CN103874711A - 用于结晶g-蛋白偶联受体目的的新的融合伴体 - Google Patents

Abstract

描述了GPCR-融合伴体蛋白，其包含G蛋白偶联受体（GPCR）的GPCR和融合伴体例如红素氧还蛋白、细胞色素b562RIL（Bril、bRIL、BRIL）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶，所述融合伴体替换所述GPCR的第五和第六螺旋之间的GPCR第三胞内环的一部分或全部，或其连接于所述GPCR的末端或C端。描述了晶体形式的GPCR-融合伴体蛋白，其任选地具有适合于所述GPCR的x-射线晶体结构测定的质量。描述了使用GPCR-融合伴体蛋白中的融合伴体来支持GPCR-融合伴体蛋白的结晶以用于所述GPCR的x-射线晶体结构测定的方法。还描述了通过蛋白质数据库的筛选来鉴定其他适合的融合伴体的方法。

Description

用于结晶G-蛋白偶联受体目的的新的融合伴体

相关申请

本申请要求2011年5月13日提交的美国临时申请系列号61/485,872和2012年3月30日提交的美国临时申请系列号61/618,424的优先权，每个所述临时申请的公开内容以其全文通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究和开发的陈述

根据由美国国立卫生研究院国家综合医学科学研究所（NationalInstitutes of Health,National Institute of General Medical Sciences）（NIH NIGMS）授予的资助号P50GM073197，美国政府在本发明中具有一定权利。

发明背景

发明领域

本发明涉及包含G蛋白偶联受体（GPCR）的融合伴体蛋白，其中融合伴体替换所述GPCR的胞内结构域的一部分或末端连接于GPCR的N或C端，其中这样的融合伴体蛋白可用于形成衍射质量的晶体以支持这样的GPCR的结构测定。

相关技术的描述

G-蛋白偶联受体包含一大类膜结合蛋白质，该类蛋白质共有多种结构和功能属性（Friedricksson等，Mol.Pharmacol.63（6）:1256-1272,2003和Friedricksson等，Mol.Pharmacol.67（5）:1414-1425,2005）。GPCR被分类为6类中的1类：A，B，C，D，E和F，参见Friedricksson等（2003）和Friedricksson等（2005）。GPCR包含7个跨膜螺旋区以及结合内源配体的细胞外部分。这个胞外配体结合结构域通常是调节GPCR功能的药剂的靶点。

可以进行蛋白质结晶以获得晶体结构，所述晶体结构允许进行高分辨率结构分析以产生精确的蛋白质三维结构，例如活性位点或配体结合位点，其中这样的结构信息然后可用于预测蛋白质的功能和行为。结晶和通过X-射线晶体学的结构测定需要良好衍射的晶体，其可以从在结晶筛选过程中稳定的高度纯化并浓缩的受体稳定地生长。GPCR难以以未修饰形式结晶，这是因为GPCR在用于纯化的去污剂微团中通常是不稳定的，并且可能缺乏可用于形成晶体接触的足够的蛋白质表面积。

将融合伴体并入到蛋白质中已被用于支持难于以未修饰形式结晶的蛋白质的结晶（Engel等，“Insertion of carrier proteins intohydrophilic loops of the Escherichia coli lactose permease”，Biochemicaet Biophysica Acta（2002）,1564:38-46;Prive，“Fusion proteins asTools for Crystallization:the Lactose Permease from Escherichia coli”，Acta Cryst.（1994）,D50:375-379；Prive等，“Engineering the LacPermease for Purification and Crystallization”，Journal of Bioenergeticsand Biomembranes（1996）,28（1）:29-34）。

已将T4溶菌酶（T4L）作为融合伴体用于GPCR融合蛋白中，所述融合蛋白保留了所需生物化学、药理学和结构性质，并且可以结晶。将T4L作为融合伴体并入β2-肾上腺素能受体（β2AR）和A2A-腺苷受体（A_2A）的可用胞内环中以帮助受体稳定和结晶，从而实现了得到的GPCR融合蛋白的结构测定。已发现，包含T4L显著改进了这两种受体的表达、纯化和结晶（Cherezov,V.,Rosenbaum,D.M.,Hanson,M.A.,Rasmussen,S.G.,Thian,F.S.,Kobilka,T.S.,Choi,H.J.,Kuhn,P.,Weis,W.I.,Kobilka,B.K.和Stevens,R.C.，“High-resolutioncrystal structure of an engineered human beta2-adrenergic Gprotein-coupled receptor”，Science318:1258-1265,2007（Cherezov等，2007）；Rosenbaum,D.M.,Cherezov,V.,Hanson,M.A.,Rasmussen,S.G.,Thian,F.S.,Kobilka,T.S.,Choi,H.J.,Yao,X.J.,Weis,W.I.,Stevens,R.C.和Kobilka,B.K.，“GPCR engineering yieldshigh-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptorfunction”，Science318:1266-1273,2007（Rosenbaum等，2007）；Jaakola,E.P.等，“The2.6angstrom crystal structure of a human A2Aadenosine receptor bound to an antagonist”，Science322:1211-1217,2008（Jaakola等，2008）；美国专利号7,790,950B2，PCT公布WO2009/055509A2）。为了克服β2AR（对可扩散激素和神经递质作出响应的GPCR的一种充分研究的原型）的结构柔性并促进其结晶，对β2AR融合蛋白进行工程化，其中用T4L替换GPCR第三胞内环的大部分，从而产生了保持接近原始的药理性质并能够结晶而用于高分辨率结构分析的β2AR-T4L。与部分反向激动剂卡拉洛尔结合的人β2AR-T4L在

分辨率下的晶体结构已被确定，且该结构提供了与可扩散配体结合的人类G蛋白偶联受体的高分辨率视图，其证实了配体结合位点可接近性由第二胞外环赋予，所述胞外环通过一对紧密间隔的二硫桥和环内的短螺旋片段保持在结合腔之外（Cherezov等，2007,Science318:1258）。在报告的β2AR-T4L高分辨率结构的情况中，肾上腺素能受体配体结合的突变体的分析为反向激动剂结合和接纳儿茶酚胺激动剂所需的结构变化提供了深入了解（Rosenbaum等，2007,Science318:1266）。

发明简述

在某些实施方式中，本发明提供了包含融合伴体蛋白的组合物，所述融合伴体蛋白将GPCR与融合伴体例如红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril、bRIL、BRIL）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白、木聚糖酶或按照本发明的方法选择的其他融合伴体相组合。在某些实施方式中，所述融合伴体替换了所述GPCR的第五和第六螺旋之间的GPCR第三胞内环的一部分或全部。在某些其他的实施方式中，所述融合伴体被连接在所述GPCR的C-端或N-端。在某些其他的实施方式中，所述GPCR的C或N端被截短，且所述融合伴体连接在这样的截短末端处。在某些实施方式中，所述融合伴体蛋白为晶体形式。在进一步的实施方式中，这样的晶体具有适用于所述GPCR的x-射线晶体结构测定的质量。在某些实施方式中，这样的结构（或其一部分）可以以至少

到至少

之间的分辨率获得。在某些进一步的非限制性实施方式中，这样的结构（或其一部分）可以以至少

或

的分辨率获得。

在某些实施方式中，本发明提供了一种用于制备晶体形式的GPCR的方法，所述方法包括制备适合于表达一定氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列从N-端起包含GPCR的前五个跨膜结构域、融合伴体结构域和这种GPCR的第六和第七跨膜结构域。

在某些实施方式中，本发明提供了用于选择按照本发明进一步评估用途的适当候选融合伴体的方法。在某些这样的实施方式中，本发明提供了一种方法，其包括对相关数据可以获得的多个候选融合伴体进行筛选的过程，其包括下列步骤：选择满足一个或多个下列标准的候选融合伴体：（i）具有相隔不超过

或

或

的N和C端；（ii）具有低于25kD（或20kD或15kD）的分子量；（iii）已被证实以至少

或

或

或

或

或

或或

的衍射分辨率结晶；（iv）具有在超过一组化学条件下形成晶体的能力；和（v）可以形成具有超过一种空间群的晶体。在某些实施方式中，上述方法的实施不使用上面标号为（i）的标准。

附图简述

图1A-1F示出了与插入到β2-肾上腺素能受体（β2AR）中以形成β2AR-融合伴体蛋白的一组候选融合伴体相关的数据，其中图1A-1E示出了SEC数据，其对应于各种β2AR-融合伴体蛋白在存在配体（标记为噻吗洛尔-NA）和不存在配体（标记为NA-NA）情况下的提取和初步纯化，以及配体结合的β2AR-融合伴体蛋白物质（标记为噻吗洛尔-Ni）的二次纯化，且图1F示出了各种β2AR-融合伴体蛋白的最终纯化产物在10%凝胶上的SDS-PAGE，从左到右为MW标准品、β2AR-T4L、β2AR-C-term-T4L、β2AR-Bril、β2AR-红素氧还蛋白、β2AR-木聚糖酶和β2AR-黄素氧还蛋白。

图2A-2F示出了与稳定化的β2AR-细胞色素B562融合伴体蛋白（β2AR-Bril）结晶和初步衍射相关的数据，其中图2A-2C显示β2AR-Bril构建体被表达和纯化（图2A，来自于不同浓度的等分试样的分析SEC迹线，示出了蛋白质的量；图2B，来自于不同浓度的等分试样的SEC迹线，已对存在的蛋白质量进行标准化），从而产生高质量的单分散性蛋白质（图2C，β2AR-Bril在SEC后的SDS-PAGE），并且图2D-2F显示纯化的β2AR-Bril可以形成晶体，产生大的双折射晶体，其主要在一个维度上生长（图2D，示出了β2AR-Bril晶体的双折射性的数字化图像），并且通过色氨酸荧光（图2E，示出了β2AR-Bril晶体的色氨酸荧光的数字化图像）和衍射（图2F，β2AR-Bril晶体衍射的数字化图像）证实是蛋白质晶体。

图3A-3B示出了与通过包含导致优越的晶体生长和衍射性质的助结晶添加剂三甲胺N-氧化物而产生的β2AR-Bril晶体相关的数据，其中图3A示出了在存在三甲胺N-氧化物添加剂的优化条件下获得的β2AR-Bril晶体的数字化图像，图3B示出的衍射结果表明这些晶体衍射x-射线达到

的标称分辨率。

图4A-4D示出了与插入到腺苷A2A受体（A_2A）中的一组候选融合伴体相关的数据，其中图4A是10%SDS-PAGE凝胶的数字化图像，其在最左侧道中的MW标准品之后，从左到右表征了A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-T4L-Cterm、A_2A-红素氧还蛋白、A_2A-木聚糖酶、A_2A-T4L的表达和纯化，图4B示出了各种A_2A-融合伴体蛋白的分析型尺寸排阻层析（aSEC）分析的迹线（蛋白质水平测量为280nm处的UV吸收），用于单分散性和均质性的分析，并且图4C和4D示出了来自于测量已知腺苷A_2A受体配体的稳定性诱导的热变性分析的数据，分别对于在A_2A拮抗剂ZM241285存在下（图4C）和A_2A激动剂UK432097存在下（图4D）的A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-红素氧还蛋白和A_2A-T4L。

图5示出了结合于激动剂UK432097的A_2A-BRIL晶体的数字化图像。

图6A-6B示出了与插入到NOP1受体中的一组候选融合伴体相关的数据，其中图6A是用抗FLAG抗体探测的10%SDS-PAGE凝胶Western印迹的数字化图像，从左到右表征了NOP1-BRIL、NOP1-黄素氧还蛋白、NOP1-T4L-Cterm、NOP1-红素氧还蛋白、NOP1-木聚糖酶、NOP1-T4L-727、NOP1-T4L-722、MW标准品、NOP1-37A的表达和纯化，并且图6B示出了各种NOP1-融合伴体蛋白的分析型尺寸排阻层析（aSEC）分析的迹线，其用于单分散性和均质性的分析。

图7A-7B示出了来自于热变性分析的结果，在图7A中比较了NOP1-BRIL、NOP1-黄素氧还蛋白和NOP1天然IL3-37A（对照）的结果，具有多个NOP1-T4L变体的结果（图7B）。

图8A-8B示出了与插入到CCR5受体中的一组候选融合伴体相关的数据，其中图8A是用抗FLAG抗体探测的10%SDS-PAGE凝胶Western印迹的数字化图像，从左到右表征了CCR5-BRIL（标记为“1423（CytB）”）、CCR5-黄素氧还蛋白（标记为1424（Flavo-）”）、CCR5-T4L-Cterm（标记为“1425（T4L_C）”）、CCR5-红素氧还蛋白（标记为“1426（Rubre-）”）、CCR5-木聚糖酶（标记为“1427（木聚糖酶）”）的表达和纯化以及MW标准品，并且图6B示出了CCR5-T4L、CCR5-BRIL（“CCR5-CytB”）、CCR5-黄素氧还蛋白、CCR5-T4L-Cterm（标记为“CCR5-T4L_C”）、CCR5-红素氧还蛋白和CCR5-木聚糖酶的分析型尺寸排阻层析（aSEC）分析的迹线，其用于单分散性和均质性的分析。

图9是确定被提出作为适合的融合伴体的一组可溶性蛋白结构域的表，其通过使用本发明的方法来鉴定。

发明详述

提供了方法和组合物。提供的组合物为包含将GPCR和融合伴体组合的融合伴体蛋白的组合物的形式，其中融合伴体根据本文提出的原则来选择。在某些实施方式中，融合伴体选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶。在某些实施方式中，融合伴体蛋白氨基酸序列是与红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶中的一种至少90%同源的序列。在某些实施方式中，融合伴体蛋白氨基酸序列是与红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶中的一种至少70%同源，并表现出与这种融合伴体的天然形式的折叠相似性的序列。

