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CN103630494B - 用于检测粒子的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于检测粒子的对应方法，包括：将假设包括一种或多种将要检测的粒子的取样布置在反应腔内；经由一个或多个移出器来移出反应腔内的取样的至少一部分；以及检测/确定用来表示一种或多种粒子的存在和/或数目的值。

Description

用于检测粒子的装置和方法
交叉引用
本申请要求德国专利申请DE102005052752的权利，该专利申请通过参考完全包括于此。本申请还涉及德国专利申请DE102005052713以及在2006年11月6日提交的标题为“Method and device for the detection of molecular interactions”的国际专利申请（Maiwald参考序号：C7794），这两份申请都通过参考完全包括于此。
技术领域
本发明涉及用于检测粒子的装置和方法。
背景技术
在诸如人类体液和非人类体液的取样中检测诸如细胞或病毒的一种或多种粒子的绝对水平的存在和/或枚举，对于确定人类和通常哺乳动物的健康状态是非常重要的。这些应用的临床重要实例包括计数HIV-阳性对象中的CD4+细胞、利用化学疗法治疗的病人中的粒细胞和血小板、以及血袋中的白细胞。另一方面，非医学应用包括检测在诸如污水或食物产品的环境取样中的（细菌的）污染物。
用于执行该分析的主要化验平台当前是基于流式血细胞计数的化验系统。流式血细胞计数包括将里面含有具有目标粒子的取样的流动流传送到流式血细胞计数仪的检测区域。使用在鞘液流中的流体动力集中将粒子沿着核心流布置成单个纵列（file）。然后，利用光束分别地询问粒子。通常，使用激光来辐射检测区域中的目标粒子，以利用目标粒子创建照明现象。光学装置和检测电子装置测量在取样中的目标粒子的光吸收、散射、荧光和/或光谱特性，或者，测量附着到目标粒子的荧光标记的相应特性。在荧光的情况下，每个目标粒子在通过照明区时产生荧光光子的脉冲。此外，可以利用滤光器或滤光器组合来获得荧光与照明或激发光的区别划分。使用光电倍增管或光电二极管来完成荧光检测。另一技术依赖利用目标粒子的照明束中的光子的光散射。利用目标粒子的光散射，识别目标粒子作为散射角的函数，该散射角的函数则是目标粒子的尺寸和形状以及散射光子的波长的函数。
因此，单个目标粒子的成功检测和识别依赖多个要素。首先，激光功率必需足够以在目标粒子通过辐射区域的简短通过期间生成足够大量的荧光（或散射）光子。当生成足够数量的光子从而来自目标粒子的荧光脉冲被可靠地从背景光子的随机波动中区别开来时，通常发生粒子的检测。第二，重要的是使得由取样的载体液体或液体中的杂质的散射或发射的荧光以及设备本身引发的这些不期望的背景光子最小化，设备自身诸如流动流通过的毛细管的壁。
例如，在美国纽约由Wiley-Liss出版的Sharpiro,R.M.(2002)的第四版PracticalFlow Cytometry以及WO90/13368、WO99/44037以及WO01/59429中描述了流式血细胞计数仪及它们在不同应用中的使用方法。
然而，传统流式血细胞计数系统由于通常设备庞大而尚不可用于日常临床使用，这不仅仅使得“现场”测量（例如床边测试）困难，还导致了每次化验的高成本。由此，清楚地需要更简单、更紧凑以及更便宜的系统，优选呈现可兼容的性能特征。
因此，近年来，已经应用微流技术以便开发需要更小样本和试剂容积的血细胞计数仪（例如参见Altendorf,E等.(1997)Sens.Actuat.1,531-534;Huh,D.等(2005）Physiol.Meas.26,R73-R98;Dittrich,P.S.,以及Manz,A.(2005)Anal.Bioanal.Chem.382,1771-1782)。基于这些成就的化验设备比传统装置更小以及更便携。
该小型流动血流计数器的实例在国际专利申请WO02/10713中进行了描述。该装置使用不精确流体驱动器，该不精确流体驱动器分别偶联到取样流体接收器以及用于支持流体的储液池，并由闭环反馈路径控制，从而使得能够进行更紧凑的器械设置。
代替使用流式血细胞计数仪，还可以通过采用专用于感兴趣粒子的分子标志（也就是标记）以间接方式判定给出取样中的粒子的存在和/或数量，并且这些分子标志在取样中的拷贝数与这些感兴趣粒子的数目相关。当前，可使用不同方法来执行这些化验，例如基于ELISA的化验（例如见Kannangal,R等.(2001)Clin.Diagn.Lab.Immunol.8,1286-1288），以及包括涂覆顺磁珠的使用的基于显微镜的方法（例如见Carella,A.Y.等.(1995)Clin.Diagn.Lab.Immunol.2,623-625）或者包括涂覆胶乳珠的使用的基于显微镜的方法（例如见Balakrishnan,P等.(2004).J.Acquir.Immune Defic.Syndr.36,1006-1010）。此外，还可以在使用显微镜光学元件对标记的粒子进行成像之前在膜上特别捕捉这些标记的粒子（Rodriguez,W.R等.(2005)PLOS Medicine2,e182,663-672）。
另一种用于计数粒子的化验装置在国际专利申请WO2005/008226中进行了描述。该装置包括：光源，将光投射到包含要被化验且标记以染料的粒子的取样芯片的分区中；以及移动器，用于每隔预定时间间隔分别相对于物镜和光源以这样的方式将芯片的位置移动预定距离，该方式使得邻近刚才被摄影区域的某个区域被移动到光的入射点。因此，接连地对取样芯片上的分区进行摄影。对每个分区中的粒子数目进行计数和数学处理以计算在取样中的粒子总数。
此外，美国专利申请2006/0024756涉及用于检测磁性标记的目标粒子或细胞的紧凑成像血细胞计数装置。为此，要化验的生物取样中存在的所有细胞被荧光标记，但是仅仅目标细胞才使用偶联到铁磁珠的单克隆抗体被磁性标记。标记的取样，在腔或试管内，被布置在两个楔形磁体之间以选择性地将磁性标记的细胞运动到试管的观察表面。LED照明细胞，并且CCD照相机捕捉由目标细胞放射的荧光的图像。数字图像分析提供在表面上的细胞的计数，该计数可以与原始取样的目标细胞浓度相关。
然而，上述所有这些装置和方法需要相对复杂尖端的检测技术，这些检测技术从初始成本和需要化验设备的维修来说都比较昂贵并且需要高级受训人员。这使得传统系统不适于日常医疗实践、“床边”测试或远程位置的医疗实践。
因此，还具有对于用于取样中的一个或多个粒子的定性和/或定量检测的化验装置的需要，该化验装置克服了上述限制。具体地，需要这样的装置，该装置使得能够不仅以较高灵敏度还以容易进行且成本高效的方式检测甚至小量（也就是小数目）的给出粒子。
此外，还需要使用该化验装置以快速且可靠地检测在给出样本中的一种或多种粒子的存在和/或量的准确判定的对应方法。具体地，需要可以“现场”也就是在收集将要分析的取样期间或紧接着收集了该取样之后执行的方法。
由此，本发明的目的是提供这样的化验装置以及使用该化验装置的对应方法。
发明内容
第一方面，本发明涉及用于粒子的定性和/或定量检测的装置，包括：形成在第一表面和第二表面之间的腔体内的反应腔，其中，第二表面与第一表面相对地设置；以及一个或多个移出器，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分，借助于一个或多个移出器，来改变在第一表面和第二表面之间的距离。
该一个或多个移出器可以是第一表面和/或第二表面的组成部分（“移出结构”），或者可以是与第一表面和/或第二表面相对布置的独立的实体（“移出体”）。该一个或多个移出器可以由弹性可变形材料制成。在优选实施例中，该装置包括两个移出器，这两个移出器可以与相同表面或不同表面相对地设置。
优选地，第一和/或第二表面的至少一部分由透明材料制成。此外，优选第一表面和/或第二表面的至少一个或多个部分是弹性可变形的。特别优选地，该至少一个或多个弹性可变形部分与一个或多个移出器相对地设置。该至少一个或多个弹性可变形部分可以不同于发生检测的表面区域。
在一些实施例中，本发明的装置还包括一个或多个器件，这些器件当反应腔弹性变形时允许保持反应腔的容积基本不变。优选地，该一个或多个器件是横向限定反应腔的弹性侧壁。
另一方面，本发明涉及系统，该系统包括至少两个部分，其中，该至少两个部分的每一个包括：形成在第一表面和第二表面之间的腔体中的反应腔，其中，第二表面与第一表面相对地设置；以及一个或多个移出器，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分，借助于一个或多个移出器来改变在第一表面和第二表面之间的距离；以及其中，该至少两个部分的反应腔彼此连通。
可以如下面对本发明的装置的描述来形成反应腔、第一表面、第二表面和/或系统的一部分的至少一个移出器。
在一个实施例中，该系统还包括一个或多个器件，这些器件当反应腔弹性变形时允许保持反应腔的容积基本不变。优选地，该一个或多个器件是横向限定反应腔的弹性侧壁。
在另一实施例中，系统还包括检测系统。
尤其优选地，系统还包括与该至少两个部分的每一个反应腔连通的取样引入通道，以及可选地还包括允许在该至少两个反应腔之间的暂时流体连通的一个或多个器件。
另一方面，本发明涉及用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：将假定包括一种或多种将要检测的粒子的取样布置在反应腔中；经由一个或多个移出器来移出反应腔中移出的取样的至少一部分；以及检测/确定表示一种或多种粒子的存在和/或数目的值。
优选地，将要分析的取样是生物取样，以及将要检测的一种或多种粒子从由原核细胞、真核细胞以及病毒粒子组成的组中进行选择。
在优选实施例中，将取样布置在反应腔中包括将所述取样引入到根据本发明的装置的反应腔中。
优选地，经由一个或多个移出器的至少一个，通过对第一表面和/第二表面施加压力，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分中改变尤其优选减少在第一表面和第二表面之间的距离，从而移出取样的至少一部分。
在本发明方法的优选实施例中，在移出取样的至少一部分之后，减少的距离接着被再增加。可以重复地执行对于距离的这种减少和接着再增加。优选在第一表面和第二表面之间的距离已经被减少之后执行检测。
