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CN103781908B - 用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒 - Google Patents

用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒 Download PDF

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CN103781908B CN201280040788.8A CN201280040788A CN103781908B CN 103781908 B CN103781908 B CN 103781908B CN 201280040788 A CN201280040788 A CN 201280040788A CN 103781908 B CN103781908 B CN 103781908B
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Abstract

具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸序列的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。在检测中可采用核苷酸和双标记探针（DLP）以用来检测靶核酸序列。

Description

用于核酸杂交的组合物、方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及关于核酸杂交的方法和检测的领域。
背景技术
双标记探针（DLP）包含的多核苷酸的一端用荧光染料（报告剂）（报告子，reporter）标记并且另一端用猝灭剂分子标记。这种探针通常用于各种杂交试验，包括实时PCR。在使用DLP的方法中，当探针的猝灭剂在物理上接近报告剂时，通过其中最常见的FRET（荧光共振能量转移）的物理化学机制使荧光猝灭。
通过增加报告剂和猝灭剂之间的距离迅速降低猝灭剂的猝灭效率。在单一游离的（未结合的）完整DLP分子中的猝灭剂和报告剂之间的距离可部分取决于因探针序列而定的DLP的二级结构。那些具有更多二级结构的DLP可存在于超螺旋构象中，其中猝灭剂和报道剂极为接近且猝灭效率很高。预计那些具有很少或没有二级结构的DLP存在于更松弛的构象（relaxed conformation）中，其中猝灭剂和报告剂是进一步分开的且猝灭效率更低。具有较低猝灭效率的DLP可具有高荧光背景，因为报告剂的某些荧光可“逃避”猝灭剂的影响。在实时PCR检测中高荧光背景是不需要的，它会导致，例如引起低检测灵敏度或信号漂移的低信噪比，从而使来自阴性样品的荧光信号突破阈值。当来自研究样品的信号突破阈值时，将CT赋值给它。在自动数据分析中，其中样品鉴别是基于CT值进行的，示出信号漂移的阴性样品可分类为阳性从而导致不必要的返工。
规避具有高荧光背景的DLP的方法之一是使用如文献报道的附加通用双链探针（AUDP）替代DLP。在AUDP中，报告剂和猝灭剂分别和2个不同的彼此相连的探针复合物分子的5’和3’末端连接。因此报告剂和猝灭剂总是极为接近直到将带有猝灭剂的探针置换并释放荧光。然而由于它们的通用性质，AUDP不能提供DLP所提供的用于PCR检测的附加特异性门（specificity gate）。
人们需要克服上述的常规杂交探针和检测的限制，尤其要提供可有效增强核酸探针特别是双标记核酸探针的性能的组合物、方法和试剂盒。
发明内容
一方面，本发明提供了具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。
另一方面，本发明提供了一种组合物，包含：
a）具有与第二核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游；以及
b）用于检测靶序列的核酸探针，其中探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段；
其中第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的。
在某些方面，本发明提供了一种用于测定样品中存在靶核酸的方法。该方法包括在多核苷酸存在下使样品和探针接触。多核苷酸具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游。探针是用于检测靶核酸的核酸探针。探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段。第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的。
