CN103830739A - 配体多肽ph1形成的药物输送系统及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种配体多肽PH1形成的药物输送系统及其用途，所述药物输送系统包括配体多肽PH1、载药系统、至少一种活性物质，所述多肽PH1连接于所述载药系统表面；本发明还涉及配体多肽PH1在制备特异性结合肿瘤相关巨噬细胞药物中的用途。通过长期试验发现并证明PH1多肽可以很好的靶向肿瘤相关细胞、诱导其分化和抑制肿瘤生长，PH1多肽脂质体的复合物可以很好的靶向肿瘤相关巨噬细胞，可以应用于小分子药物和基因药物的肿瘤相关巨噬细胞的靶向输送，本发明中的全反式维甲酸多肽脂质体可以有效诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化和抑制肿瘤的生长，可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤复发，因此具有极大的医疗实用性。

Description

配体多肽PH1形成的药物输送系统及其用途

技术领域

本发明涉及一种靶向多肽脂质体制剂及其应用，具体是涉及一种配体多肽PH1形成的药物输送系统及其用途。 

背景技术

在多年的临床实践中，人们一直观察到肿瘤病人瘤组织中常常有大量炎症细胞浸润，但其生物学意义只有在近年内才得到学术界的重视：这些肿瘤相关炎症细胞被认为对肿瘤的生长、存活、和转移有重要的促进作用。 

肿瘤相关炎症细胞的源头，被认为是来自骨髓的淋巴前体细胞(Myeloid cells)。在正常组织中，这些髓系来源的前体细胞可以很快分化成粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，但在肿瘤等疾病条件下，这些前体细胞的分化被抑制，但同时被大量招募到肿瘤组织中，成为髓系抑制细胞。这些肿瘤抑制细胞包括肿瘤相关巨噬细胞，表达tie2的单核细胞，肿瘤相关粒细胞等。 

实体肿瘤的微环境内富集了大量的炎症细胞，而肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在癌症和炎症之间起着重要的调节作用。TAMs具有促肿瘤细胞增殖、血管生长、抑制适应性免疫等作用。在疾病的恶化过程中起着重要的作用。与其它招募到肿瘤组织的髓系来源的细胞如(tie2-macrophages,MDSCs)一起，靶向TAMs可能成为肿瘤生物治疗的新途径。 

肿瘤相关巨噬细胞通过表达和分泌一系列促进肿瘤细胞增殖和存活的因子，抑制T细胞活性，以及促进肿瘤血管生成等等，促进肿瘤的生长和转移中起着重要作用，并且是导致肿瘤治疗失败的主要原因。 

巨噬细胞是体液和细胞免疫中重要的效应细胞和抗原提呈细胞，肿瘤组织中存在巨噬细胞的聚集。肿瘤相关巨噬细胞参与肿瘤的发生发展的多个阶段，浸润数量与肿瘤的不良预后密切相关，因此，对在肿瘤演变过程中各种生物学行为的干预是目前肿瘤免疫的研究热点方向，肿瘤组织的归巢能力也为一些以巨噬细胞为载体的靶向溶瘤病毒的研制和临床应用提供了可能。 

巨噬细胞主要起源于外周循环的单核细胞，是天然免疫系统的主要成员，巨噬细胞在单核细胞趋化蛋白血管内皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子等的作用下向肿瘤微环 境定向移动，分化为肿瘤相关巨噬细胞，参与肿瘤的生存增殖浸润转移，并与预后不良相关，但并非所有的巨噬细胞都有促肿瘤的作用，肝脏中的巨噬细胞通过吞噬外周循环中的肿瘤细胞起到抗肿瘤作用；有动物实验表明，敲除巨噬细胞可以提高肿瘤的转移率。 

血管生成是肿瘤生长和转移过程中的重要事件，血管基底膜及细胞外基质在损伤等刺激因素作用下被降解破坏，继而内皮细胞迁移形成新生血管，为肿瘤细胞提供营养物质运输的通路和扩散途经，在一些人类肿瘤中，肿瘤相关巨噬细胞的积聚常与血管生成及血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子的表达相关。也有人认为，肿瘤相关巨噬细胞具有促抗血管生成的双重效应，但促血管生成的效应占优势。对乳腺癌、肺癌、肾癌、基底细胞癌等的研究发现，浸润与肿瘤组织中血管生成呈正相关，低氧是血管再生和活化的重要条件，在缺氧和肿瘤微环境信号刺激下，巨噬细胞上调纤维母细胞生长因子、胸腺嘧啶磷酸化酶、尿激酶型纤溶酶原激活物等促血管生成因子的表达，通过转基因动物研究发现，肿瘤巨噬细胞作为血管生成的开关参与肿瘤的转移，是肿瘤基质中产生促血管生成因子的主要细胞；消除其能够减缓肿瘤进展，中和其诱导物或表面受体可以阻止在肿瘤组织中的募集，抑制血管生成；对人类宫颈癌的研究发现，肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子参与肿瘤相关的淋巴管再生与肿瘤细胞淋巴管转移。 

