CN103865951A - 酿酒酵母表达载体及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酿酒酵母表达载体及其构建和应用。所述酿酒酵母表达载体是通过在pYF1274质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的融合基因编码序列构建而成的。通过将该酿酒酵母表达载体转化的酿酒酵母生物法生产丁醇，产量达到1.556g/L，这为通过基因工程手段生产生物丁醇提供了有益的帮助。

Description

酿酒酵母表达载体及其构建和应用

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一种酿酒酵母表达载体及其构建和应用，具体涉及一种含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的酿酒酵母表达载体及其构建，和将此表达载体转化到酿酒酵母中发酵生物法合成丁醇的应用。

背景技术

丁醇是一种重要的有机化工原料，它是多种涂料的溶剂和制造增塑剂和酯类的原料，同时也是继乙醇后的一种极具发展前景的能源物质，有着十分广泛的用途。丁醇和乙醇相似，但丁醇在燃料性能和经济性方面比乙醇有着明显的优势：1）汽油中的主要成分是C₅-C₁₂，因此丁醇与汽油的配伍性更好；2）丁醇具有较高的能量密度，具有较好的燃料经济性；3）丁醇亲水性弱，能与汽油任意比例混合，腐蚀性小，便于管道输送。

目前工业上生产丁醇主要有3种方法：1）羰基合成法；2）醇醛缩合法；3）发酵法。前两种方法属于化学法，是以石油为原料，投资大，技术设备要求高。而微生物发酵法的原料价廉，来源广泛，选择性好，副产物少，安全无污染。随着石油储量的减少和价格持续上涨，加上石油化工造成的环境污染问题，促使人们认识到丁醇发酵的重要性。从长远的利益出发，应用微生物发酵法来获得生物丁醇是最经济、有效、无污染的根本措施。

目前国内外报道的用于微生物发酵产丁醇的宿主菌株多采用拜氏梭（Beijerinckii）和丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）或其突变株。这些菌株呈现出较强的淀粉酶活力，适用于发酵玉米和谷类等淀粉质原料，导致用于发酵的原料成本偏高。此外，由于受到丁醇的毒害作用，这些菌株发酵所获得的丁醇产量和产率低。这也成为制约丁醇生物生产的主要瓶颈所在。

伴随着代谢工程、基因工程技术的迅速发展和C.acetobutylicum ATCC 824基因组测序的完成，构建高转化率，遗传稳定的基因工程菌种生产生物丁醇已成为研究热点。例如通过基因阻断技术，解除代谢过程中存在的产物和中间产物，构建了高丁醇比菌株。此外，许多学者还通过基因工程技术成功将丁醇合成途径导入大肠杆菌、酿酒酵母、短乳杆菌、恶臭假单胞菌和枯草芽孢杆菌等中用于生物丁醇的合成。虽然上述菌株发酵后都能够获得丁醇，证明了由非自然宿主生产丁醇是可行的，但产量都是微量的。所以如何应用基因工程技术，从丁醇合成途径水平上出发，通过切断代谢过程中存在的产物（乙醇和丙酮）和/或组合丁醇合成途径中的关键酶来构建高产丁醇的工程菌种，这对于提高微生物发酵生物丁醇的产量和产率具有重要的理论意义。

由于酿酒酵母作为工业菌株生产乙醇的巨大成功，因而吸引了许多学者通过构建酿酒酵母工程菌株来生产与乙醇仅有两个碳原子差异的生物丁醇。然而目前所报道过的在酿酒酵母中构建不同来源的生物丁醇合成途径的关键基因，工程菌发酵后丁醇的产量最高仅为2.5mg/L。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种酿酒酵母表达载体，即通过选择不同来源于生物法合成丁醇用的6关键酶基因来构建表达载体从而提高酿酒酵母发酵生物法合成丁醇的产量。

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种所述酿酒酵母表达载体的构建方法。

本发明所要解决的技术问题之三在于提供所述酿酒酵母表达载体在生物法合成丁醇过程中的应用。

本发明所述的酿酒酵母表达载体，是在pYF1274质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入生物法合成丁醇用的6关键酶基因的融合基因编码序列，从而构建而成的，命名为pYF 1274-Buta(syn)O。

所述的6关键酶基因的融合基因，是通过口蹄疫病毒2A蛋白（NP_740461，以下简称2A蛋白）将生物法合成丁醇用的6关键酶基因的核苷酸序列串联而形成，串联的具体方式为：EcatoB-2A蛋白-Cahbd-2A蛋白-Cacrt-2A蛋白-Tdter-2A蛋白-CaadhE2-2A蛋白-Cbfdh。

所述的生物法合成丁醇用的6关键酶分别是：⑴大肠杆菌的乙酰辅酶A乙酰转移酶（EcatoB），其核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示；⑵丁醇梭菌的3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（Cahbd），其核苷酸序列如SEQ.ID No.2所示；⑶丁醇梭菌的5-巴豆酸酶（Cacrt），其核苷酸序列如SEQ.ID No.3所示；⑷齿垢密螺旋体菌的反式烯脂酰-CoA还原酶（Tdter），其核苷酸序列如SEQ.ID No.4所示；⑸丁醇梭菌的乙醇脱氢酶E（CaadhE2），其核苷酸序列如SEQ.ID No.5所示；⑹甲基营养酵母的甲酸脱氢酶（Cbfdh），其核苷酸序列如SEQ.ID No.6所示。这6个基因均是采用酿酒酵母偏爱密码进行改造的。

所述的2A蛋白是全部使用酵母偏爱的三联子密码，其核苷酸序列如SEQ.ID No.7所示。

本发明所述的酿酒酵母表达载体的构成方法，包括以下步骤：

1）生物法合成丁醇用的6关键酶基因的合成

按照酿酒酵母偏爱密码合成生物法【Ai-Sheng Xiong，Quan-Hhong Yao，Ri-He Peng，Xian Li，Huiqin Fan，Zong-ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，e98:1～10】分别设计6关键酶基因的引物，引物均为5’端至3’端，进而合成生物法合成丁醇用的6关键酶基因。

2）生物法合成丁醇用的6关键酶基因与口蹄疫病毒2A蛋白的串联

通过连续延伸PCR【上海农业学报，1999，15，11-16】，将口蹄疫病毒2A蛋白与步骤1）所得的6关键酶基因串联形成融合基因Buta(syn)O。

3）酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O的构建

利用BamHI和SacI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将步骤2）中得到的融合基因Buta(syn)O与pYF1274质粒连接。

4）获得酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O

在上述步骤3）之后，通过质粒纯化得到该表达载体。

将上述生物法合成丁醇用的6关键酶基因的酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O转化到酿酒酵母中并通过摇瓶发酵生物法产生丁醇，具体步骤如下：

1）选用醋酸锂法转化酿酒酵母。

2）参照Steen等的方法（E-J.Steen et al.,2008,Microb Cell Fact.,7:36:1-8）摇瓶发酵。

3）参照Steen等的方法（E-J.Steen et al.,2008,Microb Cell Fact.,7:36:1-8）丁醇的气相色谱测定。

附图说明

图1为酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O的构建方式。

图2为不同时间段的丁醇气相色谱图。

图3为不同时间段的丁醇产量图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇（Sigma-Aldrich）公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》-书（J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社）。