在一个实施例中，本发明的方法包括：将包括多种粒子的取样布置在反应腔中；经由一个或多个移出器移出反应腔中的移出所述多种粒子的子集；确定表示反应腔内的被移出的粒子子集中的粒子数量的一个或多个值；以及可选地，根据在检测期间获得的一个或多个值，计算在反应腔中的多个粒子的总数。
在一些实施例中，该方法还包括：在执行检测之前，将每个包括一个或多个可检测部分（moisties）的一个或多个试剂布置/引入到反应腔内。优选地，该一个或多个试剂从由以下组成的组中进行选择，并且具有对于将要检测的一个或多个粒子的键合性（binding affinity）：核酸、缩氨酸、蛋白质结构域、蛋白质、碳水化合物、低分子量化合物以及它们的类似物和/或混合物。
在另一方面，本发明涉及一种方法，包括：将取样的多个粒子布置在检测腔内；从检测腔移出多个粒子的一些，以便仅仅剩余多个粒子的适当子集；光学地检测多个粒子的子集的粒子；以及基于检测的粒子，确定表示粒子子集的粒子数目的值。
在一个实施例中，该方法还包括：基于表示适当子集的粒子数目的值，来确定表示取样中的粒子的数目或充足的值。可选地，该确定还可以基于检测腔的检测容积的尺寸。
在优选实施例中，该方法还包括将取样的多个粒子布置在检测腔中并且从检测腔移出多个粒子的一些的步骤重复NR次，以便在每种情况下，仅仅剩余多个粒子的适当子集，以及当NR≥2时，针对数量ND的NR次重复，光学地检测多个粒子的子集的粒子，以及基于检测的粒子，确定表示粒子的适当子集的粒子数目的值，其中，ND≥NR。
在本发明的方法的另一优选实施例中，将布置和移出的步骤重复NR次包括：对于多个NR重复，将移出的多个粒子的至少一些再引入到检测腔内。
在本发明的另一优选实施例中，移出多个粒子的一些包括减少检测腔的容积，从而可以包括减少在腔的第一壁和第二壁之间的距离。
在另一实施例中，本发明的方法包括：将取样的多个粒子布置在检测腔中；从检测腔移出多个粒子的一些，从而仅仅剩余多个粒子的适当子集；光学地检测多个粒子的子集的粒子；以及判定在粒子子集中的目标粒子的存在。
在另一实施例中，本发明的方法包括：将取样的第一批多个粒子布置在检测腔中；减少检测腔的容积；光学地检测检测腔内的粒子；基于检测的粒子，确定表示在检测腔中存在的粒子的数目的值；增加检测腔的容积；将取样的第二批多个粒子布置在检测腔中；减少检测腔的容积；以及基于检测的粒子，确定表示在检测腔中存在的粒子的数目的值。
另一方面，本发明涉及一种装置，该装置包括：检测腔，配置为用来容纳包括多个粒子的取样；致动器，配置为从检测腔移出该多个粒子的一些，以便仅仅剩余多个粒子的适当子集；检测器，配置为检测粒子子集的粒子；以及处理器，配置为基于检测的粒子来确定表示粒子的适当子集的粒子数目的值。
优选地，该装置被配置为：操作致动器以将移出的多个粒子的至少一些再引入到检测腔内，接着从检测腔移出多个粒子的一些以便仅仅剩余多个粒子的第二适当子集，而处理器被配置为：操作检测器来检测第二适当子集的粒子，并且基于检测的粒子，确定表示粒子的第二适当子集的粒子数目的值。
该装置还可以包括储液池，该储液池能够容纳从检测腔移出的粒子，并且可以从该储液池将粒子再引入到检测腔中。
在一个实施例中，处理器可以配置为：基于检测的粒子，判定在粒子子集的粒子中的目标粒子的存在。
附图说明
图1是包括光学检测系统的本发明的化验装置的示意性截面图；
图2是采用包括彼此相对地布置在装置的不同侧上的两个移出器的装置的本发明的化验的示意性图示；
图3是采用包括位于装置同侧的不同位置处的两个移出器的装置的本发明的化验的示意性图示；
图4A和4B示出本发明的化验装置或本发明的化验系统（A）以及其操作模式（B）的特定实施例；
图5示出根据本发明的用于确定在人类血液中的CD4+细胞的数目的化验的结果；
图6示出分别利用流式血细胞计数仪和根据本发明的化验获得的人类血液中的CD4+细胞数目的比较。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及用于粒子的定性和/或定量检测的装置，包括：
（a）反应腔，形成在第一表面和第二表面之间的腔体内，其中，第二表面与第一表面相对地设置；以及
（b）一个或多个移出器，
其中，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分，可借助于一个或多个移出器，来改变在第一表面和第二表面之间的距离。
在本发明的范围内，“反应腔”（这里还称为“反应空间”或“检测腔”或“腔”）表示在第一表面和第二表面之间的腔体中形成的空间。反应腔可以是任何基本形状，例如圆形、椭圆形、二次形（quadratic）或矩形。本发明的优选反应腔具有立方体或圆柱三维形状。尤其优选的是，将反应腔配置为（毛细）通道。可选地，反应腔可以包括逐渐变细的部分。例如，反应腔可以从中央区域到一个或两个终端区域逐渐变细。利用侧壁来横向限制反应腔。第二表面与第一表面相对或基本相对地设置。优选地，第一和第二表面彼此平行或基本平行地布置。
在第一表面和第二表面之间的距离被定义为在面对反应腔的装置的第一表面的一侧与面对反应腔的的第二表面的一侧之间的距离，并还表示反应腔的厚度。根据本发明，反应腔的厚度通常最多是1cm，优选最多为5mm，更优选最多为3mm，以及最优选最多为1mm。
在本发明的一些实施例中，反应腔被设计为毛细间隙，其可以利用在第一和第二表面之间作用的毛细力来填充。通常，毛细间隙具有最多1mm、优选最多750μm以及尤其优选最多500μm的厚度。在本发明的优选实施例中，毛细间隙具有300μm的厚度、更优选200μm的厚度以及尤其优选150μm的厚度。
在根据本发明的化验装置中，在第一表面和第二表面之间的距离可变。在优选实施例中，距离可以在0mm到1mm的范围内改变。另外对于第一表面和第二表面之间的距离的下限为50μm到200μm的范围内。另外优选上限在0.3mm到0.5mm的范围内。
术语“移出器”或“致动器”，如在这里使用的，表示适于通过改变至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分中的第一表面和第二表面之间的距离，来移出在本发明装置的反应腔中或其至少一个或多个部分中的溶液。换句话说，本发明的移出器还可以定义为允许第一表面和/或第二表面或它们的至少一个或多个部分相对于彼此的垂直运动的器件。术语“至少在表面区域的一个或多个部分中”，如这里所用的，将被理解为：经由移出器完成的在第一表面和第二表面之间的距离的改变不一定在第一表面和/或第二表面的整个表面区域上发生（也就是所述表面的一个或两个作为整体地相对于彼此垂直运动），而是可以被局部限制为所述表面的一个或两个的表面区域的至少一部分（也就是仅各个（一个或多个）表面的（一个或多个）表面区域的这些一个或多个部分相对于彼此垂直运动，从而在各个（一个或多个）表面的（一个或多个）表面区域的剩余一个或多个部分中的距离保持基本不变）。在本发明的优选实施例中，减少在第一表面和/或第二表面之间的距离，尤其优选通过对所述表面的一个或两个的至少一部分施加压力来减少该距离。
根据本发明的移出器可以构成第一表面或第二表面的集成部分（这里也称为“移出结构”）或者可以作为位于反应腔外部的独立实体而存在（这里也称为“移出体”）。在移出器作为移出结构提供的情况下，也就是作为第一表面或第二表面的集成部分提供的情况下，移出结构可以被设计为延伸到反应腔内部的凸起实体。该凸起实体可以具有适于在执行本发明方法时导致反应腔内的溶液的移出的任何形状。该凸起形状的实例包括齿、脊、褶皱和突出，优选后者。根据作为第一表面或第二表面的集成部分的移出结构的性质，该移出结构可以利用与各个表面的剩余部分或其至少部分相同的材料制成。
在本发明的其他实施例中，移出器构成独立的移出体，不集成在第一表面或第二表面中，而与所述表面的任一个相对地设置，其中，该移出器位于面对远离反应腔的相应表面的一侧处。在一些实施例中，移出器位于垂直于反应腔的相应表面。该移出体可以具有适于用于本发明的任何形状，以导致反应腔内的溶液的移出。该移出体的实例包括人类手指、杆、销、塞、柱、推杆（tappet）以及模板（Stencil），其中优选最后两种。
在本发明的范围内，该装置可以包括一个或多个移出器，所有移出器可以是第一表面和/或第二表面的集成部件或可以是移出体。然而，还可能本发明包括至少一个移出体以及集成在一个所述表面中的至少一个移出结构。在本发明的优选实施例中，该装置包括两个移出器。在其他实施例中，该装置包括至少三个、至少四个、至少八个或至少12个移出器。
本发明的所有移出器可以被集成在第一表面或第二表面中，和/或与第一表面或第二表面相对地设置。或者，还可能该装置包括集成在和/或定位到两个所述表面的至少两个移出器。在本发明的优选实施例中，该装置包括至少两个移出器，这些移出器单独是与第一表面和/或第二表面相对设置的移出体类型。在尤其优选的实施例中，该装置包括两个移出器，其中，这两个移出器与第一表面或第二表面相对地设置。在另一尤其优选的实施例中，该装置还是包括两个移出器，但是一个移出器与第一表面相对地设置，而另一移出器则与第二表面相对地设置。在第三尤其优选的实施例中，与不同表面相对设置的两个移出器也布置为彼此相对。
移出器可以由适于通过对第一表面和/或第二表面施加压力以引发在所述表面之间的距离的变化（也就是减少）从而导致在反应腔中的溶液的至少部分移出的任何材料制成。通常，（一个或多个）移出器由非晶材料制成。术语“非晶材料”，如这里所用的，表示其中原子的位置没有长期次序（order）的固体，也就是非晶体材料。这些非晶材料的实例包括诸如氧化铝陶瓷的陶瓷材料、诸如浮法硼硅（borofloat）玻璃的玻璃、硅树脂以及诸如聚苯乙烯或聚四氟乙烯（TeflonTM）的合成聚合物。可选地，非晶材料还可以是光学透明的，也就是透光的。适合透明材料的实例包括玻璃或类玻璃材料，诸如窗玻璃、浮法硼硅玻璃、石英玻璃、黄晶玻璃或蓝宝石玻璃，以及合成聚合物，诸如，聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或丙烯酸树脂。在本发明的装置包括多于一个的移出器的情况下，所有这些移出器可以由相同材料制成，或者这些移出器的至少一个可以由不同的材料制成。
