CN103751148B - 一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球及其制备方法，该纳米微球具有双层壳的核‑壳结构，双亲性聚氨酯的亲水段为壳层，疏水段为核，药物被包裹于核心，功能分子暴露在纳米微球壳层表面，有机硅氧烷水解又会在亲水和疏水层间形成另一层壳；其中所述的药物为卡培他滨、阿霉素、紫杉醇；所述功能分子为叶酸；所述有机硅氧烷为四甲氧基硅烷。其特点是：利用生物降解高分子材料用来做药物控制释放制剂，能够使药物以最小的剂量在指定病患部位产生治疗效果，并可以通过优化药物释放速率来提高治疗效果，并且降低毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于化学药物技术领域，涉及一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球及其制备方法。
背景技术
结直肠癌(CRC)是人类死于癌症的第三大原因, 据估计，在发达国家,每年会诊断出100万新病例。化学治疗是必不可少的手段之一。
氟尿嘧啶是批准用于化学治疗结直肠癌的主要药物。卡培他滨是一种口服氟尿嘧啶,它广泛应用在单独或联合其他药物治疗结直肠癌。它结合奥沙利铂以及贝伐单抗,对结肠癌患者有一定的疗效，但同时，也产生一定的副作用。卡培他滨结合伊立替康治疗mCRC也存在一些毒副作用,尤其是腹泻。许多文献报道与卡培他滨用量相关最常见的副作用包括高胆红素血症,腹泻和手足综合症，事实上,与之相关的还有一系列的毒性包括心绞痛、心律失常和心肌梗塞等。
一个研究得较多的方法是利用新型药物传递系统来减少药物毒副作用。纳米载体的输送系统,是利用生物可降解聚合物制备的纳米颗粒(NPs)包裹药物。药物因与外界隔离而减少了生物毒性，而且药物载体的屏蔽作用增加了缓释特性。良好的生物相容性和可降解的聚合物作为载体材料，也会增加药物治疗的安全性和减少药物崩解，随着聚合物的降解，药物缓慢释放，达到最佳治疗效果。此外，利用聚合物的可修饰性，在形成微球前的聚合物分子链端或者分子链中，或者形成微球后在其表面连接靶向功能基团，使得药物到达特定部位才释放。减少了药物的损失和对正常组织的损害。
近年来，国内外学者对于卡佩他滨单独或协同其他药物的临床做了很多研究，但是将其用于缓释剂型的研究还未受到重视。
聚氨酯具有良好的生物相容性和优良的物理机械性能，对人体具有良好的生理可接受性，通过改变分子链中软硬段的组成可以改变聚氨酯的物理化学性能。此外，聚氨酯微球具有微相分离结构，良好的生物相容性，同时又具有高弹性和高强度等特点，因此可用作蛋白质、抗体、酶等的载体和药物控制释放。
四甲氧基硅烷作为二氧化硅的前驱物，能与有机溶剂以任意比例混溶，但极易水解，当把溶有四甲氧基硅烷的有机溶剂溶于水溶液中时，TMOS发生水解反应，因其疏水特性，反应发生在疏水核和亲水壳之间。因而形成了一层二氧化硅的壳。同时，因TMOS水解后暴露出氧原子，结合氢和PEG分子中的氧原子极易形成氢键，稳定了这层硅壳。由此，该载药高分子纳米纳米微球因为有了这些释放壁垒，能够使药物以更缓慢和均匀的速度释放出来。
发明内容
本发明的目的之一提供一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球。
本发明的另一目的是提供实现第一目的的一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球的制备方法。
一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球，所述纳米微球具有双壳层核-壳结构，其中核由双亲性聚氨酯的疏水段形成，抗肿瘤药物被包裹于核心，壳层由双亲性聚氨酯的亲水段形成，双亲性聚氨酯分子链上连接的靶向分子在微球形成后暴露在纳米微球壳层表面，所述纳米微球的另一个壳层由有机硅氧烷水解形成，位于由双亲性聚氨酯所形成的壳层与核之间；其中所述抗肿瘤药物为卡培他滨、阿霉素或紫杉醇；所述靶向分子为叶酸；所述有机硅氧烷为四甲氧基硅烷。
本发明是通过以下方法实现：