单纯的使用抗肿瘤药物如索菲拉尼，结果表明索菲拉尼治疗后肿瘤容易复发，而联合巨噬细胞清除药物唑来膦酸、氯磷酸二钠脂质体的治疗效果可以起到增强肿瘤的治疗效果，但是这种没有选择性的清楚体内的全部巨噬细胞，毒性比较大，破坏体内免疫平衡，在实际的治疗中具有很大的局限性。 

不成熟的髓系细胞可抑制T细胞的反应以及抗原提呈免疫反应。维甲酸类药物包括维生素A的天然及人工合成的衍生物，维生素A(视黄醇)进入人体后转变成视黄醛，再经氧化变成维甲酸。维甲酸是维持生长发育不可缺少的物质，尤其在促进上皮组织分化生长及维持其正常功能方面起重要作用。研究表明全反式维甲酸给药后可极大地减少脾脏里的免疫抑制类细胞的数量，但是单独使用不可以抑制肿瘤的生长。 

综上所述：肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)作为免疫抑制细胞（MDSCs）的一个亚群。通过分泌一系列促肿瘤生长的因子，在肿瘤的发生、发展和转移方面起着重要作用。而传统针对肿瘤细胞的药物治疗，往往预后效果不佳，容易复发，这与肿瘤相关巨噬细胞的存在有重要的作用。本发明尝试从免疫调节而不直接针对肿瘤细胞的角度，即从诱导肿瘤相关巨噬细胞分化成正常的对抗肿瘤的巨噬细胞的角度来探索肿瘤治疗的新方法。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种配体多肽PH1形成的药物输送系统及其用途。 

本发明是通过以下的技术方案来实现的， 

第一方面，本发明涉及一种配体多肽PH1在制备特异性结合肿瘤相关巨噬细胞药物中的用途，所述配体多肽PH1的结构为苏氨酸-蛋氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-组氨酸-酪氨酸（T-M-G-F-T-A-P-R-F-P-H-Y）。 

第二方面，本发明涉及一种药物输送系统，所述系统包括前述的配体多肽PH1、载药系统、至少一种活性物质；所述多肽PH1连接于所述载药系统表面。 

优选地，所述载药系统为以下任一结构或其组合结构：纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、脂蛋白。 

优选地，所述活性物质为抗肿瘤药物，抗代谢药物，细胞毒性/抗生素，光敏剂，激酶抑制剂，抗炎药物，免疫抑制剂，抗感染用药物或抗病毒药物。 

优选地，所述活性物质为用于超声造影、放射造影、核医学造影剂的诊断试剂，目的基因、反义基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、siRNA,mRNA,或上述基因的组合，或含上述基因的真核表达载体DNA。 

优选地，所述活性物质为全反式维甲酸。 

第三方面，本发明涉及前述述药物输送系统的方法，包括如下步骤： 

步骤1，将PH1多肽脂质、脂质材料和全反式维甲酸溶解，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物； 

步骤2，将所述多肽脂质、脂质材料和全反式维甲酸的混合物旋转蒸发得到一层均匀的脂膜产物； 

步骤3，将所述的脂膜产物水合得到水合产物； 

步骤4，将所述水合产物通过聚碳酸酯滤膜挤出器挤出，获得全反式维甲酸、多肽与脂质体的复合物。 

优选地，所述脂质材料为蛋黄磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；其中，蛋黄磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、多肽脂质的摩尔比为（15-20）：（10-12）：（0.5-1.1）：（0.5-1.1）； 

所述全反式维甲酸与所述脂质材料质量比为(18-22)：(1-1.2)； 

所述滤膜挤出器的聚碳酸酯膜孔径依次为400nm、200nm、80nm。 

第四方面，本发明涉及前述药物输送系统在制备特异性的靶向肿瘤相关巨噬细胞、 诱导肿瘤相关巨噬细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发药物中的用途。 

优选地，所述肿瘤相关巨噬细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌、小淋巴细胞瘤的相关巨噬细胞。 

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：通过长期试验发现并证明PH1多肽可以很好的靶向肿瘤相关细胞、诱导其分化和抑制肿瘤生长，PH1多肽脂质体的复合物可以很好的靶向肿瘤相关巨噬细胞，可以应用于小分子药物和基因药物的肿瘤相关巨噬细胞的靶向输送，本发明中的全反式维甲酸多肽脂质体可以有效诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化和抑制肿瘤的生长，可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤复发，因此具有极大的医疗实用性。 

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显： 

图1为PH1多肽脂质体合成效率液相检测结果。 

图2为PH1多肽脂质体MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）检测结果。 

图3为载有ATRA不同处方脂质体的粒径结果。 

图4为肿瘤相关巨噬细胞表征结果。 

图5为体外PH1多肽脂质体和PEG脂质体与肿瘤相关巨噬细胞的结合实验结果。 

图6为体内PH1多肽脂质体与肿瘤相关巨噬细胞的结合实验结果。 

图7为体外不同处方载有ATRA多肽脂质体诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化结果。 

图8为体内不同处方载有ATRA多肽脂质体诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化结果。 

图9为载有ATRA多肽脂质体和PEG脂质体体内诱导肿瘤相关巨噬细胞表型的变化结果。 

图10为不同比例多肽脂质修饰的载siRNA不同阳离子脂质体与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、正常单核细胞（Monocyte）结合荧光强度示意图。 

