CN103636505B

CN103636505B - 一种高叶绿素多蘖大麦的复合选育方法

Info

Publication number: CN103636505B
Application number: CN201310713460.4A
Authority: CN
Inventors: 刘成洪; 黄剑华; 王亦菲; 陈志伟; 陆瑞菊; 杜志钊; 何婷; 高润红; 徐红卫; 郭桂梅
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103636505A

Abstract

本发明提供高叶绿素含量和/或多茎蘖数大麦的复合选育方法、制备麦绿素产品的方法和提高大麦叶绿素含量和/或茎蘖数。本发明的方法包括取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10℃处理10-30天；收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和培养所述纯合加倍单倍体；从而筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，已将所述大麦制备成所需的麦绿素产品。本发明通过杂交技术将多个优异性状聚合，利用小孢子培养技术对目标性状进行快速纯合稳定，在人工可控环境下进行多指标筛选，最终获得高叶绿素含量多茎蘖的大麦种质材料。该材料通过田间种植或水培方式可作为麦绿素等营养保健产品生产的优良种质材料。

Description

一种高叶绿素多蘖大麦的复合选育方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种高叶绿素含量和多茎蘖大麦材料的筛选培育方法。

背景技术

麦类作物的幼苗是一种传统中草药，我国早在《本草纲目》和《伤寒纪要》中的记载了麦苗的药用价值。1969年，日本学者荻原义秀博士发表了《禾本科植物绿叶成分及作为稳定的药品、食品研究》一文，并致力于商品化开发。1991年，他利用“超低温快速喷雾干燥法”的技术，将大麦嫩苗榨汁浓缩成粉末，称为“麦绿素”(BarelyGreen)，并向国际市场推广。目前市场上的麦绿素产品是以大麦或小麦等麦类作物分蘖盛期的嫩叶(麦高20-30cm)为主要原料，辅以糊精等配料加工而成的。麦绿素富含蛋白质、叶绿素、大量的活性酶(如SOD酶、过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶等)、β-胡萝卜素、多种维生素,以及多种微量元素（郭建华，2008）。

现代生物试验和临床研究证实，麦绿素具有以下9个方面生理功能：(1)促进损伤DNA的恢复作用；(2)消炎镇痛；(3)增强免疫力及防癌、抗癌、抗辐射作用；(4)抑制艾滋病病毒作用；(5)降血压；(6)抗溃疡；(7)清除体内多余自由基，抗衰老及防治心脑血管疾病；(8)防治糖尿病；(9)加速伤口愈合，促进造血，消除口臭（乔文静，2009）。美国FDA已批准大麦嫩叶汁作为食品增补剂。在日本，大麦嫩叶汁制品已获得日本健康协会认定的健康食品的标志（牛广财，2011）。目前国外已研制开发出麦叶系列产品，如小麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品等等，日本还推出了在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。

麦绿素产品具有良好的营养保健功能，有着广阔的市场前景，麦绿素的主要生产基地在美国、加拿大、澳洲等，由于它的纯天然性和保健作用，迎合了人们“回归自然”的追求,因而风靡北美、欧洲、澳大利亚、东南亚，每年销售额已达23～27亿美元（黄相国，2003）。大麦功能产品的生产将会增加大麦种植产业的附加值，使农民增收，据报道,每亩可生产鲜叶500kg,产值可达1000元以上,农民收入比种植常规大麦和其它冬季作物高出一倍以上（武红霞，2002）。

但目前生产麦绿素的专用大麦品种缺乏，严重限制了麦绿素产品的开发与利用。目前功能大麦的选育在我国还未引起足够重视，传统的育种目标并不能满足功能大麦选育的要求。传统的育种目标主要是考虑品种的农艺性状如籽粒产量与品质、抗病性等，而以生产麦绿素专用的大麦品种原料取自营养生长期，因此，需要重新考虑其选育目标。对麦绿素专用大麦品种选育，要求苗期生长快，拔节时茎叶产量高，叶绿素等营养含量高。