在本发明的优选实施例中，一个或多个移出器的至少一个由弹性可变形材料制成，该弹性可变形材料也就是在形变之后无需任何其他外部操纵独立地至少基本上恢复到其原始形状的材料。可选地，根据本发明的该弹性可变形材料还优选是生物/化学惰性的（也就是不具有或具有很少相对于化学和/或生物试剂的反应性），可选地为透明和/或非自体荧光的。这些材料的实例包括硅弹性体（siliconeelastomer）、聚亚安酯、磷酸三乙酯、丙烯酸树脂以及丙烯酸酯，其中尤其优选硅弹性体。硅弹性体主要由交联硅树脂聚合物构成。这些聚合物具有化学式[R2SiO]n的-Si-O-骨架（backbone），其中，R表示有机侧基，诸如甲基、乙烷基、苯基等，其可用于交联两个或多个聚合物。通过改变-Si-O-链长度、侧基以及交联，可以合成硅使之具有广泛多种特性和成分。它们可以从液体到胶体到橡胶到硬塑料连贯地改变。最常见类型是线性聚二甲基硅氧烷。另一组硅材料基于硅树脂，其利用分支及笼形寡聚矽氧烷来形成。在尤其优选的实施例中，弹性可变形材料从由硅胶和硅油组成的组中进行选择。另外合适的材料包括：自然橡胶，也就是从帕拉橡胶树（巴西的三叶胶树）提取的橡胶；以及另外成分的橡胶（通常还称为合成橡胶），可以通过多种单体的聚合来制造，这些单体包括例如异戊二烯（2-甲基-1,3-丁二烯）、2-氯-1,3-丁二烯、以及甲基-丙烯连同小百分比的异戊二烯以供交联。适合合成橡胶的实例包括丁苯橡胶、丁腈橡胶、聚氨酯橡胶、聚酯橡胶、氯丁二烯橡胶、丁基合成橡胶、表氯醇橡胶以及磷腈类橡胶。
在本发明的一些实施例中，第一表面和/或第二表面包括发生检测的表面区域，也就是检测区域（这里也称为“检测区”）。也就是说，将要分析的一类或多类粒子的定性和/或定量检测被限制到所述表面的一个或两个的不同表面区域，例如可能由于所用的检测系统的空间限制，导致粒子的检测和/或枚举仅将在第一表面和/或第二表面的中央部分中发生。优选地，受第一表面和/或第二表面的（一个或多个）检测区域限制的反应腔的部分的容积已知为允许定量分析。在本发明的一些实施例中，在第一表面和第二表面之间的“检测区域”被设计为优选位于反应腔的中央部分中的毛细间隙，其中，在该区域中的所述表面之间的距离可选为小于反应腔的剩余部分中的距离。
在本发明的其他实施例中，第一表面和/或第二表面的至少一个或多个部分是弹性可变形的。也就是说，各个表面的至少一个或多个部分由弹性可变形材料制成，该弹性可变形材料例如弹性膜，如上结合一个或多个移出器所述的。根据本发明的尤其优选的弹性膜由硅胶制成。由此，在一个实施例中，第一表面和/或第二表面的整个表面区域可由弹性可变形材料制成。在本发明的一个实施例中，整个反应腔弹性可变形，也就是，第一表面、第二表面和横向侧壁是弹性可变形的。优选地，第一表面和/或第二表面的至少一个或多个弹性可变形部分与一个或多个移出器相对地设置。因此，本发明装置的与移出器相对的所有表面区域可以是弹性可变形的。然而，还可能与移出器相对的至少一个这样的表面区域不是弹性可变形的。在本发明的一个优选实施例中，第一表面和/或第二表面的至少一个或多个弹性可变形部分与发生检测的各个（一个或多个）表面区域不同。
根据本发明，第一表面和第二表面可以由相同材料或不同材料制成。此外，还可能第一表面和/或第二表面包括由与相应表面区域的剩余部分不同的材料制成的表面区域。例如，第一表面和/或第二表面的一个表面区域，诸如中央、可选矩形的表面区域（也就是“窗”），由透明材料制成，其中，相应表面区域的剩余部分（也就是“边界”）由不透明材料制成。优选地，该透明材料的“窗”位于发生检测的表面区域内。
根据本发明的第一表面和/或第二表面的至少一部分可以由非晶材料制成。术语“非晶材料”，如这里所用的，表示其中原子的位置没有长期次序（order）的固体，也就是非晶材料。这些非晶材料的实例包括诸如氧化铝陶瓷的陶瓷材料、诸如浮法硼硅（borofloat）玻璃的玻璃、硅树脂（silicone）以及诸如聚苯乙烯或聚四氟乙烯（TeflonTM）的合成聚合物。
在本发明的优选实施例中，第一表面和/或第二表面的至少一部分可以由透明材料也就是透光材料制成。适合透明材料的实例包括玻璃或类玻璃材料，诸如窗玻璃、浮法硼硅玻璃、石英玻璃、黄晶玻璃或蓝宝石玻璃，以及合成聚合物，诸如聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯或丙烯酸树脂。
根据本发明的装置还可以包括布置在反应腔的第一表面和/或第二表面上的微阵列（这里还称为“阵列”或“阵列元件”）。如这里使用的，“微阵列”表示在支板（也称为基板）上的俘获分子（例如一种或多种探测分子或物质库）的定义的空间排布（布局），其中，微阵列中的每个分子的位置被分别确定。优选地，微阵列包括定义的部位或预定区域，也就是所谓的阵列元件或点，这些阵列元件或点可以特定图案来布置，其中，每个阵列元件优选包括仅仅一种俘获分子。在支板上的俘获分子的排布可以通过共价键或非共价键来生成。适用于微阵列的基板包括显微镜载片（slide）、晶圆或陶瓷材料。然而，还可以将俘获分子直接固定在第一表面和/或第二表面上。
根据本发明的装置还可以包括一个或多个器件，这些器件当减少在第一表面和第二表面之间的距离时允许保持反应腔的容积基本不变。也就是说，提供补偿区域（或者“储液池”），当减少在所述表面之间的距离时，可以将在第一表面和第二表面之间的反应腔中存在的任何液体材料移出到该补偿区域（或者“储液池”）中。术语“基本不变”，如在这里所用的，被理解为：在减少第一表面和第二表面之间的距离之后，“压缩”状态中的反应腔的容积无需精确地与“非压缩”状态下的反应腔的原始容积相同。优选地，“压缩”状态中的反应腔的容积是“非压缩”状态下的容积的至少90%、尤其优选至少95%。在本发明的一些实施例中，优选以干燥形式（例如冻干形式如粉末、颗粒或小丸）在补偿区域或储液池中提供用于执行本发明方法所需的任何试剂，诸如包括可检测部分（也就是标记）或缓冲液的试剂。
优选地，这通过提供利用由弹性材料制成的侧壁横向限定的反应腔来获得。根据本发明，一个或多个横向侧壁可以由弹性材料制成。尤其优选的弹性材料是硅胶。
在另一实施例中，本发明装置还包括腔体。术语“腔体”，如这里所用的，被理解为表示围绕反应腔的实体，该实体由第一表面、第二表面和横向侧壁形成。
第一表面、第二表面和/或一个或多个横向侧壁可以是腔体的（多个）构成部分。也就是说，作为腔体的构成部分的（一个或多个）各个表面由与腔体相同的材料制成。或者，第一表面、第二表面和/或一个或多个横向侧壁中的一个或多个，分别可以由不同于腔体的另一材料制成。在本发明的范围内，由此可能定义反应腔的所有四个表面由相同的材料制成，或者两个或三个表面由相同材料制成而剩余（一个或多个）表面由不同材料制成，或者每个表面由不同材料制成。
限制反应腔的第一表面和/或第二表面和/或一个或多个横向侧壁还可以包括一个或多个开口，这些开口可以是可锁定和/或可密封的，并且可用于将要分析的取样以及执行本发明方法需要的可选任何附加试剂、检测试剂等直接引入。或者，这些开口还可以用于附着没有作为腔体的构成部分设计的装置的任何附加（补充）模块，这些模块诸如填充单元、处理单元、温度控制单元、专用（也就是复杂）检测单元以及垃圾容器。在反应腔与这些附加模块的一个或多个之间的连接可以通过使用一个或多个刚性或柔性管、管嘴、套管、针状物等来实现，这些部件可分别利用压配合（也称为“Luer系统”）或者互扭配合（twist-on fitting）（也称为“Luer锁定系统”）来附着到反应腔和附加模块，优选使用后种配合。两种系统在本领域中都已知并且可以在商业上得到。
腔体优选至少部分地由非晶材料尤其是透明材料制成。适当的材料包括：玻璃；合成材料，诸如MacrolonTM、尼龙、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯；以及金属，诸如高级钢、铝以及黄铜。在一些实施例中，腔体由导电材料制成，该导电材料优选从由以下材料组成的组中进行选择：具有5到30%的碳纤维的聚酰胺、具有5到30%的碳纤维的聚碳酸酯、具有2到20%的不锈钢纤维的聚酰胺以及具有5到40%的碳纤维的聚苯硫醚。
根据本发明的装置通常作为单个（也就是独个）实体来操作。然而，也可以将两个或多个这样的装置组装成多部分系统，该多部分系统包括分开的反应腔以并行地执行一个取样的多个化验，其中，如上描述的装置对应于多部分系统的一部分或单元或实体。由此，在另一方面，本发明涉及系统，该系统包括至少两个部分，其中，该至少两个部分的每一个包括：在第一表面和第二表面之间的腔体中形成的反应腔，其中，第二表面位于与第一表面相对；以及一个或多个移出器，其中，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分中，在第一表面和第二表面之间的距离可以借助于一个或多个移出器来改变。该系统的至少两个部分的反应腔可以彼此连通。
术语“彼此连通”，如在这里所用的，表示在各个反应腔之间的经由附加器件的直接或间接的互连，这些附加器件诸如共用取样引入通道、填充单元、处理单元等。然而，如这里所用的，该术语不一定表示，在引入取样之后，反应腔彼此持久流体连通。
在优选实施例中，该系统还包括取样引入通道，该通道与至少两个装置的每个反应腔连通。取样引入通道（这里还称为“取样加载区”或“取样区域”）可以包括如上所述的一个或多个可以锁定和/或可以密封的开口，以引入将要分析的取样。该取样引入通道可以被配置为腔，各个反应腔从该腔分叉。连接取样引入通道和反应腔的开口也可以是可锁定和/或可密封的。具体地，优选防止在将取样引入到该多部分系统的分开的反应腔中之后液体从反应腔倒流到共用取样引入通道，这将导致包括可变的试剂（诸如俘获分子、标记等）的来自不同反应腔的取样溶液的混合，并由此导致对于将要并行执行的多个分开的化验的正确检测的干扰。
因此，在本发明的另一优选实施例中，该系统还包括一个或多个器件，这些器件允许在至少两个反应腔之间的暂时流体连通。尤其优选的是，允许仅仅从取样引入通道到分开的反应腔的单向流体连通而没有倒流。这可以优选通过在取样引入通道与反应腔之间的连接处提供单向阀来获得，该单向阀防止来自反应腔的取样的倒流。
在本发明的优选实施例中，该装置还包括连接到反应腔的检测系统。优选地，检测系统被布置为与第一表面和/或第二表面相对，可选地位于发生检测的特定表面区域中。
适当检测系统的选择取决于多个参数，诸如用于检测的附加试剂（例如染料或标记）的可选存在或将要检测的粒子类型。本领域中良好建立了多种光学和非光学检测系统。可以与本发明一起使用的检测系统的大体描述可以具体在例如德国柏林海德尔堡的Lottspeich,F.和Zorbas H.(1998)Bioanalytik,SpektrumAkademischer Verlag的第23.3章到23.4章中找到。