图11为不同比例多肽脂质修饰阿霉素脂质体的对MDSCs细胞毒性情况示意图。 

图12为全反式维甲酸空白血浆的标准曲线。 

图13为载有全反式维甲酸PH1多肽脂质体和PEG脂质体半衰期。 

图14为载有全反式维甲酸多肽脂质体药效学实验结果。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1、PH1多肽脂质的合成

氢化豆磷脂（HSPC）以及1，2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺2000-马来酸酯（DSPE-PEG2000-Mal）购自日本油脂公司（NOF Corporation）； 

PH1多肽购自上海吉尔生化生物有限公司；其它试剂购自中国国药化学试剂公司； 

全反式维甲酸（ATRA）购自美国西格玛公司； 

步骤一、PH1多肽脂质(DSPE-PEG2000-Mal-PH1)的合成 

（1）除气HEPES溶液的配制：超纯H2O 50ml加热沸腾10min，充N2饱和至冷却，加入HEPES盐595.75mg，得浓度为50mM，用2mol/L NaOH调节pH至7.0，整个过程N2保护，4℃保存备用； 

（2）称取DSPE-PEG2000-MAL粉末10mg，加入除气HEPES盐10ml水合脂膜成为胶束溶液；按照多肽PH1：DSPE-PEG-MAL的摩尔比为2:1，在N2保护下将PH1加入该胶束溶液中。反应在温度为10℃，转速为200rpm条件下恒温振荡,反应24h后得到最终产物DSPE-PEG2000-Mal-PH1； 

（3）最终将所有溶液收集到透析袋中，在4℃，2000ml去离子水，透析，每隔2小时换一次水，反复8次后，继续透析过夜,以除尽游离多肽和盐； 

（4）最终收集到15ml离心瓶中，继续加纯水到透析袋中，冲洗透析袋壁，最终定容到12ml，分装到10个2ml离心瓶中冻干36个小时后，保存备用； 

步骤二、PH1多肽脂质的合成效率高效液相色谱检测和合成产物基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测。液相条件（如表1所示），流动相：A:纯水；B:甲醇/四氢呋喃(94:5)波长为210nm；进样量：20μl；流速1ml/min；柱温35℃。 

表1 

时间/分钟	水	甲醇/四氢呋喃
			0	20%	80%
5	0%	100%
			20	0%	100%

23

0%

80%

结果如图1和图2所示，合成效率＞85%。 

实施例2、全反式维甲酸多肽脂质体的复合物的制备及鉴定

蛋黄卵磷脂(EPC)购自日本油脂株式会社，Lot No：108057-3； 

胆固醇以及聚乙二醇化磷脂1，2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）购自美国Avanti Polar Lipids公司； 

步骤一、全反式维甲酸、多肽脂质体复合物的制备 

八个脂质体处方（如表2所示）中脂质比例：蛋黄卵磷脂（EPC）:胆固醇（Chol）:多肽脂质：聚乙二醇化磷脂1,2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）； 

表2 

处方	组成成分摩尔比
		2%PEG	ATRA:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3:15：10：0.52
4%PEG	ATRA:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3.3:15：10：1
		NON-ATRA	PH1:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=0.52：15：10：0.52
2%PH1+2%PEG	ATRA:PH1:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3.4:0.52：15：10：0.52
		2%PH1+4%PEG	ATRA:PH1:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3.7:0.52：15：10：1.1
4%PH1+2%PEG	ATRA:PH1:EPC:CHOL:DSPE-PEG2000=3.8:1.1：15：10：0.52
		2%PH1	ATRA:PH1:EPC:CHOL=3.2:0.52：15：10
4%PH1	ATRA:PH1:EPC:CHOL=3.6:10：15：10

脂质与全反式维甲酸质量比为20:1； 

(1)溶解：脂质材料和全反式维甲酸 

置茄形瓶中用氯仿溶解后，旋转蒸发除去氯仿，将得到的产物记作溶解产物。此步骤产生脂膜，脂膜与全反式维甲酸形成混合物； 

(2)水化：向茄型瓶内加入适量磷酸盐缓冲液(即PBS，pH为7.4，其由137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄和水组成)6～7颗小玻璃珠继续不抽真空条件下旋转水合30分钟； 

将所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm聚碳酯膜各3次，最终得到平均粒径100nm左右的全反式维甲酸脂质体； 

步骤二、全反式维甲酸、多肽脂质体复合物的表征 

1、全反式维甲酸多肽脂质体包封率检测； 

将上述获得的全反式维甲酸与脂质体的复合物过葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）微柱(购自北京拜尔迪生物技术公司，所属公司：Pharmacia，Code：17-0042-01)，分离游离全反式维甲酸和全反式维甲酸与脂质体的复合物，流动相为PBS(PH7.4)，收集洗脱峰即为纯化后的全反式； 

