CN103820473A - 加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。它过量表达了生物合成丰加霉素的关键酶-腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628更高的丰加霉素合成能力。构建过程如下：1）构建表达载体pIB139-toyG； 2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。利用pIB139载体上的启动子permE*启动toyG基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-toyG特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。与原始菌株相比，重组菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了至少1.2倍，丰加霉素产量至少提高27.1%。

Description

加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

技术领域

本发明涉及通过加强toyG基因在淀粉酶产色链霉菌的表达提高丰加霉素产量，属于基因工程技术领域。

背景技术

丰加霉素是一种新型核苷类抗生素，分子式为C₁₂H₁₃N₅O₄，核糖C₁连接类似鸟嘌呤的脱氮杂嘌呤环，核心结构为吡咯嘧啶核苷类似物。作用机理主要是通过抑制微生物的转录而影响菌体的生长，其生物活性研究报道主要集中在临床医学领域。近期有研究发现丰加霉素对多种植物疫病具有良好的防治效果，长期使用不会造成环境污染，而且对植物生长也具有一定的调节作用。因此，丰加霉素在农业植物病害防治领域具有的应用潜力。相对于化学合成法，生物法合成丰加霉素以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前丰加霉素工业化生产比较经济有效的方法。

丰加霉素属于次级代谢产物，合成途径复杂，受到多种因素的限制与调控，导致丰加霉素合成水平较低，难以规模化生产。解决该问题的现有办法一般都是通过传统的诱变育种作为主要手段筛选高产优质的生产菌株，但筛选到高效菌株的不确定因素多、周期长。

如何利用分子生物学等先进的技术手段改良微生物进一步提高丰加霉素的产量成为一条可行的思路。McCarty等人以一株合成丰加霉素菌株Streptomyces rimosus (ATCC14673)为起始研究对象，克隆了生物合成丰加霉素基因簇，阐明了丰加霉素的合成过程及调控机制，研究发现丰加霉素由GTP为前体，经多步反应合成丰加霉素，其中由toyG基因编码的腺苷琥珀酸合成酶是代谢途径的关键酶之一。但是利用代谢工程技术通过增加丰加霉素代谢通量而进一步提高丰加霉素产量因为涉及表达体系的建立等复杂问题未见相关报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途。

淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628是一株拮抗放线菌，其发酵液对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用，经分离提取，确定其主要有效成分为丰加霉素，尚未见淀粉酶产色链霉菌的代谢工程分子改造方面的的研究报道。

本发明首先从以淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628 (菌株的保藏编号为CGMCC NO. 2060)中克隆出编码腺苷琥珀酸合成酶的toyG基因，并将该基因与链霉菌整合型质粒pIB139连接，成功构建了携带toyG基因的重组载体pIB139-toyG，并利用接合转移法将其特异性的整合在淀粉酶产色链霉菌1628染色体上。

一种淀粉酶产色链霉菌的toyG基因，他的序列如SEQ ID NO:1 所示。

一种加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌，它表达了生物合成丰加霉素的关键酶—腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素表达能力。

所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628。

所述的腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。

所述的腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色体。

所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，过程如下：

 1）构建表达载体pIB139-toyG； 

2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。

利用pIB139载体上的启动子permE*启动toyG基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-toyG特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。

所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌的用途，与原始菌株相比，重组菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了1.2倍，丰加霉素产量至少提高了27.1%。

本发明的有益效果：

本发明加强丰加霉素生物合成途径关键酶基因toyG在淀粉酶产色链霉菌中过量表达后，重组菌腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了1.2倍，合成丰加霉素的能力比原始菌提高了27.1%。为进一步提高丰加霉素产量，早日实现工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1是重组质粒pIB139-toyG的构建示意图。

图2是重组质粒pMD18-T-toyG的酶切验证图。

1.     toyG基因；2. pMD18-T-toyG/Nde I+Not I；3. DNA Marker DL2000。

图 3是toyG基因在E.coli BL21的SDS-PAGE分析图。

1. pET28a-toyG/E.coli BL21诱导；2. Protein Marker；3. pET28a-toyG/E.coli BL21未诱导。

图4是重组穿梭表达质粒pIB139-toyG的酶切电泳验证图。

1. toyG gene；2. pIB139-toyG/Nde I+Not I；3. pIB139/Nde I+Not I；4. λ DNA/Hind III Marker。

