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CN103864957B - 基于环糊精载体的青蒿素前药及其制备方法 - Google Patents

基于环糊精载体的青蒿素前药及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于环糊精载体的青蒿素前药，由环糊精上的至少一个取代基通过羟基与青蒿素衍生物上的羧基以酯键相连而成，具有较好的水溶性与较高的靶向生物利用度。本发明的另一方面涉及上述青蒿素前药的制备方法，该方法先将环糊精磺酰化、青蒿素衍生物生成水溶性的青蒿素衍生物盐，继而将磺酰化的环糊精与青蒿素衍生物盐在强极性有机溶剂中进行反应而得，具有较高的产率。

Description

基于环糊精载体的青蒿素前药及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物合成领域，特别涉及一种基于环糊精载体的青蒿素前药及其制备方法。
背景技术
青蒿素（Artemisinin,AMS），是从中草药青蒿(ArtemisiaannuaL.)中分离出来的一种内含过氧化基团的倍半萜内酯类抗疟药物，对于氯喹抗药品系的疟原虫（Plasmodiumfalciparum）有治疗功效。青蒿素衍生物如蒿甲醚(artemether)、二氢青蒿素(dihydroartemisinin)、蒿乙醚(arteether)及青蒿琥酯(artesunate)，对氯喹抗药品系、氯喹敏感品系的疟原虫以及脑内疟疾都有效。由世界卫生组织推荐，对于疟疾感染人群使用快速、可靠的青蒿素组合治疗方案(ACT)，在疟疾泛滥的大多数国家被广泛接受。
近年来，研究发现：青蒿素及其衍生物显示了较好地杀死癌细胞的效果。青蒿素具有选择性杀死癌细胞的能力，并且对正常细胞影响极小，青蒿素与传统肿瘤化疗药物的作用机制不同，它可以逆转肿瘤细胞的多药耐药。与多柔比星、长春新碱、甲氨蝶吟或羟基脲存在抗药性的白血病细胞系对青蒿琥酯不存在交叉耐药现象。并且，青蒿素药物作为抗疟疾药物己在临床应用多年，其安全性已在数千万例临床病例的应用中得到确认。
目前，对于青蒿素及其衍生物抗肿瘤的原理还在进一步研究中，可能同青蒿素与Fe2+反应产生大量自由基以及烷基化作用有关，另外，与其诱导肿瘤细胞凋亡的关系也十分密切。对于前者，由于癌细胞中的铁离子浓度较正常细胞高很多，而青蒿素结构中的过氧桥能被铁离子催化裂解产生自由基，因此有可能通过自由基途径将细胞杀死；对于后者，研究表明青蒿素可以诱导小鼠白血病癌细胞和人肝癌发生凋亡，但是对于刺激(药物作用靶点)和效应(细胞凋亡)的具体机制尚不够清楚。另外，有研究显示：青蒿素对肿瘤血管生长因子有一定的影响，青蒿琥酯有广谱抗癌活性。
对于青蒿素类药物的体外研究表明：青蒿素类药物能够明显抑制体外培养的白血病P388细胞的增殖；一些青蒿酸及青蒿酸衍生物对多种体外培养的肿瘤细胞有选择性抑制作用；青蒿酯钠对人宫颈癌HeLa细胞显示杀伤作用，对人低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞(HeLa,SUNE-1和CNE2)均有杀伤作用，对肝癌细胞BEL-7402细胞生长有明显抑制作用，对裸鼠异体移植人肝癌的生长有明显抑制作用；青蒿琥酯有诱导U937细胞凋亡的作用，对人结肠癌细胞HCT-8、人红白血病细胞K562及人乳腺癌MCF-7细胞株有杀伤作用。
在体内实验方面，给予Hep2肝癌小鼠腹腔注射不同剂量的青蒿琥酯发现，60mg/kg青蒿琥酯对小鼠Hep2肝癌有显著抑制作用，其抑瘤率为80.4%；通过肌肉注射给药方式来研究青蒿琥酯的作用发现，青蒿琥酯对小鼠肝癌、S180实体瘤均有明显的抑瘤作用。在研究青蒿琥酯对小鼠肝癌H22抑制作用的实验中发现，青蒿琥酯以300mg/kg灌胃时，抑瘤率为40%以上，与阳性对照药5-Fu作用相近。另外，实验小鼠口服硫酸亚铁6h后再给双氢青蒿素，可显著抑制移植性小鼠纤维肉瘤的生长，比单纯使用双氢青蒿素的效果大大增加。青蒿素类药物还可以抑制裸鼠人卵巢癌HO-8910移植性瘤、转基因鼠前列腺腺癌等瘤体的生长。
综上所述，青蒿素类药物具有较好的抗癌性能；但是，因其水溶性较差、生物利用度低，使其不能较好的传输到癌细胞上；在人体和动物模型中，青蒿素及其衍生物消除较快，不能在癌细胞表面形成治疗剂量。
前体药物（prodrug），也称前药、药物前体、前驱药物等，是指经过生物体内转化后才具有药理作用的化合物。前体药物本身没有生物活性或活性很低，经过体内代谢后变为有活性的物质，这一过程不能增加其活性，但能改变药物的物理化学性质，解决药物的水溶性和稳定性等问题，从而增加药物的生物利用度，加强靶向性，降低药物的毒性和副作用。目前前体药物分为两大类：载体前体药物(carrier-prodrug)和生物前体药物(bioprecursor)。生物前体药物大部分不是人为修饰的，而是在研究作用机制时，发现其作用过程是经体内酶催化代谢而产生的活性物质。载体前体药物是指具有活性的化合物与其运输作用的载体通过共价键结合，在体内通过简单的水解作用卸掉载体，由活性化合物发挥药理作用。
因此，开发一种水溶性好、生物利用度高的青蒿素类抗癌前药具有重要的现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种水溶性好、生物利用度高的青蒿素前药及其制备方法。
具体地，本发明提供了一种基于环糊精载体的青蒿素前药。
天然环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，其中研究得较多并且具有重要实际意义的是含有6、7、8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-、β-和γ-环糊精。X-线晶体衍射、红外光谱和核磁共振波谱分析的结果显示，构成环糊精分子的每个D(+)-吡喃葡萄糖都是椅式构象，各葡萄糖单元均以1，4-糖苷键结合成环。由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转，环糊精是两端开口、一端大一端小、中空的圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，腔内部由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区，而所有羟基则在分子外部，大口端由C2和C3的仲羟基构成，小口端由C6的伯羟基构成，具有很强的亲水性。