在其他方面，本发明提供了一种试剂盒。试剂盒包含具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，该第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。
附图说明
图1是本发明的“探针包装（probe wrapper）”与探针杂交的一个实施方式的示意图。
图2是本发明的某些实施方式的示意图：描述了具有如SEQ ID NO:1所给出的序列的探针以及如SEQ ID NO:2所给出的序列的探针包装。荧光团；猝灭剂●。
图3是示出一个实施方式中的探针包装和探针的示意图，其中探针与靶序列杂交。
具体实施方式
在一方面，本发明提供了用于检测靶核酸序列的核酸探针的杂交的多核苷酸（在此也称之为“探针包装”）。一般地，在规定条件下，探针包装与核酸探针的上游和下游区域都有杂交。
图1示意性地示出了探针包装1通过互补碱基对3与DLP2杂交的一个实施方式。在图1中所示的实施方式中，探针包装是具有与第二多核苷酸片段5邻接的第一多核苷酸片段4的单链多核苷酸，其中第二多核苷酸片段5位于第一多核苷酸片段4的下游。第一多核苷酸片段4的序列和定义探针2的第一探针片段6的第一探针序列是互补的，探针2还包含第一探针片段6下游的第二探针片段7，第二探针片段7也包含核酸序列。探针包装1的第二多核苷酸片段5的序列和探针2的第二探针片段7的序列是互补的。在图1中，将探针2描述为进一步包含分别在其5’和3’末端的报告剂8和猝灭剂9。
一般地，第一探针片段，第二探针片段，或两者都和靶序列是完全或充分地互补的以允许探针以序列特异性的方式与靶标杂交。
虽然，在某些实施方式中，探针包装的第一和第二多核苷酸片段的序列与探针的第一和第二探针片段的序列是完全互补的，但在其他实施方式中，探针包装与探针的杂交不限于通过完全互补的序列使它们各自的片段退火（annealing）。换言之，只要多核苷酸（即探针包装）与探针特异性结合，退火片段的序列就不必完全互补；可包括一或多个通用碱基，例如，肌苷或5-硝基吲哚；以及可部分包括不互补的碱基或序列。
在一个实施方式中，探针包装的第一多核苷酸片段的序列和探针的第一探针片段的序列的反向互补序列是同源的。在另一个实施方式中，第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段序列的反向互补序列之间的同源性百分比至少约为90%，例如，约90%至约100%，以及约94%至约96%。在某些实施方式中，第一多核苷酸片段的序列是第一探针片段的序列的反向互补序列。
在另一实施方式中，探针包装的第二多核苷酸片段的序列和探针的第二探针片段的序列的反向互补序列是同源的。在另一实施方式中，第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列的反向互补序列之间的同源性百分比至少约为90%，例如，约90%至约100%，以及约94%至约96%。在某些实施方式中，第二多核苷酸片段的序列是第二探针片段的序列的反向互补。
在优选的实施方式中，探针包装能够与具有报告剂和猝灭剂的DLP杂交。
例如，在某些实施方式中，DLP是在一端用荧光染料（报告剂）标记以及相对端用猝灭剂分子标记的单链多核苷酸。在不持有任何特定理论的情况下，认为当猝灭剂在物理上接近报告剂时，通过其中最常见的为荧光共振能量转移（FRET）的物理化学机制使荧光猝灭。在规定条件下，本发明的探针包装与DLP的上游和下游的片段都可以杂交，因此报告剂和猝灭剂的定位彼此极为接近（图1）。这种“包装（wrapping）”可提高通过猝灭剂分子猝灭荧光的效率，从而降低例如PCR周期的检测期间的游离形式（即，在靶标检测中无约束或未结合）的DLP的荧光背景。这致使可产生假阳性结果的信号漂移的消除或显著减少。进一步地，DLP和探针包装之间的相互作用是可逆的，例如，在PCR周期中的变性步骤期间使分子分离以确保DLP对于靶标检测的下一周期的有效性。
在设计探针包装时，例如，对于使用有相互作用标记（例如，报告剂/猝灭剂）的DLP，在试验条件和检测温度下，探针包装的上游和下游片段（即分别为第一和第二多核苷酸片段）应具有足够长度，当DLP没有与靶标结合时，探针包装和探针是相关联的，并且探针的标记基团保持彼此极为接近。根据使用的检测条件，探针包装的第一和第二多核苷酸片段中的每一个的长度各自可达至少约3个核苷酸，例如，约3至约50个核苷酸，约5至30个核苷酸，约9至约20个，以及约11至约15个核苷酸。在一个实施方式中，每个片段的长度各自为约9至约11个核苷酸。进一步地，也可根据包括探针和/或靶序列的检测条件使用更大长度（例如，大于约50个核苷酸）的探针包装片段。可参考探针和/或靶序列选择探针包装的每个多核苷酸片段的实际长度，如此在检测步骤期间在靶标缺失的情况下探针仍能与探针包装结合。