一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球的制备方法，所述制备方法包括以下三步：
（1）以具有良好生物相容性的亲水性化合物和疏水性化合物为原料，多异氰酸酯和低分子扩链剂通过预聚—扩链将亲疏水性化合物组合成长链，形成双亲性载体中心；
（2）将载体中心连接靶向分子；
（3）利用微乳技术将连接有靶向分子的载体中心包裹抗肿瘤药物制备得到一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的药物纳米微球。
上述方法中，所述亲水性化合物为聚乙二醇；所述疏水性化合物为聚（乳酸-羟基乙酸）、聚乳酸或聚己内酯；所述多异氰酸酯为甲苯-2,4-二异氰酸酯、L-赖氨酸乙酯二异氰酸酯或4,4′-二环己基甲烷二异氰酸酯；所述低分子扩链剂为2,2-二羟甲基丙酸。
上述方法中，步骤（3）所述微乳技术为乳化溶剂挥发法或纳米沉淀-透析法。
上述方法中，步骤（1）具体制备步骤如下：将亲水性化合物的丙酮溶液以及过量的多异氰酸酯混合，其中亲水性化合物在丙酮中的摩尔浓度为0.01-0.3mol/L,多异氰酸酯的物质的量为亲水化合物的1-1.2倍，将反应体系边搅拌边升温至70-80℃，反应1.5-2h后降温至25-40℃, 向其加入扩链剂，扩链剂与亲水性化合物物质的量之比为1.0-1.1：1，在搅拌的条件下升温至60-80℃，搅拌0.5-1h，使其混合均匀，再降温至25-40℃，向其中加入疏水性化合物，疏水性化合物的物质的量为亲水性化合物物质的量的1.1-1.3倍，即0.011-0.39mol/L的丙酮溶液，在机械搅拌的条件下升温至77-85℃，搅拌1-2h，得到聚氨酯预聚物丙酮溶液，滴加至冰无水乙醚，取沉淀于60-70℃真空干燥12-24h，得到双亲性聚氨酯PCEC，即双亲性载体中心。
上述方法中，步骤（2）所述载体中心连接靶向分子，具体方法包括以下步骤：取步骤（1）反应产物PCEC 2-5g溶于20-30mL四甲基亚砜（DMSO）中，然后加入0.02-0.08g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和0.01-0.1g的N-羟基丁二酰亚胺（NHS），室温下反应12-24h，加入端氨基叶酸（FA-PEG-NH2），其中物质的量比PCEC: FA-PEG-NH2为1:1-1:1.2，继续反应12-24h，加入50-100 mL蒸馏水搅拌均匀，冷却至室温后，于3500-5000rpm转速下离心5-10min，取上清液，在于蒸馏水中透析36-48h，每隔2-4h换一次水，后冷冻干燥，得到FA-PCEC。
上述方法中，所述乳化溶剂挥发法，具体包括如下步骤：
1）以FA-PCEC为溶质，以二氯甲烷或四氢呋喃或丙酮为溶剂，配制成浓度为10-200mg/mL的油相基质溶液，将抗肿瘤药物分散于上述基质溶液形成油相；再向所述的油相中地加入四甲氧基硅烷，在300-500rpm的转速下搅拌15-30min使其混合均匀，得到溶液A；其中所述药物的质量为FA-PCEC的5%-20%，所述四甲氧基硅烷的物质的量为FA-PCEC的1.0-1.2倍；
2）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成聚乙烯醇质量分数为0.5%-1.0%的水相溶液，即溶液B；
3）再将步骤1）所述的溶液A滴加到步骤2）所述的溶液B，水相的体积是油相的5-20倍，搅拌8-12小时，然后高速离心收集所得的纳米微球，取沉淀，加蒸馏水分散，再重复离心取沉淀的步骤，直至聚乙烯醇被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥即得到目的产物；所述搅拌为500-1000rpm，所用离心速度8000-10000rpm。
上述方法中，所述纳米沉淀-透析法，具体包括如下步骤：
1）以FA-PCEC为溶质，以二氯甲烷、四氢呋喃或丙酮为溶剂，配制成浓度为10-200mg/mL的油相基质溶液，将抗肿瘤药物分散于上述基质溶液，形成油相；并向所述的油相中地加入四甲氧基硅烷，搅拌均匀，得到溶液A；其中所述抗肿瘤药物的质量为FA-PCEC的5%-20%，所述四甲氧基硅烷的物质的量为FA-PCEC的1.0-1.2倍；