在本发明的优选实施例中，检测系统可以是光学检测系统。通常，执行根据本发明的方法不需要使用复杂的设备而是涉及简单的检测系统，优选基于诸如荧光、光学吸收、谐振转移等的参数的测量。
根据本发明的尤其优选的检测系统基于诸如透射比浊法和散射比浊法的吸收测量（例如参见在费城的WB Saunders公司的Tietz,N.O的Textbook of ClinicalChemistry第78-97页中的Tiffany,O.(1986)Fluorometry,nephelometry,andturbdimetry），其可以利用本领域中建立的光度测定装置来获得。两种方法都允许基于该浊度分别对于光的透射或散射的效果的测量来确定溶液中的“昏暗”或浊度。在液体中的浊度由其中悬浮的粒子的存在所导致。如果光束通过混浊取样，则其强度减少。透射比浊法表示未散射的光的测量，这些光也就是透射通过粒子的浑浊溶液的光，该测量可以使用标准的光度测定计来执行。另一方面，散射比浊法是（侧）散射光的测量。该技术需要专用设备，其中，将检测器设置为与入射光束成角度。
还优选用于本发明的是，基于标记有荧光团的光谱激发粒子的荧光强度的比较的检测系统。荧光性是特定分子在被特定波长的光激发时发射它们自体的光的能力，该能力导致特有的吸收和放射性能。特别地，通过荧光显微镜的修改后的方法来执行荧光信号的定量检测（例如参见Lichtman,J.W.,以及Conchello,J.A.(2005)Nature Methods2,910-919;Zimmermann,T.(2005)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.95,245-265）。由此，分别由光吸收和光发射导致的信号利用一个或多个滤光器和/或堇青石（dichrotie）来分开并成像在适合的检测器上。通过数字图像处理来执行数据分析。可以利用本领域中公知的多个软件包来实现图像处理（这些软件诸如数学数字图像处理，EIKONA或Image-PRO）。因为本发明意图执行而没有从反应腔移除和/或替换任何溶液（也就是，在存在任何未绑定的标记的情况下执行检测，引起不确定的信号背景），优选使用允许对背景噪声进行高效且准确的校正的图像处理软件。尤其优选地，不仅仅通过测量信号强度的差异还通过伴随考虑诸如将要测量的信号的“形状”的另外参数，来完成特定信号的检测，该信号的“形状”此外利用将要检测的粒子的形状来确定。例如，诸如标记有荧光抗体的圆形细胞的圆形粒子将导致在光学检测期间记录的图像中的“圆形信号”。适用于该目的的优选软件是Iconoclust软件（德国Jena的Clodiag ChipTechnologies GmbH）。
可以用于本发明中的另一光学检测系统是共焦荧光显微镜，其中，经由点光源在透镜的焦平面内照明对象。重要的是，点光源、对象以及点光检测器位于光学共轭的平面上。这些共焦系统的实例例如在NJ的Hobroken的Wiley-Liss的Diaspro,A.(2002)Confocal and2-photon-microscopy:Foundations,Applications and Advances中进行了详细描述。本发明的荧光光学系统尤其优选表示没有自动对焦的荧光显微镜，例如具有固定焦距的荧光显微镜。
在根据本发明的可选择装置中，提供用于执行分析物的电化学检测的器件，该执行例如通过经由连接到第一表面和/或第二表面的电极来测量氧化还原电位的改变来完成（例如见Zhu,X等.(2004)Lab Chip.4,581-587），或者通过循环电压计来完成（例如见Liu.J等(2005)Anal.Chem.77,2756-2761以及Wang,J.(2003)Anal.Chem.75,3941-3945）。此外，还可以提供用于例如通过阻抗测量来执行电气检测的器件（例如见Radke,S.M等.(2005)Biosens.Bioelectron.20,1662-1667）。
通常，根据本发明的装置和系统是独立的。也就是说，它们在执行化验的同时不一定需要移除和/或替换反应腔内的取样和/或任何其他试剂。因此，本发明的装置和系统的优选实施例仅仅包括取样进口端口而不包括出口端口。
在另一方面，本发明提供用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
（a）将假设包括将要检测的一种或多种粒子的取样布置在反应腔内；
（b）经由一个或多个移出器，来移出在反应腔中的取样的至少一部分；以及
（c）检测/确定表示一种或多种粒子的存在和/或数目的值。
在本发明的优选实施例中，“将取样布置在反应腔内”包括将所述取样引入到如上所述的发明的装置或系统的反应腔内。
在本发明的另一尤其优选的实施例中，该方法包括：
（a）将包括多个粒子的取样布置在反应腔内；
（b）经由一个或多个移出器来移出在反应腔内的所述多个粒子的子集；以及
（c）确定表示在步骤（b）中移出的粒子子集的粒子数目的一个或多个值。可选地，该方法还包括：
（d）根据在步骤（c）中获得的一个或多个值来计算在反应腔内的多个粒子的总数。
在本发明的一些实施例中，在步骤（c）中的量化检测/确定包括对取样内的一种或多种粒子的计数，例如在生物取样中的细胞的枚举。
如这里所用的术语“取样”表示通过使用根据本发明的装置将要分析的液体，以及假设该“取样”包括一种或多种将要检测的粒子。优选地，将要分析的取样是生物取样。可以使用本发明分析的液体取样的实例包括有机和无机化学溶液、饮用水、污水、人体以及非人体流体诸如全血、血浆、血清、尿、痰、鼠尾草（salvia）或脑脊髓液、来自动物、植物或组织培养的细胞提取物、原核与真核细胞悬浮液、噬菌体制备等。取样还可以包括一种或多种附加试剂，附加试剂可能由于在将取样引入（布置）在反应腔内之前对取样的光学净化和/或处理所导致，该附加试剂诸如稀释剂、溶剂或缓冲剂。
将要分析的取样可以包括当执行本发明时将要检测的一种或多种粒子。术语“粒子”，如这里所用的，表示具有特定的结合（binding）性能和/或特有反应性，这些特定的结合（binding）性能和/或特有反应性使得能够通过执行本发明的方法来检测“粒子”。因此，术语“粒子”不仅仅以字面意思解释为表示诸如细胞或病毒的“真实“粒子，而是还理解为包括将要检测的分子，特别是（生物）高分子诸如核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物以及相似物或它们的混合物，且具有到取样中存在或附加到取样中的任何（合成）粒子的键合性。
术语“类”，如这里结合术语“粒子”的使用，表示特定类型的粒子，也就是例如特定类型的细胞或特定噬菌体。因此，术语“一种或多种”表示诸如一个或多个不同细胞类型的一个或多个不同的粒子类型。
根据本发明的“真实”粒子包括自然发生的以及合成的粒子。这些自然发生的粒子的实例包括原核细胞（例如细菌细胞，诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）、真核细胞（例如诸如酿酒酵母的酵母细胞、诸如Sf9或Hi-5细胞的昆虫细胞、诸如HeLa或Cos细胞的永生细胞系、以及诸如哺乳动物血细胞的原代细胞）或病毒（例如诸如M13或T7噬菌体的噬菌体粒子）。合成粒子的实例包括（顺磁性）聚苯乙烯珠以及乳胶珠，可选择地涂覆以将要利用本发明检测的一种或多种分子，特别是一种或多种（生物）高分子，诸如核酸、蛋白质、脂质或碳水化合物。
将要分析的取样可以经由一个或多个开口直接引入到反应腔内，这些开口可以锁定和/或密封，并存在于第一表面、第二表面和/或一个或多个横向侧壁中。可以通过使用适合的压力生成器件，例如吸液管、注射器或例如可以是处理设备的功能单元的自动单元，来将取样可选择地连同附加试剂一起转移到反应腔内。或者，可以利用毛细作用力而无需任何外部操纵地，例如，通过将取样紧邻定义反应腔的任何表面中存在的一个开口地设置，来将取样引入到反应腔内。
在本发明的方法的特定实施例中，利用通过操作一个或多个移出器导致的负压，来将取样引入到反应腔内。在该实施例中，最初，也就是在添加取样之前，至少在反应腔的一个或多个部分中的第一表面和第二表面之间的距离，或者换句话说，至少在第一和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分中的第一表面和第二表面之间的距离，经由一个或多个移出器通过向第一和/或第二表面应用压力来减少。优选地，将该距离减少到零或几乎零的值。然后，再增加所述减少的距离，优选通过如下行为来将该距离增加到初始值：重设移出器（例如通过在向后方向上运动移出器）从而导致在反应腔内的负压，该负压则允许将取样引入到反应腔内。
本发明的方法意图在执行方法时不需要移除和/或替换在反应腔内的取样和/或任何试剂地执行。具体地，本发明方法的优点是，不需要要求该移除/替换的清洗或漂洗步骤，例如以便增加了使用的检测方法的信噪比。然而，一些应用可能需要将附加试剂引入到反应腔中，这些附加试剂诸如包括标记的一个或多个试剂，以允许进一步检测感兴趣粒子。如上所述，在将取样引入到反应腔内之前、伴随取样或者已经将取样引入到反应腔内之后，可以将这些附加溶液直接引入到反应腔内。在优选实施例中，在添加取样之前，特别地以冻干/干燥的形式诸如粉末、颗粒或丸，在装置（例如在补偿区内）中提供附加试剂。
或者，引入将要分析的取样以及可选择的另外试剂，还可以采用通过一个或多个填充单元的间接方式。
在本发明的范围内，“填充单元”表示用于填充反应腔的器件，该“填充单元”可能是本发明的装置的集成部件，或者被设计为可以附着到反应腔以填充反应腔而在使用后拆卸的独立部件。能够保持本发明中将要分析的液体取样并且可以连接（取消连接）到反应腔的任何容器可被用作填充单元。如上已经所述的，在反应腔与填充单元之间的连接可以通过诸如管、管嘴、套管、针状物等的器件来实现。可以利用与上述相同的方式，将给出取样引入到填充单元的一个或多个可锁定和/或可密封的开口内以直接引入到反应腔内。
在特定实施例中，使用一个或多个套管来将填充单元连接到装置的反应腔。使用的套管穿过反应腔内包括的一个或多个开口的锁定和/或密封。本发明中优选使用的套管由高级钢或合成聚合物制成，通常具有0.05mm到2mm的直径。优选地，以这样的方式布置两个套管，以便一个套管用于将取样引入到反应腔内，而另一个套管则用于从反应腔取出过剩的气态材料和/或过剩液体（详细描述参见国际专利申请WO01/02094，该申请的相关内容明确附上作为参考）。