叶片是植物进行光合作用的重要器官，而叶绿素是植物进行光合作用的重要色素，其作用就是进行光能捕获，其含量的高低不仅会影响叶色，而且会直接影响光合作用的效率，有研究表明在一定范围内叶绿素的含量是与光合效率成正相关的。绿色植物都是依靠光合作用进行生物合成，完成其形态建成和生物量积累。绿色植物的叶绿素生物合成是一个由一系列酶参与合成的复杂过程，其中参与合成的酶和基因在高等植物中已比较清楚，但控制叶绿素含量的遗传模式还不清楚。目前对叶绿素含量的筛选都是集中在大田筛选，采用叶绿素仪或叶绿素荧光仪进行实地测定。这种筛选方式存在一些问题，已有研究表明叶绿素的含量受到环境因素的影响明显，不同生长周期的含量也会变化，大田环境复杂，种植条件受到各种因素影响和制约，叶绿素含量表现并不一致，另外叶绿素很大程度上受到隐性基因控制，筛选需要在高代进行，这将需要更长的时间获得纯合后代。

除了筛选高叶绿素含量，其地上部生物产量也是一个重要指标。分蘖茎叶是苗期地上部分的生物产量构成部分，要提高其生物产量，需要选择分蘖多、茎叶生长旺盛的材料。大麦育种的筛选大多集中在生长成熟期，对苗期的地上部生物产量和叶绿素含量的筛选还未见报道。

本发明将提供一种克服目前大田筛选的一些问题，实施有效、快速选育高叶绿素含量多茎蘖的大麦的方法，包括：通过杂交技术将多个优异性状聚合，利用小孢子培养技术对目标性状进行快速纯合稳定，在人工可控环境下进行多指标筛选，最终获得高叶绿素含量多茎蘖的大麦种质材料。该材料通过田间种植或水培方式可作为麦绿素等营养保健产品生产的优良种质材料。

发明内容

本发明的目的在于高效、快速提供高叶绿素含量、多茎蘖数的大麦，且所述大麦的所述性状能稳定遗传。本发明通过以下方法实现该目的，所述方法具有具有稳定性和可重复性。

本发明一方面提供高叶绿素含量和/或多茎蘖数的大麦的方法包括：

（1）取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理2-3周；

（2）收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；

（3）水培所述纯合加倍单倍体；

和筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦。

本发明另一方面提供一种制备麦绿素产品的方法，所述方法包括：

（2）收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和

（3）水培所述纯合加倍单倍体，筛选获得叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦；和

（4）将所述大麦制备成麦绿素产品。

本发明再一方面提供一种提高大麦叶绿素含量和/或茎蘖数的方法，所述方法包括：

（1）取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10℃处理10-30天；

（2）收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；

（3）水培所述纯合加倍单倍体，获得再生植株；

其中，所述再生植株为叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的植株。

应理解，所述“叶绿素含量提高”与“茎蘖数增多”是相对于起始大麦材料而言，即相对于步骤（1）的所述大麦小孢子未经本发明方法处理而获得的大麦的叶绿素含量和茎蘖数而言。

在一个具体实施例中，本发明上述方法在步骤（1）之前还包括：

（a）选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶1心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种；和

（b）培养所述品种，获得步骤（1）所述的小孢子；和

（c）如果大麦材料只具有叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速中的一个目标性状，则在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交F0代种子，繁育该F0代种子，获得F1代植株，从该F1代植株获得步骤（1）所述的小孢子。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，小孢子获自叶绿素含量高和茎蘖数多的大麦。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，所述步骤（2）包括：

（2a）消毒所述穗子，然后清洗；

（2b）从所述穗子分离小孢子；

（2c）于室温、黑暗处理小孢子36-60小时；

（2d）用诱导培养基悬浮小孢子，并将悬浮液接种于诱导培养基中，诱导愈伤；和

（2e）将诱导所得愈伤组织转入分化培养基，培养获得再生苗，即所述纯合加倍单倍体。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，分离小孢子时，在试管中加入穗子和含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的提取液，用高速分散器超速旋切，过滤，离心滤液，从而获得小孢子。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，诱导培养基以N6培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70-120g/L；分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KT1.0-2.0mg/L、萘乙酸0.03-0.08mg/L和麦芽糖15-50g/L，用3-8g/L琼脂粉固化。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，步骤（3）之后还包括：