2）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成聚乙烯醇质量分数为0.5%-1.0%的水相溶液，即溶液B；
3）再将步骤2）所述的水相B逐滴滴加到步骤1）所述的油相溶液A，水相的体积是油相的2-10倍；以300-600rpm继续搅拌2小时；再于蒸馏水介质中进行透析，每2-4小时换一次水，透析36-48小时；产物冷冻干燥即得到目的产物。
从实现本发明目的方案的过程中可以看出，本发明以双亲性聚氨酯为载体，因亲疏水作用，在溶液中，亲水嵌段和疏水嵌段分别相互聚集，形成疏水嵌段在内，亲水嵌段在外的核壳结构。四甲氧基硅烷的加入使得其从油相进入水相时，逐渐水解，在纳米微球亲疏水的主体间水解而形成一层硅壳。四甲氧基硅烷的水解产物与聚乙二醇链段亦可以形成氢键，巩固了这层硅壳。从而形成药物逐层释放的结构。
聚氨酯具有很好的生物相容性，水解性及生物抗氧化性, PEG链端连接靶向制剂叶酸的化合物，因叶酸分子中带有亲水羧基连接在亲水的PEG链上在微球形成时暴露在纳米微球表面。药物分子在疏水作用下被包裹于纳米微球的内部。
本发明通过验证，验证过程根据上述具体实施方式的步骤进行，用激光粒度仪测定粒径，用透射电镜观察纳米微球结构和粒径，用紫外分光光度计测定载药量和研究其释放特性。获得了较好的验证结果。其中纳米微球粒径在200nm左右，表面光滑，载药量为7.9%-13.3%，包封率为55.9-69.3%，本发明的产品的一个较稳定的一个范围值为载药量为10.2%-13.0%，包封率为63.4%-68.3%。释药除最初几小时突释外，能持续缓慢释放200小时以上。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）改进了现有普遍通过预聚—扩链—中和—乳化的方法合成聚氨酯纳米微球技术，即仅通过预聚—扩链两步骤合成双嵌段化合物，保留了一个活性基团，使其可以在后期经修饰连接上功能基团。
（2）采用本发明制备的纳米微球形态光滑，大小均匀。改变制备条件各因素的变化，能够控制纳米微球大小的变化。通过控制双亲性载体的分子量，可以延长卡佩他滨的作用时间。现有文献中，由于载体的不同，载药量大小不一。一般以PLGA为单独载体包裹药物的载药量大多在5%-8%，以PCEC为载体的纳米微球载药量大多为6%-12%，本发明在总分子量为4万左右的混合载体的情况下，载药量为10.2%-13.0%，包封率为63.4%-68.3%。
（3）本发明在制备的过程中，还加入了有机硅氧烷试剂。在其水解过程中随着甲基的离去，暴露出氧原子，从而能与载体亲水端的分子链形成氢键，水解的产物沉积，在疏水链和亲水链间形成一层二氧化硅壳层，硅壳对于药物释放能起到屏蔽作用，可以极大延长药物的释放周期。该纳米微球在PBS缓冲溶液中能持续释放，除了最初17h的药物突释外，在190h时，累计释放量在49%左右，该释药速度明显低于没有这层屏蔽作用的载药纳米微球体系的释药速度。
附图说明
图1为实施例1中化合物合成示意图；
图2为实施例1中聚氨酯载体连接靶向分子的红外光谱图;
图3为实施例1中TMOS水解与PEG分子间形成氢键的示意图；
图4为实施例1制备成的聚氨酯载体连接靶向分子链示意图；
图5为实施例1制备成的载药纳米微球的结构示意图；
图6为实施例1中纳米微球透射电镜图；
图7为实施例1中纳米微球的粒径分布图；
图8为实施例2中纳米微球透射电镜图；
图9为实施例2所制备PCEC/TMOS NPs与PCEC NPs、PEG-PCL NPs的对比药物释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明,但本发明的实施方式不限于此。