本文中描述的GPCR包括天然存在的GPCR及其变体，并且可以包括具有GPCR的7个跨膜结构域并在一个或多个胞内或胞外区域中或在任一端或两端具有替代或缺失的蛋白质。在某些实施方式中，本发明提供了融合伴体蛋白构建体，其由以融合伴体替代第五和第六跨膜结构域之间的一部分或基本上所有胞内结构域的GPCR构成。在某些实施方式中，本发明提供了融合伴体蛋白构建体，其由具有连接到GPCR或在C-端和/或N-端截短的GPCR的C-端或N-端上的融合伴体的这样的GPCR或截短的GPCR构成。

提供了使用新的融合伴体以支持适用于GPCR的晶体学结构研究（例如用于通过GPCR-融合伴体蛋白的X-射线晶体学进行GPCR结构确定）的蛋白质结晶的方法。提供了从本发明的方法产生的组合物。

提供了使用新的融合伴体以支持适用于GPCR的晶体学结构研究的蛋白质结晶的方法，所述方法包括将融合伴体并入到GPCR的胞内结构域中以形成GPCR-融合伴体蛋白，其中融合伴体包括选自红素氧还蛋白、细胞色素b562RIL（Bril）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶的氨基酸序列的氨基酸序列；表达并纯化所述GPCR-融合伴体蛋白；然后将纯化的GPCR-融合伴体蛋白结晶；进行结晶GPCR-融合伴体蛋白的晶体学结构研究；并从所述结晶GPCR-融合伴体蛋白的晶体学结构研究来确定GPCR的结构特征。

提供了使用新的融合伴体以支持适用于GPCR的晶体学结构研究的蛋白质结晶的方法，所述方法包括将融合伴体连接于GPCR的N-端或C-端以形成GPCR-融合伴体蛋白，其中融合伴体包括选自红素氧还蛋白、细胞色素b562RIL（Bril）、T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶的氨基酸序列的氨基酸序列；表达并纯化所述GPCR-融合伴体蛋白；然后将纯化的GPCR-融合伴体蛋白结晶；进行结晶GPCR-融合伴体蛋白的晶体学结构研究；并从所述结晶GPCR-融合伴体蛋白的晶体学结构研究来确定GPCR的结构特征。

提供了使用新的融合伴体来改进GPCR-融合伴体蛋白的结晶以产生适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的方法，从而支持GPCR-融合伴体蛋白的晶体学结构研究。提供了使用新的融合伴体来提高GPCR-融合伴体蛋白的表达以支持GPCR-融合伴体蛋白的结晶的方法。提供了使用新的融合伴体来改进GPCR-融合伴体蛋白的纯化以支持GPCR-融合伴体蛋白的结晶的方法。

提供了用于鉴定、预测、选择、筛选和评估潜在的新融合伴体的方法，所述融合伴体用于并入到GPCR的可用胞内环中以产生具有用于结晶和通过X-射线晶体学进行结构测定的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。提供了用于鉴定、选择、筛选、评估GPCR-融合伴体蛋白的方法。

提供了用于搜索、筛选和挖掘数据库以鉴定能够用作融合伴体来支持适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的结晶的新的蛋白质结构、结构域结构、蛋白质、多肽、结构域或其等同物的方法。

提供了用于鉴定、预测、选择、筛选和评估潜在的新融合伴体的方法，所述新融合伴体适合作为融合伴体来支持适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的结晶。在某些这样的实施方式中，融合伴体与T4L相比提供了改进的性能。

提供了用于搜索、筛选和挖掘数据库以鉴定能够提供适合的融合伴体来支持适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的结晶的新的蛋白质结构、结构域结构、蛋白质、多肽、结构域或其等同物的方法。在某些这样的实施方式中，融合伴体与T4L相比提供了改进的性能。

提供了具有用于结晶和晶体学结构研究的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。

提供了具有用于结晶和晶体学结构研究的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白的晶体。

提供了用于鉴定潜在的新融合伴体的方法，所述新融合伴体用于并入到GPCR的可用胞内环中以产生具有用于结晶和通过X-射线晶体学进行结构测定的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。提供了按照本发明的鉴定方法得到的GPCR-融合伴体蛋白。

提供了用于选择潜在的新融合伴体的方法，所述新融合伴体用于并入到GPCR的可用胞内环中或连接到GPCR的N-端或C-端以产生具有用于结晶和通过X-射线晶体学进行结构测定的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。提供了按照本发明的选择方法得到的GPCR-融合伴体蛋白。

提供了用于筛选潜在的新融合伴体的方法，所述新融合伴体用于并入到GPCR的可用胞内环中或连接到GPCR的N-端或C-端以产生具有用于结晶和通过X-射线晶体学进行结构测定的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。提供了按照本发明的筛选方法得到的GPCR-融合伴体蛋白。

提供了用于评估潜在的新融合伴体的方法，所述新融合伴体用于并入到GPCR的可用胞内环中或连接到GPCR的N-端或C-端以产生具有用于结晶和通过X-射线晶体学进行结构测定的所需生物化学和结构性质的GPCR-融合伴体蛋白。提供了按照本发明和评估候选融合伴体的方法获得的GPCR-融合伴体蛋白。

提供了使用新融合伴体的方法，所述融合伴体包括但不限于大肠杆菌（E.coli）黄素氧还蛋白（PDB ID:1AG9，MW:20kD）、结核分枝杆菌（M.tuberculosis）假设蛋白（PDB ID:2ASF，MW:15kD）、大肠杆菌（E coli）CHEY（PDB ID:1JBE，MW:14kD）、牛（Bos taurus）BPT1（PDB ID:1G6X，MW:7kD）、T4溶菌酶C-端片段（“Cterm-T4L”PDB ID:2O7A，T4肠细菌噬菌体，14kD）、黄素氧还蛋白（PDB ID:1I1O，普通脱硫弧菌（Desulfovibrio vulgaris），突变体Y98H，16kD）、细胞色素b₅₆₂RIL（“Bril”PDB ID:1M6T，大肠杆菌可溶性细胞色素b562，12kD）和趋化蛋白cheA（PDB ID:1TQG，来自于海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的CheA磷酸转移酶结构域，11.9kD）。在某些实施方式中，本发明提供的融合伴体具有与任何上述融合伴体的70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同源性，并且在某些实施方式中，还与这样的融合伴体具有高度折叠相似性或显著折叠相似性。

提供了使用新的融合伴体来支持适用于GPCR的晶体学结构研究的蛋白结晶的方法，所述GPCR包括但不限于5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-ht1e、5-HT1F、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT4、5-ht5a、5-HT6、5-HT7、M1、M2、M3、M4、M5、A1、A2A、A2B、A3、α1A-肾上腺素受体、α1B-肾上腺素受体、α1D-肾上腺素受体、α2A-肾上腺素受体、α2B-肾上腺素受体、α2C-肾上腺素受体、β1-肾上腺素受体、β2-肾上腺素受体、β3-肾上腺素受体、C3a、C5a、C5L2、AT1、AT2、APJ、GPBA、BB1、BB2、BB3、B1、B2、CB1、CB2、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CR1、XCR1、CCK1、CCK2、D1、D2、D3、D4、D5、ETA、ETB、GPER、FPR1、FPR2/ALX、FPR3、FFA1、FFA2、FFA3、GPR42、GAL1、GAL2、GAL3、脑肠肽(ghrelin)、FSH、LH、TSH、GnRH、GnRH2、H1、H2、H3、H4、HCA1、HCA2、HCA3、kisspeptin、BLT1、BLT2、CysLT1、CysLT2、OXE、FPR2/ALX、LPA1、LPA2、LPA3、LPA4、LPA5、S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5、MCH1、MCH2、MC1、MC2、MC3、MC4、MC5、MT1、MT2、促胃动素(motilin)、NMU1、NMU2、NPFF1、NPFF2、NPS、NPBW1、NPBW2、Y1、Y2、Y4、Y5、NTS1、NTS2、delta、kappa、mu、NOP、OX1、OX2、P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6、P2Y11、P2Y12、P2Y13、P2Y14、QRFP、PAF、PKR1、PKR2、PRRP、DP1、DP2、EP1、EP2、EP3、EP4、FP、IP1、TP、PAR1、PAR2、PAR3、PAR4、RXFP1、RXFP2、RXFP3、RXFP4、sst1、sst2、sst3、sst4、sst5、NK1、NK2、NK3、TRH1、TA1、UT、V1A、V1B、V2、OT、CCRL2、CMKLR1、GPR1、GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR15、GPR17、GPR18、GPR19、GPR20、GPR21、GPR22、GPR25、GPR26、GPR27、GPR31、GPR32、GPR33、GPR34、GPR35、GPR37、GPR37L1、GPR39、GPR42、GPR45、GPR50、GPR52、GPR55、GPR61、GPR62、GPR63、GPR65、GPR68、GPR75、GPR78、GPR79、GPR82、GPR83、GPR84、GPR85、GPR87、GPR88、GPR101、GPR119、GPR120、GPR132、GPR135、GPR139、GPR141、GPR142、GPR146、GPR148、GPR149、GPR150、GPR151、GPR152、GPR153、GPR160、GPR161、GPR162、GPR171、GPR173、GPR174、GPR176、GPR182、GPR183、LGR4、LGR5、LGR6、LPAR6、MAS1、MAS1L、MRGPRD、MRGPRE、MRGPRF、MRGPRG、MRGPRX1、MRGPRX2、MRGPRX3、MRGPRX4、OPN3、OPN5、OXGR1、P2RY8、P2RY10、SUCNR1、TAAR2、TAAR3、TAAR4、TAAR5、TAAR6、TAAR8、TAAR9、CCPB2、CCRL1、FY、CT、降钙素受体样肽、CRF1、CRF2、GHRH、GIP、GLP-1、GLP-2、胰高血糖素、分泌素、PTH1、PTH2、PAC1、VPAC1、VPAC2、BAI1、BAI2、BAI3、CD97、CELSR1、CELSR2、CELSR3、ELTD1、EMR1、EMR2、EMR3、EMR4P、GPR56、GPR64、GPR97、GPR98、GPR110、GPR111、GPR112、GPR113、GPR114、GPR115、GPR116、GPR123、GPR124、GPR125、GPR126、GPR128、GPR133、GPR143、GPR144、GPR157、LPHN1、LPHN2、LPHN3、CaS、GPRC6、GABAB1、GABAB2、mGlu1、mGlu2、mGlu3、mGlu4、mGlu5、mGlu6、mGlu7、mGlu8、GPR156、GPR158、GPR179、GPRC5A、GPRC5B、GPRC5C、GPRC5D、frizzled、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、SMO。待评估的GPCR包括但不限于：A类视紫红质样GPCR；B类分泌素样GPCR；C类亲代谢型谷氨酸/信息素GPCR；cAMP受体犁鼻器受体（V1R和V3R）；以及味觉受体T2R。待评估的GPCR包括但不限于A类GPCR、B类GPCR、C类GPCR、D类GPCR、E类GPCR和F类GPCR。

候选GPCR包括，但不限于，β2-肾上腺素能受体（β2AR）、A2A-腺苷受体（A_2A）、S1P1、阿片样受体（OLR）包括NOP1、趋化因子受体CXCR3（CXCR3）、趋化因子受体CCR5（CCR5）、GLP1R、PTHR1、LPA1、LPA2、LPA3、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5。

评估标准和参数

在本文中提供了利用至少一些下面的标准来搜索、筛选或“挖掘”蛋白质数据的数据库以便鉴定和评估潜在的融合伴体和所得到的GPCR-融合伴体蛋白的方法。在一个方面，提供了利用至少下列标准来鉴定和评估潜在的融合伴体以提供支持适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的结晶的适合融合伴体的方法，在某些实施方式中包括与T4L相比提供了改进性能的融合伴体。初始搜索标准包括但不限于下面表1中的标准：

用于选择和评估潜在的新融合伴体的其他特征或标准可以包括相对特征，即可以选择具有不同参数值例如尺寸（kD）、折叠数（折叠多样性）的一组潜在的新融合伴体。

在某些实施方式中，在融合伴体寻求评估用作连接于GPCR末端的融合伴体时，对融合伴体N端与C端接近性的标准可以给予较少权重或没有权重。

在某些实施方式中，本发明提供了选择适合的候选融合伴体以进一步评估本发明的用途的方法。在某些这样的实施方式中，本发明提供的方法包括筛选与这种候选融合伴体相关数据可用的多个候选融合伴体的过程，其包括选择满足下列一个或多个标准的候选融合伴体的步骤：（i）具有相隔不超过或

或

的N和C端；（ii）具有低于25kD（或20kD或15kD）的分子量；（iii）已被证实以至少

或

或

或

或

或或或

的衍射分辨率结晶；（iv）具有在超过一组化学条件下形成晶体的能力；和（v）有能力形成具有超过一种空间群的晶体。在某些实施方式中，上述方法的实施不使用上面标号（i）的标准。在某些实施方式中，上述方法的实施还使用下列其他标准：（vi）具有至少50%α-螺旋含量；以及（vii）在N-端或C-端或两端具有α-螺旋结构域。不受任何具体理论的限制，据认为高α-螺旋含量与更快的折叠动力学相关，其可提高融合蛋白的稳定性和正确折叠。此外，在末端处的α-螺旋结构域可以通过使GPCR的相邻跨膜结构域的α-螺旋基序连续来促进更稳定的折叠，如果出于GPCR和融合伴体的α-螺旋结构域的连续性来选择接合部以使得连续的α-螺旋结构域跨越GPCR与融合伴体之间的接合部（或两个接合部）时，情况尤为如此。