将小孢子培养获得的再生植株放入大麦标准营养液中培养，进行再次筛选，选出叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，并收集其种子。

在一个具体实施例中，所述再次筛选是在人工可控环境下采用水培方式进行筛选。

在一个具体实施例中，所述人工可控环境包括：在人工气候室内采用日光灯管照明，光照强度约1500-2500lx，优选约1800-2000lx；保持室温白天约18-22℃，优选约20℃，晚上约16-20℃，优选18℃，白天、夜晚的温度波动约1-2℃。

在一个具体实施例中，所述麦绿素产品选自：大麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品，以及在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。

在一个具体实施例中，本发明上述方法中，所获得的小孢子用预处理液于室温、黑暗预处理36-60小时，其中，所述预处理液含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸。

优选地，本发明获得的大麦植株叶绿素含量和茎蘖数都提高。

本发明提供方法具有以下特征：

1．麦绿素产品原料取材一般是在6-7叶期，因此6-8周的水培即可完成培养过程，达到预定生长时期，期间可方便进行测定与取材。根据本文所述统计指标分别筛选出性状优异的品种。本发明采用的是人工可控的统一培养条件，在人工气候室完成，不受季节控制，筛选具有稳定性和可重复性。2叶1心期的是非常敏感的筛选时期，品种间的差异比较明显，不明显的品种在后期的连续测定中也可以进行比较。同时选择分蘖数目作为一个评价地上部生物量的指标。

2．筛选目标围绕大麦苗期叶绿素含量和地上部分生物产量两个目标进行，不考察材料后生育期籽粒产量等性状。

3．对初步筛选的含有较好目标性状大麦材料，采用小孢子培养技术获得纯合加倍单倍体（DH）株系，种质所有性状完全纯合，隐性性状可以当代表现。

4．对单一优异目标性状的大麦材料采用杂交技术聚合目标性状。

5．根据目标性状选用不同指标进行大量筛选，筛选涉及初选材料、纯合DH植株、杂交聚合性状分离后代。

6．现有的大田筛选技术通常耗时2-3年，甚至更长时间，才有可能筛选得到具有上述目标性状的可用来制备麦绿素产品的大麦材料，但筛选缺乏稳定性和可重复性。本发明由于对小孢子的特殊处理而可大大缩短该筛选时间，通常在一年内即可实现。

具体实施方式

本发明上述的方法包括：

（1）取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理10-30天；

（3）水培所述纯合加倍单倍体。

所述“低温”通常指2-10℃，例如3-5℃。低温处理指在低温下放置新鲜采摘的所述小穗。低温处理的时间通常是10-30天，例如可以是14-21天不等。

小孢子通常取自叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的亲本材料种子种植得到的大麦。

本文中，“叶绿素含量高”指就所筛选的批次而言，叶绿素含量相对较高的植株，例如，指在所筛选批次中叶绿素含量排在前20％的株系，优选前10％，更优选前5％。当然可选自叶绿素含量最高或相对最高的几株。

本文中，“分蘖数多”指就所筛选的批次而言，分蘖数多相对较多的植株，例如，指在所筛选批次中分蘖数排在前20％的株系，优选前10％，更优选前5％。

本文中，“生长迅速”就所筛选的批次而言，生长速度相对较快的植株，例如，指在所筛选批次中生长速度排在前20％的株系，优选前10％，更优选前5％。

通常，可首先根据目标性状，选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶1心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标分别筛选出性状优异的品种，例如筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种。

可采用已报道的标准大麦水培营养液（改良Hoagland溶液）进行水培，该营养源配方如下：

NH₄NO₃(0.2mM)、KNO₃(5mM)、CaNO₃.2(2mM)、MgSO₄(2mM)、KH₂PO₄(0.1mM)、Na₂SiO₃(0.5mM)、NaFe(III)–EDTA(0.05mM)、H₃BO₃(0.01mM)、MnCl₂(0.005mM)、ZnSO₄(0.005mM)、CuSO₄(0.0005mM)、Na₂MoO₃(0.0001mM)，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。