维甲酸与脂质体的复合物悬液，其中全反式维甲酸的浓度为2mg/ml。将纯化后的全反式维甲酸与脂质体的复合物悬液用9倍体积甲醇破坏，用紫外检测器的高效液相色谱测定包封率。测定条件：ODS柱(Diamonsil，5μm，250×4.6mm)；检测温度为25℃；检测波长为340nm；流速为1.0ml/min；流动相为乙腈/甲醇(体积比为95∶5)。全反式维甲酸的包封率(EE)按以下公式计算：EE＝(Wi/Wtotal)×100％，其中，Wi是过葡聚糖凝胶G-50(Sephadex G-50)柱后被甲醇破坏的复合物中全反式维甲酸的质量；Wtotal是与过柱的脂质体体积相同的过柱前的经甲醇破坏的复合物中的全反式维甲酸质量；结果显示全反式维甲酸与脂质体的复合物的包封率为85％； 

2全反式维甲酸多肽脂质体的粒径 

全反式维甲酸与脂质体的复合物的粒径实验重复三次取平均值±标准差。结果（如图3所示）显示全反式维甲酸多肽脂质体复合物的平均粒径为100左右，粒度分布(PDI)均<0.3。 

实施例3、多肽脂质体与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的体内体外结合试验

蛋黄卵磷脂(EPC)购自日本油脂株式会社，Lot No：108057-3； 

胆固醇以及聚乙二醇化磷脂1,2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）购自美国Avanti Polar Lipids公司； 

荧光脂质FITC DHPE购自美国invitrogen公司 

多肽脂质（DSPE-PEG2000-maleimid-PH1）自行合成； 

Anti-mouse FITC-CD11b抗体、Anti-mouse PE-Gr1抗体、Anti-mouse Percp/cy5.5-F4/80抗体、Anti-mouse FITC-CD11b抗体及其同型对照抗体全部购自美国ebiosciecce公司； 

步骤一、接种肿瘤 

将1x106 4T-1细胞用胰酶消化，并重悬于200μL PBS缓冲液；在6周龄的Balb/c小白鼠乳腺，皮下注射肿瘤细胞悬液；2个星期，肿瘤长至直径约10mm，即可以使用； 

步骤二、PH1多肽荧光脂质体的制备 

PH1多肽脂质体各脂质比例为蛋黄卵磷脂（EPC）:胆固醇（Chol）:FITC荧光脂质:多肽脂质:聚乙二醇化磷脂1,2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）摩尔比为1.5:1:0.31:0.066:0.066； 

PEG脂质体各脂质比例为蛋黄卵磷脂（EPC）:胆固醇（Chol）:FITC荧光脂质:聚乙二醇化磷脂1,2-一二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）摩尔比为1.5:1:0.31:0.066； 

(1)溶解：脂质材料置茄形瓶中用氯仿溶解后，旋转蒸发除去氯仿，将得到的产物记作溶解产物，此步骤产生脂膜； 

(2)水化：向茄型瓶内加入适量磷酸盐缓冲液(即PBS，pH为7.4，其由137mM NaCl、2.7mM KCl、8mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄和水组成)6～7颗小玻璃珠继续不抽真空条件下旋转水合30分钟。将所得脂质体囊泡依次挤压通过孔径为400nm，200nm，100nm聚碳酯膜各3次，最终得到平均粒径100nm左右的多肽脂质体和不含多肽的PEG脂质体； 

步骤三、肿瘤相关巨噬细胞表征 

(1)将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，小心取出肿瘤，在冰上切碎肿瘤组织。转移至含1ml胶原酶（collagense IV）消化液的15ml离心管中，轻轻的涡旋混匀（37摄氏度，200转/分钟），消化2小时后，过40μm膜至50ml离心管。离心弃上清，加入红细胞裂解液5ml,37裂解5分钟，PBS洗两次，即制的肿瘤单个细胞悬液； 

(2)肿瘤相关巨噬细胞表型分析 

1.细胞计数，调整细胞浓度为107/ml；分三平行试验组，每组5个样品管（流式管），编号1-1～1-5；2-1～2-5；3-1～3-5； 

2.每个流式管中加入100μl细胞（10⁶个）； 

3.按编号从第一道第五个样品管内加入CD11b,GR1，F4/80三者的同型对照抗体；第二个样品管加入CD11b抗体；第三个样品管加入GR1抗体；第四个样品管加入F4/80；第二个样品管加入CD11b,GR1和F4/80抗体； 