通过使用包括标准（i）–（vii）的本发明的方法，鉴定了下列候选融合伴体（使用蛋白质数据库ID号列出）：2rhf，2ehs，2ip6，3i7m，1x3o，1u84，1h75，2huj，1ysq，3ls0，2qr3，1zuh，2b8i，2cgq，3fxh，3nph，2o4d，1tmy，1vku和2es9。这样的搜索和鉴定的满足标准（i）–（vii）的候选融合伴体的概略结果示出在图9中。搜索、筛选、挖掘、鉴定潜在的融合伴体

本文提供了搜索、筛选和/或“挖掘”蛋白质信息的可搜索数据库，以获得至少满足表1中列出的标准的潜在融合伴体的数据库记录的方法。本文提供了鉴定至少满足在本文提供的搜索、筛选和/或挖掘方法中使用的标准的潜在融合伴体的方法。本文提供了用于鉴定至少满足在本文提供的搜索、筛选和/或挖掘方法中使用的标准的潜在融合伴体以提供适合的融合伴体来支持适用于晶体学结构研究的GPCR-融合伴体蛋白的结晶的方法。在某些实施方式中，提供了与T4L相比具有改进的性能的融合伴体。

示例性的数据库包括但不限于蛋白质数据库（Protein DataBank）（PDB；世界范围的蛋白质数据库，www.wwpdb.org）、JenaLib、ModBase、OCA、SCOP、CATH、Iditis。

人们可以通过包括但不限于实验适应性、实验热稳定性的参数进一步表征潜在的融合蛋白，从嗜热菌预先选择结构，并排除具有辅因子或金属结合要求的蛋白质。

本文中提供了进一步评估通过本文提供的数据库搜索、筛选和/或挖掘方法鉴定的潜在融合伴体的方法。使用其他标准来对于使用表1的非限制性初始搜索标准鉴定到的各潜在融合伴体评估在一个或多个数据库中提供的信息。

提供了使用面向对象的结构化方法来筛选数据库中存档的分子结构集合（数据库中包含的记录）的方法。在一个方面，提供了面向对象的结构化方法来筛选以相容格式存档在数据库中的分子结构（“对象”），并对“对象”进行操作，包括探查相关元数据例如实验条件、衍射分辨率和作者身份，从而允许用户根据用户在图形用户界面（GUI）中指定的任何类型的元数据程序性地过滤和/或筛选数据库记录。在另一个方面，提供了具有界面控制的GUI，其使用户能够探查由数据库提供的一些、许多或所有属性。

在非限制性实施方式中，使用Visual Studio Professional2008（Microsoft Corporation）开发应用以执行这里提供的方法，利用包括Windows Presentation Foundation（WPF）图形子系统和C#编程语言（“C Sharp语言”或“C#语言”）的.NET framework v.3.5（MicrosoftCorporation）。在进一步的非限制性实施方式中，WindowsPresentation Foundation（WPF）是为构建应用提供编程模型的.NETframework v.3.5的图形子系统，其允许将应用的业务逻辑例如程序过滤和/或后端处理与软件客户端应用的图形使用界面（GUI）分离开。

在非限制性实施方式中，面向对象的结构化方法用于筛选在PDB储存库中存档的分子结构，每种蛋白质结构在PDBXML文件中，并且在与XML格式相容的.Net数据结构内引用代表单一蛋白质结构（“对象”）的各个PDBXML文件，并对“对象”进行操作，包括探查相关元数据例如实验条件、衍射分辨率和作者身份，从而允许用户根据用户在图形用户界面（GUI）中指定的任何类型的元数据通过编程方式来过滤和/或筛选数据库记录。在另一种非限制性实施方式中，GUI包括策略界面控制，其使用户能够探查由数据库例如RCSB储存库提供的所有属性。

提供了用于挖掘数据库以获得潜在融合伴体的方法，其中挖掘可以发生一次或多次，并且挖掘可以是连续的或间歇的。提供了用于挖掘数据库以获取数据库中包含的记录的方法，从而收集数据以便探索可得的结构。提供了将本地数据储存与数据库同步的方法。根据一个方面，提供了用于自动获取数据库中包含的记录，包括但不限于自动获取数据库中包含的所有记录、自动获取数据库中包含的一些记录、自动获取数据库中包含的所选记录和自动获取满足一个或多个搜索标准的记录的方法。还提供了用于获取数据库中的更新的方法，包括但不限于最新存入数据（新记录）、更正数据库中包含的记录和进一步注释数据库中包含的记录，其中更新可以自动地或通过其他手段例如按计划搜索或获取来获取。根据一个方面，自动数据收集包括数据库中所有存在的记录的完全下载，以及对数据库进行最新存入数据和其他更新的本地增量自动更新。

在非限制性实施方式中，通过数据库中所有记录的自动获取来收集数据。在另一种非限制性实施方式中，通过初始时自动获取数据库中的所有记录，随后对数据库进行最新存入数据的本地增量更新来收集数据。在非限制性实例中，结构生物信息学研究联合实验室（Research Collaboratory for Structural Bioinformatics）（RCSB）中包含的所有蛋白质数据库（PDB）记录的自动获取由下述步骤构成：（1）所有现有PDB记录的完全下载，其中本地数据储存与PDB的PDBXML储存库同步；以及（2）RCSB储存库的最新存入数据的本地增量更新。在这一实例中，数据使用http:协议本地同步直接以从wwPDB的世界范围服务器组合（通过www.wwpdb.org）获得文件。在各种非限制性实施方式中，取决于筛选发生的时间，所有蛋白质数据库（PDB）记录的集合大小在200GB至320GB范围内。当PDB储存库包含超过60,000个结构的记录时，PDB储存库的本地副本大小达到320GB。

在非限制性实施方式中，通过使用搜索标准鉴定数据库中的候选物，并且从数据库获取已经使用搜索标准鉴定的所有记录来收集数据。

评估新的融合伴体和GPCR-融合伴体蛋白

将潜在的新融合伴体（或候选融合伴体）并入到至少一个GPCR内所述GPCR中的至少一个位置中，并且对得到的GPCR-融合伴体蛋白进行测定。根据一个方面，将各个潜在的新融合伴体并入到至少两种不同受体中。根据另一个方面，将各个潜在的新融合伴体并入到同一受体的至少两个不同位置中以产生具有相同受体和相同融合伴体的至少两种不同的GPCR，但是其中各不同的GPCR的融合配偶体整合在与另一不同的GPCR不同的位置中。根据另一个方面，对各受体形成至少两种不同的GPCR-融合伴体蛋白，其中各种不同的GPCR-融合伴体蛋白具有不同的受体。

从PDB挖掘用以并入到GPCR中来产生GPCR-融合伴体蛋白的一组潜在融合伴体的非限制性实例包括：大肠杆菌黄素氧还蛋白（PDB ID:1AG9，MW：20kD），结核分枝杆菌假设蛋白Rv2074（PDBID:2ASF，MW:15kD），大肠杆菌趋化蛋白CHEY（PDB ID:1JBE，MW:14kD），牛的牛胰蛋白酶抑制剂BPT1（PDB ID:1G6X，MW:7kD）。从PDB挖掘用以并入到GPCR中来产生GPCR-融合伴体蛋白的一组潜在融合伴体的另一非限制性实例包括：T4溶菌酶C-端片段（PDB ID:2O7A，T4肠细菌噬菌体，14kD）；黄素氧还蛋白（PDB ID:1I1O，普通脱硫弧菌，突变体Y98H，16kD）；细胞色素b₅₆₂RIL（“Bril”PDB ID:1M6T，大肠杆菌可溶性细胞色素b562，12kD）；和趋化蛋白cheA（PDB ID:1TQG，来自于海栖热袍菌的CheA磷酸转移酶结构域，11.9kD）。使用上述标准鉴定的具有尺寸和折叠变异性（折叠多样性）的一组潜在的新融合伴体的再另一非限制性实例包括红素氧还蛋白（PDB ID:1FHM，巴斯德梭菌（Clostridium pasteurianum）红素氧还蛋白，6kD）、细胞色素b₅₆₂RIL（“Bril”PDB ID:1M6T，可溶性细胞色素b₅₆₂，12kD）、T4溶菌酶C-端片段（“C-term-T4L”PDB ID:2O7A，T4肠细菌噬菌体，T4溶菌酶环状重排体（circular permutant），14kD）、黄素氧还蛋白（PDBID:1I1O，普通脱硫弧菌，突变体Y98H，16kD）和木聚糖酶（PDBID:2B45，内切-1,4-β-木聚糖酶A，21kD）。在另一非限制性实例中，一组还包括T4溶菌酶（T4L，18kD）作为对照。

在组合插入到GPCR中相对于TM-V和TM-VI的细胞内末端的不同位置中之后，测试各GPCR-融合伴体蛋白的结晶性。

待评估的GPCR包括但不限于A类GPCR、B类GPCR、C类GPCR、D类GPCR、E类GPCR和F类GPCR。候选的GPCR包括但不限于β2-肾上腺素能受体（β2AR）、A2A-腺苷受体（A_2A）、鞘氨醇1-磷酸受体1型（S1P1）、阿片样受体（OLR）包括NOP1、趋化因子受体CXCR3（CXCR3）、趋化因子受体CCR5（CCR5）。融合伴体并入GPCR的胞内结构域中

预期的融合伴体的最适位置可以通过对到目前为止解析的结构进行分析来确立。融合蛋白的并入不应破坏任何二级结构元件或三级堆积相互作用，并且不应干扰配体结合口袋。在对A类受体进行这样的考虑后，用于环替换的可靠选项是第三胞内环，在此处结构无序性显得最高。其他位置可能对其他7TM受体种类例如B类GPCR是适合的，其中关于区域和环的相对顺序了解得很少。对第三胞内环内准确位置的修饰是优化各构建体的过程的部分。

在某些实施方式中，在将融合伴体组合插入到GPCR中相对于TM-V和TM-VI的细胞内末端的不同位置中之后，测试各种GPCR-融合伴体蛋白的结晶性。变异量将与环的长度和与已知结构的序列同源性相关。平均来说，评估2-3个初始插入点，尽管本发明包括在相对于TM-V和TM-VI的细胞内末端的1、4、5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个位置处的插入。在某些实施方式中，在将融合伴体连接到GPCR或者GPCR的N或C端截短形式的N或C端之后，测试各种GPCR-融合伴体蛋白的结晶性。

在本发明的某些实施方式中，评估了在TM-V与TM-VI之间用于融合伴体的可选接合位置对融合蛋白的热稳定性的影响以将其作为结晶的潜在适合性的指示。

评估

通过本文中提供的搜索鉴定的潜在融合伴体（也称为，尤其是，融合伴体候选蛋白、可选融合伴体、潜在的载体蛋白、预期的融合伴体等）的可行性如本文中所提供的进行评估。在非限制的示例性实施方式中，β2-肾上腺素能受体（β2AR）起到模型系统的作用，其中将通过本文中提供的搜索鉴定的6种潜在融合伴体蛋白中的各种克隆到与T4-溶菌酶对于β2AR-T4L所克隆的相同β2AR位点中，因为来自于β2AR-T4L的结构已被解析。也就是说，构建了用于各种β2AR-潜在融合伴体构建体的表达载体以提供所需的β2AR-潜在融合伴体构建体作为表达产物，并将各种β2AR-潜在融合伴体构建体继续进行表达载体的病毒产生、中等规模表达和β2AR-潜在融合伴体构建体的稳定性和单分散性的初步表征。在使用β2AR-潜在融合伴体构建体的非限制的示例性实施方式中，将2种潜在融合伴体蛋白排除在考虑之外，然后将剩余的4种β2AR-潜在融合伴体构建体规模放大，并将β2AR-潜在融合伴体蛋白继续进行结晶试验。对于放大并推进到结晶试验中的4种构建体中的2种获得了初步晶体命中，其中β2AR-BRIL构建体在三种不同结晶条件下结晶。进一步优化导致鉴定到足以生长足够大以用于初步衍射研究的晶体的条件，以确定它们支持高分辨率结构测定的潜力。在这种非限制的示例性实施方式中，最好的晶体衍射至约

的分辨率。在这种非限制的示例性实施方式中，通过调整在过去的结晶工作中已知与获得所需水平的分辨率相关的参数，进一步优化产生最好晶体的条件以提高尺寸、厚度和双折射。

除了如本文中所描述的将各种潜在融合伴体（可选融合伴体）并入到β2AR中的非限制的示例性实施方式之外，已经实施了其他非限制性实施方式以探索各种潜在融合伴体在多种其他GPCR中的使用。将5个不同的潜在融合伴体中的每一个克隆到腺苷A2A、NOP1和CXCR3的各GPCR中，其中将潜在融合伴体并入到优化的接合位点中。在这些进一步的非限制性实施方式中，各种GPCR-潜在融合伴体构建体通过小规模表达研究和生物物理表征来获得。在某些非限制性实施方式中，将腺苷A2A-融合伴体蛋白的评估进一步推进到结晶试验中，并得到初步结果。不希望受到本观察的限制，总体来是结果是有利的，其中至少两种潜在融合伴体与T4L作为用于各目标GPCR的融合伴体时相比，产生相似或更好的结果。根据本文提供的方法和组合物，一般将用于形成β2AR-T4L晶体的特定条件转用于β2AR-BRIL构建体。