本发明青蒿素前药是将式I所示环糊精上R1、R2或R3取代基中的至少一个通过羟基，与式II所示青蒿素衍生物的羧基以酯键相连；
所述式I化合物中，n=1且m+n=6、7或8；R1、R2和R3为-ROH，R是(CH2)x、NH(CH2)x、NH(CH2)xNH(CH2)x、CO(CH2)x或O(CH2)x，x为0、1、2、3或4；
所述式II化合物中，R4为(CH2)y、CO(CH2)y、或其中y为大于等于0且小于10的整数，CO为羰基。
优选地，所述式II化合物为青蒿琥酯、青蒿素12位碳原子上含苯氧基的衍生物或青蒿素12位碳原子上含烷氧基的衍生物。
本发明的另一个目的在于提供一种上述青蒿素前药的制备方法，包括如下步骤：
（1）式I所示环糊精与磺酰化试剂反应生成磺酰化环糊精；
（2）式II所示青蒿素衍生物与弱酸盐发生反应，生成青蒿素衍生物盐；
（3）在极性有机溶剂中，步骤（2）所得青蒿素衍生物盐与步骤（1）所得磺酰化环糊精，在80-120℃下经反应得所述青蒿素前药；所述青蒿素衍生物盐与磺酰化环糊精的摩尔比为1：（0.1-15）。
上述制备方法中，所述磺酰化环糊精为D(+)-吡喃葡萄糖2位、3位或6位上任意一位或几位被磺酰化的环糊精。磺酰化环糊精的合成参照已有文献【R.C.Petter,J.S.Salek,C.T.Sikorski,G.Kumaravel,andF.-T.Lin:J.Am.Chem.Soc.112,3860–3868(1990)】。
所述弱酸盐为碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸盐。优选地，选用5%-10%的碳酸氢钠水溶液。由于青蒿素衍生物在水、油中溶解度较差，因此先将青蒿素衍生物转化成水溶性的青蒿素衍生物盐，以进行下一步的反应。
所述极性有机溶剂为N,N-二甲基酰胺、N,N-二乙基酰胺或二甲基亚砜。
上述制备方法中，还包括将所述青蒿素前药从反应液中分离、纯化的步骤。
所述分离、纯化步骤为：将反应液减压蒸馏，收集固体残余物并用水溶解、过滤，所得滤液浓缩后使用有机溶剂萃取或色谱层析分离得到所述青蒿素前药。
上述分离、纯化步骤中，所述有机溶剂为丙酮、乙醚、氯仿或四氢呋喃。
对于本发明青蒿素前药的理化性质及其药理作用的研究表明，本发明青蒿素前药具有较好的水溶性没在25℃水中的溶解度为45-80mg/ml，而青蒿素衍生物在水中几乎不溶；发明人还检测了本发明青蒿素前药对几种体外培养的直肠癌细胞的IC50值，结果表明：与相应原料药相比，本发明青蒿素前药抑制癌细胞生长的活性更强。
在体实验中，本发明青蒿素前药通过胃和小肠部位时仅有少量的吸收，当进入结肠道时，其环糊精载体因被结肠道中的微生物菌群分解而释放青蒿素类活性药物，从而具有靶向结肠释放特性，提高了靶向生物利用度、降低了药物毒副作用。
本发明所述青蒿素前药的制备方法，产率较高，操作简单、原料易得、反应条件温和，可用于青蒿素抗癌前药的大量制备。
附图说明
图1为β-环糊精的核磁共振氢谱（1HNMR）图；
图2示实施例1制备的6-青蒿琥酯键接β-环糊精核磁共振氢谱图（1HNMR），在7~8ppm处出现青蒿琥酯的H5,H12,H13,H14和H15特征峰，而环糊精在该处没有特征吸收；
图3示实施例1制备的6-青蒿琥酯键接β-环糊精高分辨质谱图[MS(TOF-ESI)]。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例所用磺酰化环糊精的制备为参照已有文献【R.C.Petter,J.S.Salek,C.T.Sikorski,G.Kumaravel,andF.-T.Lin:J.Am.Chem.Soc.112,3860–3868(1990)】，由相应环糊精与磺酰化试剂反应而得。
以下实施例中，化合物在水溶液中的溶解度是通过制备饱和溶液的方法测定的。将过量的化合物投入25℃、一定量的水中，搅拌1小时;过滤除去不溶物质后，将滤液蒸干，所得剩余物称重，计算单位体积水中化合物的溶解量，即为该化合物在25℃时水中的溶解度（mg/ml）。
以下实施例中，所用化合物原料的分子式如下：
（1）单6-磺酰化-β-环糊精，其分子式为：
（2）单2-磺酰化-α-环糊精，其分子式为：
（3）2,3-磺酰化-γ-环糊精，其分子式为：
（4）青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物钠，其分子式为：
（5）青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物钠，其分子式为：
实施例1单6-青蒿琥酯-β-环糊精的制备
取青蒿琥酯钠0.512g（0.01mmol）和单6-磺酰化-β-环糊精1.22g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N–二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在100℃下搅拌24h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL氯仿萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物，产率56%左右；产物在25℃时水中的溶解度为65mg/mL。
