CN103898004A

CN103898004A - 假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法

Info

Publication number: CN103898004A
Application number: CN201310586259.4A
Authority: CN
Inventors: 曾志刚; 梁彦明; 翟龙飞; 徐欣; 许之晖
Original assignee: TAIYUAN WELLROAD ANIMAL HEALTH CO LTD; Sichuan Industrial Institute of Antibiotics
Current assignee: Taiyuan City Wellroad Technology Development Co Ltd; Sichuan Industrial Institute of Antibiotics
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN103898004B

Abstract

本发明为假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法，解决巳有菌株发酵获得骨化二醇过程中底物投料量低，不适于工业化生产的问题。本发明的假诺卡氏菌，自编号为SIIA2243，其拉丁文名Pseudonocardia autotrophica，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年07月17日，保藏编号CGMCC No.7935。

Description

假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法

技术领域：

本发明涉及一种用于发酵生产骨化二醇的假诺卡氏菌，以及利用该假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的方法。

背景技术：

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）日益成为严重威胁老年人的健康的一种慢性疾病；维生素D类药物中的骨化二醇（25—羟基维生素D₃）是自然存在人体内的维生素D₃的活性代谢产物；多年来，骨化二醇主要用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨紊乱，以及与慢性肾衰竭有关的代谢性骨疾病，低钙血病。另外，骨化二醇近年也作为饲料添加剂用于饲料行业。

骨化二醇的制备有化学合成和生物发酵两种方法；化学合成反应步骤繁多、需要昂贵试剂、反应过程中会产生外消旋体，需要进行复杂的拆分过程，不仅大大影响收率，而且难以拆分完全，而且化学合成生产骨化二醇会对环境产生较大的污染。而微生物发酵的方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决骨化二醇的手性结构问题，其生产条件温和，收率高，成本低廉，环境友好，成为一种有效替代化学合成的方法。但是现有方法中添加的维生素D₃的浓度低，专利USP5474923添加维生素D₃的最大浓度仅为1000ug/ml，这不利于通过增加维生素D₃的投料量来提高骨化二醇的产量；而且目前用微生物发酵方式制备骨化二醇的相关研究仅限于实验室水平，没有工业规模深层发酵生产骨化二醇的技术方案。

发明内容：

本发明的目的是提供一种维生素D₃的投料量高，产品收率高，质量好，可工业规模发酵生产骨化二醇的假诺卡氏菌株及其发酵生产骨化二醇的方法。

本发明是这样实现的：

假诺卡氏菌，其特征在于其自编号为SIIA2243,其拉丁文名Pseudonocardia autotrophica，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期∶2013年07月17日，保藏编号CGMCCNo.7935。

假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的方法，生产过程包括：

（1）菌株SIIA2243依次经过三角烧瓶，种子罐，发酵罐进行深层培养发酵，

（2）向菌株SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D3，继续发酵得发酵液，

（3）将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，柱层析及结晶后得到骨化二醇成品。

步骤(1)中菌株SIIA2243的种子及发酵罐培养基含有蛋白胨、玉米浆、葡萄糖、黄豆粉、氯化钠、磷酸二氢钾。

步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃后，继续发酵的时间为1～4天。

步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃后的24hr内，通过增加搅拌轴转速或者增加空气流量来提高发酵液的溶氧水平。

步骤(3)中的柱层析是指制备型高效液相层析系统。

假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的方法，步骤如下：

（1）菌株SIIA2243依次经过三角烧瓶，种子罐，发酵罐进行深层培养发酵，以下各组分的含量均为重量体积百分比，即g/l00ml。

斜面培养：

配制含葡萄糖1～10%，蛋白胨1～10%，玉米浆0.1～2%，氯化钠0.1～1%，琼脂1～2.5%，其余为水，pH6.5～7.5的培养基,121℃，30分钟灭菌，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～35℃培养5～10天。