如图2中所述的探针包装/探针，探针包装的第一和第二多核苷酸片段表示为每个具有11个核苷酸的长度，与探针的各自的片段是完全互补的，探针是具有总长为30个核苷酸的单链核苷酸。
在某些实施方式中，探针包装与具有单对的标记基团的DLP结合。在其他实施方式中，DLP具有多于一对的标记基团。进一步地，不必将标记对的成员之间对应的分子一一对应，尤其是其中一个成员可影响其他成员的多于一个分子或被其影响。标记基团可相互作用，使得至少一个基团可以邻近相关的方式改变另一标记基团的至少一种可物理度量的特征。可根据探针是否与探针包装或靶标结合检测标记对的特征信号的不同。在某些实施方式中，标记对包含与两个或更多猝灭基团配对的一个荧光基团。
例如，参见图1，优选的标记基团是单个FRET对，更优选的是荧光团8和猝灭剂9。在该实施方式中，特征信号是特定波长的荧光。当探针与探针包装结合时，猝灭剂基团能够猝灭来自报告剂基团的荧光，其中若通过适当频率的光激发报告剂基团，则测定相对较低或约为0的在第一水平（级，level）的荧光信号。当探针没有与探针包结合时，猝灭剂基团不能像其中探针和探针包装彼此结合一样有效猝灭来自报告剂基团的荧光，其中若通过适当频率的光激发报告剂基团，可测定优选大于第一水平的第二水平的荧光信号。进一步地，若存在靶序列，可测定在第三水平的信号，其中第三水平大于第一水平和第二水平的任一个。
在某些实施方式中，在检测条件期间，在没有靶序列的检测条件下探针包装足够强的可逆结合至探针，但探针与其靶序列的杂交足够弱，如果存在的话，在热力学上优于探针包装与探针的相互作用。
在某些实施方式中，荧光染料包括但不限于FAM、BODIPY FL、Cy3TM、Cy3.5TM、Cy5TM、Cy5.5TM、EDANS、荧光素、HEX、IAEDANS、JOE、俄勒冈绿TM（Oregon GreenTM）、(LC)Red640、(LC)Red705、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明、德克萨斯红TM（Texas RedTM），或它们的组合。
在其他实施方式中，猝灭剂染料包括但不限于BHQ-1TM、BHQ-2TM、BHQ-3TM、DABCYL、诸如金纳米颗粒的金属簇和QSY7TM。
在一个实施方式中，相互作用标记包括但不限于供体/受体对，例如，FAM/BHQ-1、荧光素/四甲基罗丹明、荧光素/荧光素、荧光素/QSY7、荧光素/LC RED640、荧光素/LC Red705IAEDANS/荧光素、EDANS/DABCYL、BODIPY FL/BODIPY FL、TET/BHQ-1、JOE/BHQ-1、HEX/BHQ-1、俄勒冈绿/BHQ-1、TAMRA/BHQ-2、ROX/BHQ-2、Cy3/BHQ-2、Cy3.5/BHQ-2、德克萨斯红/BHQ-2、德克萨斯红/BHQ-2、Cy5/BHQ-3和Cy5.5/BHQ-3。
其他有用的标记对包括报告剂酶和合适的抑制剂。
在另一实施方式中，探针包装能够分别与具有用FAM和BHQ1标记的5’和3’末端的DLP杂交。
虽然第二片段与第一片段邻接并直接在其下游，如图1所示，在其他实施方式中，探针包装可进一步包含在第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段之间的间隔子。
本文中术语“间隔子”是指具有连接到探针包装的第一多核苷酸片段的第一末端和连接到其第二多核苷酸片段的第二末端的分子。因此，间隔分子将第一和第二片段隔离但与两者相连。间隔子可直接合成或优选的是作为整体连接到探针包装上的特定位置。间隔子内的结合可包括但不限于碳-碳单键、碳-碳双键、碳-氮单键或碳-氧单键。本发明中适用的间隔子包括例如含有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶作为碱基以及脱氧核糖作为结构元件的核苷酸。进一步地，然而，核苷酸也可包含本领域内公知的任何人工碱基，它能够利用上述碱基中的至少一个（例如肌苷）进行碱基配对。优选的间隔子也包含可具有可变长度的胸苷间隔子。间隔子还可具有合适的活性基团，优选的位于用于连接到第一和第二片段的每个末端。例如，这种活性基团可包含羟基、巯基、醛基、酰胺基和硫代酰胺基团。此外，间隔子可具有侧链或其他取代基。活性基团可通过本领域公知的合适的方法发生反应，例如，优选地，间隔子和探针包装片段之间的共价键可形成具有在第一和第二探针包装片段之间的间隔子的单一连续探针包装分子。
在一个实施方式中，探针包装具有3’末端，其被修饰以防止由聚合酶的聚合酶延伸。在另一个实施方式中，探针包装包含用磷酸基团、磷酸酯或反向3'--3'键修饰的3’末端。其他的阻断方法和类型已为本领域技术人员熟知并可利用探针包装容易的实施以阻止它的3’末端的聚合酶延伸。
