2mM丙酮酸钠，卡那霉素(50微克/毫升)，和10%热灭活的羊血清。23-24小时的成熟期过后，通过振荡位于EmCare培养液含1毫克/毫升透明质酸酶内的卵丘-卵母细胞复合体1-2分钟以去除卵丘细胞。裸露的卵母细胞用处理介质(EmCare含1%FBS)清洗，并返回到成熟培养液中。卵母细胞去核过程在卵母细胞裸露后1小时内启动。

Hoechst染色的卵母细胞，其细胞质经短暂接触紫外线以确定染色体位置，室温下(24-26°C)在没有加入细胞松弛素B的处理介质(EmCare含1%FBS)中进行去核处理，并观察和记录整个去核过程。取出的细胞质通过暴露于UV光线以检测染色体和极体的存在。

去核卵母细胞和分散的供体细胞在处理介质中操作。用吸管将小于20微米具平滑质膜的供体细胞拾取和滑入去核卵母细胞的卵周隙，细胞-卵母细胞质立即融合。4-6个融合体为1组在1个覆盖山梨糖醇融合培养液(0.25M山梨糖醇，100mM醋酸钙，0.5mM乙酸镁，0.1%BSA)，500毫米间隙的融合腔电极之间手动对齐。用BTXElectrocell Manipulator200对融合体作1个2.39千伏/厘米的简短融合脉冲(15毫秒)，然后放入含25微升培养液(修饰的SOFaa培养液含0.35mM磷酸盐和8毫克/毫升BSA)孔内，叠加矿物油，在38.5-39°C，5%二氧化碳，7%氧气和88%氮气中培养。1小时后在立体显微镜下观察融合。尚未融合的细胞如上所述进行第二次融合脉冲。2-3小时后，应用钙离子霉素和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)方法激活融合体(Dev Biol166：729–739，1994)，在DMAP中培养2.5-4小时，用处理介质洗涤，放入含25微升培养液(低磷酸盐SOFaa培养液或G1.2)孔内，叠加矿物油(平均每孔含10个胚胎)。卵裂发育(2-4细胞期)在36小时能观察到。第3天胚胎移植至同步的处于第2天周期的羊代孕母体。所有代孕山羊在妊娠35日和60日经超声波检查，并记录胎儿发育。妊娠147天或148天注射8mg地塞米松(Azium)，12小时间隔第2次和第3次注射同样药物以诱导分娩，第3次注射加上125毫克clorprostenol(Estrumate)。记录新羊数目和出生体重。

实施例3.转基因种羊及后代的检测和繁殖

克隆新羊出生后约4天取血进行PCR分析以确认转基因。PCR反应引物有三套。

第1套引物如SEQ ID NO.:15和16(5'CTT CCG TGG CCA GAA TGG AT3′/5'CAT CAGAAG TTA AAC AGC ACA GTT AGT3')从人丁酰胆碱酯酶cDNA3'端至相邻BCN-BCHE片段中的β-酪蛋白基因外显子7片段扩增出510bp DNA片段。

第2套引物如SEQ ID NO.:17和18(5'AGG AGC ACA GTG CTC ATC CAG ATC3′/5'GAC GCC CCA TCC TCA CTG ACT3')从绝缘体片段扩增出910bp DNA片段。

第3套引物如SEQ ID NO.:19和20(5'GAG GAA CAA CAG CAA ACA GAG3‘/5'ACCCTA CTG TCT TTC ATC AGC3′)扩增出山羊内源性β-酪蛋白基因360bp片段以确保提取的DNA不含PCR反应抑制物质。

扩增后，DNA在1%琼脂糖凝胶上电泳分离。应用Roche Diagnostics公司DIG系统Southern印迹(BMC Biotechnol5：9，2005)，基于在同样质重PCR阴性山羊基因组DNA中混合不同浓度表达质粒DNA和克隆山羊基因组DNA之间比较化学发光信号强度，对转基因动物的转基因拷贝数进行评估与确认。用荧光原位杂交技术(FISH)(Chromosoma102：325-332，1993)确认转基因山羊的转基因整合位点。转基因克隆羊与奶山羊种羊交配，获得转基因后代，转基因后代母羊，再进行交配、产子，获得转基因羊奶。用Ellman法在转基因克隆母羊奶检测重组人丁酰胆碱酯酶表达浓度。从雄性转基因山羊精子库通过对非转基因母山羊进行人工授精以扩大转基因山羊种群。