水培可在人工气候室内进行。采用日光灯管照明，光照强度约2000lx，保持室温白天20度，晚上18度，温度波动1-2度。

然后，种植该品种的种子（即亲本材料种子），用于小孢子培养取材。可在大田中种植，或者，若植株筛选材料不多，也可在筛选后在人工气候室种植。

对于只有其中一个目标性状优异的材料，在花粉成熟后可进行相互授粉杂交（正反杂交），获得杂交F0代种子。大田或人工气候室种植F0代种子，获得F1代植株，用于小孢子培养取材。

可从大田或人工气候室中种植的叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种中选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗进行低温处理10-30天，如前文所述。

低温处理后，可采用本领域已知的技术获取小孢子。包括消毒、高速离心等。

本文中，消毒通常用75%酒精浸泡20-60秒，饱和的漂白粉溶液消毒10-20分钟。通常用75%酒精浸泡30秒，饱和的漂白粉溶液消毒15分钟。本领域技术人员周知其它消毒手段。

消毒后，可用无菌水冲洗数次，例如3-4次。然后，每个试管接5-15个穗子，例如每管10个穗子。倒入10-20ml、优选15ml提取液，用高速分散器超速旋切，过滤（例如，用150目筛网过滤），离心滤液（例如，以100×g离心5min，重复3次），收集小孢子。提取液优选含有4-8%甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L的MES（2-(N-吗啡啉)乙磺酸）。在一个具体实施例中，提取液优选6%甘露醇、1.1g/L的CaCl₂和0.976g/L的MES。

可任选地用预处理液于室温（例如25℃）、黑暗预处理36-60小时，通常处理2天。预处理液的组成同提取液。

然后，可任选地用21%（质量体积百分比）麦芽糖纯化小孢子，再用诱导培养基洗涤1次，然后用诱导培养基将小孢子密度调节至0.5-2.0×10⁵/ml，优选1.0×10⁵/ml，取大约1ml小孢子悬浮液接种于培养皿(例如，35×15mm的培养皿中)，封口后室温（25℃）暗培养，诱导愈伤；然后转入分化培养基获得再生苗。此处获得植株为单细胞培养获得的纯合加倍单倍体（DH）。检测出的单倍体可以用秋水仙碱处理直接加倍变成加倍单倍体。

诱导培养基以N₆培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤（KT）0.3-0.8mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70-120g/L。在一个具体实施方式中，诱导培养基添加有KT0.4-0.6mg/L和2,4-D0.8-1.2mg/L，和麦芽糖80-100g/L。在一个具体实施方式中，诱导培养基添加有KT0.5mg/L和2,4-D1.0mg/L，和麦芽糖90g/L。

常规的N₆培养基的成分基本如下表1所示，不同厂商或文献所记载的不同成分的浓度或许有些许差别，但其功能都大致相同：

表1：N₆培养基的配方（单位：mg/L）：

N₆大量元素：
		(NH₄)₂SO₄	4635 -->
KNO₃	2830
		CaCl₂·2H₂O	166
MgSO₄·7H₂O	185
		KH₂PO₄	400
N₆微量元素：
		H₃BO₃	1.6
KI	0.83
		MnSO₄·4H₂O	4.4
ZnSO₄·7H₂O	1.5
		N₆铁盐：
Na₂EDTA	37.3
		FeSO₄·7H₂O	27.8

N₆有机元素：
		盐酸硫胺素	1.0
盐酸吡多辛	0.5
		甘氨酸	2.0
烟酸	0.5

可自行按上述配方配制本发明的诱导培养基，或者可向Sigma等化学试剂公司购买获得N₆培养基成品。然后根据本文所述配方配制本文的诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表2所示的浓度做出适当的变动，例如有大约5％或更低（例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围）的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以KH₂PO₄为例，每升N₆培养基中可含有大约380-420mg的KH₂PO₄（5％的变动幅度）。其它成分的浓度也如此变动。此外，N₆培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.3-0.8mg/L、KT1.0-2.0mg/L、萘乙酸（NAA）0.03-0.08mg/L和麦芽糖15-50g/L，用3-8g/L琼脂粉固化。

在一个具体实施方式中，分化培养基添加有6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）0.4-0.6mg/L、KT1.3-1.8mg/L、萘乙酸（NAA）0.03-0.06mg/L和麦芽糖20-40g/L，用4-6g/L琼脂粉固化。