实施例1生物法合成丁醇用的6关键酶基因的合成

按照酿酒酵母偏爱密码合成生物法【Ai-Sheng Xiong，Quan-Hhong Yao，Ri-He Peng，Xian Li，Huiqin Fan，Zong-ming Cheng and Yi Li，Nucleic Acid Research，2004，32(12)，e98:1～10】分别设计引物合成6关键酶基因，其中引物均为5’端至3’端，合成丁醇用的6关键酶基因。

⑴乙酰辅酶A乙酰转移酶（EcatoB）的合成引物

1.ATOB-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,AAA,AAC,TGT,GTC,ATC,GTC,TCT,GCT,GTT,CGT,ACT,GCT,ATC,GGT,TCT,TTC,AAC

2.ATOB-2:Tm=54,60mer

TAG,CAC,CCA,GGT,CGA,TGG,CAG,AGG,TAG,AAG,CGA,GAG,AAC,CGT,TGA,AAG,AAC,CGA,TAG,CAG

3.ATOB-3:Tm=54,60mer

TGC,CAT,CGA,CCT,GGG,TGC,TAC,CGT,CAT,CAA,GGC,TGC,CAT,CGA,GCG,TGC,AAA,GAT,CGA,CTC

4.ATOB-4:Tm=54,60mer

TTG,CAG,GAC,GTT,ACC,CAT,GAT,GAC,TTC,GTC,AAC,GTG,CTG,AGA,GTC,GAT,CTT,TGC,ACG,CTC

5.ATOB-5:Tm=54,60mer

TCA,TGG,GTA,ACG,TCC,TGC,AAG,CTG,GTC,TGG,GTC,AGA,ACC,CTG,CTC,GTC,AGG,CAC,TGT,TGA

6.ATOB-6:Tm=54,60mer

TTG,ACG,GTG,AAG,CCA,CAG,ACG,GTT,TCT,GCC,AGA,CCA,GAC,TTC,AAC,AGT,GCC,TGA,CGA,GCA

7.ATOB-7:Tm=54,60mer

GTC,TGT,GGC,TTC,ACC,GTC,AAC,AAG,GTC,TGT,GGT,TCT,GGT,CTC,AAG,TCT,GTT,GCA,CTT,GCT

8.ATOB-8:Tm=54,60mer

CAA,CGA,TAG,ACT,GAG,CCT,GAC,CTG,CCT,GGA,TAG,CCT,GAG,CAG,CAA,GTG,CAA,CAG,ACT,TGA

9.ATOB-9:Tm=54,60mer

TCA,GGC,TCA,GTC,TAT,CGT,TGC,TGG,TGG,TAT,GGA,GAA,CAT,GTC,TCT,TGC,TCC,ATA,CTT,GCT

10.ATOB-10:Tm=54,60mer

ACC,ATC,ACC,AAG,ACG,GTA,GCC,AGA,ACG,TGC,CTT,TGC,GTC,GAG,CAA,GTA,TGG,AGC,AAG,AGA

11.ATOB-11:Tm=54,60mer

GCT,ACC,GTC,TTG,GTG,ATG,GTC,AGG,TCT,ACG,ACG,TCA,TCC,TGC,GTG,ACG,GTC,TGA,TGT,GTG

12.ATOB-12:Tm=54,60mer

ACG,TTC,TCA,GCA,GTG,ATA,CCC,ATG,TGG,TAG,CCA,TGA,GTA,GCA,CAC,ATC,AGA,CCG,TCA,CGC

13.ATOB-13:Tm=54,60mer

GGT,ATC,ACT,GCT,GAG,AAC,GTC,GCT,AAG,GAG,TAC,GGT,ATC,ACT,CGT,GAG,ATG,CAG,GAT,GAA

14.ATOB-14:Tm=54,60mer

CAA,TTG,CAG,CAG,CAG,CCT,TAC,GCT,GAG,AGT,GGA,GTG,CAA,GTT,CAT,CCT,GCA,TCT,CAC,GAG

15.ATOB-15:Tm=54,60mer

TAA,GGC,TGC,TGC,TGC,AAT,TGA,GTC,TGG,TGC,ATT,CAC,TGC,CGA,GAT,CGT,TCC,TGT,CAA,CGT

16.ATOB-16:Tm=54,60mer

CTC,ATC,CTG,AGA,GAA,GAC,GAA,GGT,CTT,CTT,ACG,AGT,GAC,GAC,GTT,GAC,AGG,AAC,GAT,CTC

17.ATOB-17:Tm=54,60mer

TCG,TCT,TCT,CTC,AGG,ATG,AGT,TCC,CAA,AGG,CTA,ACT,CCA,CTG,CTG,AAG,CAC,TTG,GTG,CAT

18.ATOB-18:Tm=54,60mer

CCA,GCA,GTG,ACA,GTG,CCT,GCC,TTG,TCG,AAG,GCA,GGA,CGC,AAT,GCA,CCA,AGT,GCT,TCA,GCA

19.ATOB-19:Tm=54,60mer

GCA,GGC,ACT,GTC,ACT,GCT,GGT,AAC,GCT,TCT,GGC,ATC,AAC,GAT,GGT,GCT,GCT,GCT,CTC,GTC

20.ATOB-20:Tm=54,60mer

GAG,TGA,GAC,CTG,CTG,CCA,GTG,CAG,CAG,ATT,CTT,CCA,TGA,TGA,CGA,GAG,CAG,CAG,CAC,CAT

21.ATOB-21:Tm=54,60mer

ACT,GGC,AGC,AGG,TCT,CAC,TCC,ACT,TGC,TCG,TAT,CAA,GTC,CTA,TGC,CTC,TGG,TGG,TGT,TCC

22.ATOB-22:Tm=54,60mer

CTG,GGT,GGC,AGG,AAC,TGG,ACC,CAT,ACC,CAT,CAG,TGC,TGG,TGG,AAC,ACC,ACC,AGA,GGC,ATA

23.ATOB-23:Tm=54,56mer

GTC,AGC,AAG,CTG,GAG,ACC,AGC,AAG,CTG,CAA,TGC,CTT,CTG,GGT,GGC,AGG,AAC,TGG,AC

⑵3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（Cahbd）的合成引物

1.CAHBD-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,AAG,AAG,GTC,TGT,GTC,ATT,GGT,GCA,GGT,ACT,ATG,GGT,TCT,GGC,ATT,GCT,CAG