实施例4.重组人丁酰胆碱酯酶的纯化

所有纯化程序在20°C±2°C进行，除非另有说明。

含重组人丁酰胆碱酯酶羊奶(实施例3)通过切向流过滤系统除去脂肪和酪蛋白，超过80%的重组人丁酰胆碱酯酶被回收。用7个柱床体积的缓冲液含10mM磷酸盐，pH7.2，1mMEDTA，140mM NaCl，清洗澄清的乳汁(乳清)，并使用30kD过滤器进行浓缩。乳清加样到经相同缓冲液平衡过的HQ50离子交换柱(Applied BioSystems)。收集含重组人丁酰胆碱酯酶的洗脱液。同一交换柱用10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，1M氯化钠缓冲液清洗以移除任何捕获的杂质。HQ50洗脱液随后加载到预先用10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，140mM NaCl缓冲液平衡过的普鲁卡因胺亲合柱。用10个柱床体积的相同平衡缓冲液洗涤该柱，用10mM磷酸盐，pH7.2，1mM EDTA，500mM NaCl缓冲液洗脱蛋白。纯化蛋白经无菌过滤，并保存于4℃。用Ellman法检测纯化重组人丁酰胆碱酯酶活性，并测定总蛋白质浓度。蛋白纯度和结构(包括测定四聚体，二聚体或单体)通过SDS-PAGE银染法染色和反相HPLC测定。

测定结果，表达的是人丁酰胆碱酯酶全酶，并且在羊奶中除了存在四聚体形式人丁酰胆碱酯酶，还存在着单体和二聚体形式的人丁酰胆碱酯酶。这不利于后期的修饰。

实施例5人丁酰胆碱酯酶单体的制备和纯化

重复实施例1-3，不同点在于，用SEQ ID NO.:21所示的下游引物(5'CTA TGA GGGCCC GCG ATC GCT ATT ATC CTG TCA TTT CCA AGA CTT TTG GAA AAA ATG ATG TC3')替换SEQ ID NO.:14所示的引物，从而制得羊奶中特异表达重组人丁酰胆碱酯酶单体的转基因山羊。

同实施例4进行纯化，并用Ellman法检测纯化重组人丁酰胆碱酯酶活性，并测定总蛋白质浓度。蛋白纯度和结构(包括测定四聚体，二聚体或单体)通过SDS-PAGE银染法染色和反相HPLC测定。

测定结果表明：所表达的人丁酰胆碱酯酶是单体形式，并且在羊奶中无二聚体形式人丁酰胆碱酯酶，也无四聚体形式人丁酰胆碱酯酶。

实施例6人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的制备和纯化

重复实施例1-3，不同点在于，将实施例1所构建的表达盒中人丁酰胆碱酯酶全酶编码序列(SEQ ID NO.:4)用人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码序列(SEQID NO.:6)代替，从而制得羊奶中特异表达重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的转基因山羊。

同实施例4进行纯化，并用Ellman法检测纯化重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白活性，并测定总蛋白质浓度。蛋白纯度和结构(包括测定四聚体，二聚体或单体)通过SDS-PAGE银染法染色和反相HPLC测定。

测定结果表明：所表达的人丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白是单体形式，并且在羊奶中无二聚体形式，也无四聚体形式。

此外，人丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白保留了约90%人丁酰胆碱酯酶单体的活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5'至3'，依次包括可操作性连接的以下元件：

(i)绝缘体片段；

(ii)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质启动子序列；

(iii)至少一个信号肽编码序列，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽；

(iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述丁酰胆碱酯酶单体为不形成四聚体的截断型单体，并且所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID No.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；(b)氨基酸序列如SEQ ID No.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；和

(v)终止密码子；

并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。

2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述的信号肽编码序列为酪蛋白信号序列。

3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述的重组蛋白编码序列选自下组：

(i)核苷酸序列如SEQ ID No.:5所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；

(ii)核苷酸序列如SEQ ID No.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。

4.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述表达盒。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求4所述的载体或染色体中整合有权利要求1所述表达盒，其中所述的宿主细胞为非人哺乳动物细胞，且选自下组：乳腺上皮细胞或胚胎成纤维细胞。

6.一种制备丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，其特征在于，其中所述单体为不形成四聚体的截断型单体，并且所述方法包括步骤：

(i)提供一转基因的非人哺乳动物动物，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有权利要求1所述表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和

(ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。

7.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤；

(i)提供一含有权利要求1所述表达盒的载体或来自所述载体的含权利要求1所述表达盒的核酸片段；

(ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞；

(iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有权利要求1所述表达盒的细胞，从而获得整合的细胞；

(iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞；

(v)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合细胞的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物；

其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。