在一个具体实施方式中，分化培养基添加有6-BA0.5mg/L、KT1.5mg/L、NAA0.05mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化。

MS培养基的配方如下表2所示（单位：mg/L）：

表2

MS大量元素：
		NH₄NO₄	1650
KNO₃	1900
		CaCl₂·2H₂O	440
MgSO₄·7H₂O	370

KH₂PO₄	170
		MS微量元素：
H₃BO₃	6.2
		KI	0.83
MnSO₄·4H₂O	22.3
		ZnSO₄·7H₂O	8.6
Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
		CuSO₄·5H₂O	0.025
CoCl₂·6H₂O	0.025
		MS铁盐：
Na₂EDTA	37.3
		FeSO₄·7H₂O	27.8
MS有机元素：
		盐酸硫胺素	0.1
盐酸吡多辛	0.5
		烟酸	0.5
甘氨酸	2.0
		肌醇	100.0

MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。本领域技术人员将理解，可对上述表2所示的浓度做出适当的变动，例如有大约5％或更低（例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围）的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升MS培养基中可含有大约95-105mg的肌醇（5％的变动幅度）。其它成分的浓度也如此变动。诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。

将小孢子培养获得的再生植株（芽长根长超过2cm时）从培养基中移出，清水洗净根部琼脂，用海绵条包裹根基部，置于漂浮板上，放入大麦标准营养液中培养，人工气候室控制生长环境条件，进行再次筛选。此次筛选获得的具有优异性状的材料可以稳定遗传，并且可以筛选到单份材料中两个性状都比较理想的目标材料。筛选到的植株可移栽盆钵泥土栽培，人工气候室种植至籽粒成熟，收获单株种子，同上繁殖保种。

任选地，可种植所述种子，从而收获高叶绿素含量、多茎蘖的材料。

水培的条件，包括光照、温度、培养液等如前文所述。

通过培养小孢子获得的再生植株，该材料是由一套染色体加倍而来纯合的加倍单倍体（DH），亲本的遗传性状完全纯合，隐性性状可在当代植株表现。

因此，本发明也包括采用本发明方法制备得到的大麦植株及其种子，以及采用该大麦植株制备得到的麦绿素产品，包括但不限于大麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品，以及在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品等。

下文将以具体实施例的方式对本发明进行描述。应理解，以下实施例仅仅是阐述性的，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。此外，应理解，上述各培养基中各成分的优选范围可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。

实施例

实施例1：亲本筛选

根据大田种植大麦材料目测情况，选取叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖数多的材料200份，分单株收获种子。取种子100粒，表面采用75%乙醇浸30秒，1%次氯酸钠消毒15分钟，蒸馏水冲洗干净，置于湿润纱布上于室温暗处催芽过夜，发芽后选取生长健壮，根芽长度大于1厘米的小苗30株，用海绵条包裹种子，置于漂浮板（漂浮板可用泡沫板按5厘米间距打孔，直径约1.5厘米）圆孔中，置于营养液中培养。营养液采用已报道的标准大麦水培营养液（改良Hoagland溶液，配方如下：

NH₄NO₃(0.2mM);KNO₃(5mM);CaNO₃.2(2mM);MgSO₄(2mM);KH₂PO₄(0.1mM);Na₂SiO₃(0.5mM);NaFe(III)–EDTA(0.05mM);H₃BO₃(0.01mM);MnCl₂(0.005mM);ZnSO₄(0.005mM);CuSO₄(0.0005mM);Na₂MoO₃(0.0001mM).使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0左右。

人工气候室采用日光灯管照明，光照强度约2000lx，大型空调控温送风，保持室温白天20度，晚上18度，温度波动1-2度。

当苗生长至2叶1心期时，用日本SPAD-502手持式叶绿素仪测定第2片叶，每个植株连续测定中部区域10次，读取平均值作为叶绿素含量值，这一时期材料间差异比较明显。以后每个星期如法测定一次倒2叶，至整个培养结束（生长至6-7叶时）。分蘖开始后，每周统计分蘖数，同时测定植株高度和叶片数目评价其生长速度。