除非另有指明，否则本文中提供的方法和组合物根据本领域技术人员的知识使用已知方法来实施，特别是按照用于组装构建体、克隆、表达、纯化、结晶（包括但不限于脂质立方结晶）、评估（包括但不限于热稳定性测定、配体结合测定包括饱和等温线测定和竞争性结合测定）方法，正如尤其是在下述文献中所公开的：Cherezov等，2004（Cherezov,V.,Peddi,A.,Muthusubramaniam,L.,Zheng,Y.F.和Caffrey,M.,“A robotic system for crystallizing membrane andsoluble proteins in lipidic mesophases,”Acta Crystallogr D BiolCrystallogr60:1795-1807,2004），Cherezov等，2007（Science318:1258-1265,2007），Rosenbaum等，2007（Science318:1266-1273,2007），Stevens等，如在作为WO2009/055509A2出版的PCT/US08/80847中和作为US20110031438A1（2011年2月10日）出版的美国专利申请号12/739,134中所公开的，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties（W.H.Freeman andCompany,1993），Sambrook等，Molecular Cloning:A LaboratoryManual（第二版，1989），Methods In Enzymology（S.Colowick和N.Kaplan主编，Academic Press,Inc.），Remington's PharmaceuticalSciences（Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company，第18版，1990），Carey和Sundberg,Advanced Organic Chemistry,Vols.A和B（Plenum Press，第3版，1992），其公开内容以其全文通过引用并入本文。

实施例

实施例1.鉴定用于并入到GPCR中的潜在融合伴体的数据挖掘

进行蛋白质数据库（PDB；Worldwide Protein Data Bank，www.wwpdb.org）的初始筛选以鉴定满足上面表1中列出的标准的潜在的新融合伴体：候选的潜在融合伴体的N和C端应该相隔不超过

；分子量低于25kD；潜在融合伴体的晶体应该具有优于

的衍射分辨率；潜在融合伴体的晶体应该在至少两种不同化学条件下形成；以及潜在融合伴体的晶体应该产生超过一种空间群。通过这种筛选鉴定到下面的潜在融合伴体：大肠杆菌黄素氧还蛋白（PDB ID:1AG9，MW:20kD）、结核分枝杆菌假设蛋白（PDB ID:2ASF，MW:15kD）、大肠杆菌CHEY（PDB ID:1JBE，MW:14kD）、牛BPT1（PDB ID:1G6X，MW:7kD）。

实施例2.S1P1-融合伴体蛋白

S1P1是结合脂质信号传导分子鞘氨醇1-磷酸（S1P）的GPCR，所述鞘氨醇1-磷酸是结合于被称为S1P_1-5的5种GPCR的循环脂质。S1P₁选择性地调控免疫和心血管系统中的生理功能，包括免疫细胞运输和内皮完整性的维持。如下所述，产生并评估了4种新的S1P1-融合伴体蛋白。

将下述每种蛋白作为潜在融合伴体进行评估：T4溶菌酶C-端片段（“Cterm-T4L”PDB ID:2O7A，T4肠细菌噬菌体，14kD），黄素氧还蛋白（PDB ID:1I1O，普通脱硫弧菌，突变体Y98H，16kD），细胞色素b₅₆₂RIL（“Bril”PDB ID:1M6T，大肠杆菌可溶性细胞色素b562，12kD）和趋化蛋白cheA（PDB ID:1TQG，来自于海栖热袍菌的CheA磷酸转移酶结构域，11.9kD）。

如下所述将每种潜在融合伴体并入到S1P1中：合成编码融合伴体的cDNA构建体，其编码在其相应的晶体结构中观察到的所有氨基酸。为了产生S1P1融合体，首先通过基于PCR的定点诱变在S1P1cDNA内氨基酸密码子S232/R233与K243/A244之间引入独特的限制性位点，以产生用于插入融合伴体cDNA的位点。然后使用含有与引入到S1P1受体DNA中的位点匹配的编码的末端限制性位点的引物，通过PCR扩增融合伴体cDNA（即编码融合伴体的cDNA）。将S1P1受体（GenBank:M31210.1）的cDNA作为基础构建体用于进一步修饰，其氨基酸序列显示如下：

人S1P1受体，GenBank登记号M31210.1的氨基酸序列

MGPTSVPLVKAHRSSVSDYVNYDIIVRHYNYTGKLNISADKENSIKLTSVVFILICCFIILENIFVLLTIWKTKKFHRPMYYFIGNLALSDLLAGVAYTANLLLSGATTYKLTPAQWFLREGSMFVALSASVFSLLAIAIERYITMLKMKLHNGSNNFRLFLLISACWVISLILGGLPIMGWNCISALSSCSTVLPLYHKHYILFCTTVFTLLLLSIVILYCRIYSLVRTRSRRLTFRKNISKASRSSENVALLKTVIIVLSVFIACWAPLFILLLLDVGCKVKTCDILFRAEYFLVLAVLNSGTNPIIYTLTNKEMRRAFIRIMSCCKCPSGDSAGKFKRPIIAGMEFSRSKSDNSSHPQKDEGDNPETIMSSGNVNSSS[SEQ ID NO:1]

使用标准分子生物学技术将融合伴体cDNA插入到S1P1受体编码序列中。首先，将编码融合伴体的cDNA和修饰的S1P1cDNA通过限制性消化切割并纯化。其次，将消化的PCR产物与载体连接并转化到大肠杆菌中。得到的克隆通过DNA测序进行验证。在这一过程中，S1P1载体的限制性消化移除了受体ICL3的短区段（S232-K243），其随后被插入的融合伴体cDNA替换，导致在S1P1受体的残基R231与K243之间的插入。为了改进受体融合的性能，将S1P1受体C-端截短至S1P1M325。各种受体融合构建体的完整氨基酸序列显示如下（其中融合伴体序列用斜体表示）：

S1P1-BRIL的氨基酸序列

MGPTSVPLVKAHRSSVSDYVNYDIIVRHYNYTGKLNISADKENSIKLTSVVFILICCFIILENIFVLLTIWKTKKFHRPMYYFIGNLALSDLLAGVAYTANLLLSGATTYKLTPAQWFLREGSMFVALSASVFSLLAIAIERYITMLKMKLHNGSNNFRLFLLISACWVISLILGGLPIMGWNCISALSSCSTVLPLYHKHYILFCTTVFTLLLLSIVILYCRIYSLVRTRADLEDNWETLNDNLKVIEKADNAAQVKDALTKMRAAALDAQKATPPKLEDKSPDSPEMKDFRHGFDILVGQIDDALKLANEGKVKEAQAAAEQLKTTRNAYIQKYLASRSSENVALLKTVIIVLSVFIACWAPLFILLLLDVGCKVKTCDILFRAEYFLVLAVLNSGTNPIIYTLTNKEMRRAFIRIM[SEQ ID NO:2]

S1P1-黄素氧还蛋白的氨基酸序列

MGPTSVPLVKAHRSSVSDYVNYDIIVRHYNYTGKLNISADKENSIKLTSVVFILICCFIILENIFVLLTIWKTKKFHRPMYYFIGNLALSDLLAGVAYTANLLLSGATTYKLTPAQWFLREGSMFVALSASVFSLLAIAIERYITMLKMKLHNGSNNFRLFLLISACWVISLILGGLPIMGWNCISALSSCSTVLPLYHKHYILFCTTVFTLLLLSIVILYCRIYSLVRTRAKALIVYGSTTGNTEYTAETIARELADAGYEVDSRDAASVEAGGLFEGFDLVLLGCSTWGDDSIELQDDFIPLFDSLEETGAQGRKVACFGCGDSSWEYFCGAVDAIEEKLKNLGAEIVQDGLRIDGDPRAARDDIVGWAHDVRGAIASRSSENVALLKTVIIVLSVFIACWAPLFILLLLDVGCKVKTCDILFRAEYFLVLAVLNSGTNPIIYTLTNKEMRRAFIRIM[SEQ ID NO:3]

S1P1-木聚糖酶的氨基酸序列

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S1P1-红素氧还蛋白的氨基酸序列

MGPTSVPLVKAHRSSVSDYVNYDIIVRHYNYTGKLNISADKENSIKLTSVVFILICCFIILENIFVLLTIWKTKKFHRPMYYFIGNLALSDLLAGVAYTANLLLSGATTYKLTPAQWFLREGSMFVALSASVFSLLAIAIERYITMLKMKLHNGSNNFRLFLLISACWVISLILGGLPIMGWNCISALSSCSTVLPLYHKHYILFCTTVFTLLLLSIVILYCRIYSLVRTRMKKYTCTVCGYIYNPEDGDPDNGVNPGTDFKDIPDDWVCPLCGVGKDQFEEVEEASRSSENVALLKTVIIVLSVFIACWAPLFILLLLDVGCKVKTCDILFRAEYFLVLAVLNSGTNPIIYTLTNKEMRRAFIRIM[SEQ IDNO:5]

编码进一步的N-和C-端修饰的表达构建体。将编码该组S1P1受体融合蛋白的合成cDNA克隆到pFastBac中，所述pFastBac被修饰以包含N-端的红细胞凝集素信号序列和C-端的10组氨酸标签和其后的FLAG表位。由完成的S1P1-BRIL构建体编码的带有添加的氨基酸（斜体字体）的氨基酸序列的实例如下所示。

S1P1-BRIL表达构建体的表达产物的氨基酸序列

MKTIIALSYIFCLVFAGAPGPTSVPLVKAHRSSVSDYVNYDIIVRHYNYTGKLNISADKENSIKLTSVVFILICCFIILENIFVLLTIWKTKKFHRPMYYFIGNLALSDLLAGVAYTANLLLSGATTYKLTPAQWFLREGSMFVALSASVFSLLAIAIERYITMLKMKLHNGSNNFRLFLLISACWVISLILGGLPIMGWNCISALSSCSTVLPLYHKHYILFCTTVFTLLLLSIVILYCRIYSLVRTRADLEDNWETLNDNLKVIEKADNAAQVKDALTKMRAAALDAQKATPPKLEDKSPDSPEMKDFRHGFDILVGQIDDALKLANEGKVKEAQAAAEQLKTTRNAYIQKYLASRSSENVALLKTVIIVLSVFIACWAPLFILLLLDVGCKVKTCDILFRAEYFLVLAVLNSGTNPIIYTLTNKEMRRAFIRIMGRPLEVLFQGPHHHHHHHHHHDYKDDDDK[SEQ ID NO:6]

使用在Invitrogen 杆状病毒表达系统手册中概述的标准流程，产生含有S1P1受体融合表达构建体的重组杆粒DNA。简单来说，将含有目标基因的pFastBac质粒转化到DH10bac细胞中，并在适合的琼脂平板上对转化体进行颜色筛选。从转化平板选择白色菌落，并将其在液体培养中生长。从这些过夜细菌培养物纯化大量重组杆粒DNA。使用Fugene HD（Promega），用纯化的杆粒DNA转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）（Sf-9）细胞，并在4天后收获重组病毒。在扩增以产生高滴度原种后，感染Sf-9细胞，并在48小时后收获用于分析。使用荧光团标记的抗FLAG抗体，通过流式细胞术评估每个克隆的细胞表面表达，并将其用作度量受体融合蛋白的正确折叠和运输的标准。

然后通过重复的杜恩斯匀浆和离心以除去可溶性蛋白和细胞器，从冷冻的完整细胞分离总膜级份。

通过如下详述的十二烷基麦芽糖苷（DDM）提取和随后在Talon树脂（Clontech）上的固定化金属亲和层析（IMAC），从膜纯化S1P1-融合伴体蛋白（“S1P1融合受体”）。通过添加室温裂解缓冲液至总体积为25mL，将冷冻的细胞膜解冻。加入S1P1受体拮抗剂W146至终浓度为125μM。将混合物在室温下温育1小时以确保受体被配体完全饱和，然后加入碘乙酰胺至浓度为1mg/mL，并在4℃继续温育1小时。通过加入去污剂和胆甾醇半琥珀酸酯（CHS）引发受体溶解，以获得0.5%DDM和0.1%CHS的终浓度。溶解缓冲液由下列混合物构成：50mM Hepes pH7.5，800mM NaCl，30mM咪唑，0.1%DDM0.02%CHS，125μM W146。将溶解在4℃下进行2小时，然后将混合物在Ti70转子（Beckman）中以70,000rpm离心35分钟。然后使用上清液重悬浮1mL水洗的Talon superflow IMAC树脂，并将悬液在4℃温育过夜。在与Talon树脂温育后，将悬液倒入25mLBioRad一次性柱中，收集通流物并保存用于后面的分析。然后将收集的Talon树脂用20ml含有下列组分的缓冲液洗涤：20mM HepespH7.5，500mM NaCl，0.05%DDM，0.01%CHS，250μM W146。使用补充有200mM咪唑的相同缓冲液来洗脱受体。

将洗脱的蛋白质通过尺寸排阻层析（SEC）和随后的SDS-PAGE进行分析。简单来说，将每种S1P1-融合伴体蛋白以结晶浓度配制，例如50mg/mL，稀释30倍并进样到分析HPLC上，其中使用尺寸排阻层析（SEC）分离样品以获得接近均质的S1P1-融合伴体蛋白。S1P1-Cterm-T4L、S1P1-黄素氧还蛋白和S1P1-Bril S1P1-融合伴体蛋白在存在或不存在配体的情况下稳定，并且即使在浓度>50mg/mL后也保持单分散，正如由来自于使用尺寸排阻层析（SEC）的分析的迹线所表明的（数据未示出）。将对应于S1P1-融合伴体蛋白的SEC级份在10%凝胶上通过SDS-PAGE进行评价、分离并染色，证实了每种S1P1-融合伴体蛋白可以被纯化至接近均质（数据未示出）。