4.4度避光孵育30min，PBS洗涤细胞2次，每管加入400μl PBS； 

5.流式细胞仪检测（注意各荧光补偿的调节）； 

图4中可以看出肿瘤相关巨噬细胞占肿瘤基质的50%左右，且其表型为CD11b⁺GR1⁺F4/80⁺细胞； 

步骤四、PH1多肽荧光脂质体与肿瘤相关巨噬细胞体外结合试验 

设计PH1、PEG、PBS三个大组，每个大组又分为3小组，每小组两个样品管，每个样品管加入106步骤二制备的肿瘤相关巨噬细胞，然后每个样品管加入步骤一制备的FITC荧光脂质体和PEG脂质体常温孵育1h，PBS洗涤两次用流失细胞仪检测脂质体与肿瘤相关巨噬细胞的体外结合效率，图5中可以看出，相对PBS对照组PEG图PH1多肽脂质体均有与肿瘤相关巨噬细胞结合，但相对PEG组，PH1多肽组与肿瘤相关细胞明显有更强的结合效率； 

步骤五，PH1多肽荧光脂质体与肿瘤相关巨噬细胞体内结合试验 

按步骤二制备PH1荧光脂质体10mg/ml。设计PH1、PBS两组，每组3个只荷瘤小鼠，两组分别尾静脉注射PBS、PH1荧光脂质体200ul；4h后处死小鼠，按步骤三的方法制备肿瘤单细胞悬液。进行流失分析：每只小鼠安排一个样品管，每个样品管加入对应荷瘤小鼠的106肿瘤单细胞悬液，第一个样品管（PBS组小鼠）加入F4/80同型对照抗体，第二个样品管（PH1组小鼠）加入F4/80抗体。4度孵育30min，PBS洗涤两次用流失细胞仪检测脂质体与肿瘤相关巨噬细胞的体内结合效率。图6中可以看出尾静脉注射4小时后PH1荧光多肽脂质体已经大量的聚集在肿瘤组织内并且与结合上的细胞是F4/80+肿瘤相关巨噬细胞，说明PH1多肽脂质体在体内可以很好的靶向到肿瘤相关巨噬细胞。 

实施例4、全反维甲酸多肽脂质体体外体内诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化

步骤一、肿瘤相关巨噬细胞的分选 

1.细胞计数300g,10min，去上清； 

2.每107细胞中加入90μl buffer； 

3.每107细胞中加入10μl CD11b microbeads； 

4.混匀，4℃，15min； 

5.每107细胞中加入1～2ml buffer洗涤，300g，10min，去上清； 

6.重悬至500μl buffer得细胞悬液； 

7.将MS柱放入磁场，另取500μl buffer润MS柱； 

8.buffer流空后将细胞悬液过柱，流空后3*500μl buffer冲洗（buffer先涮标本试管后再加入分选柱），收集得到未标记细胞悬液； 

9.取下MS柱，放到阳性细胞收集管中（50ml离心管），加入1ml buffer快速推下，即可获得纯度>95%的CD11b+肿瘤相关巨噬细胞。 

步骤二、全反维甲酸多肽脂质体体外诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化 

(1)制备8种不同处方的脂质体 

按实施例1的方法，制备八个不同处方脂质体分别为2%PH1+2%PEG，2%PH1+4%PEG,4%PH1+2%PEG，2%PH1，4%PH1，2%PEG，NON-ATRA，4%PEG(2mg/ml)； 

(2)分为9大组，每大组分为3组，每组分5个样品管，编号1-1～1-5；2-1～2-5；3-1～3-5；4-1～4-5；5-1～5-5；6-1～6-5；7-1～7-5；8-1～8-5；9-1～9-5每管加入106实施例4的步骤一的方法分选获得CD11b+肿瘤相关巨噬细胞。每组分别加入PBS,2%PH1+2%PEG，2%PH1+4%PEG，,4%PH1+2%PEG，2%PH1，4%PH1，2%PEG，NON-ATRA，4%PEG20μl。常温孵育12小时，按编号从第一道第五个样品管内加入CD11b,GR1，F4/80三者的同型对照抗体；第二个样品管加入CD11b抗体；第三个样品管加入GR1抗体；第四个样品管加入F4/80；第二个样品管加入CD11b,GR1和F4/80抗体4度避光孵育30min。PBS洗涤细胞2次，每管加入400μl PBS，流式细胞仪检测（注意各荧光补偿的调节）。从图7（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005）可以看出PBS,2%PEG，NON-ATRA，4%PEG组在减少肿瘤相关巨噬细胞数量上没有差异，而且NON-ATRA组与PBS对照组没有差别说明PH1不是一个治疗多肽，诱导肿瘤相关巨噬细胞分化，减少肿瘤相关细胞数量就全反式维甲酸在起作用。其余含有PH1多肽的组在减少肿瘤相关巨噬细胞的数量上与PBS组相比较有显著性差异，说明PH1多肽可以很好的靶向肿瘤相关巨噬细胞，并且只有全反式维甲酸被输送到肿瘤相关巨噬细胞内才会发挥诱导明显的分化的作用。 