填充单元可以包括集成或可拆卸的独立废物容器，该废物容器用作从反应腔取得过剩介质（media）。可选地，废物容器包括有另外的气态、液态或固态过滤介质，诸如纤维素、过滤材料以及硅胶，它们将可逆或不可逆地结合剩余物质。此外，垃圾容器可以包括一个或多个气孔或可以在内部设有真空，用于改进过剩物质到垃圾容器的转移。
填充单元还可以包括确保其准确匹配反应腔的相应附着部位的机械器件，也就是相对于反应腔准确布置填充单元以允许在诸如可锁定和/或可密封的开口的优选部位处经由一个或多个套管、管嘴等将填充单元连接到反应腔。该机械器件的实例包括特别设计的扣合或弹簧锁。优选地，该机械器件允许在将取样以及任何可选试剂引入到反应腔内之后拆卸填充单元。
本发明的一个优点为可以分析小于10μl的容积的取样。通常，取样容积在1到1000μl的范围内、优选在1到100μl的范围内、更优选在1到25μl的范围内、以及最优选在1到5μl的范围内。
将要分析的取样可以无需任何进一步的净化就引入到反应腔内，因为本发明的装置和方法专门设计为允许无需执行清洗和漂洗步骤来执行给出取样中的任何粒子的定性和/或定量检测。然而，在一些情况下，可能优选至少部分地净化取样，例如用来移除可能干扰进一步检测的任何天然污染物。可以以不同方式来获得取样的该（部分）净化，不同方式例如通过在将取样引入到反应腔内之前对于取样进行过滤。
此外，由于比较高的粘性会干扰取样在本发明装置的反应腔各处的扩散，所以需要稀释将要分析的取样。可以通过对取样添加稀释剂来容易地完成取样的稀释。适合的稀释剂的实例包括水、有机和无机溶剂、磷酸盐缓冲液等。如上所述，稀释剂可以在将取样引入到装置内之前添加或者可以直接添加到填充单元和/或反应腔内。
在取样以及可选择地任何附加试剂被引入到反应腔内或者已经从一个或多个填充单元转移到反应腔之后，可选择地将取样在反应腔内培育给定的一段时间，从而允许在反应空间各处的适当扩散。通常，培育期在1秒到30分钟的范围内、优选在10秒到15分钟的范围内以及尤其优选在30秒到10分钟的范围内。
在一些优选实施例中，根据本发明的方法还包括：在执行步骤（b）之前将每个包括一个或多个可检测部分（moiety）的一个或多个试剂引入到装置的反应腔内。也就是说，如上所述，可以在引入取样之前、伴随取样地或者在已经引入取样之后，直接地或经由填充单元将包括一个或多个可检测部分的试剂引入到反应腔内。
术语“包括一个或多个可检测部分的试剂”，如这里使用的，表示包括一个或多个适合的化学物质或酶（也就是一个或多个“部分”）的任何混合物，其在化学、物理或酶反应中直接或间接地生成可检测的复合物或信号。该试剂由此可能因为能够形成与所述粒子的交互作用而被一类或多类感兴趣粒子的检测所需要或便利该检测。如这里使用的，该术语被理解为包括如此的可检测标记物（也称为“标记”）以及偶联到一个或多个这样的可检测标记物的任何复合物。
在优选实施例中，从由以下物质组成的组中选择一个或多个试剂：核酸、缩氨酸、蛋白质结构域、蛋白质、碳水化合物、低分子量化合物以及它们的类似物和/或混合物。
可以用在本发明中的核酸的实例包括：自然发生的核酸，诸如脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）；以及核酸类似物，诸如戍糖核酸（PNA）或锁核酸（LNA）。自然发生的核酸的特定实例包括：DNA序列，诸如染色体DNA或cDNA分子；以及RNA序列，诸如hnRNA或mRNA分子；或它们的反向互补核酸序列。这些核酸可以采用任何长度，以及可以是单链或双链分子，优选单链。通常，本发明中所用的这些核酸在长度上为10到1000个基、优选15到500个基、更优选20到100个基以及尤其优选20到40个基。
可用作根据本发明的试剂的缩氨酸、蛋白质结构域或蛋白质包括自然发生以及例如通过重组DNA技术或经由化学合成人工设计的分子。用于设计和制备这些蛋白质分子的方法在本领域中公知（例如参见NY的Cold Spring Harbor的ColdSpring Harbor Laboratory出版社出版的Sambrook,J等(1989)的第二版Molecular,Cloning:A Laboratory Manual）。通常，本发明的缩氨酸试剂在长度上为2到200个氨基酸、优选2到100个氨基酸、更优选5到50个氨基酸以及尤其优选10到25个氨基酸。
术语“蛋白质结构域”，如这里使用的，表示多肽序列的一部分，该多肽序列的一部分与其呈现的特定功能诸如配位键合或催化活性度相关地进行定义。这些蛋白质结构域的优选实例是抗体的Fab段、诸如G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶或核受体的细胞受体的配位键合结构域、以及植物血凝素的碳水化合物结合结构域。
可用作本发明中的试剂的碳水化合物的实例包括葡萄糖或果糖的单糖、诸如乳糖或蔗糖的二糖以及诸如淀粉的低聚糖和多聚糖，其中优选单糖。
术语“低分子量化合物”，如在这里所用的，表示分子，优选有机分子，包括至少两个碳原子，但是优选不具有多于七个可旋转碳键，具有的分子量在100与2000道尔顿之间的范围内、优选在100与1000道尔顿之间的范围内，以及可选择地包括一个或两个金属原子。这些分子的实例包括咪唑、吲哚、异噁唑、噁唑、吡啶、嘧啶以及噻唑。
根据本发明可以使用的可检测标记物或标记包括任何化合物，其在化学、物理或酶反应中直接或间接地生成可检测的化合物或信号。优选地，标记可以从酶标记、有色标记、荧光标记、发色标记、发光标记、放射标记、半抗原、生物素（biotin）、金属络合物、金属以及胶体金中选择，其中尤其优选荧光标记。所有这些类型的标记在本领域中良好实现。利用这些标记介入（mediate）的物理反应的优选实例是，当使用放射标记时在X射线的辐射或激发或发射之后发出荧光或磷光。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β牛乳糖和β内酰胺酶是酶标记的实例，其催化发色反应产物的形成，并且其可以用在本发明中。优选的酶标记是辣根过氧化物酶，尤其连同从由以下物质组成的组中选择的酶作用物一起使用：3-氨基-9-乙基咔唑、4-氯-1-萘酚、3,3’-二氨基联苯胺以及3,3’,5,5’-四甲基-对二氨基联苯，后者尤其优选。
在本发明的优选实施例中，包括一个或多个可检测部分的一个或多个试剂被直接偶联到一种或多种将要检测的粒子，其中要注意，该偶联通常不对于“作为整体”的粒子发生，而是对于一种或多种特定分子、优选地在所述粒子的表面上对于诸如核酸或蛋白质的高分子发生。该“表面分子”可以是在细胞表面上自然发生的分子（例如诸如G蛋白偶联受体或特定碳水化合物部分的细胞表面受体），或者被人工涂覆到粒子的表面，该粒子例如经由生物素/亲合素联合（avidin-linkage）偶联到顺磁性珠的核酸分子（也称为“俘获分子”或“分子探针”）。标记反应，也就是一个或多个可检测部分附着到本发明的试剂，可以在本发明装置外部也就是引入取样之前执行，或者可选地在上面已经描述的填充单元中直接在装置中执行。可以通过本领域中公知的方法来执行标记（例如可见Sambrook,J等,supra;以及Lottspeich,F.,以及Zorbas H.,supra）。
优选地，每个包括一个或多个可检测部分的一个或多个试剂具有对于它们键合连接的特定“表面分子”（或这样的粒子）的键合性。这些试剂的实例包括抗体以及其片断（例如Fab段）、抗体类分子（例如抗运载蛋白）、以及DNA-或RNA-键合蛋白质以及其片断。将要用在本发明中的适合抗体或抗体片断包括抵抗将要检测的特定分析物而生成的一级抗体以及抵抗其中已经生成了一级抗体的动物种类的免疫球蛋白G而生成的二级抗体。标记通过如上所述将试剂偶联到一个或多个可检测标记而完成。
在另一优选实施例中，在反应腔内存在的同时，每个包括一个或多个可检测部分的一个或多个试剂和在将要被检测的粒子上的“表面分子”（或这样的粒子）被允许形成与彼此的分子间相互作用。最后，使用适当的检测方法来检测这些分子间相互作用。
在已经将取样可选择地连同任何附加试剂引入到反应腔内之后，经由一个或多个移出器在反应腔内移出取样的至少一部分。术语“移出”，如这里使用的，被理解为在反应腔内移动取样，这通过借助于一个或多个移出器，至少在第一表面和/或第二表面的表面区域的一个或多个部分，改变（优选减小）第一表面和第二表面之间的距离来实现，优选通过对所述一个或两个表面或它们的至少一个或多个部分施加压力。因此，以下都在本发明的范围内：改变所述表面的整个表面区域各处的第一表面与第二表面之间的距离；或者改变仅仅在表面区域的一部分中的距离，该部分诸如在反应腔的一个终端处；或者改变在表面区域的至少两个不同部分诸如反应腔的两个终端中的第一表面和第二表面之间的距离。
改变优选减小在第一表面和第二表面之间的距离，通过经由一个或多个移出器将第一表面和/或第二表面相对于彼此垂直运动来完成。术语“垂直运动”，如这里所用，表示装置的一个或两个表面垂直于或基本垂直于它们相应的表面区域来运动，从而导致它们之间的距离的改变。在第一表面和第二表面之间的距离改变可以通过在任何方向上垂直运动两个表面的任一个或者通过在相反方向上同时运动两个表面来完成。因此，减小装置的第一表面和第二表面之间的距离可以通过向着第二表面运动第一表面或其至少一个或多个部分、通过向着第一表面运动第二表面或其至少一个或多个部分、或者通过向着彼此运动两个表面或它们的至少一个或多个相应部分来完成。反之也成立，增加装置的第一表面和第二表面之间的距离可以通过远离第二表面运动第一表面、通过远离第一表面运动第二表面、或者通过远离彼此运动两个表面来完成。特别地，优选通过经由所述一个或多个移出器对任一个或两个表面施加压力和/或牵引力来改变第一表面和第二表面之间的距离。在本发明的范围内，可以经由存在于给定装置内的所有移出器或经由这些移出器的仅仅一个且其他至少一个移出器保持未用地伴随施加压力和/或牵引力。例如，由此，在包括两个移出器的本发明的装置中，可以经由两个移出器或经由它们中的仅仅一个，来伴随地对第一表面和/或第二表面的至少一部分施加压力和/或牵引力，从而移出布置在反应腔内的取样。
因此，考虑到上面定义的不同类型的移出器，关于第一表面和第二表面（在下面术语“第一表面”和/或“第二表面”也被理解为表示相应表面区域的至少一部分）之间的距离的改变优选减小的不同模式，是可以设想到的，最终导致反应腔内取样的至少一部分的移出。