在对每种S1P1-融合伴体蛋白的表达水平进行初始评估，然后进行小规模纯化和SEC分析后，由于表达水平低和SEC峰形不佳，关于S1P1-cheA（PDB ID:1TQG）蛋白的进一步工作被放弃。使用上面概述的流程，将编码S1P1-Cterm-T4L、S1P1-黄素氧还蛋白和S1P1-Bril的剩余3种构建体过表达并纯化至接近均质。

实施例3.β2肾上腺素能受体融合伴体蛋白

将一组候选融合伴体各自插入到β2-肾上腺素能受体（β2AR；b2肾上腺素能受体）中，并将各种得到的β2AR-融合伴体蛋白表达、提取和纯化以确定各种性质。构建、表达β2AR融合蛋白并对于下列β2AR-融合伴体蛋白进行评估：β2AR-T4L，β2AR-C-term T4L，β2AR-Bril，β2AR-红素氧还蛋白，β2AR-木聚糖酶和β2AR-黄素氧还蛋白。

使用被命名为β2AR-T4L（“β-2肾上腺素能受体/T4-溶菌酶嵌合体”PDB ID3D4S）的与T4-溶菌酶融合的β2肾上腺素能受体的以前解析的X-射线晶体结构作为指导，将候选融合伴体插入到β2AR中对应于直接替换原始β2AR-T4L（即PDB ID3D4S）中的融合T4L序列的位置处。因此，连接位点保持与原始β2AR-T4L蛋白相同。所有表达构建体携带N-端红细胞凝集素信号序列，之后是FLAG M2表位。基础构建体的C-端被进一步修饰以将原始的组氨酸纯化标签从6个延长至10个组氨酸，以促进纯化。所有β2AR-融合蛋白编码序列（“受体融合基因”）通过合成cDNA重叠延伸PCR来构建，并通过限制性消化和连接到表达载体pFastBac1中而克隆。

在表达构建体中使用的β2AR的氨基酸序列（GenBank登记号NP_000015.1）

MKTIIALSYIFCLVFADYKDDDDAMGQPGNGSAFLLAPNRSHAPDHDVTQQRDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLACADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTFGNFWCEFWTSIDVLCVTASIWTLCVIAVDRYFAITSPFKYQSLLTKNKARVIILMVWIVSGLTSFLPIQMHWYRATHQEAINCYAEETCCDFFTNQAYAIASSIVSFYVPLVIMVFVYSRVFQEAKRQL[SEQ ID NO:7]

β2AR-T4L的氨基酸序列

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β2AR-C-term T4L的氨基酸序列（来自于Hanson等，2008）MKTIIALSYIFCLVFADYKDDDDAMGQPGNGSAFLLAPNRSHAPDHDVTQQRDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLACADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTFGNFWCEFWTSIDVLCVTASIWTLCVIAVDRYFAITSPFKYQSLLTKNKARVIILMVWIVSGLTSFLPIQMHWYRATHQEAINCYAEETCCDFFTNQAYAIASSIVSFYVPLVIMVFVYSRVFQEAKRQLKDEAEKLFNQDVDAAVRGILRNAKLKPVYDSLDAVRRAALINMVFQMGETGVAGFTNSLRMLQQKRWDEAAVNLAKSRWYNQTPNRAKRVITTFRTGTWDAYKNLSGGGGAMDIFEMLRIDEGKFCLKEHKALKTLGIIMGTFTLCWLPFFIVNIVHVIQDNLIRKEVYILLNWIGYVNSGFNPLIYCRSPDFRIAFQELLCLRRSSLKHHHHHHHHHH[SEQ ID NO:9]

β2AR-Bril的氨基酸序列

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β2AR-红素氧还蛋白的氨基酸序列

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β2AR-木聚糖酶的氨基酸序列

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β2AR-黄素氧还蛋白的氨基酸序列

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通过在0.5mM噻吗洛尔（配体）存在下与0.5%w/v DDM/CHS去污剂混合物一起温育，然后使用固定化金属亲和层析（IMAC）在0.5mM噻吗洛尔存在下进行纯化，从细胞质膜提取各种β2AR-融合伴体蛋白。在不存在配体的情况下使用相同的方案以测试各种构建体的稳定性和对配体结合的有利响应。在配体结合纯化的情形中，使用较少量的第二IMAC树脂对蛋白质进行二次纯化。

通过加入含有2mM噻吗洛尔的裂解缓冲液至总体积为25mL，将12.5ml冷冻的细胞膜融化。将混合物在4℃温育1小时以确保受体被配体完全饱和，然后加入碘乙酰胺至浓度为1mg/mL，并在4℃继续温育1小时。通过加入去污剂和胆甾醇半琥珀酸酯以获得0.5%DDM和0.1%CHS的终浓度而引发受体溶解。溶解缓冲液由下列混合物组成：50mM Hepes pH7.5，150mM NaCl，25mM咪唑，0.1%DDM，0.02%CHS，500μM噻吗洛尔。使溶解在4℃下进行2.5小时，然后将混合物在Ti70转头（Beckman）中以70,000rpm离心35分钟。然后使用上清液重悬浮1mL水洗的Talon superflow IMAC树脂，并将悬液在4℃温育过夜。在与Talon树脂温育后，将悬液倒入25mL BioRad一次性柱中，收集通流物并保存用于后面的分析。然后将收集的Talon树脂用20ml含有下列组分的缓冲液洗涤：50mM Hepes pH7.5，500mM NaCl，0.05%DDM，0.01%CHS，500μM噻吗洛尔。使用补充有200mM咪唑的相同缓冲液来洗脱受体。无配体的纯化按照相同步骤来完成，但是从所有缓冲液中省略拮抗剂噻吗洛尔。

将从IMAC纯化收集的洗脱液进样到分析型SEC柱上，并通过UV吸收和色氨酸荧光监测迹线。使用峰形来比较受体融合蛋白的产率和相对质量。简单来说，可以通过对峰下面积进行积分并将该面积与具有已知浓度和消光系数的参比标准品例如牛血清白蛋白的面积进行比较来估算功能性折叠的蛋白质的产率。蛋白质的质量根据蛋白质SEC峰的单分散性来估算，其中不存在第二峰或主峰的肩峰表明质量高（图1，A-E），以及通过在具有全蛋白染色的10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳来估算（图1F）。

图1示出了插入到β2AR中的候选融合伴体组中每一个的结果和性能。图1A-1E示出了对应于在配体存在下（黑色迹线）和配体不存在下（红色迹线）每种β2AR-融合伴体蛋白的提取和初级纯化以及配体结合的融合蛋白物质（绿色迹线）的二次纯化的SEC数据。

图1F示出了每种β2AR融合伴体蛋白的最终纯化产物在10%凝胶上的SDS-PAGE，从左到右为MW标准品、β2AR-T4L、β2AR-C-termT4L、β2AR-Bril、β2AR-红素氧还蛋白、β2AR-木聚糖酶和β2AR-黄素氧还蛋白。

基于一组候选融合伴体蛋白的这种初始评估，选择了4种构建体用于在大规模表达和纯化后对它们在脂质立方相中结晶的能力进行进一步分析。在大规模表达和纯化后对它们在脂质立方相中结晶的能力进行进一步分析的4种β2AR-融合伴体蛋白中，β2AR-Bril产生晶体命中，即产生可接受的晶体。β2AR-Bril融合伴体蛋白给出初始微晶体命中，并被进一步优化以支持高分辨率衍射和结构解析。此外，β2AR-木聚糖酶成功结晶以形成衍射至约

分辨率的晶体。

如上所述对β2AR-Bril进行表达和纯化，区别在于在缓冲液中包含卡拉洛尔代替噻吗洛尔，从而产生通过SDS-PAGE测定纯度高于95%的蛋白质样品。将得到的纯化蛋白质浓缩至60mg/mL并通过分析型SEC进行分析以确定终浓度和异质性水平（图2A-C）。然后将纯化的浓缩材料在含有10%w/w胆甾醇的脂质立方相中重构。将重构的蛋白质脂质混合物的小等分试样分布在96孔玻璃结晶板上，并用潜在的结晶诱导缓冲液和试剂覆盖。确定诱导结晶的具体试剂，从而产生大的双折射晶体（图2D），其通过晶体的色氨酸荧光（图2E）和衍射（图2F）来证实本质上是蛋白质。

β2AR-Bril融合伴体蛋白的FRAP研究

进行β2AR-Bril的FRAP分析以鉴定待探索的可选结晶条件，其目的是产生更高分辨率的晶体。β2AR-Bril用Cy3荧光染料（～550nm激发，～570nm发射）标记，将Cy3单官能N-羟基琥珀酰亚胺酯（Cy3NHS）（GE Healthcare）从在DMF中的5mg/mL原液，以2-5的染料/蛋白质摩尔比添加到在纯化流程中结合于第二IMAC纯化柱的纯化蛋白质中。将得到的溶液混合，并在避光条件下在4℃温育2-3h。在该温育后，使用过量的纯化缓冲液将未反应的染料从柱子上洗掉。通过添加过量缓冲液对柱子进行进一步洗涤，然后将柱子在暗处、在4℃下温育至少12小时。在该温育后，将具有结合的蛋白质的柱子用另外的缓冲液洗涤直至通过光谱测量分析没有观察到未反应染料的迹象为止。将标记的蛋白质从IMAC柱上洗脱，浓缩，并在脂质立方相结晶环境中重构。在将少量脂质立方相β2AR-Bril（“LCP/b2bril”）材料与被认为能够实现结晶的各种条件进行温育后，使用光脱色荧光恢复（FRAP）来测量Cy3-标记的β2AR-Bril的二维横向扩散。如果不存在已知的结晶条件，则在脂质立方相的结晶基质内的扩散分析结果可用于缩窄结晶空间的搜索。或者，可以使用FRAP分析以通过最大化被标记蛋白质的回收恢复率并优化扩散速率来优化已知条件，从而支持更大的晶体。对于β2AR-Bril来说，使用FRAP分析来鉴定可选的结晶条件以探索产生更高分辨率的晶体。在某些实施方式中，β2AR-Bril融合伴体蛋白如上所述使用β2ARwtN187来制备，并将得到的β2AR-Bril命名为“IMPT-1497”。

LCP-FRAP。将用于LCP-FRAP分析的Cy3标记的蛋白质在LCP中重构，并分配在如结晶章节中所描述的玻璃夹心板上。自动化高通量LCP-FRAP分析的设置已被描述。简单来说，将LCP夹心板装载在定制的LCP-FRAP工作台上，所述工作台由Zeiss AxioImager A1荧光显微镜、Micropoint染料细胞激光器（Photonic Instruments）、冷却的CCD FireWire相机CoolSnap HQ2（Photometrics）和自动XYZ显微镜台MS-2000（Applied Scientific Instrumentation）构成。然后通过以25Hz的脉冲率触发15-20次激光脉冲将各LCP液滴脱色。在脱色之前和之后立即获取荧光图像。在30分钟的恢复期后，再次获取图像以确定荧光恢复，并通过ImagePro高级显微软件套装（Media Cybernetics）进行分析。

热稳定性分析。N-[4-(7-二乙基氨基-4-甲基-3-香豆素基)苯基]马来酰亚胺（CPM）染料购自Invitrogen，并以4mg/mL溶解在DMSO（Sigma）中作为原液以备将来使用。将原液保持在-80℃下，并在使用前在染料稀释溶液（10mM缓冲液，500mM NaCl，10%甘油，0.025%DDM和0.005%CHS）中1:40稀释。热变性分析使用总体积为200μL的样品在石英荧光计比色杯（Starna Cells,Inc.,Atascadero,CA）中进行。将受体（4μg）在适合的缓冲溶液中稀释至终体积为200μL，向蛋白质溶液加入5μL稀释的染料，并在4℃下温育30min。将混合的溶液转移至比色杯，并通过Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian,USA）使用2℃/min的变温速率收集数据。激发波长为387nm，发射波长为463nm。所有分析在从20℃开始至95℃的温度范围内进行。使用GraphPad Prism程序（GraphPad Prism,GraphpadSoftware,San Diego,CA,USA）处理稳定性数据。为了确定熔解温度（Tm），使用Boltzmann反曲方程（sigmoidal equation）来拟合数据。

热稳定性。然后评估不同β2AR构建体的热稳定性。在100μM噻吗洛尔存在下进行测定以在加热期间维持受体的稳定性。相对于β2AR-T4L，β2AR-黄素氧还蛋白和β2AR-CtermT4L的稳定性分别低约9℃和4℃。β2AR木聚糖酶的稳定性比β2AR-T4L高约3℃，而β2AR-BRIL和β2AR-红素氧还蛋白两者比β2AR-T4L的稳定性高约8℃。因此，我们选择β2AR-BRIL和β2AR红素氧还蛋白用于进一步结晶研究。

结晶。用于膜蛋白的介观结晶方法（meso crystallization method）已被详细描述。将蛋白质溶液与9:1的油酸单甘油酯:胆甾醇的熔融脂质混合物以40%蛋白质对60%脂质的比例在常规注射器混合器中混合。将含有重构的LCP的注射器装载在自动结晶机器人（NT8-LCP，Formulatrix）上，并将35-50nL LCP分配到96孔玻璃夹心板（MarienFeld）上，然后用800nL沉淀剂溶液覆盖。将液滴用盖玻片密封，并在自动温箱/成像仪RockImager1000（Formulatrix）中在20℃下温育和成像。β2AR-BRIL和A_2AAR-BRIL两者的晶体在7天内长出。