本发明结合实施例进一步说明，其中可降解的亲水性化合物为聚乙二醇（PEG），其分子量为4000g/mol；可降解的疏水性化合物为聚己内酯（PCL）,其分子量为4000g/mol；多异氰酸酯为4,4′-二环己基甲烷二异氰酸酯（HMDI）,其相对分子质量为262 g/mol；低分子扩链剂为2,2-二羟甲基丙酸(DMPA)；靶向分子为叶酸（FA）；抗肿瘤药物为卡佩他滨（CAP）；有机硅氧烷为四甲氧基硅烷（TMOS）。
实施例1
一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球，其特征在于方案具体为：
微乳技术为乳化溶剂挥发法。
步骤一：制备双亲性聚氨酯，包括如下步骤：
（1）在装有搅拌器，回流冷凝管和温度计的三口瓶中加入5gPEG和20mL丙酮,搅拌均匀后向其中加入0.36gHMDI在机械搅拌的情况下缓慢升温至80℃,搅拌1h,使其混合均匀；
（2）将反应体系边搅拌边升温至75℃,反应1.5h后降温至30℃, 向其加入0.20gDMPA。在机械搅拌的情况下升温至70℃,搅拌1h,使其混合均匀，再降温至30℃。
（3）在机械搅拌的情况下升温至70℃,搅拌0.5h,使其混合均匀，再降温至30℃,向其中加入5.5gPCL, 在机械搅拌的情况下升温至80℃,搅拌2h,得到聚氨酯预聚物丙酮溶液，滴加至冰无水乙醚，取沉淀于60℃真空干燥12h，得到双亲性聚氨酯PCEC，即双亲性载体中心。
步骤二：双亲性聚氨酯连接靶向分子，包括以下步骤：
取第一步反应产物(PCEC)3g溶于20mL四甲基亚砜中，然后加入0.036gEDC和0.02gNHS,室温下反应24h，再向该反应体系中加入1.01g端氨基叶酸（FA-PEG-NH2），继续反应20小时，加入50mL蒸馏水搅拌均匀，冷却至25℃后，于3500 r/min下离心10min，取上清液，于蒸馏水中透析40h，每三小时换一次水以除去DMSO和NHS等小分子。然后冷冻干燥，得到FA-PCEC。
步骤一和步骤二的化合物反应过程如示意图1，其反应结果的红外测试结果如图2。
图2中，在3490 cm-1为分子链段-OH的振动峰，2905 cm-1、1469 cm-1和842 cm-1处均出现C-H的伸缩振动、弯曲振动和摇摆振动的特征吸收峰。在1780 cm-1有一个强振动峰为C=O 的伸缩振动吸收峰。1186 cm-1 和1089.6 cm-1为脂肪醚C-O特征峰。FA-PCEC与PCEC的谱图特征大致相同，只是在1573 cm-1的出现苯环骨架振动，该苯环为叶酸分子上，表明PCEC连接上了FA-PEG-NH2。从FA-PCEC谱图上，也可以看到的吸收峰如2140 cm-1以及低波数段的峰发生了类似于FA-PEG-NH2的改变。也表明FA-PEG-NH2成功地接在了PCEC上。
步骤三：乳化溶剂挥发法制备纳米微球，包括如下步骤：
（1）取2g FA-PCEC为溶质，溶解于20mL二氯甲烷中，配制成浓度为100mg/mL的油相基质溶液，将0.2g抗肿瘤药物CAP分散于上述基质溶液，形成油相；并向所述的油相中滴加入0.019g四甲氧基硅烷，搅拌均匀；
（2）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成100mL聚乙烯醇质量分数为1.0%的水相溶液；
（3）再将第（1）步所述的油相滴加到步骤（2）所述的水相溶液，将该混合液搅拌12小时，使有机溶剂充分挥发，然后高速离心收集所得的纳米微球，取沉淀，加蒸馏水分散再重复离心取沉淀的步骤，直至聚乙烯醇被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥即得到目的产物。所述搅拌为600rpm，所用离心速度为8000rpm；
微球制备过程中TMOS水解与PEG分子间形成的H键结构如附图3。因TMOS水解后暴露出氧原子，结合氢和PEG分子中的氧原子形成氢键，这也稳定了微球制备过程中形成的的硅壳。图4为聚氨酯载体连接靶向分子链示意图，图5为制备的载药纳米微球的结构示意图;
用激光粒度仪和透射电镜对所得到的纳米微球进行测试表征，透射电镜结果参见图6，粒径与粒径分布结果如图7。从图6可以清晰观察到样品为规则圆形及表面相对光滑。而且还可以看到明显的核-壳结构。从图7也可以看到微球粒径呈现正态分布，且分布范围比较窄，表明制备的微球大小比较一致，在200nm左右，和透射电镜的结果一致。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：