首先，在移出器构成第一表面或第二表面的集成部分（例如设计为延伸到反应腔内的凸起实体的移出结构）以减小在所述表面之间的距离的情况下，可以向着相对的表面垂直地运动包括移出结构的相应表面，以向着包括移出结构的表面垂直运动相对表面，或者向着彼此相对垂直地运动两个表面。可选地，与“集成”移出结构相对的表面也包括在相应（也就是相对）位置处的移出器，该移出器也可以集成到表面中或可以表示移出体，如上所述操作该移出器。相应（一个或多个）表面的垂直运动可以通过移出体类型的一个或多个移出器来获得，或者通过允许所述表面的垂直运动的一个或多个附加器件来获得。该装置可以被集成到或附加到装置的第一表面和/或第二表面，或可以包括独立实体。在一些实施例中，从由人类手指、杆、销、挺杆和螺钉组成的组中选择一个或多个器件。如果装置被集成到自动处理系统中，则连接到反应腔的诸如撞杆（stamp）或柱塞（plunger）的一个或多个器件可用于在第一表面和/或第二表面上施加压力。用于对表面施加压力的任何器件可以仅仅用手将它们按压在一起。
第二，在移出器以移出体形式存在以减小在所述表面之间的距离的情况下，可以通过向着表面运动所述移出器，来对与移出器所位于的表面相对的相应表面施加压力，至少在表面区域的该部分中的表面可以可选择地由弹性可变形材料制成。相应表面的（弹性）变形，也就是垂直方向上的表面的“运动”，经由移出器完成，然后导致第一表面和第二表面之间的距离的减小。可选地，第二移出器可以与上述移出体相对地定位在反应腔的另一“侧”上。该第二移出器可以是集成到相应表面内的移出结构或可以是与相应表面相对设置的另一移出体。第二移出器的垂直运动在与第一移出器相反的方向上发生。
至少在（一个或多个）表面区域的一个或多个部分中减小在反应腔的第一表面和第二表面之间的距离导致伴随的在减小了距离处的相应部位处的反应空间的伴随（空间限制）减小。因此，将要分析的取样变得至少部分地从这些部位接连移出以及在反应腔内“运动”，优选运动到补偿区，该补偿区允许保持反应腔的容积基本不变。
在已经减小在第一表面和第二表面的至少一个或多个部分之间的距离之后，可以立即执行检测，如下所述。
术语“检测/确定指示一种或多种粒子的存在和/或数目的值”，如这里所用，表示确定诸如导电率、氧化还原电位、荧光强度或生物体发光的参数，这些参数允许对于取样中的给出粒子进行定性和/或定量的测量。在本发明的范围内，可以确定仅仅这些参数的单个，但是也可以同时或接连地确定多于一个的参数（例如导电率和利用适合标记导致的荧光信号的强度）。
优选地，检测在位于第一表面和/或第二表面的（一个或多个）检测区域之间的反应腔的部分中执行，如上所述。该部分反应腔也称为“检测区”。对于定量测量，也就是粒子的计数，则优选采用分别包括反应腔和具有已知容积的检测区的装置。
然而，在该方法的这个阶段，优选再增加在反应腔的第一表面和第二表面的至少一个或多个部分之间的距离。尤其优选恢复原始距离，也就是减小之前在反应腔的第一表面和第二表面之间的距离。这可以通过至少一个移出结构的在相反方向上的垂直运动以及可选择地也通过如上所述允许所述表面的垂直运动的器件的在相反方向上的垂直运动来获得，也就是通过不继续向相应表面或表面区域上施加压力来获得。可选择地，已经经由第一移出器在给定表面区域中施加压力减少了的第一表面和第二表面之间的距离的再增加，可以通过经由第二移出器在另一表面区域中施加压力减小距离来改进。优选地，两个移出器都表示移出体，其可以与相同表面相对地设置，也就是与第一表面或第二表面相对地设置，或与不同表面相对地设置。在第一表面和/或第二表面的至少一个或多个表面区域中再增加该两个表面之间的距离，导致该两个表面之间的反应空间的伴随（可选择地空间限制）的增加。此外，已经在反应空间内移出的取样，优选在提供的补偿区中，将在相反方向上扩散回去。由此，通过使用在相反方向上操作的定位在第一表面和/或第二表面的表面区域的不同部位处的至少两个移出器，如上所述，可以获得反应腔内的取样的连续移出以及混合。
在本发明的特别优选实施例中，在第一表面和第二表面的至少一个或多个部分之间的距离的接连减小和再增加被重复至少两次。在两个或多个连续的“压缩/松弛周期”期间第一表面和第二表面的至少一个或多个部分之间的距离的减小程度优选相同。也就是说，在装置的压缩状态下的两个表面之间的距离保持不变。然而，也可以改变在两个或多个连续的“压缩/松弛周期”期间第一表面和第二表面的至少一个或多个部分之间的距离的减小程度，例如随着周期的增加数目来增加程度。优选，重复距离的该接连的减小和再增加，直到取样均匀分布在反应腔内，也就是已经建立了均衡条件，该均衡条件是诸如取样中的粒子的计数的定量分析的可靠性所必需的。由此，当在反应腔的特定“检测区”中执行检测时，在该区域中的重复检测步骤的平均值的确定将提供对于整个反应腔内的粒子的实际数目的准确测量（只要整个反应腔的容积以及“检测区”的容积已知）。可以执行的减小和再增加的循环的数目取决于实践者的主意。通常，循环数目在2到2000的范围内、优选在10到1500的范围内、更优选在50到1000的范围内以及尤其优选在100到500的范围内。
根据本发明，可以在减小和再增加反应腔的第一表面和第二表面之间的距离的每个循环之后，来检测/确定指示一种或多种粒子的存在和/或数目的值，其中，优选在已经减小所述距离之后执行检测。然而，还可以重复检测多次，例如在每第二个或每第五个减小/再增加循环之后重复检测。此外，可以在完成最后的减小/再增加循环之后仅仅执行一次检测。在优选实施例中，在每个减小/再增加循环之后执行检测。在本发明的其他优选实施例中，检测还包括确定到那时执行的检测步骤中获得的结果的平均值，作为允许指示取样中存在的一种或多个粒子的总数的定量分析。例如，在第二个减小/再增加循环之后，计算分别在第一和第二减小/再增加循环后获得的结果的平均值；在第三个减小/再增加循环之后，计算分别在第一、第二和第三减小/再增加循环后获得的结果的平均值。可以使用本领域技术人员知道的适合的计算机软件，来分析和数学处理检测的一个或多个周期中获得的数据，以确定粒子的存在和/或计算粒子数目。
根据将要检测的（一个或多个）粒子的特定类型以及使用的可检测标记的性质，可以利用多种方法来执行检测，这些方法在本领域中已知（例如参见Ausubel,F.M等supra;Coligan,J.E等（2000）Current Protocols in Protein Sciences,Wiley &Sons,Hoboken,NJ;以及Lottspeich,F.,以及Zorbas H.,supra）。
因此，执行根据本发明的方法通常不需要使用复杂或笨重的仪器而是涉及简单的检测系统，优选基于诸如荧光、光学吸收、谐振传递等的参数的测量。根据本发明的尤其优选的检测系统基于诸如上面已经描述过的透射比浊法和散射比浊法的吸收测量，其可以利用本领域中已知的光度测定装置来获得。虽然简单，但是这些方法能够准确判定不仅仅取样中的给定一种或多种粒子的存在，还能够准确确定这些粒子的数目（例如参见费城WB Saunders公司的Tietz,N.O.(ed.)的Textbook of Clinical Chemistry.,第78-97页）。
另外尤其优选的检测系统基于诸如落射荧光或暗场荧光显微镜方法的用于测量荧光信号的“传统”方法（例如参见纽约Plenum出版公司出版的Lakowicz,J.R.(1999)Principles of Fluorescence Spectroscopy,第二版）。
本发明中还可以使用的另外荧光检测方法包括总体内部荧光显微镜方法（例如参见纽约的牛津大学出版社出版的Lacey,A编的Light Microscopy in Biology第399-423页的Axelrod,D.(1999)Surface fluorescence microscopy with evanescentillumination）、荧光寿命成像显微镜方法（例如参见Dowling,K等.(1999)J.Mod.Optics46,199-209）、荧光谐振能量传递（例如参见Periasamy,A.(2001)J.Biomed.Optics6,287-291）、生物体发光谐振能量传递（例如参见Wilson,T.,和Hastings,J.W.(1998)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.14,197-230）以及荧光关联能谱法（例如参见Hess,S.T等(2002)Biochemistry41,697-705）。
上述检测系统的备选方案包括：白光装置，例如如在WO0012759、WO0025113以及WO9627025中所述；共焦系统，例如如US5324633、US6027880、US5585639和WO0012759中所述；基于尼普科夫圆盘的共焦检查系统，例如如US5760950中所述；使用微光学元件的大规模集成荧光检测系统，例如如WO9927140中所述；以及激光扫描系统，例如如WO0012759中所述。使用这些传统检测系统的检测方法的大体描述可以例如在US5324633中找到。
此外，如上所述，可以例如通过经由连接到第一表面和/或第二表面的电极来测量氧化还原电位的改变（例如见Zhu,X等(2004)Lab Chip.4,581-587），或者通过循环伏安法（例如见Liu,J等(2005)Anal.Chem.77.2756-2761；以及Wang.J(2003)Anal.Chem.75,3941-3945），来使用电化学检测方法。此外，可以通过阻抗测量（例如见Radke,S.M等(2005)Biosens.Bioelectron.20,1662-1667）来采用电气检测方法。还可以通过例如在Z.Guttenberg等(2005)Lab Chip.5,308-317中描述的检测声表面波来执行检测。
在本发明的特定实施例中，使用分别基于荧光或生物体发光淬灭基团对的相应形成的FRET或BRET，来执行检测，以便仅仅在目标分子结合到在多孔基体中固定的俘获分子时才发生荧光信号。FRET的使用也例如在Liu,B等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.美国102,589-593；以及Szollosi,J等(2002)J.Biotechnol.82,251-266中进行了描述。BRET的使用例如在Prinz,A等(2006)Chembiochem.7,1007-1012以及Xu,Y等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.美国96,151-156中进行了详细描述。