LCP中的蛋白质扩散和结晶。不需如A_2AAR-BRIL的情形中所必需的连接位点优化，我们能够在LCP中生长β2AR-BRIL晶体。以与A_2AAR-BRIL相似的方式进行LCP-FRAP分析，以便指导结晶试验。将蛋白质用Cy3-单NHS酯在pH7.5的缓冲液中标记，并在LCP-FRAP样品制备之前同样地通过分析型尺寸排阻层析（aSEC）来评估纯度、单分散性和标记效率。通过将蛋白溶液与熔融油酸单甘油酯以40%（w/w）蛋白质溶液、54%（w/w）油酸单甘油酯、6%（w/w）胆甾醇的最终比例混合，将标记的蛋白在LCP中重构，并如前面所介绍的将其与自制掩蔽物（screen）温育。根据以前的β2AR结晶条件，将掩蔽物的pH调整到6、7和8。在所有3种pH之间，β2AR-BRIL在pH7下显示出最适移动分数（mobile fraction），其在使用特定沉淀剂时高于60%（补充图8a）。对显示出高扩散恢复的条件进行进一步优化以用于结晶试验。优化的晶体生长到接近80x15微米，并衍射至

X-射线数据收集。晶体学数据在Argonne National Laboratory处在Advanced Photon Source的23ID-B/D束线（GM/CA CAT）上，使用波长为

的10μm准直小射束和MarMosaic300检测器来收集。为了降低辐射损伤，在使用未衰减的射束以3s的暴露时间和1°的振荡收集5-10帧后，将晶体平移至新位置，或者如果可能，更换晶体。为了确定结构，使用HKL2000将来自于55个A2AAR晶体的数据集整合、调整比例并合并在一起。使用A2AAR-T4L/ZM结构（PDB编码3EML）的A2AAR部分作为搜索模型，通过Phaser获得最初的分子置换方案。通过在Coot与Refmac5之间重复地循环在过度ΣA加权的2|Fo|-|Fc|密度中手工构建BRIL残基，并使用同样的程序对得到的模型进行进一步精炼直至收敛。

β2AR-Bril结晶条件的进一步优化已鉴定到产生优越的晶体生长和衍射性质的助结晶添加剂（三甲胺N-氧化物）（图3A）。当包含三甲胺N-氧化物时，β2AR-Bril晶体衍射x-射线至的标称分辨率（图3B）。

实施例4带有候选融合伴体的腺苷A2a受体融合伴体蛋白

将一组候选融合伴体各自插入到腺苷A2a受体（“A_2A”，也称为A2A-腺苷受体、ADORA2A、腺苷A_2A受体、A2a）中，并将得到的各A_2A-融合伴体蛋白表达、提取和纯化以测定各种性质。

通过基因合成技术形成各种A_2A-融合伴体构建体，在所述技术中将短的DNA寡聚物通过重叠延伸PCR进行合并。随后将用于A_2A的各种融合伴体亚克隆到我们的标准表达盒组中，所述表达盒在受体的N-端上整合有Flag表位亲和标签，并在受体的C-端整合有10x组氨酸标签。

使用与上述基本上相同的方案将所有蛋白表达、收获并纯化。使用如Invitrogen 

杆状病毒表达系统手册中概述的标准流程产生含有A_2A-融合伴体蛋白表达构建体的重组杆粒DNA。用纯化的杆粒DNA转染草地贪夜蛾（Sf-9）细胞，收获重组病毒并扩增以产生高滴度原种。感染Sf-9细胞并在48小时后收获用于分析。然后从冷冻的全细胞分离总膜级份。通过十二烷基麦芽糖苷（DDM）提取然后在Talon树脂（Clontech）上进行固定化金属亲和层析（IMAC），从膜纯化A_2A-融合伴体蛋白（也称为“A2a受体融合蛋白”）。通过电泳和分析型尺寸排阻层析分析洗脱的蛋白的产率和均质性。选择显示出可接受的高表达水平的A_2A-融合伴体蛋白构建体用于在两种不同配体ZM241385（拮抗剂）和UK-432097（激动剂）存在下在热变性分析（CPM分析）中进一步分析A_2A-融合伴体蛋白。

制备并评估了下列A_2A-融合伴体蛋白：A_2A-BRIL，A_2A-黄素氧还蛋白，A_2A-T4L-Cterm-T4L溶菌酶片段（T4l-Cterm。在图4中也标记为“T4L-frag”），A_2A-红素氧还蛋白，A_2A-木聚糖酶和A_2A-T4L。在表达和纯化后，如图4中所示进行A_2A-融合伴体蛋白的生物物理表征。通过电泳分析洗脱的蛋白的产率和均质性，通过分析型尺寸排阻层析分析单分散性和均质性，并通过热变性测定法分析已知A_2A受体配体的稳定性诱导。

图4A示出了使用具有总蛋白染色的10%SDS-PAGE凝胶对洗脱的纯化A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-T4L-Cterm（“T4L-frag”）、A_2A-红素氧还蛋白、A_2A-木聚糖酶、A_2A-T4L的产率和均质性的分析。图4B示出了通过分析型尺寸排阻层析进行的单分散性和均质性分析，示出了A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-T4L-Cterm（标为“T4L-frag”）、A_2A-红素氧还蛋白、A_2A-木聚糖酶和A_2A-T4L的洗脱的纯化制备物的aSEC的蛋白质水平（280nm处的UV吸收值）。

在进一步的表征中，将A_2A-融合伴体蛋白在40mL培养物中表达，测量表达水平，并估算每种A_2A-融合伴体蛋白的分子量和将其与如下面表2中示出的融合伴体的N端与C端之间的距离（“N-C距离”）相关联。观察到融合伴体具有较短N-C距离、即小于

的构建体显示出相应A_2A-融合伴体蛋白的较低表达水平。

将所选择的显示出可接受的高表达水平的A_2A-融合伴体蛋白构建体在A_2A受体的两种不同配体ZM241385（拮抗剂）和UK-432097（激动剂）存在下，在热变性分析（CPM分析）中进行进一步分析。在有利的性质的基础上选择A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白和A_2A-红素氧还蛋白，并包含A_2A-T4L作为对照。将各种A_2A-融合伴体蛋白纯化，和将各A_2A-融合伴体蛋白的原液与两种配体（ZM241385（拮抗剂）和UK-432097（激动剂））中的各种合并，并在20至90℃之间分析热变性点。各种A_2A-融合伴体蛋白具有代表性热变性点（Tm），其随着所结合的化合物而变。图4C示出了A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-红素氧还蛋白和A_2A-T4L在拮抗剂ZM241285存在下的热变性分析的结果。图4D示出了A_2A-BRIL、A_2A-黄素氧还蛋白、A_2A-红素氧还蛋白和A_2A-T4L在激动剂UK432097存在下的热变性分析的结果。在各种情况下，有利地将至少一种可选融合伴体与A_2A-T4L进行比较，其中,A_2A-BRIL和A_2A-红素氧还蛋白在两种配体条件下与A_2A-T4L相比显示出相当或更好的稳定性。根据这一分析，选择A_2A-BRIL和A_2A-红素氧还蛋白用于大规模表达、纯化和结晶研究。

配体结合和下游信号传导。进行配体结合和下游信号传导分析以测试融合结构域对A2AAR的功能活性的影响。在存在和不存在1M NaCl的情况下，使用激动剂（UK432,097）和拮抗剂（ZM241385）两者进行放射活性配体结合测定。尽管融合结构域对拮抗剂亲和性几乎没有影响，但对于所有A2AAR嵌合体来说，相对于WT A2AAR，激动剂亲和性一致地提高。对于所有嵌合体来说，1M NaCl的存在使激动剂亲和性降低。在两种配体存在下进行cAMP积累分析以测试融合结构域是否抑制下游信号传导（补充图YY）。除了A2AARCtermT4L之外，在激动剂或拮抗剂任一者存在下，各种嵌合体的基础活性显示出很少的反应至无反应。A2AAR-CtermT4L在激动剂存在下能够产生50%的信号传导（将在相应配体存在下由WTA2AAR产生的信号定义为100%）。

热稳定性。由于GPCR的固有柔性，高的热稳定性在它们的结晶中是重要的度量标准。为了测试融合结构域对蛋白质的影响，进行了基于荧光的热稳定性测定。在加热之前，将A2AAR构建体与拮抗剂ZM241385或激动剂UK432,097温育以使受体稳定。当与ZM241385结合时，A2AAR-BRIL、A2AAR-黄素氧还蛋白和A2AAR-红素氧还蛋白都具有彼此几乎一致的热转变温度，比A2AAR-T4L的温度高约6℃。当与UK432,097结合时，A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白显示出相似的热转变温度，而与A2AAR-T4L相比，A2AAR-黄素氧还蛋白的转变温度降低超过10℃。A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白在拮抗剂或激动剂结合构象中提高的热稳定性使它们成为用于结晶试验的有吸引力的候选物，因为多种高度稳定化配体的可用性提高了发现成功的结晶条件的可能性。选择A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白用于进一步结晶研究。

接合优化。当根据最初为T4L的插入而优化的接合部来选择接合部的A2AAR一侧上的界面时，在脂质立方相（LCP）中使用A2AAR-BRIL或A2AAR-红素氧还蛋白的初始结晶试验没有产生任何晶体，其中所述T4L具有与BRIL

和红素氧还蛋白

相比不同的N-和C-端之间的距离

。在所有三种结构域之间，界面处的二级结构也不同：T4L界面由垂直的α-螺旋构成，BRIL由反平行的α-螺旋构成，而红素氧还蛋白由环组成。这些考虑因素导致测试在接合部的A2AAR一侧上添加或移除原始残基以提高蛋白质的热稳定性。鉴定到能够提高A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白两者的稳定性的多个可选接合部。其中，对于A2AAR-BRIL来说最稳定的接合部是在接合部的TM6一侧移除或添加3个残基，这将蛋白质的稳定性提高接近4℃。对于A2AAR-红素氧还蛋白来说，最稳定的接合部是在TM5上添加2个残基或在TM6上移除3个残基，这两者都将蛋白质的稳定性提高接近4℃。

LCP中的蛋白质扩散和结晶。通过高通量LCP-FRAP分析，对与ZM241385复合的热稳定化的A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白构建体进行进一步评估。优先地将蛋白质在N端用Cy3-单NHS酯在pH7.5下进行标记，以最小化对蛋白质核心的干扰。在LCP-FRAP样品制备之前，通过分析型尺寸排阻层析（aSEC）评估所有蛋白质样品的纯度、单分散性和标记效率。通过将蛋白质溶液与熔融油酸单甘油酯以40%（w/w）蛋白质溶液、54%（w/w）油酸单甘油酯、6%（w/w）胆甾醇的最终比例混合将标记的蛋白在LCP中重构，并如前面所介绍的将其与自制掩蔽物温育。根据以前的A2AAR结晶条件，将掩蔽物的pH调整到4、5和6。在所有3种pH中，A2AAR-BRIL和A2AAR-红素氧还蛋白两者在pH5下显示出最适移动分数，其在使用特定沉淀剂时高于70%。我们发现，在整个96孔条件下获得的A2AAR-BRIL的移动分数始终地高于A2AAR-红素氧还蛋白的移动分数，并将A2AAR-BRIL继续用于进一步的结晶试验，焦点在于产生高于70%的移动分数恢复的条件，包括柠檬酸盐、酒石酸盐、硝酸盐和硫氰酸盐。通过NT8-LCP结晶机器人（Formulatrix）在96孔玻璃夹心板（Marienfeld）中进行结晶试验，在各个孔中使用40-50nL含有蛋白的LCP，将其用0.8μL沉淀剂溶液覆盖，并用玻璃盖片密封（Cherezov等，2004；Caffrey&Cherezov，2009）。在25-28%（v/v）PEG400、0.04至0.06M硫氰酸钠、2%（v/v）2,5-己二醇、100mM柠檬酸钠pH5.0中，在7天内获得最佳衍射质量的晶体。晶体生长至60x10x3μm的平均尺寸，并衍射至

A2AAR-BRIL的高分辨率晶体结构在

下解析。

实施例5与b562RIL的腺苷A2a受体融合伴体蛋白偶联物

使用腺苷受体，通过将其第三胞内环用脱辅基细胞色素b562RIL替换，制备了融合伴体-GPCR蛋白偶联物，并获得晶体以允许以1.8埃分辨率阐明其结构。在这里，我们用热稳定化的脱辅基细胞色素b562RIL（BRIL）替换人类A2A腺苷受体（A2AAR）的第三胞内环（ICL3），并以

分辨率测定了与高亲和性亚型选择性拮抗剂ZM241385复合的这种嵌合蛋白（被称为A2AAR-BRIL-ΔC）的晶体结构。

将与ZM241385复合的A2AAR-BRIL-ΔC构建体在富含胆甾醇的类膜的脂质立方相环境中结晶。总体

分辨率的结构与A2AAR-T4L-ΔC/ZM241385（PDB ID3EML；

分辨率）的原始晶体结构接近一致，其所有原子的

比A2AAR高82%，并且与热稳定化的突变体A2AAR/ZM241385（PDB ID3PWH；

）（比A2AAR高84%）的结构接近一致。在A2AAR的所有失活状态结构中丢失的细胞外环2（ECL2）的远端部分被完全解析。靠近BRIL接合位点的螺旋V和VI的胞质末端的构象与具有未修饰的ICL3的A2AAR结构中的构象紧密近似，与A2AAR-T4L-ΔC/ZM241385中由T4L融合引起的扭曲构象相反。

的结构每个受体包括23个有序脂质链和3个胆甾醇。合在一起，它们形成各个蛋白质分子周围的几乎完整脂质双层，从而介导晶体接触。细胞外侧上的脂质具有更强的电子密度，并显得更有序。该结构中的所有3个胆甾醇结合于受体的细胞外部分，并与其他脂质（43至