探针包装和DLP的非限制性实例在表1中提供。
表1：DLP和包装的序列的实例
本领域普通技术人员将认识到的一个问题是往往不能准确预测在复杂溶液中的核酸分子的行为，因此，在根据本发明剪切探针包装和/或探针以达到特定检测条件下的最佳化时实证检验是非常有用的。
在其他方面，本发明提供了包含探针包装和探针的组合物。
在某些实施方式中，组合物包含：
a）探针包装，其中探针包装是具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，其中第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游；以及
b）用于检测靶序列的核酸探针，其中探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段；
其中第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的。
在一个实施方式中，第一多核苷酸片段的序列是第一探针片段的序列的反向互补序列。在另一个实施方式中，探针包装的第二多核苷酸片段的序列和探针的第二探针片段的序列的反向互补序列是同源的。
在优选的实施方式中，在检测温度的杂交条件下，特别是在没有靶核酸链的情况下探针核酸链可逆退火（anneal to）至探针包装核酸链以形成具有探针/探针包装Tm的探针/探针包装复合物，其中在靶核酸链存在时，探针核酸链优先退火至靶核酸链以形成探针/靶标Tm。
优选地，探针/靶标Tm大于探针/探针包装Tm。在另一实施方式中，探针/探针包装Tm大于检测温度。
在某些实施方式中，其中探针包含信号产生报告剂（例如，荧光团），当探针退火至探针包装时，可测定在第一水平的报告剂信号。在其他实施方式中，第一水平小于存在靶序列的测定的信号。
在一个实施方式中，探针进一步包含报告剂和猝灭剂。
在不持有任何特定理论的情况下，认为探针/探针包装链的分离是由探针/靶标螺旋结构的热力学驱动的。在检测条件下探针/靶标螺旋结构可克服探针/探针包装对的吸引力。
本发明的核酸分子包括可从DNA、RNA或它们的组合制备的探针包装和探针。进一步地，除了参与和探针序列杂交的单链片段之外，在其他实施方式中，核酸分子也可进一步包含双链的核酸区域。进一步地，核酸分子可包括已修饰的核苷酸。修饰的核苷酸间键（internucleotide linkage）在包含脱氧核苷酸和核苷酸的核酸分子中是有用的，例如，改变杂交强度以及对非特异性降解和核酸酶的耐受性。核苷酸之间的键可包括不同于磷酸二酯键的键，例如肽键。修饰的核苷酸间键为本领域技术人员熟知并包括甲基膦酸酯键、硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、亚磷酰胺键（phosphoroamidite）和磷酸酯键。脱磷酸键（dephospho-linkage）作为核苷酸之间的桥也是已知的，并且包括硅氧烷桥、碳酸酯桥、羧甲基酯桥、乙酰亚胺（acetamidate）桥、氨基甲酸酯桥和硫醚桥。具有诸如N-乙烯基、甲基丙烯酰氧基乙基、甲基丙烯酰胺或亚乙基亚胺核苷酸间键的“塑性DNA”有也可用于本发明的核酸分子中。“肽核酸”（PNA）特别有用，因为它对核酸酶的降解的耐受性以及因为它与天然核酸形成了更强的杂交。
在更进一步的方面，本发明提供了一种用于测定样品中至少一个靶核酸链的存在的方法。方法包括：在探针包装存在的情况下使样品和探针接触。
在一个实施方式中，探针包装是具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸的多核苷酸，第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸的下游；以及探针是用于检测靶序列的核酸探针，其中探针包含第一探针片段和位于第一探针片段下游的第二探针片段。其中第一多核苷酸片段的序列和第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸片段的序列和第二探针片段的序列是互补的，其中探针进一步包含包括荧光团和猝灭剂的FRET对。
在另一个实施方式中，在检测温度的杂交条件下，在没有靶核酸链时，第一和第二探针片段分别能够特异性的和可逆的退火至探针包装的第一和第二多核苷酸片段以形成具有探针/探针包装Tm的探针/探针包装复合物，其中在靶核酸链存在时，探针能够优先退火至靶核酸链以形成探针/靶标Tm。
在某些实施方式中，方法进一步包含在检测温度下测定探针的荧光信号的改变。
在其他实施方式中，当探针退火至探针包装时，在检测温度下测定在第一水平的荧光信号，其中在检测温度下荧光信号大于样品中存在靶核酸链的第一水平。