本发明另外利用以下的附图和实例来示出，这些附图和实例仅仅为了描述本发明的特定实施例的目的，而不被解释为以任何方式限制本发明的范围。
附图的详细描述
图1示出根据本发明的化验装置的示意性截面图。装置的反应腔由第一表面、第二表面以及横向侧壁定义，其中，第二表面的至少中央区域由弹性可变形材料制成。该装置还包括与第二表面相对布置的采用移出体形式的移出器。通过经由移出器对第二表面施加压力，可以改变第一表面和第二表面之间的距离。反应腔位于腔体内并被密封。光学检测系统与反应腔的第一表面相对地设置。
图2是采用包括移出体形式的两个移出器的装置进行本发明的化验的示意性图示。这些移出器中的一个与第一表面相对地设置，而另一个则与装置的第二表面相对地设置。此外，以这样的方式布置移出器，以便它们相对于彼此相对地设置。第一表面和第二表面至少在与移出器相对的相应表面区域中由弹性可变形材料制成。已经将包括多个粒子的取样连同标记布置在反应腔内，这些标记具有对于特定类粒子的键合性。通过经由两个移出器对第一表面和第二表面施加压力，所述表面之间的距离变得在反应腔的中央部分中减小，从而导致反应腔内的取样的至少部分移出（优选移出到未示出的补偿区）。此外，通过减小在两个表面之间的所述距离，形成“间隙”，在该“间隙”中，通过记录表示特定标记的粒子的存在和/或数目的值，发生对于这些特定标记的粒子的检测。然后，优选通过将两个移出器重设到它们的原始位置（也就是通过不继续对表面施加压力），来再增加表面之间的距离。移出的取样由此将“移回”以及在再次减小距离之前变成再分布在反应腔各处。确定在“检测区”中执行的重复的检测步骤期间获得的结果的平均值将提供对于整个反应腔内将要检测的标记粒子的总数的准确测量（只要反应腔的容积以及“检测区”的容积已知）。
图3是采用包括在装置的两个终端区域处的与相同表面（下面称为“第一表面”）相对设置的移出体形式的两个移出器的装置的本发明的化验的示意性图示。反应腔的中央部分被配置为具有定义容积的毛细间隙。与两个移出器相对设置的第一表面的相应表面区域由弹性可变形材料制成。已经将包括多个粒子的取样连同具有对于特定类粒子的键合性的标记布置在反应腔内。通过经由在反应腔的一个终端区域处的第一移出器对第一表面施加压力，在反应腔的该部分中，减小第一表面和第二表面之间的距离，导致反应腔内的取样朝着另一终端区域的移出。接着，位于另一终端区域处的相应第二移出器利用移出的液体在其原始位置上向后移出的液体推动，导致在反应腔的该部分中的第一表面和第二表面之间的距离的增加。取样的移出导致毛细间隙中的反应腔内存在的标记的粒子的不同子集的定位，在毛细间隙中发生检测。接着通过经由第二移出器对第一表面施加压力，在“向后方向”上移出反应腔内的取样，导致标记粒子的另一不同子集布置在毛细间隙中。由此，通过使用在相反方向上操作的两个移出器，获得连续的移出，由此获得反应腔内的取样的混合。通过确定在“检测区”中执行的重复的检测步骤期间获得的结果的平均值，可以计算在整个反应腔内要检测的标记的粒子的总数（只要反应腔的容积也已知）。
图4示出本发明的装置和系统以及操作的对应模式的特定实施例。图4A（上部）示意性示出配置为由第一表面和第二表面定义的通道以及在补偿区或储液池中的一端处流出的单个装置或部件。储液池的至少一部分由弹性可变形材料制成。在所述储液池中可以提供试剂（诸如缓冲剂或标记），优选以干燥形式提供。移出器与储液池（未示出）的一个表面相对地设置。在装置的相对端部处，提供取样引入通道（也就是取样加载区）。通道包括特定的检测区域（也就是检测区）。可以将至少两个这样的装置或部件组装到包括分开的反应腔的多部件系统，以便并行地执行一个取样的多个化验。各个反应腔经由共用的取样引入通道彼此连通。图4A（中间和底部图）分别示出包括两个和三个装置的该多部件系统的两个例示实施例。图4B示意性示出如何操作单元（诸如多部件系统的单个装置或单个部件）。上部是初始状态的装置的截面图。包括特定检测区域的通道由刚性第一表面（阴影（hatched））以及由弹性可变形材料制成的第二表面（“盖膜”）来限制。将移出器（“模板（Stencil）”）向着储液池的第二表面按压，导致在该表面区域中的第一表面和第二表面之间的距离的减小，优选将该距离减小到零或接近零的值。将一滴液体取样布置在取样引入通道中并利用由移出器的释放（例如通过在向后反向上移动移出器）导致的负压从而导致储液池的松弛（图4B中间的图）来引入到反应腔内。最终，再次将移出器向着储液池的第二表面按压。由此，通过另一次减小在该表面区域中的两个表面之间的距离，取样变得至少部分地在反应腔内移动。因此，在执行一种或多种粒子的检测之前，通过重复储液池的接连的压缩和松弛，可以获得取样的搅动/混合（图4B底部的图）。
图5示出根据本发明的用于确定在人类血液中的CD4+细胞的数目的化验结果。根据制造者的指示，使用CD3CD4套件（德国海德尔堡的GE医疗生命科学），利用抗-CD4藻红蛋白共轭单克隆抗体来标记人体血液取样的CD4+细胞。将血液取样稀释到小于500细胞/μl的浓度，并且在由聚二甲基硅氧烷制成的配置为毛细通道的反应腔内进行分析。反应腔具有大约2μl的总容积。在利用毛细作用力将取样引入到反应腔内之后，通过经由推杆对反应腔的一个表面施加压力由此导致取样的部分移动，来对取样进行搅动。可以重复10次这种方式的取样移动。使用具有10X物镜（像场1727×1385μm）和F1-FITC滤光器（Zeiss#09）的显微镜（Akioskop;Carl Zeiss GmbH,Jena,德国），通过光学检测，来分析标记的细胞。曝光时间为2500ms。重复5-7次的检测。示出代表性的显微镜图像。通过计算对于各次测量获得的细胞数目的平均值，使用适当的计算机软件包（Image J软件版本1.71，由NIH Image提出的公共域JAVA图像处理程序），确定取样中的CD4+细胞的数目。因为像场由此“检测区”的容积以及反应腔的容积已知，所以可以计算CD4+细胞/μl取样的浓度。
图6示出分别利用流式血细胞计数仪和根据本发明的化验获得的人类血液中的CD4+细胞数目的比较。如图5所示，标记人体血液取样的CD+细胞。根据制造商的指示使用Guava PCA流式血细胞计数仪（美国CA的Hayward的G uavaTechnologies公司，激发波长：532nm，发射波长：580-583nm）以及使用如图5所示的本发明的化验，来分析取样。结果是5-7次测量的平均值±SEM，以及表达为每μl血液的CD4+细胞的数目。
实例
实例1：判定人体血液中的CD+细胞的存在
根据制造者的指示，使用CD3CD4套件（德国海德尔堡的GE医疗生命科学），利用抗-CD4藻红蛋白共轭单克隆抗体来标记人体血液取样的CD4+细胞。简单说，10μl血液与2μl CD4-PE（1：25稀释的储备溶液）以及2μl的20mM EDTA混合。然后，将混合物在黑暗中培育15分钟。血液取样被稀释到小于500个细胞/μl的浓度（更高的浓度会干扰装置的正确操纵），并且在由聚二甲基硅氧烷也就是弹性可变形材料制成的配置为毛细通道的反应腔中进行分析。反应腔尺寸为2.048mm×0.04mm×24mm并且具有大约2μl的总容积。
为了引入取样，2.5μl的稀释后的血液取样被布置在通道开口附近，并且利用毛细力而无需另外的外部操纵来引入。此后，通过经由推杆（或钳子）对反应腔的一个表面施加压力来搅动反应腔，从而导致取样的部分移出。以这种方式移出取样被重复10次。
使用具有10X物镜（像场1727×1385μm）和F1-FITC滤光器（Zeiss#09）的显微镜（Akioskop;Carl Zeiss GmbH,Jena,德国），通过光学检测，来分析标记的细胞。曝光时间为2500ms。重复5-7次的检测。示出代表性的显微镜图像。
通过计算对于各次测量获得的细胞数目的平均值，使用适当的计算机软件包（Image J软件版本1.71，由NIH Image提出的公共域JAVA图像处理程序），确定取样中的CD4+细胞的数目。因为像场由此“检测区”的容积以及反应腔的容积已知，所以可以计算CD4+以细胞/μl取样计的浓度。
实例2：用于确定人体血液中的CD4+细胞的数目的流式血细胞计数仪和本发明化验的比较
为了测试用于定量分析的本发明的化验的适宜性，将本发明的化验与用于确定人体血液中的CD4+细胞数目的传统流式血细胞计数仪进行比较。如实例1所示，标记人体血液取样的CD4+细胞。根据制造商的指示使用Guava PCA流式血细胞计数仪（美国CA的Hayward的Guava Technologies公司，激发波长：532nm，发射波长：580-583nm）以及使用如实例1所示的本发明的化验，来分析取样。结果在图6中示出，并且表示5-7次测量的平均值±SEM。结果被表达为每μl血液的CD4+细胞的数目。
两种方法获得的平均值以及相应差异百分比也在以下表中进行总结。
化验号 平均流量 平均化验 Δ[%]
1 1234 1114 9.78
2 1208 1330 9.14
3 1212 1245 2.66
4 1198 1162 3.01
5 1169 1131 3.34
6 1011 710 29.83
7 1118 1064 4.85
8 1008 968 4.03
9 1058 1170 9.58
如可以看到的，在执行的九个独立化验中的五个中，两种方法之间的变化小于5%，在三种情况下变化小于10%。仅仅在第6号化验中，获得了大约30%的较高变化，这可能由于其中两个分析并非利用相同的血液取样并行地执行的情况所导致。然而，其他结果清楚指示：本发明的方法适于生物取样中的粒子的定量检测。
这里描述性示出的本发明适于在缺乏未在这里特别公开的任何元件、限制的情况下实现。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等将被开放性地理解而不意图限制。此外，这里采用的术语和表达被用于描述性而非限制性的术语，并且不意图使得这些术语和表达的使用排除所示和所描述的特性或其部分的任何等效，而是知道，多种修改在本发明的范围内是可以的。因此，应该理解，虽然已经利用优选实施例和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采取这里包含的本发明的修改和变化，并且这些修改和变化被认为在本发明的范围内。