）相比具有低的B-因子（25至

）。这些胆甾醇中的2个（CLR1和CLR3）结合于对称相关受体，并通过形成面对面的相互作用介导晶格堆积。第三个胆甾醇分子（CLR2）不参与晶体接触。有趣的是，CLR2和CLR3占据沿着螺旋VI的疏水沟，并与夹置在它们之间的Phe2556.57的芳香环形成广泛接触（图3C）。在受体的腺苷家族中，6.57位是保守的，为Ile、Val或Phe：都是能够支持在这种结构中观察到的堆积相互作用类型的疏水残基。此外，CLR2与Ser263的主链羧基形成氢键

并且CLR3（通过Cys259-Cys262二硫键稳定化的环）的羟基与ECL3中Cys259的硫具有极性相互作用

胆甾醇对螺旋VI的该区域的特异性结合和构象稳定化可以通过将Asn2536.55侧链的位置固定在受体的配体结合口袋中而在A2AAR中发挥功能性作用。这个关键残基存在于所有腺苷受体中，并锚定激动剂和拮抗剂复合物两者中配体的中央核的环外胺。

A2AAR-BRIL-ΔC DNA由GenScript合成，其在5’末端具有侧翼限制性位点AscI，在3’末端具有侧翼限制性位点HindIII。根据野生型人A2AAR和被称为BRIL的来自于大肠杆菌的热稳定化的脱辅基细胞色素b562（M7W，H102I，K106L）的序列，该基因包括下列特点：（a）BRIL的残基Ala1至Leu106被插入到A2AAR ICL3区域内Lys209至Gly218之间。（b）A2AAR的C-端残基317-412被截断。被命名为pFastBac1-830400的表达载体是修饰的含有表达盒的pFastBac1载体（Invitrogen），其带有BamHI侧翼的HA信号序列和后面的在N-端的FLAG标签，并在C-端具有10xHis标签。使用标准的基于PCR的定点诱变引入表达盒的成分。表达盒还含有相应的AscI和HindIII限制性位点，从而允许合成的A2AAR-BRIL-ΔC DNA的标准限制性消化和后续连接。

为了进行生物化学表征，使用BamHI和HindIII限制性酶从pFastBac1-830400表达载体消化所有构建体。在消化后，使用内源性限制性位点BamHI和HindIII将插入片段亚克隆到pcDNA3.1（-）中，并验证它们的序列。HEK293细胞在37℃和7%CO₂中在培养基中生长，所述培养基由补充有10%新生牛血清（NCS）、50μg/ml链霉素和50IU/ml青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）组成。将细胞以1:15的比例在平板上每周传代培养两次。使用磷酸钙沉淀方法（40）将细胞用标示的质粒（每种10μg）转染。所有实验在转染后48h进行。

细胞表面受体测量和酶联免疫吸附测定法。转染后24小时，将细胞以每个孔10⁵个细胞的密度拆分到聚D-赖氨酸包被的96孔板中。在另外24h后，在培养基中，在37℃下用小鼠抗FLAG（M2）第一抗体（Sigma，1:1000）标记细胞表面受体30min。然后将细胞用补充有25mM HEPES的DMEM洗涤一次，然后在补充有作为第二抗体的在山羊中产生的辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG（Brunswig）（1:5000）的培养基中，在37℃下温育另外30min。将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次。最后，将细胞与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）在室温下，在暗处温育5min。用1M H₃PO₄终止反应，并在5min后，使用VICTOR2读板器（PerkinElmer LifeSciences）在450nm处读取吸光度。进行不添加第二或第一抗体的对照实验。在两种情况下，没有观察到光吸收。

使用HEK293细胞膜的竞争结合分析。[3H]ZM241385（27.4Ci/mmol）从ARC Inc.（St.Louis,MO,USA）获得。ZM241385和CGS21680从Ascent Scientific（Bristol,UK）获得，而UK432,097从Axon（Groningen,The Netherlands）获得。所有其他材料从商业来源购买并具有可获得的最高纯度。如上所述生长和转染HEK293细胞。如下制备膜。在转染后48h，通过将细胞刮入5ml PBS中将细胞从板上脱离，收集并以700×g（3000r.p.m.）离心5min。将源自于8块板

的沉淀物合并，并重悬浮在8ml冰冷的含有5mMMgCl2的50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4中。使用UltraThurrax来匀浆细胞悬液。通过在Beckman Optima LE-80K超速离心机中在4℃下以100,000×g（31,000r.p.m.）离心20min，将膜与胞浆级份分离。将沉淀物重悬浮在4ml Tris缓冲液中，并重复匀浆和离心步骤。使用Tris缓冲液（2ml）重悬浮沉淀物，并加入腺苷脱胺酶（ADA）（0.8IU/ml）以降解内源性腺苷。将膜以250μL的等份储存在-80℃下。使用BCA（二喹啉甲酸）方法测量膜蛋白浓度。对于竞争结合实验来说，首次将25μg膜用于单点实验，而随后将6至20μg的蛋白质用于具有完整曲线的实验，以确保总结合低于添加的总放射活性的10%，以防止放射性配体耗尽。将膜的等分试样在总体积为100μl的分析缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.4，补充有5mM MgCl₂）中，在25℃温育2h。放射性配体置换实验使用5种浓度的竞争性配体（ZM241385或UK432,097），在不存在和存在1M NaCl的条件下进行。[3H]ZM241385以～4.0nM的浓度使用。非特异性结合在100μM CGS21680存在下测定，并占总结合的不到10%。使用Filtermate-harvester（PerkinElmer Life Sciences），通过96孔GF/B过滤板的快速真空过滤以分离结合和游离的放射性配体来终止温育。随后将滤器用冰冷的清洗缓冲液（50mM Tris HCl，补充有5mMMgCl₂，pH7.4）清洗三次。使用PE1450Microbeta Wallac Trilux闪烁计数器（PerkinElmer Life Sciences）通过闪烁能谱测定法测定滤器结合的放射性。

通过细胞内cAMP测定证明下游信号传导。HEK293T细胞如上所述进行生长和转染。在转染后48h收获细胞，并使用LANCE UltracAMP384试剂盒，按照推荐的方案（PerkinElmer Life Sciences）测定产生的cAMP的量。简短来说，将4000个细胞/孔与单一浓度的UK432,097（30nM，约EC80）（在不存在或存在ZM241385（100nM，约100×Ki）的情况下）或单独的ZM241385（100nM），在刺激缓冲液（PBS，补充有5mM HEPES、0.1%BSA、50μM咯利普兰、50μM西洛酰胺和0.8IU/ml ADA）中，在37℃下预温育30min。随后，按照制造商的说明书添加检测和抗体溶液，然后在室温下在暗处温育1hr。产生的荧光强度在

Multilabel Reader（PerkinElmer,Groningen,Netherlands）上定量。

在Sf9细胞中的受体表达和纯化。使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）获得高滴度重组杆状病毒（>10⁸个病毒颗粒/ml）。简单来说，通过使用3μl FuGENE HD转染试剂（Roche）和转染介质（Expression Systems）将5μg含有靶基因序列的重组杆粒转染到草地贪夜蛾（Sf9）细胞中来产生重组杆状病毒。将细胞悬液在27℃下温育4d，同时振摇。在4d后分离P0病毒原种，并用于产生高滴度杆状病毒原种。在用gp64-PE（Expression Systems）染色细胞后通过流式细胞测定法进行病毒滴度测定（42）。将2-3×10⁶个细胞/ml细胞密度的Sf9细胞用P2病毒以3的MOI（感染复数）感染。在感染后48h通过离心收获细胞，并储存在-80℃下直至使用。通过在含有10mM HEPES（pH7.5）、10mM MgCl₂、20mM KCl和无EDTA的完整蛋白酶抑制剂混合物（Roche）的低渗缓冲液中融化冷冻的细胞沉淀物将昆虫细胞膜破坏。通过在相同的低渗缓冲液（～2-3次）中，然后在含有1.0M NaCl、10mM HEPES（pH7.5）、10mMMgCl₂、20mM KCl的高渗缓冲液（～3-4次）中进行重复的杜恩斯匀浆和离心，对分离的原始膜进行充分清洗以除去可溶性蛋白质和膜结合蛋白质。将纯化的膜重悬浮在10mM HEPES（pH7.5）、10mMMgCl₂、20mM KCl和40%甘油中，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃下直至进一步使用。在溶解之前，将纯化的膜在4mM茶碱（Sigma）、2.0mg/ml碘乙酰胺（Sigma）和无EDTA的完整蛋白酶抑制剂混合物（Roche）存在下在冰上解冻。在4℃下温育30min后，通过在0.5%（w/v）正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷（DDM）（Anatrace）和0.1%（w/v）胆甾醇半琥珀酸酯（CHS）（Sigma）存在下，在4℃下温育2.5-4h来溶解膜。通过以150,000×g离心45min来除去未溶解的材料。将上清液与TALON IMAC树脂（Clontech）在含有50mM HEPES（pH7.5）、800mM NaCl、0.5%（w/v）DDM、0.1%（w/v）CHS和20mM咪唑的缓冲液中温育。在结合过夜后，将树脂用10倍柱体积的50mM HEPES（pH7.5）、800mM NaCl、10%（v/v）甘油、25mM咪唑、0.1%（w/v）DDM、0.02%（w/v）CHS、10mMMgCl₂、8mM ATP（Sigma）和25μM ZM241385（Tocris，被制备成在DMSO中的100mM原液）清洗，然后用4倍柱体积的50mMHEPES（pH7.5）、800mM NaCl、10%（v/v）甘油、50mM咪唑、0.05%（w/v）DDM、0.01%（w/v）CHS和25μM ZM241385清洗。使用最小体积的25mM HEPES（pH7.5）、800mM NaCl、10%（v/v）甘油、220mM咪唑、0.025%（w/v）DDM、0.005%（w/v）CHS和25μM ZM241385来洗脱受体。使用具有100kDa分子量截止值的Vivaspin浓缩器（GE Healthcare）将在ZM241385存在下纯化的受体从～0.4mg/ml浓缩至60mg/ml。随后使用SDS-PAGE和分析型尺寸排阻层析（aSEC）分析受体纯度和单分散性。

结晶。通过使用机械注射器混合器与熔融脂质混合，将与ZM241385复合的A2AAR-BRIL-ΔC的蛋白质样品重构在脂质立方相（LCP）中。蛋白质-LCP混合物含有40%（w/w）蛋白质溶液、54%（w/w）油酸单甘油酯（Sigma）和6%（w/w）胆甾醇（AvantiPolarLipids）。在96孔玻璃夹心板（Marienfeld）中，通过NT8-LCP结晶机器人（Formulatrix）进行结晶试验，在每个孔中使用40-50nl载有蛋白的LCP，然后用0.8μl沉淀剂溶液覆盖，并用玻璃盖片密封。在LCP中的蛋白质重构和结晶试验在室温（～21-23℃）下进行。将结晶板在温箱/成像仪（RockImager1000，Formulatrix）中，在20℃下储存和成像。在25-28%（v/v）PEG400、0.04至0.06M硫氰酸钠、2%（v/v）2,5-己二醇、pH5.0的100mM柠檬酸钠中，在7天内获得平均尺寸为60×10×3μm的衍射质量的晶体。使用50μmMiTeGen显微载片从LCP直接收获晶体，并且不添加额外的冷冻保护剂立即在液氮中快速冷冻。

X-射线数据收集和处理。晶体学数据在Argonne NationalLaboratory处的Advanced Photon Source的23ID-B/D束线（GM/CACAT）上，使用波长为

的10μm准直小射束和MarMosaic300检测器来收集。为了降低辐射损伤，在使用未衰减的射束以3s的暴露时间和0.5°的振荡收集5帧后，将晶体平移至新位置，或者如果可能，更换晶体。使用HKL2000将来自于55个晶体的数据集整合、调整比例并合并在一起。

结构确定和优化。使用A2AAR-T4L-ΔC/ZM结构（PDB ID3EML）的A2AAR结构域作为搜索模型，通过Phaser获得最初的分子置换方案。通过在Coot与Refmac5之间重复地循环在过度ΣA权重的2|Fo|-|Fc|密度中手工建立BRIL残基，并使用同样的程序对得到的模型进行进一步优化直至收敛。对所有胆甾醇观察到的优良的电子密度允许将这种类型的分子与其他结蛋白质合的脂质可靠地区分开，并允许对它们进行可信的定位和定向（图3C、D）。然而，其他脂质的电子密度对于明确地鉴定它们的头基来说不够清晰。因此，除了少数与用于结晶的主要脂质组分油酸单甘油酯（OLC）更好地拟合之外，大多数靠近蛋白质疏水表面的细长电子密度管被建模为油酸（OLA）。数据收集和优化统计示出在表S1中。

表S1.X-射线数据收集和优化统计。

*如MolProbity中所定义。

实施例6.带有候选融合伴体的阿片样受体融合伴体蛋白

将一组候选融合伴体各自插入到阿片样受体1（“NOP1”）中，并将每种得到的NOP1-融合伴体蛋白表达、提取并纯化以确定各种性质。使用NOP1来制备带有融合伴体Bril（BRIL，bRIL）、黄素氧还蛋白、Cterm-T4L、红素氧还蛋白、木聚糖酶和T4L（作为对照）的融合伴体蛋白用于下面描述的研究。

通过基因合成技术制备各种NOP1-融合伴体构建体，其中将短的DNA寡聚物通过重叠延伸PCR进行合并。随后将用于NOP1的各种融合伴体亚克隆到我们的标准表达盒组中，所述表达盒在受体的N-端整合有Flag表位亲和标签并在受体的C-端整合有10x组氨酸标签。