图5是重组菌1628-TOYG的PCR电泳验证图。

1.原始菌株；2-5.基因工程菌株；6. DL2000 Marker。

具体实施方法

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1：目的基因的扩增及重组淀粉酶产色链霉菌的构建

以S. diastatochromogenes 1628染色体基因组为模板，以PtoyG F Nde I和PtoyG R Not I为引物，PCR扩增获得含有Nde I和Not I 两个酶切位点的toyG基因，与pMD18-T Vector连接，构建克隆载体pMD18-T-toyG（Nde I + Not I），将克隆载体pMD18-T-toyG（Nde I + Not I）转化至受体大肠杆菌中，涂布于含氨苄抗性的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜后，随机挑取阳性转化子酶切鉴定后送上海生工测序并进行序列分析，用Nde I 和 Not I双酶切得到含有Nde I 和 Not I 两个酶切位点的toyG基因，与同样双酶切的链霉菌整合型穿梭表达载体pIB139连接，得到重组穿梭表达载体pIB139-toyG经酶切验证后，将其转入E.coliET12567(pUZ8002)，在卡那抗性和阿泊拉霉素抗性的LB平板上筛选阳性转化子E.coliET12567(pUZ8002，pIB139-toyG)，以E.coliET12567(pUZ8002，pIB139-toyG)为供体，淀粉酶产色链霉菌为受体，利用接合转移法将pIB139-toyG特异性的整合在淀粉酶产色链霉菌S. diastatochromogenes 1628染色体上，在阿泊拉霉素抗性MS平板上筛选阳性转化子，即得到重组淀粉酶产色链霉菌1628-TOYG。

以S. diastatochromogenes 1628 染色体为模板，设计两条引物， PCR扩增toyG，引物设计如下：

toyG F Nde I：5’-CGCCATATGGTGCCCGCACTTGTGCTG -3’

toyG R Not I：5’-CGCGCGGCCGCCTACAGGAAGGAGTTGATC-3’ 

重组质粒pMD18-T-toyG以限制性内切酶Nde I 和 Not I双酶切验证如图2所示，重组质粒pMD18-T- toyG双酶切获得约1.3kb和2.7kb的DNA片段，分别与toyG基因片段和质粒pMD18-T的大小一致，说明重组克隆载体连接正确。对重组质粒pMD18-T-toyG进行测序，序列分析表明插入片段为1284 bp的序列，编码427个氨基酸，相对分子量大小分别约为47 kDa，与已报道的许多链霉菌属的腺苷琥珀酸合成酶基因具有较高的同源性，其中最高为89%。toyG核酸序列如SEQ ID NO:1所示。将toyG基因连入pET28a载体，构建pET28a-toyG重组载体，并将重组载体转入大肠杆菌BL21，挑取阳性转化子于10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日转接，IPTG诱导表达，如图3所示，诱导后重组菌有明显的特征性条带出现，测得腺苷琥珀酸合成酶酶活力为23 U/mg总蛋白，表明toyG基因在大肠杆菌中成功表达。

整合型重组穿梭表达质粒pIB139-toyG的酶切验证结果如图4所示，重组质粒pIB139-toyG经Nde I 和 Not I双酶切释放1.3 kb的片段与toyG基因大小一致，说明质粒pIB139-toyG构建正确，以接合转移法将其特异性的整合在淀粉酶产色链霉菌S. diastatochromogenes 1628染色体上，在阿泊拉霉素抗性平板上随机挑取若干单菌落于CP培养基中培养多次后，提取染色体。PCR实验均能扩增出阿泊拉霉素抗性基因apr（图5），证明重组淀粉酶产色链霉菌1628-TOYG构建成功，且遗传稳定。

实施例2：淀粉酶产色链霉菌原始菌及重组菌的发酵性能验证

与原始菌株相比，重组菌的腺苷琥珀酸合成酶酶活提高了1.2倍；对重组菌1628-TOYG以及原始菌S. diastatochromogenes 1628进行250 mL摇瓶发酵实验，从发酵角度对淀粉酶产色链霉菌中腺苷琥珀酸合成酶酶活的增强对丰加霉素产量的提高作用进行验证。往复式摇床转速为200 r/min，28℃，发酵96h，对照组为淀粉酶产色链霉菌出发株。如表1所示，重组菌丰加霉素的产量高于原始菌，重组菌丰加霉素最终产量达到171.54 mg/L，较原始菌提高了约27.1%，且重复性良好。说明在丰加霉素生产菌株S. diastatochromogenes 1628中增强生物合成途径的关键酶腺苷琥珀酸合成酶—ToyG的表达有助于提高发酵过程中丰加霉素的产量。