步骤三、全反维甲酸多肽脂质体体内诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化和表型的变化 

从上述步骤二的实验结果中优选出5个处方进行体内诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化试验。这5个处方分别是2%PH1+2%PEG，2%PH1+4%PEG，,2%PH1，4%PH1，2%PEG并制备浓度15mg/ml这5种脂质体。将Balb/c小鼠随机分成6组，每组3只。每只小鼠接种1x1064T1乳腺癌肿瘤细胞。待肿瘤长到100mm³开始按每组处方给药，每两天给药一次，每只小鼠200μl。4次给药后，将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，小心取出肿瘤，在冰上切碎肿瘤组织。转移至含1ml胶原酶（collagense IV）消化液的15ml离心管中，轻轻的涡旋混匀（37摄氏度，200转/分钟），消化2小时后，过40μm膜至50ml离心管。离心弃上清，加入红细胞裂解液5ml,37裂解5分钟，PBS洗两次，即制的各个小鼠的肿瘤单个细胞悬液。按实例四的步骤四的染色方法进行抗体标记。图8（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)表明含在体内与PBS对照组和2%PEG组有PH1多肽的组在减少肿瘤相关巨噬细胞的数量上与PBS组相比较有显著性差异，说明PH1多肽可以很好的靶向肿瘤相关巨噬细胞，并且只有全反式维甲酸被输送到肿瘤相关巨噬细胞内才会发挥诱导明显的分化的作用。图9可以看出有PH1的组肿瘤相关巨噬细胞（CD11b+GR1+F4/80+）CD11b 表型数量减少，GR1表型数量减少，F4/80表型数量不变，说明全反式维甲酸多肽脂质体可以很好的诱导肿瘤相关巨噬细胞分化为正常的巨噬细胞。从而一方面减少肿瘤相关巨噬细胞的促肿瘤的生长、转移，另一方面给增加正常巨噬细胞对肿瘤有一个杀伤的作用。这创新性的从免疫调节的角度而不是传统的直接肿瘤细胞方面探索了肿瘤治疗的新途径。 

实施例5、肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽修饰小分子干扰RNA(siRNA)脂质体

本实施例涉及两种siRNA阳离子脂质体，siRNA阳离子脂质体为肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽修饰siRNA阳离子脂质体，其制备方法包括如下步骤： 

1）取出L1阳离子脂质,胆固醇（CHOL），二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，PH1-多肽储备液，室温下平衡半小时； 

2)分别按相应摩尔比制备PEG含量0、2%、4%的多肽含量为7%的脂质体及不含多肽的对照脂质体。如：按照L1:DPPC:CHOL:PH1-多肽:=50:40:10:7（摩尔比,PH1-多肽7%）混合于茄型瓶中，充分溶解混匀； 

3)取HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于5ml离心管中，30℃预热，5～10min。将涡旋仪调至touch II档，在涡旋搅拌下，将加入脂质乙醇混合液缓慢加入20Mm pH4.0 HEPES缓冲液中，涡旋搅拌1～2min，制备含30%乙醇的脂质体混悬液； 

4)使用挤出仪，对脂质体分别过0.2μm、0.1μm、0.08μm聚碳酸酯膜11次，制备粒径小而分布均匀的空白脂质体，4℃避光保存备用； 

5）激光散射粒度分析仪（PCS）测定纳米粒子粒径分布； 

6)使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪，使用He-Ne离子(λ=633nm)为入射光，动力学光散射试验在25℃进行，反射角为1.33，角度为90°，连续检测三次的平均值作为得到的数据； 

7）按siRNA/脂质总量=1/10，取适量cy5-luciferase-siRNA溶液。将制备好的空白脂质体放置在涡旋仪上，缓慢加入siRNA溶液，37℃孵育2h； 

8）将制备好的复合物置于HEPES缓冲液(20mM pH4.0)于中，4℃下透析4h。然后取出，继续在pH7.0PBS溶液中，4℃下透析12h。透析结束收集于离心管中，即为脂质基因复合物，4℃保存备用； 

9）激光散射粒度分析仪（PCS）测定纳米粒子粒径分布； 

10）使用的仪器是英国马尔文公司的ZetaSizer3000H激光粒度仪，使用He-Ne离子激光(λ=633nm)为入射光，动力学光散射试验在25℃进行，反射角为1.33，角度为 90°。连续检测三次的平均值作为得到的数据。 

效果验证： 

（1）肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽修饰siRNA脂质体的表征如下表3所示： 

表3 

（2）不同比例多肽脂质的siRNA阳离子脂质体与细胞结合能力考察 

1)分离肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、正常小鼠单核细胞（Monocyte）细胞，计数，1640调整细胞浓度至2×106个/ml。24孔板，每孔200μl细胞悬液； 

2）避光条件下，各种待测细胞中加入不同脂质体50μl(siRNA每孔0.5μg，终浓度2μg/ml)，37℃下避光静置孵育4.5小时； 

3）孵育结束后，弃去细胞培养液，加入PBS+2%FBS缓冲液400μl/孔,300g,10min,离心洗涤3次彻底清洗； 

4）利用流式细胞分析仪，在FL-4的激发光通道下计数10,000个细胞，分析细胞荧光强度分布及平均值； 

由图10可知：在与肿瘤相关巨噬细胞结合实验中多肽修饰的MC3脂质体的Cy5-siRNA荧光强度高于无多肽修饰的MC3对照脂质体。并且在对照细胞Monocyte中两者无明显差异。说明PH1脂质体可以包载siRNA,并与肿瘤相关巨噬细胞细胞产生特异性结合或者内吞作用。 

