CN103768080A - 一种抗耐药肿瘤的靶向制剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药物制剂，尤其是一种抗耐药肿瘤的靶向制剂、制备方法及应用，属于制药技术领域。抗耐药肿瘤的靶向制剂，由A、B、C、D四部分组成，所述A部分为金纳米粒，B部分为聚乙二醇，C部分为腙键，D部分为化疗药物。本发明将阿霉素和金纳米粒通过腙键相连接制备的靶向金纳米递药系统具有酸敏感特性，可将阿霉素特异地释放到pH小于6的环境，实现对耐药肿瘤内微环境（溶酶体和内涵体，pH小于6）的特异性响应。其有益效果是：满足耐药肿瘤治疗的需求，同时降低阿霉素毒副作用。

Description

一种抗耐药肿瘤的靶向制剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种药物制剂，尤其是一种抗耐药肿瘤的靶向制剂、制备方法及应用，属于制药技术领域。

背景技术

目前，化学治疗已和手术治疗、放射治疗成为恶性肿瘤不可或缺的重要治疗手段。临床化疗过程中，近年来新的化疗药物不断出现,恶性肿瘤化疗失败的现象却屡见不鲜,其主要原因就是长期应用抗肿瘤药物后所形成的肿瘤多药耐药（multidrug resistance,MDR）现象。MDR是指在化疗过程中，当肿瘤细胞对某种治疗药物产生耐药性后,对未接触过的、结构不同、作用机制各异的其他抗肿瘤药物具有交叉耐药性。MDR是当今肿瘤治疗的一大难题,据美国癌症协会估计，90%以上的肿瘤患者死于不同程度的耐药。1970年，Biedler等首次观察到了MDR现象，从此之后,人们对产生MDR的诸多机制进行了深入的研究，主要包括膜蛋白介导的MDR，酶类介导的MDR和细胞凋亡基因介导的MDR。其中，由膜蛋白介导的药物外排是产生MDR最为重要的机制。目前所知的与MDR相关的膜转运蛋白主要包括P-糖蛋白（P-gp），多药耐药相关蛋白（MRP1-9），肺耐药相关蛋白（LRP）和乳腺癌耐药蛋白（BRCP）。

目前，肿瘤MDR的逆转策略主要体现在4个方面，一是对原有的抗肿瘤药物进行结构改造，开发新的不易产生耐药性的抗肿瘤药物；二是开发针对P-gp等耐药机制的化疗增敏剂，但这些化疗增敏剂普遍存在中毒剂量与有效剂量相近，难以达到逆转有效浓度，以及作用靶点单一，选择性低等问题，而且逆转剂与化疗剂合并使用，可能导致抗肿瘤药的毒副作用加剧；三是使用表面活性剂类抑制剂，文献报道一些具有两亲性结构的表面活性剂也具有抑制P-gp的作用；四是纳米技术的应用，大量研究表明，药物载体可以增加药物在耐药组织中的药物浓度以克服MDR。

金纳米粒(gold nanoparticles,GNP)是近来出现的一种新型优良载体,它能将所负载的物质有效传递到靶部位,这些物质包括小分子药物或生物大分子,如蛋白质、DNA和RNA。由于GNP特殊的物理及化学特性,因此在传递及负载药物方面具有优势。

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种蒽环类广谱抗肿瘤药,具有强烈的细胞毒性，可广泛应用于治疗肝癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌及晚期乳腺癌。但其心脏毒性和骨髓抑制较明显，直接应用对患者正常细胞损伤比较大。化疗过程中，阿霉素对肿瘤组织特异性较差,可引起剂量限制性毒性。而且肿瘤细胞也可对多种化疗药物产生抗药性。阿霉素分子结构式：