2.CAHBD-2:Tm=54,60mer

GAC,GAC,CTC,GAA,TCC,CTT,AGC,TGC,GAA,TGC,CTG,AGC,AAT,GCC,AGA,ACC,CAT,AGT,ACC,TGC

3.CAHBD-3:Tm=54,60mer

GCA,TTC,GCA,GCT,AAG,GGA,TTC,GAG,GTC,GTC,CTT,CGT,GAC,ATC,AAG,GAC,GAG,TTC,GTT,GAT

4.CAHBD-4:Tm=54,60mer

CAG,GTT,CTT,GTT,GAT,GAA,GTC,CAA,GCC,ACG,ATC,AAC,GAA,CTC,GTC,CTT,GAT,GTC,ACG,AAG

5.CAHBD-5:Tm=54,60mer

CGT,GGC,TTG,GAC,TTC,ATC,AAC,AAG,AAC,CTG,TCC,AAG,TTG,GTC,AAG,AAG,GGA,AAG,ATC,GAG

6.CAHBD-6:Tm=54,60mer

ACG,AGT,CAG,GAT,CTC,GAC,CTT,GGT,AGC,TTC,CTC,GAT,CTT,TCC,CTT,CTT,GAC,CAA,CTT,GGA

7.CAHBD-7:Tm=54,60mer

GAA,GCT,ACC,AAG,GTC,GAG,ATC,CTG,ACT,CGT,ATC,TCT,GGA,ACC,GTT,GAT,CTG,AAC,ATG,GCA

8.CAHBD-8:Tm=54,60mer

AGC,TGC,TTC,GAT,GAC,CAA,GTC,GCA,GTC,AGC,TGC,CAT,GTT,CAG,ATC,AAC,GGT,TCC,AGA,GAT

9.CAHBD-9:Tm=54,60mer

GCT,GAC,TGC,GAC,TTG,GTC,ATC,GAA,GCA,GCT,GTC,GAG,CGT,ATG,GAC,ATC,AAG,AAG,CAA,ATC

10.CAHBD-10:Tm=54,60mer

TGG,CTT,GCA,GAT,GTT,GTC,CAA,GTC,AGC,GAA,GAT,TTG,CTT,CTT,GAT,GTC,CAT,ACG,CTC,GAC

11.CAHBD-11:Tm=54,60mer

TTC,GCT,GAC,TTG,GAC,AAC,ATC,TGC,AAG,CCA,GAG,ACC,ATC,CTC,GCA,TCC,AAC,ACC,TCC,TCC

12.CAHBD-12:Tm=54,60mer

GGT,TGC,AGA,TGC,GAC,TTC,GGT,GAT,GGA,GAG,GGA,GGA,GGT,GTT,GGA,TGC,GAG,GAT,GGT,CTC

13.CAHBD-13:Tm=54,60mer

CTC,TCC,ATC,ACC,GAA,GTC,GCA,TCT,GCA,ACC,AAG,ACC,AAC,GAC,AAG,GTC,ATC,GGT,ATG,CAC

14.CAHBD-14:Tm=54,60mer

GAG,CTT,CAT,GAC,AGG,TGC,TGG,ATT,GAA,GAA,GTG,CAT,ACC,GAT,GAC,CTT,GTC,GTT,GGT,CTT

15.CAHBD-15:Tm=54,60mer

TTC,TTC,AAT,CCA,GCA,CCT,GTC,ATG,AAG,CTC,GTC,GAG,GTC,ATC,CGT,GGA,ATC,GCT,ACC,TCC

16.CAHBD-16:Tm=54,60mer

GGT,CTC,CTT,GAC,TGC,ATC,GAA,GGT,CTC,TTG,GGA,GGT,AGC,GAT,TCC,ACG,GAT,GAC,CTC,GAC

17.CAHBD-17:Tm=54,60mer

CAA,GAG,ACC,TTC,GAT,GCA,GTC,AAG,GAG,ACC,TCC,ATC,GCA,ATT,GGC,AAG,GAC,CCT,GTC,GAA

18.CAHBD-18:Tm=54,60mer

GTT,GAC,GAC,GAA,GCC,AGG,TGC,TTC,TGC,GAC,TTC,GAC,AGG,GTC,CTT,GCC,AAT,TGC,GAT,GGA

19.CAHBD-19:Tm=54,60mer

GTC,GCA,GAA,GCA,CCT,GGC,TTC,GTC,GTC,AAC,CGT,ATC,CTG,ATC,CCA,ATG,ATC,AAC,GAA,GCA

20.CAHBD-20:Tm=54,60mer

GGA,TGC,GAT,GCC,TTC,TGC,CAA,GAT,ACC,GAC,TGC,TTC,GTT,GAT,CAT,TGG,GAT,CAG,GAT,ACG

21.CAHBD-21:Tm=54,60mer

GTC,GGT,ATC,TTG,GCA,GAA,GGC,ATC,GCA,TCC,GTC,GAA,GAC,ATC,GAC,AAG,GCT,ATG,AAG,CTC

22.CAHBD-22:Tm=54,60mer

CTC,CAA,TGG,ACC,CAT,AGG,ATG,GTT,AGC,ACC,GAG,CTT,CAT,AGC,CTT,GTC,GAT,GTC,TTC,GAC

23.CAHBD-23:Tm=54,60mer

GGT,GCT,AAC,CAT,CCT,ATG,GGT,CCA,TTG,GAG,TTG,GGT,GAC,TTC,ATC,GGT,CTT,GAC,ATC,TGC

24.CAHBD-24:Tm=54,60mer

CTC,AGA,GTA,CAA,GAC,GTC,CAT,GAT,AGC,GAG,GCA,GAT,GTC,AAG,ACC,GAT,GAA,GTC,ACC,CAA

25.CAHBD-25:Tm=54,60mer

CTC,GCT,ATC,ATG,GAC,GTC,TTG,TAC,TCT,GAG,ACT,GGA,GAC,TCC,AAG,TAC,CGT,CCA,CAC,ACC

26.CAHBD-26:Tm=54,60mer

CCA,ACC,TGC,ACG,AAC,GTA,CTT,CTT,GAG,CAA,GGT,GTG,TGG,ACG,GTA,CTT,GGA,GTC,TCC,AGT

27.CAHBD-27:Tm=54,60mer

TTG,CTC,AAG,AAG,TAC,GTT,CGT,GCA,GGT,TGG,CTT,GGT,CGT,AAG,TCT,GGC,AAG,GGT,TTC,TAC

28.CAHBD-28:Tm=54,60mer

GAG,CTC,TTA,CTT,GGA,GTA,GTC,GTA,GAA,ACC,CTT,GCC,AGA,CTT,ACG,ACC,AAG,CCA,ACC,TGC

29.CAHBD-29:Tm=54,60mer

GCA,GGT,TGG,CTT,GGT,CGT,AAG,TCT,GGC,AAG,GGT,TTC,TAC,GAC,TAC,TCC,AAG,TAA,GAG,CTC

30.CAHBD-30:Tm=54,60mer

GAG,CTC,TTA,CTT,GGA,GTA,GTC,GTA,GAA,ACC,CTT,GCC,AGA,CTT,ACG,ACC,AAG,CCA,ACC,TGC

⑶5-巴豆酸酶（Cacrt）的合成引物

1.CRT-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,GAA,CTC,AAC,AAC,GTC,ATC,CTG,GAG,AAG,GAA,GGC,AAA,GTT,GCT,GTC,GTC,ACC