步骤三制备纳米微球用纳米沉淀-透析法制备纳米微球的方法，包括如下步骤：
（1）取2g FA-PCEC为溶质，溶解于20mL二氯甲烷中，配制成浓度为100mg/mL的油相基质溶液，将0.2g抗肿瘤药物CAP分散于上述基质溶液，形成油相；并向所述的油相中滴加入0.019g四甲氧基硅烷（TMOS），搅拌均匀；
（2）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成100mL聚乙烯醇质量分数为1.0%的水相溶液；
（3）再将步骤（2）所述的水相缓慢逐滴滴加到步骤（1）所述的油相溶液，以600rpm继续搅拌2小时；再于蒸馏水介质中进行透析，每2小时换一次水，透析48小时；产物冷冻干燥即得到目的产物。
（4）根据是否添加TMOS，本实施例制备两种载药纳米微球，其中一种加入TMOS组，即为本发明所述制备的纳米微球，记作PCEC/TMOS NPs，另一种不加TMOS而制备的纳米微球为对比组记作PCEC NPs。制备PCEC NPs与PCEC/TMOS NPs的不同之处仅在于制备纳米微球过程中省去添加TMOS这一步骤。
用激光粒度仪和透射电镜对所得到的纳米微球进行测试表征，透射电镜结果见附图8.从图中发现本实施例纳米微球的粒径较实施例1中小，平均为190nm。
为对比聚氨酯微球与一般双亲性化合物自主装的微球的药物释放情况。按实施例2的方法制备了以PEG-PCL（分子量为8056g/mol）双嵌段化合物制备的微球。其具体步骤为：
取2g PEG-PCL为溶质，溶解于20mL二氯甲烷中，配制成浓度为100mg/mL的油相基质溶液，将0.2g抗肿瘤药物CAP分散于上述基质溶液，形成油相；并向所述的油相中滴加入0.019g四甲氧基硅烷，搅拌均匀；以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成100mL聚乙烯醇质量分数为1.0%的水相溶液；再将水相缓慢逐滴滴加到油相溶液，以600rpm继续搅拌2小时；再于蒸馏水介质中进行透析，每2小时换一次水，透析48小时；产物冷冻干燥即得到目的产物。
图9为通过本发明实施例2制备的的纳米微球PCEC/TMOS NPs与纳米微球PCECNPs，以及普通PEG-PCL NPs的体外药物释放对比图，从中发现本发明制备的PCEC/TMOS 载药纳米微球具有良好的药物缓释效果，无明显初期药物突释,缓释时间长达190h以上。卡培他滨从PEG-PCL NPs，PCEC NPs，PCEC/TMOS NPs中的释放速率依次递减，卡培他滨包载于NPs疏水核内，其从NPs中的体外释放很大程度上是由NPs的结构决定的，PCEC的聚氨酯结构比PEG-PCL更稳定，而PCEC/TMOS NPs又比PCEC NPs，多了一层释放屏障，对卡培他滨具有很好的控释能力，因此其释放速度最小，且三种 NPs在经过初期10h突释后达到稳定的药物释放速率。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：
将实施例1中的步骤三的第（2）步的PVA水溶液体积调整为400mL，即第二次乳化的表面活性剂溶液的体积为有机溶剂体积20倍。用激光粒度仪和扫描电镜对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径较实施例1中小,原因是水相体积的增大,减小了油相的粘度,有利于油相在水相中的分散形成乳滴, 使得最终形成的微球粒径减小。
实施例4
本实施例与实施例2不同之处在于：
将实施例2中的步骤三的第（3）步的搅拌速度调整为300rpm。
用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。
实施例5
本实施例与实施例2不同之处在于：
将实施例2中的步骤三的第（3）步的搅拌速度调整为400rpm。