种子培养及发酵：

配制含蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0的种子培养基装入500ml摇瓶中，冷却后将培养好的斜面菌株挖块接入到装有种子培养基的摇瓶中，摇瓶转速100～300r/min，温度20～35℃，培养2～5天，得摇瓶种子液。

按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基30升，移入到50升一级种子罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的摇瓶种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入一级种子罐内，20～35℃搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1∶0.5～1∶2 v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天，按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基300升，移入到500升二级种子罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的一级种子罐内的种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入二级种子罐内，20～35℃，搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1:0.5～1:2v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天。

配制含蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0的发酵培养基3000升，移入到5000升发酵罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的二级种子罐内的种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入发酵罐内，20～35℃，搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1∶0.5～1∶2 v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天。

（2）向SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃，继续发酵，向5000升发酵罐中已经培养了1～4天的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃，环糊精化合物在发酵液中的终重量百分浓度达到0.1～5%，维生素D₃在发酵液中的终浓度达到500ug/ml～5000ug/ml，补料后24hr内提高搅拌轴转速为200～500r/min，或者增加空气流量到1∶0.8～1∶2.5 v/v/m，继续发酵1～10天。

骨化二醇的提取：

终止发酵后，将发酵液通过压差法移入到10000升的储罐中，往储罐中加入等体积的乙酸乙酯，充分搅拌后，加入破乳剂，静置分层后移去下层的发酵液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取，而减压浓缩后获得的浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，获得骨化二醇组分，结晶后即得骨化二醇成品。

骨化二醇的HPLC测定：

色谱柱为Kromasil正相硅胶柱(250×4.6mm i.d,5um)，流动相为异丙醇—正己烷(1∶9)，流速1.5ml/min，柱温为40℃，检测波长265nm。

假诺卡氏菌SIIA2243的获得途径：

菌株分离、诱变与鉴定。

从广州白云山的土壤样品中分离筛选得到的能够将维生素D₃转化为骨化二醇的原始菌株SIIA243。往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10ml无菌生理盐水进行洗涤，获得孢子悬液，梯度稀释至菌体浓度在10⁷CFU/ml左右，取5ml菌悬液放置在直径为9cm的培养皿中，在30W紫外灯下距离30cm照射30秒，梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上，28℃培养10天，挑取单菌落于斜面培养基上，28℃培养7天，获得紫外诱变菌株备用。

往菌株SIIA243的斜面培养物中加入10mlpH5.0的无菌磷酸缓冲液进行洗涤，获得孢子悬液，菌悬液中亚硝基胍的浓度为50ug/ml，往诱变处理后的菌悬液加入无菌硫代硫酸钠，使亚硝基胍分解以终止其作用，之后梯度稀释并取0.1ml涂布于平板培养基上，28℃培养10天，挑取单菌落于斜面培养基上，28℃培养7天，获得亚硝基胍诱变菌株备用。

将紫外诱变和亚硝基胍诱变获得的菌株移种到含维生素D₃的基本培养基及完全培养基上，28℃培养5～10天，检出在含维生素D₃的基本培养基不长、在完全培养基上生长的菌株；然后将筛选到的菌株移种到含骨化二醇的基本培养基上，28℃培养5～10天，检出不生长或生长势较弱的菌落（含维生素D₃或骨化二醇的基本培养基包含Na₂HP0₄、 KH₂P0₄、 MgS0₄、CaC1₂、微量元素溶液和琼脂粉。）。将这些不消耗底物维生素D₃和产物骨化二醇的菌落挑选出来，在摇瓶中发酵72hr后补入维生素D₃，使其在发酵液中的终浓度达到500ug/ml～5000ug/ml，然后再发酵1～10天，经过HPLC检测，挑选出能够耐受高浓度底物维生素D₃且具有底物维生素D₃残留低，产物骨化二醇产量高这种转化特性的菌株；