2.CRT-2:Tm=54,60mer

CAG,TGC,GTT,CAA,TGC,CTT,AGG,ACG,GTT,GAT,GGT,GAC,GAC,AGC,AAC,TTT,GCC,TTC,CTT,CTC

3.CRT-3:Tm=54,60mer

ATC,AAC,CGT,CCT,AAG,GCA,TTG,AAC,GCA,CTG,AAC,TCT,GAC,ACC,CTC,AAG,GAG,ATG,GAC,TAC

4.CRT-4:Tm=54,60mer

TTC,AGA,GTC,ATT,CTC,GAT,CTC,GCC,AAT,GAC,GTA,GTC,CAT,CTC,CTT,GAG,GGT,GTC,AGA,GTT

5.CRT-5:Tm=54,60mer

GTC,ATT,GGC,GAG,ATC,GAG,AAT,GAC,TCT,GAA,GTC,CTG,GCA,GTC,ATT,CTC,ACT,GGT,GCA,GGT

6.CRT-6:Tm=54,60mer

GAT,GTC,TGC,ACC,TGC,AAC,GAA,GGA,CTT,CTC,ACC,TGC,ACC,AGT,GAG,AAT,GAC,TGC,CAG,GAC

7.CRT-7:Tm=54,60mer

GAG,AAG,TCC,TTC,GTT,GCA,GGT,GCA,GAC,ATC,TCT,GAG,ATG,AAG,GAG,ATG,AAC,ACC,ATC,GAA

8.CRT-8:Tm=54,60mer

CTT,GTT,GCC,AAG,GAT,ACC,GAA,CTT,ACG,ACC,TTC,GAT,GGT,GTT,CAT,CTC,CTT,CAT,CTC,AGA

9.CRT-9:Tm=54,60me

GGT,CGT,AAG,TTC,GGT,ATC,CTT,GGC,AAC,AAG,GTC,TTC,CGT,CGT,TTG,GAA,CTC,CTG,GAG,AAG

10.CRT-10:Tm=54,60mer

TGC,GAA,GCC,ATT,GAC,AGC,TGC,GAT,GAC,AGG,CTT,CTC,CAG,GAG,TTC,CAA,ACG,ACG,GAA,GAC

11.CRT-11:Tm=54,60mer

CCT,GTC,ATC,GCA,GCT,GTC,AAT,GGC,TTC,GCA,CTG,GGA,GGT,GGA,TGT,GAG,ATC,GCT,ATG,TCC

12.CRT-12:Tm=54,60mer

TGC,GTT,GGA,GGA,AGC,GAT,ACG,GAT,GTC,GCA,GGA,CAT,AGC,GAT,CTC,ACA,TCC,ACC,TCC,CAG

13.CRT-13:Tm=54,60mer

TGC,GAC,ATC,CGT,ATC,GCT,TCC,TCC,AAC,GCA,CGT,TTC,GGT,CAA,CCA,GAA,GTT,GGT,CTC,GGA

14.CRT-14:Tm=54,60mer

ACG,CTG,AGT,GCC,ACC,AAA,GCC,AGG,AGT,GAT,TCC,GAG,ACC,AAC,TTC,TGG,TTG,ACC,GAA,ACG

15.CRT-15:Tm=54,60mer

ATC,ACT,CCT,GGC,TTT,GGT,GGC,ACT,CAG,CGT,CTC,TCT,CGT,TTG,GTT,GGC,ATG,GGT,ATG,GCA

16.CRT-16:Tm=54,60mer

GAT,GTT,CTG,TGC,AGT,GAA,GAT,CAG,CTG,CTT,TGC,CAT,ACC,CAT,GCC,AAC,CAA,ACG,AGA,GAG

17.CRT-17:Tm=54,60mer

AAG,CAG,CTG,ATC,TTC,ACT,GCA,CAG,AAC,ATC,AGG,CAG,ACG,AAG,CAT,TGC,GTA,TCG,GTC,TTC

18.CRT-18:Tm=54,60mer

CAA,CTC,AGA,AGG,TTC,GAC,GAC,CTT,GTT,GAC,AAG,ACC,GAT,ACG,CAA,TGC,TTC,GTC,TGC,CTT

19.CRT-19:Tm=54,60mer

GTC,AAC,AAG,GTC,GTC,GAA,CCT,TCT,GAG,TTG,ATG,AAC,ACT,GCA,AAG,GAG,ATC,GCA,AAC,AAG

20.CRT-20:Tm=54,60mer

CTT,GAC,AGC,GAC,TGG,TGC,ATT,GGA,GAC,GAT,CTT,GTT,TGC,GAT,CTC,CTT,TGC,AGT,GTT,CAT

21.CRT-21:Tm=54,60mer

ATC,GTC,TCC,AAT,GCA,CCA,GTC,GCT,GTC,AAG,TTG,TCC,AAA,CAG,GCT,ATC,AAT,CGT,GGT,ATG

22.CRT-22:Tm=54,60mer

GAA,TGC,CAA,TGC,AGT,GTC,GAT,GTC,ACA,CTG,CAT,ACC,ACG,ATT,GAT,AGC,CTG,TTT,GGA,CAA

23.CRT-23:Tm=54,60mer

CAG,TGT,GAC,ATC,GAC,ACT,GCA,TTG,GCA,TTC,GAG,TCT,GAA,GCA,TTC,GGC,GAA,TGC,TTC,TCC

24.CRT-24:Tm=54,60mer

AGC,AGT,CAT,TGC,ATC,CTT,CTG,ATC,CTC,AGT,GGA,GAA,GCA,TTC,GCC,GAA,TGC,TTC,AGA,CTC

25.CRT-25:Tm=54,60mer

ACT,GAG,GAT,CAG,AAG,GAT,GCA,ATG,ACT,GCT,TTC,ATC,GAG,AAG,CGT,AAG,ATT,GAA,GGC,TTC

26.CRT-26:Tm=54,60mer

GAG,CTC,TTA,ACG,GTT,CTT,GAA,GCC,TTC,AAT,CTT,ACG,CTT,CTC,GAT,GAA,AGC,AGT,CAT,TGC

27.CRT-27:Tm=54,60mer

GCA,ATG,ACT,GCT,TTC,ATC,GAG,AAG,CGT,AAG,ATT,GAA,GGC,TTC,AAG,AAC,CGT,TAA,GAG,CTC

28.CRT-28:Tm=54,60mer

GAG,CTC,TTA,ACG,GTT,CTT,GAA,GCC,TTC,AAT,CTT,ACG,CTT,CTC,GAT,GAA,AGC,AGT,CAT,TGC

⑷反式烯脂酰-CoA还原酶（Tdter）的合成引物

1.TER-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,ATT,GTC,AAG,CCA,ATG,GTT,CGT,AAC,AAC,ATC,TGC,CTG,AAC,GCT,CAT,CCA,CAA