表1 重组菌与原始菌最终丰加霉素产量的比较

菌体	丰加霉素产量 (mg/L)
		1628	134.97
1628-TOYG	171.54

序列表

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国计量学院

 

<120>  加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌及构建方法与用途

 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1284

<212>  DNA

<213>  Streptomyces diastatochromogenes

 

<400>  1

gtgcccgcac ttgtgctgct cggtgctcag tggggtgatg agggcaaggg aaaggccacc       60

 

gatctgctcg gtgggtcagt ggactacgtc gtgcgttatc agggcggcaa caacgccggc      120

 

cacacggtcg tcgtgggcga ccagaagtac gcactgcacc tcctcccttc cggaatcctc      180

 

tcgccggggt gcaccccggt catcggcaac ggcgtcgtcg tcgacccggc ggtcctgctc      240

 

tccgagctga gcggactcaa cgagcgcggc gtcgacacgt ccaagctgct gttgagcggt      300

 

aacgcgcatc tgatcacgcc gtacaacatc accaccgaca aggtgacgga acggttcctc      360

 

ggcaagcgga agatcggcac caccggtcgg ggcatcggcc cgacctacgc cgacaagatc      420

 

aaccgcaccg gcatccgggt ccaggacctc tacgacgagt cgatcctgac ccagaaggtc      480

 

gaggcggccc tcgacgtcaa gaaccagctg ctcaccaagc tctgcaaccg ccgcgccatc      540

 

gaggccgggc aggtcgtcga ggagctgctg ggctacgccg accagatcaa gggctacgtc      600

 

gccgacacca ccctgatcct caacaaggcc ctggacgacg acaaggtcgt gctcttcgag      660

 

ggcgggcagg gcaccctgct cgacatcgac cacggcacgt accccttcgt gacctcctcg      720

 

aacccgaccg cgggcggtgc ctgcacgggt gcgggcgtcg gccccacgaa gatcagccgg      780

 

gtcatcggca tcctcaaggc gtacaccacc cgggtgggcg ccggaccgtt cccgacggag      840

 

ctgttcgacg aggacggcga ggcgctgcgc cggatcggcg gcgagcgtgg tgtcaccacc      900

 

gggcgcgacc gtcgctgcgg ctggttcgac gcggtcatcg cccgctacgc gacccgggtc      960

 

aacggcctga cggacttctt cctcgccaag ctcgacgtcc tcaccggctg ggagcagatc     1020

 

ccggtctgcg tggcctacga gatcgacggc aagcgcgtcg aggagctgcc ctacagccag     1080

 

accgacttcc accacgcgaa gccgatctac gagatgctgc cgggctggtc cgaggacatc     1140

 

accaaggcca agaccttcgc cgagctgccg aagaacgccc aggcgtacgt caaggcgctg     1200

 

gaggagatgt cgggcgcccc gatctccgcg atcggcgtcg gccccggccg gaccgagacg     1260

 

atcgagatca actccttcct gtag                                            1284

Claims (8)

1.一种淀粉酶产色链霉菌的toyG基因，其特征在于：他的序列如SEQ ID NO:1 所示。

2.一种加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：它表达了生物合成丰加霉素的关键酶—腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG，具有比淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628更高的丰加霉素表达能力。

3.如权利要求2所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述的原始菌为淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)1628。

4.如权利要求2所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述的腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG来自于待重组的原始菌淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)。

5.如权利要求2所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述的腺苷琥珀酸合成酶编码基因toyG整合入原始菌淀粉酶产色链霉菌染色体。

6.一种如权利要求2所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于，过程如下：

1）构建表达载体pIB139-toyG； 

2）利用接合转移法将所述的表达载体整合入淀粉酶产色链霉菌染色体，获得所述的工程菌。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，利用pIB139载体上的启动子permE*启动toyG基因的表达，利用接合转移法将载体pIB139-toyG特异性的整合入淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) 1628的染色体，获得了遗传稳定的工程菌。

8.一种利用如权利要求2所述的加强了toyG表达的重组淀粉酶产色链霉菌的用途，其特征在于，与原始菌株相比，重组菌腺苷琥珀酸合成酶酶活至少提高了1.2倍，丰加霉素产量至少提高了27.1%。 

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