在更进一步的实施方式中，根据本发明的检测可以是多重的，即，在一个试验中可检测到多于一个的靶核酸分析物。典型地，在多重检测中，将在性质上与其共价附着的染料不同的多于一个的特异性核酸探针加入将要检测的混合物中。可选择染料以从每个特异性核酸探针产生可区分的荧光信号。可同时记录核酸探针的不同染料组合的信号以同时检测和/或量化对应的靶核酸。
在一个实施方式中，方法是实时PCR。在另一实施方式中，方法是在同一检测中包括多个探针包装、探针和/或靶标的多重检测。在某些实施方式中，方法是包括两个或更多个根据本发明的不同探针以及它们的对应的探针包装的多重实时PCR。
除了同源检测（homogenous assay）之外，在其他实施方式中，本发明的核酸分子可用于进行核酸微阵列的试验，因此靶核酸分析物可以是由上达至数百核酸序列，并且在某些实例中上达至数万核酸序列组成的核酸序列的混合物。这种实例特别适用于表达分析，其中许多或全部mRNA序列存在于生物系统中，例如分析从细胞培养得来的特定细胞类型。典型地，可通过利用之前在检测中用作分析物的通用引物的逆转录PCR扩增mRNA序列。在这种设定下将存在于分析物中的所有核酸序列连同一种或多种合适的探针包装同时应用于微阵列，从而允许分析物的所有核酸序列与在阵列上存在的所有核酸的相互作用。在其他实例中，靶核酸分析物包含有限数量上达至100个的核酸序列以及在某些实例中只有一个核酸序列。一般地，在微阵列分析中，通过阵列上点的位置与附着其上的探针序列之间的已知关联将产生的荧光信号转变为序列特异性结果。
本发明的核酸分子的应用包括体外诊断领域，其包括临床诊断，在分子生物学、高通量药物筛选、兽医诊断学、农业遗传学检测、环境检测、食品检测、工业过程监控、法医学和保险测试领域的研究。体外诊断和临床诊断与从体内抽取的核酸样品的分析相关，以便检测病原体（例如，病毒、细菌）的存在，疾病，或症状，它的发展阶段和/或严重程度以及患者对治疗的反应。在高通量药物筛选和开发中，与诸如抗原、抗体、受体等的其他试剂类似地使用核酸，以分析在高样本数量设置下，当暴露于一种或多种化合物时生物系统的响应，来鉴定药物先导物。兽医诊断学和农业基因测定涉及类似于体外诊断的从非人类动物或植物物种得来的样品，并提供用于农业基因产品和工艺的质量控制的方法。在环境检测中，可分析生物体和它们的表征环境介质的污染的毒素，例如，土壤、水、空气等。食品检测作为质量控制方法包括对诸如细菌和真菌等生物体的定量。在工业过程监控中，检测和/或定量核酸以表征生产过程的适当控制和/或若该过程失控则产生信号。在保险检测中，在筛选检验中标识生物体和/或它们的毒素以测定客户的风险类别或帮助审核候选人。本领域普通技术人员将认识到的一个问题是本发明的探针包装和探针可用于核酸的检测和/或定量的各种其他应用，并且正不断开发新的应用。
在一个实施方式中，本发明的核酸分子包括可在用于检测血浆捐赠和/或血浆制造的检测中使用的探针包装和探针。例如，在某些实施方式中，试验包括用于存在或不存在的诸如但不限于HIV、HCV、细小病毒、细菌、酵母等传染源的血浆捐赠和/或制造的PCR检测。
在某些实施方式中，检测和/或定量来自生物源（例如，血液、精液、唾液、尿液、脊髓液、皮肤）的RNA分子（例如，mRNA、病毒基因组RNA）。典型地，如果存在，将RNA分子转变为cDNA分子和/或进一步由PCR扩增以提供待测定的靶核酸分析物。
在其他实施方式中，检测是利用在不同环境条件下从生物系统获得的mRNA样品进行的，例如经受不同浓度的候选药物或候选药物混合物，它可提供在药物开发中要求的关于候选药物的疗效、安全性分析、作用机制和其他性能的数据。
在某些实施方式中，可运用本发明的核酸分子检测或定量可存在于样品中的DNA靶标（例如，病毒基因组DNA、DNA多态性）。
在进一步的方面，本发明提供了一种试剂盒。例如，在某些实施方式中，本发明的检测试剂盒包括至少一个设计为与探针一起使用的探针包装。探针包装可以是包含具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，第二多核苷酸片段位于第一多核苷酸片段的下游，其中第一多核苷酸片段的序列和探针的第一探针片段的序列是互补的，其中第二多核苷酸的序列和探针的第二探针片段的序列是互补的，其中第二探针片段位于第一探针片段的下游。
试剂盒也可包括探针、实施检测的说明和/或检测试剂，例如无机盐、缓冲液、核酸酶抑制剂、限制性内切酶和变性剂。试剂盒也可包括阴性和阳性对照。进一步地，扩增检测试剂盒可包括除了某些或以上全部之外的引物、核苷酸和/或聚合酶。
试剂盒内的各成分可从商业上或根据本领域已知方法制作获得。此外，试剂盒的各成分可视情况处于溶液状态或冻干状态。在一实施方式中，各成分处于同一区室，而在另一实施方式中，各成分处于单独区室。
提供以下实施例仅供说明。
实施例
实施例1
测定HIV