培养结束后，对所有材料测定数据进行统计分析，找出具有统计学差异的材料。

实施例2：筛选亲本种植

选择具有上述优异性状一项或几项（高叶绿素，多茎蘖，生长迅速）的材料作为用于杂交的亲本材料，当年大田播种。挑选大小均匀、籽粒饱满的种子播种于大田，间距3cm，行距30cm。土壤中含有机质34.0g/kg、全氮2.41g/kg、速效氮37.30mg/kg，播种前施基肥20kg/亩，分蘖期10kg/亩尿素，期间可抽样检测其叶色和地上部生物产量。

实施例3：杂交

将两份携带不同目标性状（高叶绿素或多蘖）的材料进行正反杂交，具体方法是在花粉成熟时，剪开母本植株穗子颖壳，取父本植株小花花粉进行授粉，同时进行挂牌标记，成熟后单独收获杂交种子。

实施例4：F1代植株繁殖

杂交种子同上于播种季节种于大田，获得F1代生长植株，作为游离小孢子培养材料。

实施例5：小孢子培养获得纯合DH植株

从大田中选取中部小花小孢子发育处于单核早期、中期的小穗进行5度低温处理2-3周，接种时穗子用75%酒精浸泡30秒，饱和的漂白粉溶液消毒15分钟，无菌水冲洗3-4次，每个试管接10个穗子，倒入15ml提取液（含6%甘露醇，1.1g/LCaCl₂和0.976g/LMES），用高速分散器超速旋切，用150目筛网过滤，滤液以100×g离心5min，重复3次，收集小孢子。

小孢子用预处理液于25℃、黑暗预处理2d。

培养前将小孢子先用21%麦芽糖纯化，再用诱导培养基洗涤1次，然后用诱导培养基将小孢子密度调节至1.0×10⁵/ml，取1ml小孢子悬浮液接种于培养皿(35×15mm)，Parafilm膜封口，25℃暗培养，诱导愈伤。

诱导培养基以改良的N₆培养基为基本培养基，其中加有KT0.5mg/L和2,4-D1.0mg/L，麦芽糖90g/L。

将愈伤组织转入分化培养基获得再生苗。分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-BA0.5mg/L、KT1.5mg/L、NAA0.05mg/L和麦芽糖30g/L，用6g/L琼脂粉固化。

通过培养获得小孢子再生的植株，该材料是由一套染色体加倍而来纯合的加倍单倍体（DH），亲本的遗传性状完全纯合，隐性性状可在当代植株表现。

可同上进行水培再次筛选获得两个目标性状聚合（高叶绿素含量和多蘖）的大麦材料。

实施例6：DH植株筛选

将小孢子培养获得的再生植株（芽长根长超过2cm时）从培养基中移出，清水洗净根部琼脂，用海绵条包裹根基部，置于漂浮板上，放入大麦标准营养液中培养，人工气候室控制生长环境条件，同前步骤进行再次筛选。此次筛选获得的具有优异性状的材料可以稳定遗传，并且可以筛选到单份材料中两个性状都比较理想的目标材料(两个性状指标见下表)。筛选到的植株移栽盆钵泥土栽培，人工气候室种植至籽粒成熟，收获单株种子，同上繁殖保种。

选取未经过杂交和小孢子培养的原始株系作为对照的未筛选株系（品系）的种子，按前述方法进行发芽，成苗后进行采用相同水培营养液和人工气候生长条件下，同法测定叶绿素和单株茎蘖数指标进行比较。

下表3显示了采用本发明方法以及对照方法获得的不同株系的叶绿素相对含量（采用SPAD法测试）和单株茎蘖数。

表3

表3的结果显示，经本发明方法选育的大麦材料叶绿素含量和茎蘖数都远远高出未经本发明方法处理的对照大麦材料。例如，就叶绿素含量而言，本发明大麦的叶绿素含量相对于对照大麦的叶绿素含量至少有约20％的提高（比较株系L3和株系L10），最高可提高约85％（比较株系L2和L8）；同样，本发明大麦的茎蘖数相对于对照大麦的茎蘖数至少有约17％的增加（比较株系L3/L4与株系L6，而最高可增加约230％（比较株系L1和株系L7）。而且，从表3的数据可以看出，经本发明方法处理的大麦的叶绿素含量和茎蘖数普遍都高于对照大麦的叶绿素含量和茎蘖数。