核磁共振和高分辨质谱确定单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物的结构。单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物的1HNMR图显示，在D2O条件下，在0.3~3.0ppm以及5.0~7.1ppm处出现青蒿素及其衍生物的H5,H12,H13,H14和H15特征峰，而环糊精在该处没有特征吸收，而青蒿素衍生物几乎不溶于水，可初步说明青蒿琥酯与环糊精发生了反应。高分辨质谱检测，m/z：1500.5356（M+），m/z：1522.5349（M+Na）。
实施例2单2-青蒿琥酯-α-环糊精的制备
取青蒿琥酯钠5.12g（0.1mmol）和单2-磺酰化-α-环糊精1.12g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N-二乙基酰胺3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在80℃下搅拌192h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL乙醚萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单2-青蒿琥酯-α-环糊精键接物，产率60%左右；产物在25℃时水中的溶解度为78mg/mL。
实施例32,3-青蒿琥酯-γ-环糊精的制备
取青蒿琥酯钠0.512g（0.01mmol）和2,3-磺酰化-γ-环糊精19.8g（0.15mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在120℃下搅拌96h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，用水为洗脱剂柱层析，收集层析液，浓缩，于50℃下真空干燥24h，得2,3-青蒿琥酯-γ-环糊精键接物，产率54%左右；产物在25℃时水中的溶解度为80mg/mL。
实施例4单6-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-β-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物钠0.712g（0.01mmol）和单6-磺酰化-β-环糊精1.22g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N-二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在100℃下搅拌24h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL氯仿萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单6-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-β-环糊精键接物，产率56%左右；产物在25℃时水中的溶解度为45mg/mL。
实施例5单2-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-α-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物钠7.12g（0.1mmol）和单2-磺酰化-α-环糊精1.12g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N-二乙基酰胺3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在80℃下搅拌192h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL乙醚萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单2-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-α-环糊精键接物，产率60%左右；产物在25℃时水中的溶解度为48mg/mL。
实施例62,3-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-γ-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物钠0.712g（0.01mmol）和2,3-磺酰化-γ-环糊精19.8g（0.15mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在120℃下搅拌96h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，用水为洗脱剂柱层析，收集层析液，浓缩，于50℃下真空干燥24h，得2,3-青蒿素C-12-含苯氧基的衍生物-γ-环糊精键接物，产率54%左右；产物在25℃时水中的溶解度为49mg/mL。
实施例7单6-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-β-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物钠0.612g（0.01mmol）和单6-磺酰化-β-环糊精1.22g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N-二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在100℃下搅拌24h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL氯仿萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单6-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-β-环糊精键接物，产率56%左右；产物在25℃时水中的溶解度为52mg/mL。