利用使用标准实验方案的实时PCR（RT-PCR）技术测定血浆样品中HIV RNA的存在。对HIV阴性的正常人血浆样品可用作阴性对照。
在预混液存在下使从血浆中提取的HIV RNA进行单步逆转录酶、实时PCR扩增，该预混液包含缓冲液、Mg2+离子、dNTP、DMSO、MMLV逆转录酶、Taq聚合酶、HIV特异性引物以及含有或未含有探针包装1的探针1。逆转录酶、实时PCR反应是在热循环条件下根据探针/探针包装解链温度利用AB7300（Applied Biosystems公司，福斯特市，加利福尼亚州）实施的。PCR扩增后，利用本领域内已知的序列检测系统（SDS）软件（Applied Biosystems公司，福斯特市，加利福尼亚州）分析产生的荧光信号。
结果显示在HIV阳性血浆样品中HIV的检测的CT值低于40。在探针包装存在时在设定阈值下阴性对照具有低荧光背景残留。在没有探针包装时，某些样品的阴性对照中的荧光背景超过设定阈值CT低于40，产生假阳性结果。

Claims (13)

1.一种具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述探针的第二探针片段的序列是互补的，其中，所述第二探针片段位于所述第一探针片段的下游，并且其中，所述多核苷酸由如在SEQ ID NO:2中给出的序列组成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的所述序列分别为所述第一探针片段和第二探针片段的所述序列的反向互补。
3.一种组合物，包含：
a)具有与第二核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述多核苷酸由如在SEQ ID NO:2中给出的序列组成；以及
b)用于检测靶序列的核酸探针，其中，所述探针包含第一探针片段和位于所述第一探针片段下游的第二探针片段，其中，所述探针由如在SEQ ID NO:1中给出的序列组成；
其中，所述第一多核苷酸片段的序列和所述第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述第二探针片段的序列是互补的。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的所述序列分别为所述第一探针片段和第二探针片段的所述序列的反向互补。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述核酸探针进一步包含FRET对。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述FRET对是荧光团和猝灭剂。
7.一种用于测定样品中存在靶核酸的方法，所述方法包括：
在多核苷酸存在的情况下使所述样品与探针接触，其中，所述多核苷酸具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述探针是用于检测所述靶核酸的核酸探针，其中，所述探针包含第一探针片段和位于所述第一探针片段下游的第二探针片段，其中，所述第一多核苷酸的序列和所述第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述第二探针片段的序列是互补的，其中，所述多核苷酸由如在SEQ ID NO:2中给出的序列组成，并且其中，所述探针由如在SEQ ID NO:1中给出的序列组成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述探针进一步包含FRET对。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述FRET对是荧光团和猝灭剂。
10.根据权利要求7所述的方法，进一步包括在检测温度下测定所述探针的荧光信号的变化。
11.一种试剂盒，包含具有与第二多核苷酸片段邻接的第一多核苷酸片段的多核苷酸，所述第二多核苷酸片段位于所述第一多核苷酸片段的下游，其中，所述第一多核苷酸片段的序列和用于检测靶核酸的探针的第一探针片段的序列是互补的，其中，所述第二多核苷酸片段的序列和所述探针的第二探针片段的序列是互补的，其中，所述第二探针片段位于所述第一探针片段的下游，其中，所述多核苷酸由如在SEQ ID NO:2中给出的序列组成，并且其中，所述探针由如在SEQ ID NO:1中给出的序列组成。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，进一步包含所述探针。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段的序列分别为所述第一探针片段和第二探针片段的序列的反向互补。
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