实施例6、肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽修饰阿霉素脂质体

本实施例涉及一种阿霉素脂质体，该脂质体为MDSCs靶向多肽修饰阿霉素脂质体，其制备方法包括如下步骤： 

1)取出EPC,CHOL，PH1的储备液,平衡至室温； 

2)按照EPC:胆固醇=2:1（摩尔比）比例混合于茄型瓶中，加入适量氯仿，充分溶解混匀； 

3)室温下用旋转蒸发仪旋转蒸发，使氯仿挥干，形成脂质薄膜； 

4)加入(NH₄)₂SO₄-HEPES缓冲液（硫酸铵(NH₄)₂SO₄ 125mM,HEPES 20mM,pH4.0）至10mg/ml总脂质浓度，振荡并超声大约3～5min使脂膜分散； 

5)水浴超声至脂质体溶液透明，利用挤出仪及100nm孔径聚碳酸酯膜，减小粒径； 

6)空白脂质体用3500分子量的透析袋按照1:150（脂质体:透析液）体积比在HEPES(20mM,PH7.5)缓冲液中透析2h，4℃保存。彻底去除脂质体外水相中的硫酸铵及游离多肽成分，制成空白脂质体； 

7)将盐酸阿霉素溶解于HBS（氯化钠NaCl 150mM,HEPES 20mM,pH7.5）中至5mg/ml； 

8)将空白脂质体转移至离心管中，按照脂质∶阿霉素=10:1(w/w)的比例震荡混合均匀，在恒温震荡器中60℃震荡孵育1小时，得到阿霉素脂质体； 

9)利用激光粒度仪测量脂质体的粒径及分布，置于4℃备用； 

效果验证： 

（1）肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽修饰阿霉素脂质体的表征如下表4所示： 

表4 

处方	粒径Diameter(nm)	多分散系数（PDI）
			2%PEG	132.37±2.57	0.17±0.01
2%PEG+阿霉素	140.00±3.83	0.07±0.05
			2%PH1	126.53±2.67	0.06±0.01
2%PH1+阿霉素	130.07±2.31	0.17±0.02

（2）肿瘤相关巨噬细胞靶向多肽载药脂质体的CCK-8细胞毒性研究 

采用CCK-8法检测细胞存活率来表示阿霉素的细胞毒性作用。按照以下步骤进行检测，每个实验至少重复3次； 

1）将MDSC细胞悬液以2×105个/孔的密度接种于96孔培养板，培养基量为100μl/孔，37℃、5％CO2培养箱中培养； 

2）向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。每次实验设置游离阿霉素药物组,对照脂质体阿霉素药物组(2%PEG)、多肽脂质体阿霉素药物组(2%PH1)、对照组（种有细胞，加不含药物的培养基）和空白组（无细胞只加培养基）； 

通过计算，每个药物组分别加入阿霉素浓度为50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的相应药物溶液（无血清培养基稀释）， 共7个浓度梯度，每个样品浓度重复3孔，各孔迅速加入药物混匀，继续培养2～4h； 

3）离心去上清，PBS洗涤细胞1次后，加入含10%胎牛血清新鲜培养基，继续培养24h； 

4）向每孔加入10μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)，培养箱内孵育1～4小时（具体培养时间要观察，隔一段时间取出细胞看看颜色）； 

5）酶标仪检测各孔光吸收值（OD）值，检测波长为450nm，记录结果。用细胞存活率对药物剂量对数作图绘制药物浓度-细胞存活率曲线。 

由图11可以看出，PH1修饰的脂质体阿霉素的细胞毒性作用均优于非靶向的对照阿霉素脂质体，而更接近于游离阿霉素。游离阿霉素是极容易透过细胞膜进入细胞的小分子药物，但在体内缺乏靶向性分布在全身各个器官，对正常细胞、组织有很大的毒副作用，这能够通过用脂质体包裹阿霉素引起被动靶向作用而减小毒副作用。但在体外的细胞毒性研究中，正如我们的细胞毒性结果，表明脂质体阿霉素的细胞毒性较之有游离阿霉素减小，这可能是由于游离阿霉素比阿霉素脂质体更容易穿透细胞膜进入细胞内。因此，多肽PH1的修饰能增强脂质体阿霉素在体外的细胞毒性，表明配体PH1能有效导向载药脂质体特异靶向肿瘤相关巨噬细胞并促进细胞对其的内吞，不仅提高了脂质体的对细胞的选择性给药作用而且还增强了脂质体阿霉素的细胞毒作用。 

实施例7、全反维甲酸多肽脂质体体内半衰期以及药效学试验

阿维A购自上海东方公司； 

步骤一，全反式维甲酸多肽脂质体半衰期试验 

1)按实例二的步骤一制备2%PH1+2%PEG，4%PEG两类脂质体； 

2）标准曲线的绘制 

分别量取SD大鼠血浆0.1mL,精密配制成一系列不同质量浓度的维甲酸溶液,按实例二包封率色谱条件条方法操作,以阿维A为内标物，以维甲酸与内标物的峰面积比值As/Ai对样品中维甲酸质量浓度做线性回归，图12表明了在0.1～8μg/mL内线性关系良好以及标准曲线方程表明； 