2.TER-2:Tm=54,60mer

TGG,TGT,ACT,CGA,TCT,GGT,CCT,CAA,CAC,CCT,TCT,TGC,AGC,CTT,GTG,GAT,GAG,CGT,TCA,GGC

3.TER-3:Tm=54,60mer

GGA,CCA,GAT,CGA,GTA,CAC,CAA,GAA,GCG,TAT,CAC,CGC,TGA,GGT,CAA,AGC,TGG,TGC,AAA,GGC

4.TER-4:Tm=54,60mer

ATA,ACC,GTT,GGA,ACA,ACC,GAG,GAC,GAG,GAC,GTT,CTT,AGG,TGC,CTT,TGC,ACC,AGC,TTT,GAC

5.TER-5:Tm=54,60mer

TCG,GTT,GTT,CCA,ACG,GTT,ATG,GTC,TCG,CAT,CTC,GTA,TCA,CTG,CTG,CAT,TCG,GCT,ATG,GTG

6.TER-6:Tm=54,60mer

TCA,GAG,CCA,GCT,TTC,TCG,AAG,GAG,ACA,CCG,ATA,GTG,GCA,GCA,CCA,TAG,CCG,AAT,GCA,GCA

7.TER-7:Tm=54,60mer

TTC,GAG,AAA,GCT,GGC,TCT,GAG,ACC,AAG,TAT,GGC,ACT,CCT,GGC,TGG,TAC,AAC,AAC,CTT,GCC

8.TER-8:Tm=54,60mer

TGA,CGG,AGT,ACA,GAC,CTT,CAC,GCT,TGG,CAG,CCT,CAT,CGA,AGG,CAA,GGT,TGT,TGT,ACC,AGC

9.TER-9:Tm=54,60mer

TGA,AGG,TCT,GTA,CTC,CGT,CAC,CAT,CGA,TGG,TGA,TGC,CTT,CTC,TGA,CGA,GAT,CAA,GGC,ACA

10.TER-10:Tm=54,60mer

GTC,GAA,CTT,GAT,GCC,TTT,CTT,CTT,GGC,TTC,CTC,GAT,GAC,TTG,TGC,CTT,GAT,CTC,GTC,AGA

11.TER-11:Tm=54,60mer

AGA,AAG,GCA,TCA,AGT,TCG,ACC,TGA,TCG,TCT,ACT,CTT,TGG,CAT,CTC,CTG,TCC,GTA,CCG,ATC

12.TER-12:Tm=54,60mer

AAT,GGT,TTC,AAG,ACG,GAC,TTG,TGC,ATG,ATG,CCA,GTA,TCA,GGA,TCG,GTA,CGG,ACA,GGA,GAT

13.TER-13:Tm=54,60mer

AAG,TCC,GTC,TTG,AAA,CCA,TTC,GGT,AAG,ACC,TTC,ACT,GGC,AAG,ACC,GTC,GAT,CCA,TTC,ACT

14.TER-14:Tm=54,60mer

CAT,CGT,TTG,CAG,GTT,CAG,CAG,AGA,TTT,CTT,TCA,GTT,CAC,CAG,TGA,ATG,GAT,CGA,CGG,TCT

15.TER-15:Tm=54,60mer

TGC,TGA,ACC,TGC,AAA,CGA,TGA,AGA,AGC,TGC,TGC,AAC,CGT,CAA,GGT,CAT,GGG,TGG,TGA,AGA

16.TER-16:Tm=54,60mer

CAG,ACC,TTC,TTT,GGA,GAG,CTG,CTT,GAT,CCA,ACG,TTC,CCA,GTC,TTC,ACC,ACC,CAT,GAC,CTT

17.TER-17:Tm=54,60mer

AGC,TCT,CCA,AAG,AAG,GTC,TGT,TGG,AAG,AAG,GCT,GCA,TCA,CCC,TTG,CCT,ACT,CTT,ACA,TTG

18.TER-18:Tm=54,60mer

ATA,GTA,CCC,TTA,CGG,TAG,AGT,GCT,TGA,GTA,GCC,TCA,GGA,CCA,ATG,TAA,GAG,TAG,GCA,AGG

19.TER-19:Tm=54,60mer

CTC,TAC,CGT,AAG,GGT,ACT,ATC,GGT,AAG,GCA,AAG,GAA,CAC,CTG,GAA,GCA,ACT,GCA,CAC,CGT

20.TER-20:Tm=54,60mer

CAG,AGA,CGA,ATG,CAC,GGA,TGG,ATG,GGT,TCT,CCT,TGT,TGA,GAC,GGT,GTG,CAG,TTG,CTT,CCA

21.TER-21:Tm=54,60mer

CAT,CCG,TGC,ATT,CGT,CTC,TGT,CAA,CAA,GGG,CTT,GGT,CAC,TCG,TGC,ATC,TGC,TGT,CAT,CCC

22.TER-22:Tm=54,60mer

CAT,GAC,CTT,GAA,CAG,GGA,TGC,GAG,GTA,CAG,TGG,AAT,GAC,AGG,GAT,GAC,AGC,AGA,TGC,ACG

23.TER-23:Tm=54,56mer

CTG,CTC,GAT,GCA,GCC,TTC,ATG,GTT,GCC,CTT,CTC,CTT,CAT,GAC,CTT,GAA,CAG,GGA,TG

⑸乙醇脱氢酶E（CaadhE2）的合成引物

1.DHE2-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,AAG,GTC,ACT,AAC,CAG,AAG,GAA,CTC,AAG,CAG,AAG,CTC,AAC,GAG,CTG,CGT,GAA