这里已经广泛和大体地描述了本发明。落在类别（generic）公开中的更窄的种类和子类分组的每一个也形成本发明的一部分。这使得本发明的类别描述具有从类中移除任何主题的附加或否定限制，不管在这里是否具体陈述了排除的材料。
其他实施例在以下权利要求内。此外，虽然按照马库什组描述了本发明的特征或方面，但是本领域技术人员将知道，本发明也按照马库什组的任何独立成员或成员子集进行描述。

Claims (48)

1.一种用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
(a)将假设包含待检测的一种或多种粒子的取样布置在反应腔内；
(b)借助于一个或多个移出器，来移出在反应腔中的取样的至少一部分；以及
(c)检测/确定用来表示一种或多种粒子的存在和/或数目的值，其中，该方法还包括将以下步骤重复数量为NR的次数：将取样的多个粒子布置在所述反应腔中，以及从所述反应腔内移出所述多个粒子的一些，从而在每个情况下，仅仅剩下所述多个粒子的适当子集，其中NR≥2。
2.一种用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
(a)将包括多个粒子的取样布置在反应腔内；
(b)借助于一个或多个移出器来移出在反应腔内的所述多个粒子的子集；以及
(c)确定用来表示在步骤(b)中移出的粒子子集的粒子数目的一个或多个值；其中，该方法还包括将以下步骤重复数量为NR的次数：将取样的多个粒子布置在所述反应腔中，以及从所述反应腔内移出所述多个粒子的子集，从而在每个情况下，仅仅剩下所述多个粒子的适当子集，其中NR≥2。
3.根据权利要求1或2之一所述的方法，还包括：
(d)根据在步骤(c)中获得的所述一个或多个值来计算在反应腔内的多个粒子的总数。
4.根据权利要求1或2之一所述的方法，还包括：在执行步骤(b)之前，把各包括一个或多个可检测部分的一个或多个试剂布置/引入到所述反应腔内。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述一个或多个试剂从由以下组成的组中进行选择：核酸、缩氨酸、蛋白质结构域、蛋白质、碳水化合物、低分子量化合物以及它们的类似物和/或混合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述一个或多个试剂具有对于待检测的一个或多个粒子的键合性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，允许所述一个或多个试剂和待检测的所述粒子形成彼此的分子相互作用，以及其中，在步骤(c)中，检测所述分子相互作用。
8.根据权利要求1或2任何一项所述的方法，其中，所述取样是生物取样。
9.根据权利要求1或2任何一项所述的方法，其中，所述待检测的一种或多种粒子从由以下组成的组中选择：原核细胞、真核细胞以及病毒粒子。
10.一种用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
将取样的多个粒子布置在检测腔内；
从检测腔移出多个粒子的一些，从而使得仅仅剩余所述多个粒子的适当子集；
光学地检测所述多个粒子的所述子集的粒子；以及
基于所述检测的粒子，确定用来表示所述粒子子集的粒子数目的值；其中，该方法还包括将以下步骤重复数量为NR的次数：将取样的多个粒子布置在所述检测腔中，以及从所述检测腔内移出所述多个粒子的子集，从而在每个情况下，仅仅剩下所述多个粒子的适当子集，其中NR≥2。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括：基于表示所述适当子集的粒子数目的值，确定用来表示在所述取样中的粒子的数目或丰度的值。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，确定表示所述取样中的粒子的数目或丰度的值还基于：所述检测腔的检测容积的尺寸；表示所述子集的粒子数目的值，该值表示在光学检测的步骤中所述检测容积中存在的粒子数目。
13.根据权利要求12所述的方法，对于数量为ND的NR次重复，光学地检测多个粒子的所述子集的粒子，并基于所述检测的粒子，确定用来表示粒子的所述适当子集的粒子数目的值，其中ND≥NR。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，ND≥5。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，ND≥10以及NR≥5。
16.根据权利要求14所述的方法，还包括：基于数量NV的表示所述适当子集的粒子数目的NR个值，确定表示在取样中的粒子的数目或丰度的值。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，ND≥10以及NR≥NV≥5。
18.根据权利要求10所述的方法，其中，将布置和移出的步骤重复NR次包括：对于多个所述NR次重复，将所述被移出的多个粒子的至少一些再引入到所述检测腔内。
19.根据权利要求18所述的方法，还包括：在与所述检测腔流体连通的储液池中容纳从所述检测腔移出的粒子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述容纳包括膨胀所述储液池的壁。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述再引入包括收缩所述储液池的壁。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，移出所述多个粒子的一些包括减小所述检测腔的容积。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，减小所述检测腔的容积包括减小所述腔的第一壁和第二壁之间的距离。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述光学检测的步骤包括检测通过所述第一壁的光。
25.根据权利要求19所述的方法，其中，在移出之前所述检测腔具有初始容积，在移出之后所述腔具有移出后的容积，并且移出后的容积与初始容积的比率为0.25或更小。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述比率是0.15或更小。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述比率是0.05或更小。
28.根据权利要求18所述的方法，其中所述取样是液体取样，在移出所述检测腔内存在的取样的初始容积之前，移出步骤包括从所述检测腔移出所述液体取样的至少一些，并且剩余取样的容积与移出后取样的容积的比率是0.25或更小。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述比率是0.15或更小。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述比率是0.05或更小。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述再引入的步骤包括：把所述被移出取样的至少50％再引入到所述检测腔内。
32.根据权利要求31所述的方法，包括把所述被移出取样的至少70％再引入到所述检测腔内。
33.根据权利要求32所述的方法，包括把所述被移出取样的至少80％再引入到所述检测腔内。
34.根据权利要求33所述的方法，包括把所述被移出取样的至少90％再引入到所述检测腔内。
35.根据权利要求10所述的方法，其中，移出所述多个粒子的一些包括减小所述检测腔的容积。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，减小所述检测腔的容积包括减小所述腔的第一壁和第二壁之间的距离。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述光学检测的步骤包括检测通过所述第一壁的光。
38.根据权利要求35所述的方法，其中，在移出之前所述检测腔具有初始容积，而在移出之后所述腔具有移出后的容积，以及移出后的容积与初始容积的比率是0.25或更小。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述比率是0.15或更小。
40.根据权利要求38所述的方法，其中，所述比率是0.05或更小。
41.根据权利要求10所述的方法，其中，在确定表示所述子集的粒子数目的值的步骤之后，执行确定表示第二子集的粒子数目的值的步骤。
42.根据权利要求10到41的任何一项所述的方法，其中，所述粒子是细胞。
43.根据权利要求10-41之一所述的方法，其中，所述取样包括至少一些血液材料。
44.一种用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
将取样的多个粒子布置在检测腔中；
从检测腔移出所述多个粒子的一些，从而仅仅剩余所述多个粒子的适当子集；
光学地检测所述的多个粒子的子集的粒子；以及
判定在所述粒子子集中的目标粒子的存在；其中该方法还包括：
将以下步骤重复数量为NR的次数：将取样的多个粒子布置在检测腔内，并从所述检测腔移出所述多个粒子的一些，从而在每个情况下，仅仅剩余所述多个粒子的适当子集，以及其中NR≥2。
45.根据权利要求44所述的方法，包括：对于数量ND的NR次重复，光学地检测所述多个粒子的子集的粒子，以及基于所述检测的粒子，判定在所述粒子子集中的目标粒子的存在，其中ND≥NR。
46.根据权利要求45所述的方法，其中ND≥5。
47.根据权利要求46所述的方法，其中ND≥10以及NR≥5。
48.一种用于粒子的定性和/或定量检测的方法，包括：
将取样的第一批多个粒子布置在检测腔中；
减少检测腔的容积；
光学地检测检测腔内的粒子；
基于所述检测的粒子，确定用来表示在所述检测腔中存在的粒子的数目的值；
增加检测腔的容积；
将所述取样的第二批多个粒子布置在检测腔中；
减少所述检测腔的容积；
以及基于所述检测的粒子，确定用来表示在所述检测腔中存在的粒子的数目的值。
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