3)将200g的SD大鼠随机分为2组分别为2%PH1+2%PEG组，4%PEG组，每组3只，按组每只尾静脉注射500μl两类脂质体，分别股静脉注射两种全反式维甲酸脂质纳米粒溶液和全反式维甲酸对照液,剂量为10mg/kg。于给药前和给药后0，15，1，2，4，6，8和12h取静脉血0.16mL,3000r/min离心5min,分离出血浆于-20℃冰箱保存待测； 

4)样品处理方法:血浆样品0.1ml,加入2.5μg/mL内标阿维A溶液10μL旋涡振荡5min,每个样品加入100μl乙腈，旋涡振荡5min，10000r/min离心10min,取上清液用高效液相色谱法测定全反式维甲酸药物浓度，进样量为20μL，色谱条件实例二包封率的测定方法； 

5）绘制全反式维甲酸脂质体半衰期曲线如图13所示，利用kinetics计算半衰期2%PH1+2%PEG组为4.30h，4%PEG组为3.99h； 

步骤二，全反式维甲酸多肽脂质体药效学试验 

制备2%PH1+2%PEG，2%PH1+4%PEG,2%PH1，4%PH1，2%PEG浓度15mg/ml 5组种脂质体。将Balb/c小鼠随机分成6组，每组3只。每只小鼠接种1x1064T1乳腺癌肿瘤细胞。待肿瘤长到100mm³开始按每组处方给药，每两天给药一次，每只小鼠200μl。每天测量肿瘤大小，共测量18天。图14表明与2%PEG和PBS两个对照组相比，2%PH1+2%PEG，2%PH1+4%PEG，,2%PH1，4%PH1具有明显抑制肿瘤生长的效果。 

综上所述，通过长期试验发现并证明PH1多肽可以很好的靶向肿瘤相关细胞、诱导其分化和抑制肿瘤生长，PH1多肽脂质体的复合物可以很好的靶向肿瘤相关巨噬细胞，可以应用于小分子药物和基因药物的肿瘤相关巨噬细胞的靶向输送，本发明中的全反式维甲酸多肽脂质体可以有效诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化和抑制肿瘤的生长，可以应用于抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤复发，因此具有极大的医疗实用性。 

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。 

Claims (10)

1.一种配体多肽PH1在制备特异性结合肿瘤相关巨噬细胞药物中的用途，所述配体多肽PH1的结构为苏氨酸-蛋氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-组氨酸-酪氨酸。

2.一种药物输送系统，其特征在于，所述药物输送系统包括权利要求1所述的配体多肽PH1、载药系统和至少一种活性物质；所述多肽PH1连接于所述载药系统表面。

3.如权利要求2所述的药物输送系统，其特征在于，所述载药系统为以下任一结构或其组合结构：纳米粒子、聚合物、脂质体、囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、脂蛋白。

4.如权利要求2所述的药物输送系统，其特征在于，所述活性物质为抗肿瘤药物，抗代谢药物，细胞毒性/抗生素，光敏剂，激酶抑制剂，抗炎药物，免疫抑制剂，抗感染用药物或抗病毒药物。

5.如权利要求2所述的药物输送系统，其特征在于，所述活性物质为用于超声造影、放射造影、核医学造影剂的诊断试剂，目的基因、反义基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因、siRNA,mRNA,或上述基因的组合，或含上述基因的真核表达载体DNA。

6.如权利要求2所述的药物输送系统，其特征在于，所述活性物质为全反式维甲酸。

7.一种制备权利要求6所述药物输送系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将PH1多肽脂质、脂质材料和全反式维甲酸溶解，获得脂膜和全反式维甲酸的混合物；

步骤2，将所述多肽脂质、脂质材料和全反式维甲酸的混合物旋转蒸发得到一层均匀的脂膜产物；

步骤3，将所述的脂膜产物水合得到水合产物；

步骤4，将所述水合产物通过聚碳酸酯滤膜挤出器挤出，获得全反式维甲酸、多肽与脂质体的复合物。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述脂质材料为蛋黄磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；其中，蛋黄磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、多肽脂质的摩尔比为（15-20）：（10-12）：（0.5-1.1）：（0.5-1.1）；

所述全反式维甲酸与所述脂质材料质量比为(18-22)：(1-1.2)；

所述滤膜挤出器的聚碳酸酯膜孔径为依次为400nm、200nm、80nm。

9.一种如权利要求2所述的药物输送系统在制备特异性的靶向肿瘤相关巨噬细胞、诱导肿瘤相关巨噬细胞分化、抑制肿瘤增殖和复发药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述肿瘤相关巨噬细胞为乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌胰腺癌、大肠癌、基底细胞癌、黑色素瘤、滤泡性淋巴癌、小淋巴细胞瘤的相关巨噬细胞。

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