2.DHE2-2:Tm=54,60mer

CAA,CTT,GCT,CCT,GGG,TGT,AGG,TTG,CGA,ACT,TCT,TCT,GTG,CTT,CAC,GCA,GCT,CGT,TGA,GCT

3.DHE2-3:Tm=54,60mer

CTA,CAC,CCA,GGA,GCA,AGT,TGA,CAA,AAT,CTT,CAA,GCA,GTG,TGC,AAT,TGC,TGC,TGC,TAA,GGA

4.DHE2-4:Tm=54,60mer

GCC,AGT,CTC,TTC,GAC,TGC,CAA,CTT,AGC,CAA,GTT,GAT,ACG,TTC,CTT,AGC,AGC,AGC,AAT,TGC

5.DHE2-5:Tm=54,60mer

TGG,CAG,TCG,AAG,AGA,CTG,GCA,TCG,GTC,TCG,TCG,AAG,ACA,AGA,TCA,TCA,AGA,ACC,ACT,TCG

6.DHE2-6:Tm=54,60mer

GTC,TTC,TCG,TTC,TTG,TAC,TTG,TTG,TAG,ATG,TAC,TCT,GCT,GCG,AAG,TGG,TTC,TTG,ATG,ATC

7.DHE2-7:Tm=54,60mer

AAG,TAC,AAG,AAC,GAG,AAG,ACC,TGT,GGC,ATC,ATC,GAT,CAT,GAC,GAC,TCT,CTT,GGC,ATC,ACC

8.DHE2-8:Tm=54,60mer

GGA,CGA,TGG,CTG,CGA,CGA,TTC,CGA,TTG,GTT,CAG,CAA,CCT,TGG,TGA,TGC,CAA,GAG,AGT,CGT

9.DHE2-9:Tm=54,60mer

AAT,CGT,CGC,AGC,CAT,CGT,CCC,TAC,CAC,CAA,CCC,AAC,CTC,CAC,CGC,AAT,CTT,CAA,GTC,CTT

10.DHE2-10:Tm=54,60mer

TGG,AGA,GAA,GAA,GAT,TGC,GTT,ACG,AGT,CTT,CAA,GGA,GAT,CAA,GGA,CTT,GAA,GAT,TGC,GGT

11.DHE2-11:Tm=54,60mer

ACG,CAA,TCT,TCT,TCT,CTC,CAC,ATC,CAC,GTG,CAA,AGA,AGT,CCA,CCA,TCG,CTG,CTG,CCA,AGT

12.DHE2-12:Tm=54,60mer

TTC,TTA,GGT,GCA,CCT,GCT,TTG,ACA,GCT,GCG,TCC,AAG,ATC,AAC,TTG,GCA,GCA,GCG,ATG,GTG

13.DHE2-13:Tm=54,60mer

AAA,GCA,GGT,GCA,CCT,AAG,AAC,ATC,ATC,GGT,TGG,ATC,GAC,GAG,CCA,TCC,ATC,GAA,CTG,TCT

14.DHE2-14:Tm=54,60mer

CAG,TTG,CCA,AGA,TGA,TGT,CAG,CTT,CAG,ACA,TCA,GAT,CCT,GAG,ACA,GTT,CGA,TGG,ATG,GCT

15.DHE2-15:Tm=54,60mer

TGA,CAT,CAT,CTT,GGC,AAC,TGG,TGG,TCC,ATC,TAT,GGT,CAA,AGC,TGC,CTA,CTC,CTC,TGG,CAA

16.DHE2-16:Tm=54,60mer

GAT,TGC,AGG,AGT,GTT,GCC,TGC,ACC,GAC,ACC,GAT,TGC,AGG,TTT,GCC,AGA,GGA,GTA,GGC,AGC

17.DHE2-17:Tm=54,60mer

CAG,GCA,ACA,CTC,CTG,CAA,TCA,TCG,ACG,AGT,CTG,CTG,ACA,TCG,ACA,TGG,CAG,TCT,CTT,CCA

18.DHE2-18:Tm=54,60mer

GCA,CAG,ATG,ACA,CCG,TTG,TCG,TAG,GTC,TTG,GAC,AAG,ATG,ATG,GAA,GAG,ACT,GCC,ATG,TCG

19.DHE2-19:Tm=54,60mer

GAC,AAC,GGT,GTC,ATC,TGT,GCA,TCT,GAG,CAG,TCC,ATC,TTG,GTC,ATG,AAC,TCC,ATC,TAC,GAG

20.DHE2-20:Tm=54,60mer

GGA,TGT,AGG,AAC,CAC,GTT,TGA,CGA,ACT,CCT,CCT,TGA,CCT,TCT,CGT,AGA,TGG,AGT,TCA,TGA

21.DHE2-21:Tm=54,60mer

CAA,ACG,TGG,TTC,CTA,CAT,CCT,GAA,CCA,GAA,CGA,GAT,CGC,TAA,GAT,CAA,GGA,GAC,CAT,GTT

22.DHE2-22:Tm=54,60mer

AGA,CTT,GCC,AAC,GAT,GTC,AGC,GTT,GAT,GGC,ACC,ATT,CTT,GAA,CAT,GGT,CTC,CTT,GAT,CTT

23.DHE2-23:Tm=54,60mer

CTG,ACA,TCG,TTG,GCA,AGT,CTG,CTT,ACA,TCA,TCG,CTA,AGA,TGG,CTG,GCA,TCG,AAG,TCC,CTC

24.DHE2-24:Tm=54,60mer

TCA,ACA,GAC,TGG,ACT,TCA,CCA,ATC,AGG,ATC,TTG,GTG,GTC,TGA,GGG,ACT,TCG,ATG,CCA,GCC

25.DHE2-25:Tm=54,60mer

GGT,GAA,GTC,CAG,TCT,GTT,GAG,AAG,TCT,GAA,CTC,TTC,TCC,CAC,GAG,AAG,CTC,TCT,CCA,GTC

26.DHE2-26:Tm=54,60mer

TGA,GTG,CTT,CGT,CGA,AGT,CCT,TGA,CCT,TGT,ACA,TTG,CAA,GGA,CTG,GAG,AGA,GCT,TCT,CGT

27.DHE2-27:Tm=54,60mer

GGA,CTT,CGA,CGA,AGC,ACT,CAA,GAA,GGC,ACA,GCG,TCT,CAT,CGA,GTT,GGG,TGG,CTC,TGG,CCA

28.DHE2-28:Tm=54,60mer

GTC,CTT,GTT,GTT,CTG,AGA,GTC,GAT,GTA,CAA,AGA,GGA,GGT,GTG,GCC,AGA,GCC,ACC,CAA,CTC

29.DHE2-29:Tm=54,60mer

ACT,CTC,AGA,ACA,ACA,AGG,ACA,AGG,TCA,AGG,AGT,TTG,GCT,TGG,CAA,TGA,AGA,CTT,CTC,GTA

30.DHE2-30:Tm=54,60mer

TCT,CCA,GAT,GCA,CCC,TGA,GAA,GAT,GGC,ATG,TTG,ATG,AAG,GTA,CGA,GAA,GTC,TTC,ATT,GCC

31.DHE2-31:Tm=54,60mer

TCT,CAG,GGT,GCA,TCT,GGA,GAC,TTG,TAC,AAC,TTC,GCA,ATC,GCA,CCA,TCC,TTC,ACT,CTT,GGC

32.DHE2-32:Tm=54,60mer

CGA,CGT,TCT,GAG,AGA,CAG,AGT,TAC,CAC,CCC,AAG,TAC,CAC,AGC,CAA,GAG,TGA,AGG,ATG,GTG

33.DHE2-33:Tm=54,60mer

CTC,TGT,CTC,TCA,GAA,CGT,CGA,GCC,TAA,GCA,CTT,GTT,GAA,CAT,CAA,GTC,TGT,CGC,TGA,GCG

34.DHE2-34:Tm=54,60mer

GAT,TTT,CTG,TGG,AAC,TTT,GAA,CCA,GAG,CAT,GTT,CTC,ACG,ACG,CTC,AGC,GAC,AGA,CTT,GAT

35.DHE2-35:Tm=54,60mer

TCA,AAG,TTC,CAC,AGA,AAA,TCT,ACT,TCA,AGT,ACG,GAT,GTC,TCC,GTT,TCG,CAT,TGA,AGG,AGT

36.DHE2-36:Tm=54,60mer

TCG,GTG,ACG,ATG,AAT,GCA,CGC,TTC,TTG,TTC,ATG,TCC,TTC,AAC,TCC,TTC,AAT,GCG,AAA,CGG

37.DHE2-37:Tm=54,60mer

CGT,GCA,TTC,ATC,GTC,ACC,GAC,AAG,GAC,CTG,TTC,AAA,CTT,GGC,TAC,GTC,AAC,AAG,ATC,ACC

38.DHE2-38:Tm=54,60mer

TGA,AGA,TGG,AGT,ACT,TGA,TGT,CGA,TCT,CGT,CGA,GGA,CCT,TGG,TGA,TCT,TGT,TGA,CGT,AGC

39.DHE2-39:Tm=54,60mer

CAT,CAA,GTA,CTC,CAT,CTT,CAC,CGA,TAT,CAA,GTC,TGA,CCC,AAC,CAT,CGA,CTC,TGT,CAA,GAA

40.DHE2-40:Tm=54,60mer

GAT,GGT,GTC,AGG,TTC,GAA,GTT,CAG,CAT,CTC,CTT,AGC,ACC,CTT,CTT,GAC,AGA,GTC,GAT,GGT

41.DHE2-41:Tm=54,60mer

ACT,TCG,AAC,CTG,ACA,CCA,TCA,TCT,CCA,TCG,GTG,GTG,GAT,CTC,CTA,TGG,ATG,CAG,CAA,AGG

42.DHE2-42:Tm=54,60mer

TCA,ATC,TCT,GCT,TCT,GGG,TAC,TCG,TAC,AAC,AGG,TGC,ATG,ACC,TTT,GCT,GCA,TCC,ATA,GGA

43.DHE2-43:Tm=54,60mer

TAC,CCA,GAA,GCA,GAG,ATT,GAG,AAC,CTC,GCT,ATC,AAC,TTC,ATG,GAC,ATC,CGT,AAG,CGT,ATC

44.DHE2-44:Tm=54,60mer

CGA,CGG,AGA,TTG,CCT,TAG,TAC,CCA,ACT,TAG,GGA,AGT,TGC,AGA,TAC,GCT,TAC,GGA,TGT,CCA

45.DHE2-45:Tm=54,60mer

TAC,TAA,GGC,AAT,CTC,CGT,CGC,TAT,CCC,TAC,CAC,TGC,TGG,CAC,TGG,TTC,TGA,GGC,AAC,CCC

46.DHE2-46:Tm=54,60mer

GTA,CTT,CAT,TCC,AGT,CTC,GTC,GTT,GGT,GAT,GAC,TGC,GAA,AGG,GGT,TGC,CTC,AGA,ACC,AGT

47.DHE2-47:Tm=54,60mer

ACG,AGA,CTG,GAA,TGA,AGT,ACC,CAC,TGA,CCT,CCT,ACG,AAC,TGA,CTC,CAA,ACA,TGG,CAA,TCA

48.DHE2-48:Tm=54,85mer

AGC,AGT,CAA,CTT,ACG,AGG,CAT,GTT,CAA,CAT,CAG,TTC,GGT,GTC,GAT,GAT,TGC,CAT,GTT,TGG,AGT,C

⑹甲酸脱氢酶（Cbfdh）的合成引物

1.FDH-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,AAG,ATC,GTC,TTG,GTC,TTG,TAC,GGT,GCT,GGC,AAG,CAC,GCT,GCT,GAC,GAG,GAG