以上问题一直限制着其在肿瘤治疗中的应用，当前迫切需要解决的技术问题是为阿霉素提供一种递药系统，以克服单纯药物在对抗耐药肿瘤时不能发挥良好药效的难题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种抗耐药肿瘤的靶向制剂、制备方法及应用，使单纯药物在对抗耐药肿瘤时能够发挥良好药效。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种抗耐药肿瘤的靶向制剂，由A、B、C、D四部分组成，所述A部分为金纳米粒，B部分为聚乙二醇，C部分为腙键，D部分为化疗药物。

其中，所述化疗药物为阿霉素。

本发明进一步提供抗耐药肿瘤的靶向制剂的制备方法，采用柠檬酸钠还原法制备柠檬酸盐保护的金纳米粒子，再使用聚乙二醇替换金纳米表面的柠檬酸制得聚乙二醇保护的金纳米粒。最后将阿霉素和金纳米粒通过腙键相连接制备得到具有抗耐药肿瘤作用的靶向制剂，具体方法包括以下步骤：

步骤一、取50mg柠檬酸钠溶于50mL去离子水中，加入0.615mL浓度为0.02g/mL的氯金酸，再加入1.2mL浓度为0.1M的还原剂，搅拌30min得到酒红色的柠檬酸盐保护的金纳米粒；

步骤二、取4mL浓度为0.28mM的聚乙二醇水溶液与柠檬酸盐保护的金纳米粒3mL混合，搅拌1h，再用去离子水透析72h，得到聚乙二醇保护的金纳米粒；

步骤三、取45mg阿霉素、100mg肼基甲酸叔丁酯溶于10mL乙醇中，加入100μL三乙胺，室温避光氮气保护反应12h，60℃减压蒸发去除有机溶剂，将暗红色产物溶于10mL二氯甲烷中，向溶液中滴加2mL三氟乙酸，室温下避光搅拌30min，40℃减压蒸发去除有机溶剂，溶于3mL去离子水中，在pH7.2水溶液中透析2d，冷冻干燥得到阿霉素腙键；

步骤四、取2mL步骤二制得的聚乙二醇保护的金纳米粒，加入98.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，室温搅拌活化过夜，再加入57.5mg N-羟基琥珀酰亚胺、60mg步骤3制得的阿霉素腙键，4℃搅拌6h，将反应液在15000rpm下离心30min收集金纳米棒，分散在2mL去离子水中，得到阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒。

在所述步骤一中，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。所述金纳米粒粒径在3-20nm。

在所述步骤二中，聚乙二醇分子量为400、600、1000、2000或5000。

本发明再进一步提供抗耐药肿瘤的靶向制剂在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

选用金纳米粒作为药物载体，通过在金纳米粒表面修饰上聚乙二醇后，增加金纳米粒体内长循环能力，实现对耐药肿瘤的被动靶向作用。

为了增加对肿瘤的靶向性释放药物，本发明将阿霉素和金纳米粒通过腙键相连接制备的靶向金纳米递药系统具有酸敏感特性，可将阿霉素特异地释放到pH小于6的环境，实现对耐药肿瘤内微环境（溶酶体和内涵体，pH小于6）的特异性响应。其有益效果是：满足耐药肿瘤治疗的需求，同时降低阿霉素毒副作用。

附图说明

图1为本发明制剂的结构图。

图2为本发明体外抗耐药肿瘤效果实验结果对比图。

图3为本发明体内肿瘤体积抑制对比图。

图4为本发明的动物实验生存曲线图。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例一

本实施例的抗耐药肿瘤作用的靶向制剂的结构如图1所示。靶向制剂由A、B、C、D四部分组成，A部分为金纳米粒，B部分为聚乙二醇，C部分为腙键，D部分为阿霉素。

一、本实施例按以下方法制备抗耐药肿瘤的靶向制剂:

步骤一、柠檬酸盐保护的金纳米粒的制备：取50mg柠檬酸钠溶于50mL去离子水中，加入0.615mL浓度为0.02g/mL的氯金酸，然后加入1.2mL浓度为0.1M的硼氢化钠。搅拌30min得酒红色柠檬酸盐保护的金纳米粒，粒径为5nm。