通过大量的诱变、筛选工作，最终获得了本发明所指的菌株SIIA2243。菌株SIIA2243具有特定的工业用途，发酵生产骨化二醇。

通过通用引物27F与1492R 扩增菌株SIIA 2243 的16S rDNA，获得的16s rRNA基因序列，在Genebank数据库中注册，序列号为KF796659，将其与 GenBank数据库调集的其它放线菌菌株的16S rDNA相应序列进行比较，并用Mega 5.0 软件包进行系统进化分析，亲缘关系最相近的是自养假诺卡氏菌模式菌Pseudonocardia autotrophica ATCC IMSNU 20050T，相似度99%，说明菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica。

菌株SIIA2243的形态学特性：

基内菌丝（营养菌丝）在微黄，明显分枝，有横隔，气生菌丝白色，分枝，产生卷曲的孢子链，孢子类椭圆状；菌丝成节段，在节段间的凹陷处或者节段中间长出芽的方式进行出芽生长。菌落白色，皱褶，致密，圆形，菌落色素浅黄色。

菌株SIIA2243的培养特性：

将菌株SIIA2243接种在各种合成培养基和有机培养基上，28℃培养14天，记录相应生长特征。

菌株SIIA2243的生理生化特性：

在营养丰富的固体培养基上进行培养，发现其最适生长温度为18℃～32℃，在4℃时仍然缓慢生长，4℃以下及40℃以上基本观察不到生长了。该菌株革兰氏染色程阳性，需氧生长，但是在氧气少的环境下也可生长，淀粉水解反应阴性，明胶液化反应阴性，牛奶凝固和胨化反应阴性，黑色素产生呈阴性，硝酸盐还原反应阴性，不产生硫化氢；能够利用D—葡萄糖，L—阿拉伯糖，D—木糖，L—肌醇，D—甘露醇，D—果糖，鼠李糖，棉籽糖，D—乳糖，D—山梨糖，D—麦芽糖，D—半乳糖，不能够利用D—海藻糖和D—木糖。另外，该菌株能够利用碳酸氢钠为唯一碳源进行生长。

该菌株无枝菌酸，细胞壁含meso—DAP(内消旋二氨基庚二酸)，全细胞水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖。

综合以上分类数据分析，鉴定菌株SIIA2243属于自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica，其与已报道的自养假诺卡氏菌种中的相关菌株在形态学、生理生化特征、16s rRNA基因序列分析方面有所差异，因此，鉴定菌株SIIA2243为自养假诺卡氏菌种中的新菌株，命名为Pseudonocardia autotrophica SIIA2243。菌株Pseudonocardia autotrophica SIIA2243已于2013年7月17日保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 7935。

发明的有益效果：

利用本发明进行骨化二醇的发酵生产有以下优点和有益效果：

1 本发明选育获得菌株SIIA2243,不利用、不降解底物维生素D₃和产物骨化二醇，使得底物维生素D₃在发酵的过程中能够更好地被转化为骨化二醇，从而有利于骨化二醇产量的提高。另外，选育获得的菌株SIIA2243能够耐受更高浓度的维生素D₃，这有利于通过增加维生素D₃的投料量来提高骨化二醇的产量，从而更充分地发挥发酵罐的生产能力。由于选育获得菌株SIIA2243的优良特性，其在工业规模发酵过程中，维生素D₃的转化率最高能够达到80%。

2本发明提供了一种工业规模发酵生产骨化二醇的方法。该生产工艺简单易行，条件温和，安全可控，工艺稳定性好，能够大规模生产骨化二醇。

3萃取剂乙酸乙酯回收反复使用降低了对环境的危害，同时利用高压制备液相层析系统来分离骨化二醇，减少了工业规模生产中人力的投入，提高了提取收率，同时获得的骨化二醇成品纯度高，杂质少，产品质量好。

菌株SIIA2243已于2013年7月17日保藏在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No. 7935。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243的获得途径与鉴定