2.FDH-2:Tm=54,60mer

TGG,CAA,TGC,CCA,ACT,TGT,TCT,CAG,TGC,AAC,CGT,ACA,ACT,TCT,CCT,CGT,CAG,CAG,CGT,GCT

3.FDH-3:Tm=54,60mer

GAA,CAA,GTT,GGG,CAT,TGC,CAA,CTG,GCT,GAA,GGA,TCA,GGG,ACA,CGA,ACT,CAT,CAC,CAC,CTC

4.FDH-4:Tm=54,60mer

GAT,GTG,TTG,GTC,CAA,GAC,AGA,GTT,GCC,ACC,TTC,CTT,GTC,AGA,GGT,GGT,GAT,GAG,TTC,GTG

5.FDH-5:Tm=54,60mer

CTG,TCT,TGG,ACC,AAC,ACA,TCC,CAG,ACG,CTG,ACA,TCA,TCA,TCA,CCA,CTC,CAT,TCC,ATC,CTG

6.FDH-6:Tm=54,60mer

AAC,TTC,TTA,GCC,TTG,TCG,ATA,CGT,TCC,TTG,GTG,ATG,TAT,GCA,GGA,TGG,AAT,GGA,GTG,GTG

7.FDH-7:Tm=54,60mer

ATC,GAC,AAG,GCT,AAG,AAG,TTG,AAG,TTG,GTT,GTT,GTT,GCT,GGT,GTT,GGT,TCT,GAC,CAC,ATC

8.FDH-8:Tm=54,60mer

CAG,AGA,TTT,TAC,GAC,CAG,TCT,GGT,TGA,TGT,AGT,CCA,AGT,CGA,TGT,GGT,CAG,AAC,CAA,CAC

9.FDH-9:Tm=54,60mer

GAC,TGG,TCG,TAA,AAT,CTC,TGT,CTT,GGA,GGT,CAC,TGG,TTC,CAA,CGT,CGT,CTC,TGT,CGC,TGA

10.FDH-10:Tm=54,60mer

GAA,GTT,ACG,AAC,CAA,GAC,GAG,CAT,AGT,CAT,GAC,AAC,GTG,TTC,AGC,GAC,AGA,GAC,GAC,GTT

11.FDH-11:Tm=54,60mer

TCG,TCT,TGG,TTC,GTA,ACT,TCG,TTC,CAG,CTC,ACG,AAC,AGA,ACA,TCA,ACC,ACG,ACT,GGG,AGG

12.FDH-12:Tm=54,60mer

TTG,CCT,TCG,ATG,TCG,TAA,GCG,TCC,TTA,GCG,ATA,GCA,GCA,ACC,TCC,CAG,TCG,TGG,TTG,ATG

13.FDH-13:Tm=54,60mer

GCT,TAC,GAC,ATC,GAA,GGC,AAG,ACT,ATC,GCT,ACC,ATC,GGT,GCT,GGT,CGT,ATT,GGC,TAC,CGT

14.FDH-14:Tm=54,60mer

ACA,GTT,CTT,TAG,GAT,TGA,ATG,GGA,CCA,GAC,GTT,CCA,GGA,CAC,GGT,AGC,CAA,TAC,GAC,CAG

15.FDH-15:Tm=54,60mer

ATT,CAA,TCC,TAA,AGA,ACT,GTT,GTA,CTA,CGA,CTA,CCA,AGC,ATT,GCC,AAA,GGA,CGC,TGA,GGA

16.FDH-16:Tm=54,48mer

GTT,CTC,GAC,ACG,ACG,AGC,ACC,GAC,CTT,CTC,CTC,AGC,GTC,CTT,TGG,CAA

以上述ATOB-1~ATOB-23为引物，利用PCR进行扩增EcatoB片段。在50μl反应体系中，ATOB-2和ATOB-22共21个引物的添加量为2ng，ATOB-1和ATOB-232个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃90s。共35个循环。

以上述CAHBD-1~CAHBD-30为引物，利用PCR进行扩增Cahbd片段，在50μl反应体系中，CAHBD-2和CAHBD-29共28个引物的添加量为2ng，CAHBD-1和CAHBD-302个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃1min。共35个循环。

以上述CRT-1~CRT-28为引物，利用PCR进行扩增Cacrt片段，在50μl反应体系中，CRT-2和CRT-27共26个引物的添加量为2ng，CRT-1和CRT-282个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃1min。共35个循环。

以上述TER-1~TER-23为引物，利用PCR进行扩增Tdter片段，在50μl反应体系中，TER-2和TER-22共21个引物的添加量为2ng，TER-1和TER-232个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃80s。共35个循环。

以上述DHE2-1~DHE2-48为引物，利用PCR进行扩增CaadhE2片段，在50μl反应体系中，DHE2-2和DHE2-47共46个引物的添加量为2ng，DHE2-1和DHE2-482个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃150s。共35个循环。

以上述FDH-1~FDH-16为引物，利用PCR进行扩增Cbfdh片段，在50μl反应体系中，FDH-2和FDH-15共14个引物的添加量为2ng，FDH-1和FDH-162个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃70s。共35个循环。

上述各个PCR结束后，1%（W/V）琼脂糖胶电泳后回收，进行序列分析，6关键酶基因的序列分别如下：⑴乙酰辅酶A乙酰转移酶（EcatoB），其核苷酸序列如SEQ.IDNo.1所示；⑵3-羟基丁酰-CoA脱氢酶（Cahbd），其核苷酸序列如SEQ.ID No.2所示；⑶5-巴豆酸酶（Cacrt），其核苷酸序列如SEQ.ID No.3所示；⑷反式烯脂酰-CoA还原酶（Tdter），其核苷酸序列如SEQ.ID No.4所示；⑸乙醇脱氢酶E（CaadhE2），其核苷酸序列如SEQ.ID No.5所示；⑹甲酸脱氢酶（Cbfdh），其核苷酸序列如SEQ.ID No.6所示。

分别取10μl回收产物直接与T/A克隆载体（宝生物工程（大连）有限公司，D103A）相连。4℃连接过夜，42℃热激后，高效转化大肠杆菌DH5α感受态中。

实施例2生物法合成丁醇用的6关键酶基因与口蹄疫病毒2A蛋白的串联

通过连续延伸PCR法【上海农业学报，1999，15，11-16】，将口蹄疫病毒2A蛋白（核苷酸序列如SEQ.ID No.7所示）与上述所得的6关键酶基因串联形成融合基因Buta(syn)O。