用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。
实施例6
本实施例与实施例2的不同之处在于：
将实施例2中的步骤三的第（3）步的搅拌速度调整为500rpm。
用激光粒度仪和紫外分光光度计对所得到的纳米微球进行测试表征，发现本实施例纳米微球的粒径和粒径分布，载药量和包封率如表1所示。
由表1结果可知,随着搅拌速度的增加,纳米微球的粒径逐渐减小, 同时粒径分布也在一定程度上变窄。而且微球的包封率和载药量也下降。原因是随着搅拌速度的增大,剪切力也增大,导致油相液滴在水相中的分散程度提高，使得NPs更易分散为较小的乳滴,但因为搅拌剧烈,导致了药物的泄露,故包封率和载药量显著减小。
有大量的文献报道了有关纳米制剂的靶向性研究,其中证实了粒径在250nm以内的纳米制剂由于肿瘤组织的EPR效应可被动靶向于肿瘤组织,而减少了对正常组织的杀伤作用。如聚合物载药胶束，脂质体纳米颗粒等在人体的内循环中能够很顺利的进出肿瘤组织细胞，进而在肿瘤组织累积必须控制在较小直径。而包封率和载药量是评价纳米制剂质量的重要指标,包封率越大,药物损失越少,而载药量越大,越容易满足临床用药的需求,综合上述结果可以看出,选择搅拌速度500rpm相对较合适。
表1
| 转速（rpm） | 粒径(nm) | 粒径分布指数 | 载药量（%） | 包封率（%） | 实施例 |
| 300 | 232±0.12 | 0.659 | 13.3 | 69.3 | 4 |
| 400 | 220±0.25 | 0.543 | 12.2 | 63.8 | 5 |
| 500 | 212±0.37 | 0.433 | 8.8 | 58.3 | 6 |
| 600 | 198±0.33 | 0.391 | 7.9 | 55.9 | 2 |
Claims (1)
1.一种以双亲性聚氨酯为载体的具有靶向和缓释作用的抗肿瘤药物纳米微球，其特征在于：
步骤一：制备双亲性聚氨酯，包括如下步骤：
（1）在装有搅拌器，回流冷凝管和温度计的三口瓶中加入5gPEG和20mL丙酮,搅拌均匀后向其中加入0.36gHMDI在机械搅拌的情况下缓慢升温至80℃,搅拌1h,使其混合均匀；
（2）将反应体系边搅拌边升温至75℃,反应1.5h后降温至30℃, 向其加入0.20gDMPA；在机械搅拌的情况下升温至70℃,搅拌1h,使其混合均匀，再降温至30℃；
（3）在机械搅拌的情况下升温至70℃,搅拌0.5h,使其混合均匀，再降温至30℃,向其中加入5.5gPCL, 在机械搅拌的情况下升温至80℃,搅拌2h,得到聚氨酯预聚物丙酮溶液，滴加至冰无水乙醚，取沉淀于60℃真空干燥12h，得到双亲性聚氨酯PCEC，即双亲性载体中心；
步骤二：双亲性聚氨酯连接靶向分子，包括以下步骤：
取第一步反应产物PCEC 3g溶于20mL二甲基亚砜中，然后加入0.036gEDC和0.02gNHS,室温下反应24h，再向该反应体系中加入1.01g端氨基叶酸FA-PEG-NH2，继续反应20小时，加入50mL蒸馏水搅拌均匀，冷却至25℃后，于3500 r/min下离心10min，取上清液，于蒸馏水中透析40h，每三小时换一次水以除去DMSO和NHS等小分子；然后冷冻干燥，得到FA-PCEC；
步骤三：乳化溶剂挥发法制备纳米微球，包括如下步骤：
（1）取2g FA-PCEC为溶质，溶解于20mL二氯甲烷中，配制成浓度为100mg/mL的油相基质溶液，将0.2g抗肿瘤药物CAP分散于上述基质溶液，形成油相；并向所述的油相中滴加入0.019g四甲氧基硅烷，搅拌均匀；
（2）以聚乙烯醇为溶质，以水为溶剂，制成100mL聚乙烯醇质量分数为1.0%的水相溶液；
（3）再将第（1）步所述的油相滴加到步骤（2）所述的水相溶液，将该混合液搅拌12小时，使有机溶剂充分挥发，然后高速离心收集所得的纳米微球，取沉淀，加蒸馏水分散再重复离心取沉淀的步骤，直至聚乙烯醇被洗干净，最后将沉淀冷冻干燥即得到目的产物；所述搅拌为600rpm，所用离心速度为8000rpm。
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