将紫外诱变和亚硝基胍诱变获得的菌株移种到含维生素D₃的基本培养基及完全培养基上，28℃培养5～10天，检出在含维生素D₃的基本培养基不长、在完全培养基上生长的菌株；然后将筛选到的菌株移种到含骨化二醇的基本培养基上，28℃培养5～10天，检出不生长或生长势较弱的菌落（含维生素D₃或骨化二醇的基本培养基包含Na₂HP0₄、 KH₂P0₄、 MgS0₄、CaC1₂、微量元素溶液和琼脂粉。）。将这些不消耗底物维生素D₃和产物骨化二醇的菌落挑选出来，在摇瓶中发酵72hr后补入维生素D₃，使其在发酵液中的终浓度达到500ug/ml～5000ug/ml，然后再发酵1～10天，经过HPLC检测，挑选出能够耐受高浓度底物维生素D₃且具有底物维生素D₃残留低，产物骨化二醇产量高这种转化特性的菌株。

菌株SIIA2243的形态学特性：

菌株SIIA2243的培养特性：

菌株SIIA2243的生理生化特性：

实施例2：

自养假诺卡氏菌Pseudonocardia autotrophica SIIA2243发酵生产骨化二醇

为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。除非另有特指，本实施例中的灭菌条件为121℃，30分钟。%为质量百分比。

1 培养基：

斜面培养基：葡萄糖1.5%，蛋白胨1.0%，玉米浆0.3%，氯化钠0.4%，琼脂1.5%，其余为水，pH7.0,

种子培养基：蛋白胨1.5%，玉米浆1.5%，葡萄糖1.5%，黄豆粉0.4%，氯化钠0. 5%，磷酸二氢钾0.2%，其余为水，pH7.5。

发酵培养基：蛋白胨1.5%，玉米浆1.5%，葡萄糖1.5%，黄豆粉0.4%，氯化钠0. 5%，磷酸二氢钾0.2%，其余为水，pH7.5,

2 发酵生产骨化二醇

制种：SIIA2243斜面菌株挖块到装有100ml种子培养基的500ml三角烧瓶中，摇瓶转速280r/min，温度29℃，培养3天，总共制得1.5升种子液，火焰保护下移入到已灭菌的装有30升种子培养基的50升发酵罐中，培养条件为∶搅拌轴转速260r/min，29℃，空气流量0.9立方米/小时，罐压0.05Mpa，培养2天。将培养了2天的30升种子液通过灭菌管道压入到已灭菌的装有300升种子培养基的500升发酵罐中，培养条件为∶搅拌轴转速180r/min，29℃，空气流量18立方米/小时，罐压0.05MPa培养1天。

发酵：将培养了1天的300升种子液通过灭菌管道压入到已灭菌的装有3000升发酵培养基的5000升发酵罐中，培养条件为∶搅拌轴转速80r/min，28℃，空气流量90立方米/小时，罐压0.05MPa培养3天。向发酵罐中补入溶解有9000 g倍他环糊精的溶液100升和溶解有1500 g维生素D₃的溶液100升，补料后将搅拌速度调整为120 r/min，24hr后又调整为80r/min，继续发酵4天后终止发酵。

提取精制：终止发酵后，将约3000升发酵液通过管道移入到10000升的储罐中，往储罐中加入3000升乙酸乙酯，搅拌2hr，搅拌轴转速50r/min，加入破乳剂后静置过夜，分层后移去下层的发酵液，将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取，而减压浓缩后获得的浓缩液利用高压制备液相层析系统进行分离，制备柱为C18柱，检测波长为265nm，流动相为乙腈—水（体积比80∶20），收集目标组分，减压浓缩干后，获得骨化二醇组分，结晶后即得骨化二醇成品907g。

Claims

1.假诺卡氏菌，其特征在于其自编号为SIIA2243，其拉丁文名Pseudonocardia autotrophica，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年07月17日，保藏编号CGMCCNo.7935。