步骤二、聚乙二醇（分子量2000）保护的金纳米粒的制备：取4mL浓度为0.28mM的聚乙二醇（分子量2000）水溶液、柠檬酸盐保护的金纳米粒3mL混合，搅拌1h。去离子水透析72h，得聚乙二醇保护的金纳米粒。

步骤三、阿霉素腙键的制备：取45mg阿霉素、100mg肼基甲酸叔丁酯溶于10mL乙醇中，加入100μL三乙胺，室温避光氮气保护反应12h，60℃减压蒸发去除有机溶剂，将暗红色产物溶于10mL二氯甲烷中，向溶液中滴加2mL三氟乙酸，室温下避光搅拌30min，40℃减压蒸发去除有机溶剂，溶于3mL去离子水中，在pH7.2水溶液中透析2d，冷冻干燥得阿霉素腙键。

步骤四、阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒制备：取2mL步骤二制得的聚乙二醇保护的金纳米粒，加入98.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，室温搅拌活化过夜，再加入57.5mgN-羟基琥珀酰亚胺、60mg步骤3制得的阿霉素腙键，4℃搅拌6h，将反应液在15000rpm下离心30min收集金纳米棒，分散在2mL去离子水中，得阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒。

体外药物释放实验

分别配制pH5.0、pH6.5和pH7.4的磷酸盐缓冲溶液考察阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒的释药性能。将一定量的目标偶联物装入截留量为10000的透析袋中，然后置于不同pH值的磷酸缓冲液中，37℃水浴摇床孵育，于1h、2h、4h、6h、10h、14h、20h、28h、36h、44h、和56h，取出20μL水解液注入HPLC系统检测阿霉素释放量，结果如图2所示。

二、体外抗耐药肿瘤效果实验

1.细胞培养

人源乳腺癌细胞（MCF-7）和人源乳腺癌耐阿霉素细胞（MCF-7/DOX），分别使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，5%CO₂，37℃条件下培养，至细胞进入指数生长期。

2.体外抗耐药肿瘤效果实验

取对数生长期的MCF-7、MCF-7/DOX细胞，按每个孔1×10⁵个分别播种在96孔细胞培养板中，高糖DMEM培养基，5%CO₂，37℃条件下预培养24h，每个孔加入180μL阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒溶液，其中阿霉素浓度为0.001-10μg/mL，培养48或72h后，每个孔加入20μL浓度为5mg/mL的噻唑蓝，5%CO₂，37℃条件下继续培养4h，弃掉上层培养液，使用磷酸缓冲液（pH7.4）清洗培养板三次，然后每个孔加入150μL二甲基亚砜，570nm处测定样品吸光度值，通过非线性拟合得出50%抑制浓度（IC50）。结果如表1所示

表1.

表中**P<0.01具有极显著性差异。

三、体内抗耐药肿瘤效果实验

1.动物

荷瘤小鼠的模型建立：裸鼠，体重18-20g，左前支腋下皮下移植1×10⁶MCF-7或MCF-7/DOX细胞，当肿瘤体积达到0.1cm³后，模型建立成功，用于体内药效学实验。

2.体内抗耐药肿瘤效果实验

治疗方案：将模型建立成功的荷瘤小鼠随机分成3组，分别在第0天和第3天尾静脉注射生理盐水、阿霉素水溶液或阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒，剂量为10mg/kg。

肿瘤体积（V）的测定：使用游标卡尺测定肿瘤长径（L）和短颈（W），通过公式V=L×W²/2.计算得出肿瘤体积，在30天疗程内每两天测定一次，绘制肿瘤体积抑制图，结果如图3所示。

图中，**P<0.01具有极显著性差异。

四、生存期测定：在30天疗程内，每天记录各组荷瘤小鼠存活数量，绘制生存曲线图，结果如图4所示。

实施例二

本实施例按以下方法制备抗耐药肿瘤的靶向制剂，实验结果参见实施例一:

步骤一、柠檬酸盐保护的金纳米粒的制备：取50mg柠檬酸钠溶于50mL去离子水中，加入0.615mL浓度为0.02g/mL的氯金酸，然后加入1.2mL浓度为0.1M的亚硫酸钠。搅拌30min得酒红色柠檬酸盐保护的金纳米粒，粒径为10nm。

步骤二、聚乙二醇（分子量5000）保护的金纳米粒的制备：取4mL浓度为0.28mM的聚乙二醇（分子量5000）水溶液、柠檬酸盐保护的金纳米粒3mL混合，搅拌1h。去离子水透析72h，得聚乙二醇保护的金纳米粒。

步骤三、阿霉素腙键的制备：取45mg阿霉素、100mg肼基甲酸叔丁酯溶于10mL乙醇中，加入100μL三乙胺，室温避光氮气保护反应12h，60℃减压蒸发去除有机溶剂，将暗红色产物溶于10mL二氯甲烷中，向溶液中滴加2mL三氟乙酸，室温下避光搅拌30min，40℃减压蒸发去除有机溶剂，溶于3mL去离子水中，在pH7.2水溶液中透析2d，冷冻干燥得阿霉素腙键。

步骤四、阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒制备：取2mL步骤二制得的聚乙二醇保护的金纳米粒，加入98.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，室温搅拌活化过夜，再加入57.5mgN-羟基琥珀酰亚胺、60mg步骤3制得的阿霉素腙键，4℃搅拌6h，将反应液在15000rpm下离心30min收集金纳米棒，分散在2mL去离子水中，得阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种抗耐药肿瘤的靶向制剂，由A、B、C、D四部分组成，所述A部分为金纳米粒，B部分为聚乙二醇，C部分为腙键，D部分为化疗药物。

2.根据权利要求1所述抗耐药肿瘤的靶向制剂，其特征在于：所述化疗药物为阿霉素。

3.根据权利要求1所述抗耐药肿瘤的靶向制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取50mg柠檬酸钠溶于50mL去离子水中，加入0.615mL浓度为0.02g/mL的氯金酸，再加入1.2mL浓度为0.1M的还原剂，搅拌30min得到酒红色的柠檬酸盐保护的金纳米粒；

步骤二、取4mL浓度为0.28mM的聚乙二醇水溶液与柠檬酸盐保护的金纳米粒3mL混合，搅拌1h，再用去离子水透析72h，得到聚乙二醇保护的金纳米粒；

步骤三、取45mg阿霉素、100mg肼基甲酸叔丁酯溶于10mL乙醇中，加入100μL三乙胺，室温避光氮气保护反应12h，60℃减压蒸发去除有机溶剂，将暗红色产物溶于10mL二氯甲烷中，向溶液中滴加2mL三氟乙酸，室温下避光搅拌30min，40℃减压蒸发去除有机溶剂，溶于3mL去离子水中，在pH7.2水溶液中透析2d，冷冻干燥得到阿霉素腙键；

步骤四、取2mL步骤二制得的聚乙二醇保护的金纳米粒，加入98.5mg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，室温搅拌活化过夜，再加入57.5mg N-羟基琥珀酰亚胺、60mg步骤3制得的阿霉素腙键，4℃搅拌6h，将反应液在15000rpm下离心30min收集金纳米棒，分散在2mL去离子水中，得到阿霉素-腙键-聚乙二醇-金纳米粒。

4.根据权利要求3所述抗耐药肿瘤的靶向制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠。

5.根据权利要求4所述抗耐药肿瘤的靶向制剂的制备方法，其特征在于：所述金纳米粒粒径在3-20nm。

6.根据权利要求3所述抗耐药肿瘤的靶向制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，聚乙二醇分子量为400、600、1000、2000或5000。

7.一种抗耐药肿瘤的靶向制剂在制备抗耐药肿瘤药物中的应用。

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