表达结果的初步分析表明，NOP1-黄素氧还蛋白融合伴体蛋白（“NOP1-黄素氧还蛋白”）产生最高的表达水平。NOP1-BRIL具有第二高的表达水平。

使用与上述基本上相同的方案将所有融合蛋白表达、收获并纯化。使用如Invitrogen

杆状病毒表达系统手册中概述的标准方案产生含有NOP1受体融合蛋白表达构建体的重组杆粒DNA。用纯化的杆粒DNA转染草地贪夜蛾（Sf-9）细胞，并收获重组病毒和扩增以产生高滴度原种。感染Sf-9细胞并在48小时后收获用于分析。然后从冷冻的全细胞分离总膜级份。通过十二烷基麦芽糖苷（DDM）提取然后在Talon树脂（Clontech）上进行固定化金属亲和层析（IMAC），从膜纯化NOP1融合伴体蛋白。通过在10%SDS-PAGE凝胶上电泳，利用针对受体N-端上的Flag表位的抗体使用western印迹来分析洗脱的蛋白质的产率和均质性（图6A），并使用分析型尺寸排阻层析（aSEC）来分析单分散性（图6B）。

使用抗FLAG抗体的western印迹对SDS-PAGE凝胶进行的分析及分析型SEC表明作为融合伴体的全长T4L的插入导致与野生型NOP1相比明显更低的构建体（编码NOP1-T4L的构建体）表达以及不良的单分散性，这两者都表明构建体的稳定性较低。相反，NOP1-黄素氧还蛋白和NOP1-bRIL构建体具有明显更高的表达水平（图6A）和改善的单分散性（图6B）。

如图7中所示，将构建体在热变性分析中进行分析以确定热转变温度。全长NOP1-T4L对照与可选融合蛋白NOP1-黄素氧还蛋白和NOP1-bRIL的比较表明黄素氧还蛋白和bRIL可选融合伴体两者具有更高的稳定性（图7A）。不论T4L插入到NOP1中的接合位置如何，全长T4L作为融合伴体表现为相对于野生型使Tm降低10℃（图7B），然而与此相反，NOP1-黄素氧还蛋白和NOP1-bRIL都对转变温度没有不利影响（图7A）。

接合优化。据认为，对融合伴体在第三胞内环的范围内的最适放置的初始估计常常是不理想的，例如当寻求新的受体靶标例如NOP1时。根据初始表达和aSEC结果，选择黄素氧还蛋白作为良好的候选物用于探索受体与融合蛋白之间的接合位点的优化。根据SDS-PAGE分析并结合N-端Flag表位的western印迹，发现最适黄素氧还蛋白定位可以通过通常表示不良稳定性的高分子量低聚物质的消失来检测（图7A）。

实施例7.趋化因子CCR5受体融合伴体蛋白

使用趋化因子受体CCR5与融合伴体Bril（cytB，BRIL，bRIL）、黄素氧还蛋白、Cterm-T4L、红素氧还蛋白、木聚糖酶和T4L（作为对照）来制备融合伴体蛋白用于下面描述的研究。

通过基因合成技术制备各种CCR5-融合伴体构建体，其中将短的DNA寡聚物通过重叠延伸PCR进行合并。随后将用于CCR5的各种融合伴体亚克隆到我们的标准表达盒组中，其在受体的N-端整合有Flag表位亲和标签，并在受体的C-端整合有10x组氨酸标签。

表达结果的初步分析表明，CCR5-红素氧还蛋白和CCR5-Cterm-T4L产生最高的表达水平（图8A）。

使用与上述基本上相同的方案将所有融合蛋白表达、收获并纯化。使用如Invitrogen 

杆状病毒表达系统手册中概述的标准方案产生含有CCR5受体融合蛋白表达构建体的重组杆粒DNA。用纯化的杆粒DNA转染草地贪夜蛾（Sf-9）细胞，并收获和扩增重组病毒以产生高滴度原种。感染Sf-9细胞并在48小时后收获用于分析。然后从冷冻的全细胞分离总膜级份。通过十二烷基麦芽糖苷（DDM）提取然后在Talon树脂（Clontech）上进行固定化金属亲和层析（IMAC）从膜纯化CCR5融合伴体蛋白。通过在10%SDS-PAGE凝胶上电泳，利用针对受体N-端上的Flag表位的抗体使用western印迹来分析洗脱的蛋白质的产率和均质性（图8A），并使用分析型尺寸排阻层析（aSEC）来分析单分散性（图8B）。

利用针对受体N-端上的Flag表位的抗体使用western印迹对SDS-PAGE凝胶进行的分析及分析型SEC表明全长T4L的插入导致与野生型相比明显更低的表达以及不良的单分散性，这两者都表明构建体的稳定性较低。相反，CCR5-红素氧还蛋白和CCR5-cterm-T4L蛋白具有明显更高的表达水平（图8A）和改善的单分散性（图8B）。

实施例8与BRIL偶联的痛敏肽(Nociceptin)/孤啡肽(Orphanin)FQ肽受体融合伴体蛋白

与来自于Banyu化合物-24（C-24）的小分子拮抗剂复合的痛敏肽/孤啡肽FQ（N/OFQ）肽（NOP）受体的晶体结构得到解析，揭示出配体受体识别和选择性的原子细节。C-24模拟NOP选择性肽拮抗剂UFP-101(N/OFQ的近缘衍生物)的前4个N-端残基。将hNOP的N-端用热稳定化的脱辅基细胞色素b562RIL（BRIL）替换，并测定与化合物-24（C-24）复合的这种受体-融合蛋白的X-射线晶体结构。基于C-24赋予受体的热稳定性，选择它与hNOP-BRIL构建体进行共结晶。BRIL-ΔN-hNOP-ΔC融合蛋白也在其他配体存在下成功地结晶。

BRIL-ΔN-hNOP-ΔC。与在脂质立方相（LCP）中生长的膜蛋白一致，BRIL-ΔN-hNOP-ΔC融合蛋白形成分层的I型晶体堆积点阵。由于在P21点阵的不对称单元中具有两个反平行的受体分子，BRIL结构域之一是无序的，而第二个结构域与来自于相邻层的两个受体形成晶格接触。这两个受体的电子密度出色，与已解析的BRIL融合蛋白结构域相比具有低的B-因子（hNOP:A=52.7，hNOP:B=52.3，与此相比）。两个hNOP分子的跨膜（TM）核心与

的CαRMSD几乎相同。

Claims (41)

1.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含G-蛋白偶联受体（GPCR）的一部分的第一结构域，其中所述第一结构域包含所述GPCR的第一至第五跨膜结构域，（ii）包含融合伴体氨基酸序列的第二结构域，其中所述序列与选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白、木聚糖酶或T4溶菌酶C-端片段的蛋白质至少90%同源，以及（iii）包含所述GPCR的一部分的第三结构域，其中所述第三结构域包含所述GPCR的第六和第七跨膜结构域。

2.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含G-蛋白偶联受体（GPCR）的第一结构域，以及（ii）包含融合伴体氨基酸序列的第二结构域，其中所述序列与选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白、木聚糖酶或T4溶菌酶C-端片段的蛋白质至少90%同源。

3.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含融合伴体氨基酸序列的第一结构域，其中所述序列与选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白、木聚糖酶或T4溶菌酶C-端片段的蛋白至少90%同源，以及（ii）包含GPCR的第二结构域。

4.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含G-蛋白偶联受体（GPCR）的一部分的第一结构域，其中所述第一结构域包含所述GPCR的第一至第五跨膜结构域，（ii）包含融合伴体氨基酸序列的第二结构域，其中所述序列与选自2rhf、2ehs、2ip6、3i7m、1x3o、1u84、1h75、2huj、1ysq、3ls0、2qr3、1zuh、2b8i、2cgq、3fxh、3nph、2o4d、1tmy、1vku和2es9的蛋白质至少90%同源，以及（iii）包含所述GPCR的一部分的第三结构域，其中所述第三结构域包含所述GPCR的第六和第七跨膜结构域。

5.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含G-蛋白偶联受体（GPCR）的第一结构域，以及（ii）包含融合伴体氨基酸序列的第二结构域，其中所述序列与选自2rhf、2ehs、2ip6、3i7m、1x3o、1u84、1h75、2huj、1ysq、3ls0、2qr3、1zuh、2b8i、2cgq、3fxh、3nph、2o4d、1tmy、1vku和2es9的蛋白质至少90%同源。

6.一种包含GPCR-融合伴体蛋白的组合物，所述融合蛋白从N-端至C-端包含：（i）包含融合伴体氨基酸序列的第一结构域，其中所述序列与选自2rhf、2ehs、2ip6、3i7m、1x3o、1u84、1h75、2huj、1ysq、3ls0、2qr3、1zuh、2b8i、2cgq、3fxh、3nph、2o4d、1tmy、1vku和2es9的蛋白质至少90%同源，以及（ii）包含GPCR的第二结构域。

7.权利要求1-6的组合物，其中所述GPCR-融合伴体蛋白为晶体形式。

8.权利要求7的组合物，其中所述GPCR-融合伴体蛋白具有足以支持以至少3埃的分辨率进行所述GPCR的x-射线晶体结构测定的质量。

9.权利要求1或4的组合物，其中所述融合伴体基本上包含对应于所述GPCR的第五和第六跨膜结构域之间的GPCR第三胞内结构域的结构域。

10.权利要求1-9的组合物，其中所述融合伴体氨基酸序列与红素氧还蛋白具有至少95%的同源性。

11.权利要求1-9的组合物，其中所述融合伴体氨基酸序列与细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）具有至少95%的同源性。

12.权利要求1-9的组合物，其中所述融合伴体氨基酸序列与黄素氧还蛋白具有至少95%的同源性。

13.权利要求1-9的组合物，其中所述融合伴体氨基酸序列与木聚糖酶具有至少95%的同源性。

14.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是天然存在的GPCR。

15.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是天然存在的GPCR的变体。

16.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是A类GPCR。

17.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是S1P1受体。

18.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是β2-肾上腺素能受体（β2AR）。

19.权利要求1-6的组合物，其中所述融合伴体选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶。

20.权利要求18的组合物，其中所述GPCR-融合伴体蛋白是β2AR-Bril。

21.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是腺苷A2a受体。

22.权利要求21的组合物，其中所述融合伴体选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶。

23.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是NOP1受体。

24.权利要求23的组合物，其中所述融合伴体选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶。

25.权利要求1-9的组合物，其中所述GPCR是CCR5受体。

26.权利要求25的组合物，其中所述融合伴体选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白或木聚糖酶。

27.权利要求1-26的组合物，其中所述组合物还包含三甲胺N-氧化物作为助结晶添加剂。

28.一种使用融合伴体来支持适用于G-蛋白偶联受体（GPCR）的晶体学结构研究的蛋白质结晶的方法，所述方法包括：

（a）将融合伴体合并到所述GPCR的胞内结构域中以形成GPCR-融合伴体蛋白，其中所述融合伴体包含与选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白和木聚糖酶的蛋白质的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列；

（b）表达并纯化所述GPCR-融合伴体蛋白；以及

（c）使所述纯化的GPCR-融合伴体蛋白结晶。

29.一种使用融合伴体来支持适用于G-蛋白偶联受体（GPCR）的晶体学结构研究的蛋白质结晶的方法，所述方法包括：

（a）将融合伴体连接于所述GPCR的N-端或C-端以形成GPCR-融合伴体蛋白，其中所述融合伴体包含与选自红素氧还蛋白、细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）、黄素氧还蛋白和木聚糖酶的蛋白质的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列；

（b）表达并纯化所述GPCR-融合伴体蛋白；以及

（c）使所述纯化的GPCR-融合伴体蛋白结晶。

30.权利要求28-29的方法，其中所述GPCR是A类GPCR。

31.权利要求30的方法，其中所述GPCR选自β2-肾上腺素能受体（β2AR）、A2A-腺苷受体、S1P1受体、OLR1受体或CCR5受体。

32.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体包含红素氧还蛋白的氨基酸序列。

33.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体包含细胞色素b₅₆₂RIL（Bril）的氨基酸序列。

34.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体包含T4溶菌酶C-端片段（Cterm-T4L）的氨基酸序列。

35.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体包含黄素氧还蛋白的氨基酸序列。

36.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体包含木聚糖酶的氨基酸序列。

37.权利要求28-29的方法，其中所述融合伴体被合并到所述GPCR的TM5与TM6区之间的胞内结构域中。

38.权利要求28-37的方法，其中所述方法还包括在助结晶添加剂的存在下进行使所述纯化的GPCR-融合伴体蛋白结晶的步骤。

39.权利要求38的方法，其中所述助结晶添加剂是三甲胺N-氧化物。

40.一种选择用于GPCR蛋白与融合伴体的融合蛋白中的候选融合伴体的方法，其中如此得到的融合蛋白支持衍射质量的晶体的形成，所述方法包括下列步骤：（a）提供具有与蛋白质相关的信息的一个或多个数据库，（b）在这样的一个或多个数据库中搜索满足下列标准的蛋白质：（i）具有相隔不超过

的N和C端；（ii）具有低于25kD的分子量；（iii）已被证实可以以至少

的衍射分辨率结晶；（iv）具有在超过一组化学条件下形成晶体的能力；和（v）具有形成具有超过一种空间群的晶体的能力；以及（c）选择满足标准（i）–（v）的一种或多种蛋白质作为候选融合伴体。

41.权利要求40的方法，其中在步骤（b）中，在所述一个或多个数据库中搜索还满足下列标准的蛋白质：（vi）具有至少50%的α-螺旋含量；和（vii）在N-端或C-端或两端具有α-螺旋结构域；并且在步骤（c）中，选择满足标准（i）–（vii）的候选融合伴体。

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