2.根据权利要求1所述的假诺卡氏菌发酵生产骨化二醇的方法，其特征在于生产过程包括：

（2）向菌株SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃，继续发酵得发酵液，

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中菌株SIIA2243的种子罐及发酵罐培养基含有蛋白胨、玉米浆、葡萄糖、黄豆粉、氯化钠、磷酸二氢钾。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃后，继续发酵的时间为1～10天。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中菌株SIIA2243的发酵液在补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃后的24hr内，通过增加搅拌轴转速，或者增加空气流量来提高发酵液的溶氧水平，搅拌轴转速200～500r/min，空气流量1∶0.8～1∶2.5 v/v/m。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中的柱层析是指分离柱直径为5cm～100cm制备型高效液相层析系统。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤如下：

（1）菌株SIIA2243依次经过三角烧瓶，种子罐，发酵罐进行深层培养发酵，以下各组分的含量均为重量体积百分比，即g/l00ml，

斜面培养：三角烧瓶内配制含葡萄糖1～10%，蛋白胨1～10%，玉米浆0.1～2%，氯化钠0.1～1%，琼脂1～2.5%，其余为水，pH6.5～7.5的培养基，121℃，30分钟灭菌，灭菌后冷却、制成斜面、接种，20～35℃培养5～10天，

种子培养及发酵：种子罐，发酵罐内配制含蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0的种子培养基装入500ml摇瓶中，冷却后将培养好的斜面菌株挖块接入到装有种子培养基的摇瓶中，摇瓶转速100～300r/min，温度20～35℃，培养2～5天，得摇瓶种子液,

按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基30升，移入到50升一级种子罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的摇瓶种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入一级种子罐内，20～35℃搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1∶0.5～1∶2 v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天，按照摇瓶种子培养基的配比配置种子培养基300升，移入到500升二级种子罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的一级种子罐内的种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入二级种子罐内，20～35℃，搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1∶0.5～1∶2v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天，

配制含蛋白胨0.2～2%，玉米浆0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黄豆粉0.1～1.5%，氯化钠0.1～1.5%，磷酸二氢钾0.1～1.5%，其余为水，pH7.0～8.0的发酵培养基3000升，移入到5000升发酵罐内，121℃，30分钟灭菌，冷却后，将培养好的二级种子罐内的种子液按照重量体积百分比5～10%接种量在无菌条件下移入发酵罐内，20～35℃，搅拌轴转速100～400r/min，空气流量1∶0.5～1∶2 v/v/m，罐压0.02～0.1MPa培养1～4天，

（2）向SIIA2243的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃，继续发酵得发酵液，

继续发酵，向5000升发酵罐中已经培养了1～4天的发酵液中补入一种或者多种环糊精化合物的溶液和维生素D₃，环糊精化合物是指甲基环糊精、乙基环糊精、苄基环糊精，羟丙基环糊精、羟乙基环糊精、羟丁基环糊精，环糊精化合物在发酵液中的终重量百分浓度达到0.1～5%，维生素D₃在发酵液中的终浓度达到500ug/ml～5000ug/ml，补料后24hr内提高搅拌轴转速为200～500r/min，或者增加空气流量到1∶0.8～1∶2.5 v/v/m，继续发酵1～10天，

（3）将步骤(2)的发酵液，用有机溶剂进行萃取，浓缩，柱层析及结晶后得到骨化二醇成品，

骨化二醇的提取：

终止发酵后，将发酵液通过压差法移入到10000升的储罐中，往储罐中加入与发酵液等体积的乙酸乙酯，充分搅拌后，加入破乳剂，静置分层后移去下层的发酵液，得乙酸乙酯萃取液；将乙酸乙酯萃取液移入浓缩装置中进行减压浓缩，所回收的有机溶剂乙酸乙酯又进行二次萃取，而减压浓缩后获得的浓缩液利用分离柱直径为5cm～100cm高压制备液相层析系统进行分离，获得骨化二醇组分，结晶后即得骨化二醇成品，

骨化二醇的HPLC测定：色谱柱为Kromasil正相硅胶柱(250×4.6mm i.d，5um)，流动相为异丙醇-正己烷(1∶9)，流速1.5ml/min，柱温为40℃，检测波长265nm。