首先分别合成下列引物，其中末端字母“Z”表示“正向”，“F”表示“反向”。

EcatoBZ:GGATCCATGAAAAACTGTGTCATCGTCTCTGCTGTT

EcatoBF:ACCAGCAAGTTTGAGAAGGTCGAAGTTGAGAAGTTGGTTCAAACGTTCGATGAAGGACCAGGGTTGGATTCGACATC

CahbdZ:GATGTCGAATCCAACCCTGGTCCTAAGAAGGTCTGTGTCATTGGTGCAGGTACTATGGGTTCTGGCATTGCT

CahbdF:CAGGTCCAGGGTTGGACTCGACATCACCAGCGAGCTTCAAAAGGTCGAAGTTCAAAAGCTGCTTGGAGTAGTCGTAG

CacrtZ:TGGTGATGTCGAGTCCAACCCTGGACCTGAACTCAACAACGTCATCCTGGAGAAGGAAGGC

CacrtF:TAGGACCAGGATTAGACTCGACATCGCCTGCAAGTTTGAGCAAATCGAAATTGAGCAACTGACGGTTCTTGAAGC

TdterZ:CAGGCGATGTCGAGTCTAATCCTGGTCCTATTGTCAAGCCAATGGTTCGTAACAACATCTGC

TdterF:AGGACCAGGGTTAGACTCAACATCACCAGCGAGTTTAAGAAGGTCAAAGTTGAGGAGTTGGATACGATCGAAACGCTCGAC

CaadhE2Z:AACCAGAAGGAACTCAAGCAGAAGCTCAACTCGCTGGTGATGTTGAGTCTAACCCTGGTCCTAAGGTCACT

CaadhE2F:TGGACCAGGATTAGATTCGACGTCGCCAGCCAGCTTCAGCAGATCAAAGTTCAACAATTGGAAGGACTTGAT

CbfdhZ:GCTGGCGACGTCGAATCTAATCCTGGTCCAAAGATCGTCTTGGTCTTGTACGGTGCTGGCAAGCACGCTGC

CbfdhF:GAGCTCTTACTTCTTGTCGTGCTTACCGTAAGCCTTGGTGACGTACTCACCGTTCAACAAGATGATGTCTTGTG

以上述EcatoBZ~CbfdhF为引物，利用PCR将实施例1合成的6关键酶基因与口蹄疫病毒2A蛋白按如下顺序进行串联形成融合基因Buta(syn)O：EcatoB-2A蛋白-Cahbd-2A蛋白-Cacrt-2A蛋白-Tdter-2A蛋白-CaadhE2-2A蛋白-Cbfdh。

PCR：50μl反应体系中，EcatoBF~CbfdhZ共10个引物的添加量为2ng，EcatoBZ和CbfdhF 2个引物的添加量为30ng，扩增条件（Protocol）为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃8min。共35个循环。

实施例3酿酒酵母表达载体的构建

参看图1，分别用BamHI和SacI（购自宝生物工程（大连）有限公司）进行双酶切，回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将实施例2的融合基因Buta(syn)O与含有酵母PGK强启动子和ADC1基因终止子的pYF1274质粒（在现有的酵母商业化载体pPC-86制备方法的基础上通过把原有的ADC1基因启动子替换为PGK强启动子构建而成的，其中pPC-86的制备方法参看Pierre M.CHEVRAY and Daniel NATHANS，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,Vol.89,pp.5789-5793）连接-纯化，酶切鉴定和序列测定，即获得了含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O。

实施例4酿酒酵母表达载体pYF1274-Buta(syn)O的酿酒酵母转化

酿酒酵母转化选用醋酸锂法。具体操作是：于30℃过夜培养5ml酿酒酵母至OD6₀₀为0.5左右，扩大培养至50ml，再生长4个小时后，5000rpm/分离心8分钟收集细胞。以20ml无菌水洗，然而把离心收集的酵母以10ml现配的TE/LiAc（100mM LiAc in TE）洗一次。7000转/分离心8分钟后，最终将酵母悬于0.5ml的TE/LiAc中。50μl的酵母悬液中加入1μg的质粒DNA、50μg的鲑鱼精DNA及300μl含40%PEG3350的TE/LiAc溶液，充分混匀后于30℃保温30分钟。接着于42℃热激15分钟。离心收集的酵母重悬于TE溶液中，并涂于酵母选择培养基。

实施例5酿酒酵母阳性克隆的摇瓶发酵及丁醇含量的测定

摇瓶发酵的参照Steen等的方法（E-J.Steen et al.,2008,Microb Cell Fact.,7:36:1-8）。具体操作是：将酵母阳性克隆挑取单菌落接种与50ml SD液体培养基中,然如放入振荡摇床中30℃有氧培养1天，待OD₆₀₀值达到1时（在这期间溶氧必须维持在20%以上），转接1ml于50ml RCA液体培养基中放入厌氧培养箱中30℃培养4天，每隔一段时间取出培养液进行丁醇产量的气相测定（在此期间不断注入葡萄糖以保证葡萄糖浓度达到10-20g/L）。

丁醇的气相色谱测定参照Steen等的方法（E-J.Steen et al.,2008,Microb Cell Fact.,7:36:1-8）。具体操作是：每次取出10ml发酵液中放入锥形瓶中加入1.5ml乙酸乙酯，然后在涡旋器上充分震荡1min，10000r/min离心10min，用剪过的枪头小心吸取上清于一干净dorf管中。然后在1ml样品液中加入30mg无水硫酸钠，充分混匀，室温静置一晚上，次日10000r/min离心10min，吸取上清进行气相测定。气相测定条件：TRWAXMAS柱，条件：40℃1.2min，缓慢升温到130℃25℃/min，再升温到220℃35℃/min，最后的产量分析用Xcalibur软件。实验结果参看图2和图3，丁醇的产量达到1.556g/L。

Claims (7)

1.一种酿酒酵母表达载体，其特征在于，是在pYF1274质粒的BamHI和SacI酶切位点之间插入含有生物法合成丁醇用的6关键酶基因的融合基因编码序列构建而成的。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母表达载体，其特征在于，所述的6关键酶融合基因是由口蹄疫病毒2A蛋白与该6关键酶基因的核苷酸序列串联而成的。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母表达载体，其特征在于，所述的6关键酶融合基因包括：⑴EcatoB，即乙酰辅酶A乙酰转移酶，其核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示；⑵Cahbd，即3-羟基丁酰-CoA脱氢酶，其核苷酸序列入SEQ.ID No.2所示；⑶Cacrt，5-巴豆酸酶，其核苷酸序列如SEQ.ID No.3所示；⑷Tdter，即反式烯脂酰-CoA还原酶，其核苷酸序列如SEQ.ID No.4所示；⑸CaadhE2，即乙醇脱氢酶E，其核苷酸序列如SEQ.ID No.5所示；⑹Cbfdh，即甲酸脱氢酶，其核苷酸序列如SEQ.ID No.6所示。

4.根据权利要求2所述的酿酒酵母表达载体，其特征在于，所述的串联方式为EcatoB-2A蛋白-Cahbd-2A蛋白-Cacrt-2A蛋白-Tdter-2A蛋白-CaadhE2-2A蛋白-Cbfdh。

5.根据权利要求2或4所述的酿酒酵母表达载体，其特征在于，所述的2A蛋白的核苷酸序列如SEQ.ID No.7所示。

6.权利要求1所述的酿酒酵母表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）生物法合成丁醇用的6关键酶基因的合成；

2）生物法合成丁醇用的6关键酶基因与口蹄疫病毒2A蛋白的串联；

3）与pYF1274质粒连接。

7.权利要求1所述的酿酒酵母表达载体的用途，其特征在于，将所述酿酒酵母表达载体转化入酿酒酵母中通过摇瓶发酵生物法合成丁醇。

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