实施例8单2-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-α-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物钠6.12g（0.1mmol）和单2-磺酰化-α-环糊精1.12g（0.01mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取N,N-二乙基酰胺3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在80℃下搅拌192h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，滴入100mL乙醚萃取，过滤，收集沉淀，于50℃下真空干燥24h，得单2-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-α-环糊精键接物，产率60%左右；产物在25℃时水中的溶解度为55mg/mL。
实施例92,3-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-γ-环糊精的制备
取青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物钠0.612g（0.01mmol）和2,3-磺酰化-γ-环糊精19.8g（0.15mmol），加入到100ml圆底烧瓶中，量取二甲基亚砜3.0ml，加入到烧瓶，开始搅拌，在120℃下搅拌96h，60℃减压蒸干反应液，残余物用少量水溶解，然后滴入300mL的丙酮中，有沉淀产生，过滤，干燥沉淀。然后将沉淀溶解于微酸性水（pH＝6）中，搅拌混合后，过滤，将所得的固体，用水充分溶解，过滤，滤液浓缩，用水为洗脱剂柱层析，收集层析液，浓缩，于50℃下真空干燥24h，得2,3-青蒿素C-12-含烷氧基的衍生物-γ-环糊精键接物，产率54%左右；产物在25℃时水中的溶解度为56mg/mL。
实施例10本发明青蒿素前药对体外培养直肠癌细胞的抑制效应
以实施例1所制备单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物为例。取人直肠癌细胞HCT116，Lovo，SW480和HT29的细胞悬液(浓度4×104个/mL)各180μl分别加于96孔培养板的培养孔，在5%CO2、37°C、饱和湿度条件下预培养24h，更换其中的150μl培养基后，加入含有不同浓度单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物的培养基20μl，继续培养48h；用MTT法分别测定OD值，求出生长抑制率，观察高、中、低各浓度的上述青蒿素前药对肿瘤细胞增殖的抑制作用，并计算IC50值（即诱导50%的肿瘤细胞凋亡的药物浓度）。以不加样品的培养基为阴性对照，以现有抗癌药物奥沙利铂、氟尿嘧啶、双氢青蒿素、青蒿琥酯为阳性对照进行平行试验，并计算各自的IC50值。上述所有实验均平行操作三次。
表1、青蒿素前药在几种直肠癌细胞中的IC50值(μM)
结果如表1所示，从表1可以发现：单6-青蒿琥酯-β-环糊精键接物的抗癌活性强于其反应原料青蒿琥酯以及其它青蒿素衍生物——双氢青蒿素，也好于临床上常用的药物——奥沙利铂和氟尿嘧啶；这是由于6-青蒿琥酯键接β-环糊精相比双氢青蒿素和青蒿琥酯，更容易进入癌细胞，从而在癌细胞内快速聚集以达到治疗剂量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于环糊精的青蒿素前药，其特征在于，式I所示环糊精上R1、R2或R3取代基中的至少一个通过羟基，与式II所示青蒿素衍生物的羧基形成酯键而连接；
所述式I化合物中，n＝1且m+n＝6、7或8；R1、R2和R3为-ROH，R是(CH2)x、NH(CH2)x、NH(CH2)xNH(CH2)x、CO(CH2)x或O(CH2)x，x为0、1、2、3或4；
所述式II化合物中，R4为(CH2)y、CO(CH2)y、或其中y为大于等于0且小于10的整数，CO为羰基。
2.如权利要求1所述青蒿素前药，其特征在于，所述式II化合物为青蒿琥酯、青蒿素12位碳原子上含苯氧基的衍生物或青蒿素12位碳原子上含烷氧基的衍生物。
3.一种如权利要求1或2所述青蒿素前药的制备方法，包括如下步骤：
(1)式I所示环糊精与磺酰化试剂反应生成磺酰化环糊精；
(2)式II所示青蒿素衍生物与弱酸盐发生反应，生成青蒿素衍生物盐；
(3)在极性有机溶剂中，步骤(2)所得青蒿素衍生物盐与步骤(1)所得磺酰化环糊精，在80-120℃下反应得所述青蒿素前药；所述青蒿素衍生物盐与磺酰化环糊精的摩尔比为1：(0.1-15)。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述磺酰化环糊精为D(+)-吡喃葡萄糖2位、3位或6位上任意一位或多位被磺酰化的环糊精。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述弱酸盐为碳酸钠、碳酸氢钠或磷酸盐。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述极性有机溶剂为N,N-二甲基酰胺、N,N-二乙基酰胺或二甲基亚砜。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括将所述青蒿素前药从反应液中分离、纯化的步骤。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述分离、纯化步骤为：将反应液减压蒸馏，收集固体残余物并用水溶解、过滤，所得滤液浓缩后使用有机溶剂萃取或色谱层析分离得到所述青蒿素前药。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮、乙醚、氯仿或四氢呋喃。
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