Claims

1.一种生产叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的大麦的方法，所述方法包括：

(1)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，2-10℃处理10-30天；

(2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；

(3)水培所述纯合加倍单倍体；和

(4)筛选获得相对于步骤(1)的所述大麦小孢子未经前述步骤(1)－(3)处理而获得的大麦的叶绿素含量和茎蘖数而言叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的大麦；

其中，所述步骤(2)包括：

(2a)消毒所述穗子，然后清洗；

(2b)从所述穗子分离小孢子；

(2c)于室温、黑暗用预处理液处理小孢子36-60小时，其中，所述预处理液含有4-8％甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

(2d)用诱导培养基悬浮小孢子，并将悬浮液接种于诱导培养基中，诱导愈伤；和

(2e)将诱导所得愈伤组织转入分化培养基，培养获得再生苗，即所述纯合加倍单倍体；

其中，步骤(2b)中，分离小孢子时，在试管中加入穗子和提取液，用高速分散器超速旋切，过滤，离心滤液，从而获得小孢子，其中，所述提取液含有4-8％甘露醇、1.0-1.5g/L的CaCl₂和0.8-1.2g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

其中，所述诱导培养基以N₆培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.3-0.8mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、和麦芽糖70-120g/L；

所述分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.3-0.8mg/L、KT1.0-2.0mg/L、萘乙酸0.03-0.08mg/L和麦芽糖15-50g/L，用3-8g/L琼脂粉固化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(1)之前还包括：

(a)选取一批叶色浓绿、苗期生长旺盛、分蘖较多的大麦材料，水培后测定2叶1心期的叶绿素含量，至分蘖期后开始统计分蘖数、植株高度和/或茎基部周长，根据这些统计指标筛选出叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速的品种；和

(b)培养所述品种，获得步骤(1)所述的小孢子；和

(c)如果大麦材料只具有叶绿素含量高、分蘖数多、生长迅速中的一个目标性状，则在花粉成熟后进行相互授粉杂交，获得杂交F0代种子，繁育该F0代种子，获得F1代植株，从该F1代植株获得步骤(1)所述的小孢子；

其中，所述叶绿素含量高的品种指在所筛选批次中叶绿素含量排在前20％的株系；所述分蘖数多的品种指在所筛选批次中分蘖数排在前20％的株系；所述生长迅速的品种指在所筛选批次中生长速度排在前20％的株系。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

诱导培养基以N₆培养基为基本培养基，其中加有6-糠氨基嘌呤0.4-0.6mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.8-1.2mg/L、和麦芽糖80-100g/L；

分化培养基以MS为基本培养基，其中加有6-苄氨基腺嘌呤0.4-0.6mg/L、KT1.3-1.8mg/L、萘乙酸0.03-0.06mg/L和麦芽糖20-40g/L，用4-6g/L琼脂粉固化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后还包括：

将小孢子培养获得的再生植株放入大麦水培营养液中培养，进行再次筛选，选出叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，并收集其种子，其中，所述叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦指在所筛选批次中叶绿素含量和/或分蘖数排在前20％的大麦；所述大麦水培营养液的配方如下：NH₄NO₃0.2mM、KNO₃5mM、Ca(NO₃)₂2mM、MgSO₄2mM、KH₂PO₄0.1mM、Na₂SiO₃0.5mM、NaFe(III)–EDTA0.05mM、H₃BO₃0.01mM、MnCl₂0.005mM、ZnSO₄0.005mM、CuSO₄0.0005mM、Na₂MoO₃0.0001mM，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述再次筛选是在人工可控环境下采用水培方式进行筛选，所述人工可控环境包括：在人工气候室内采用日光灯管照明，光照强度1500-2500lx；保持室温白天18-22℃，晚上16-22℃，白天、夜晚的温度波动1-2℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用以下大麦水培营养液进行水培，该营养液配方如下：NH₄NO₃0.2mM、KNO₃5mM、Ca(NO₃)₂2mM、MgSO₄2mM、KH₂PO₄0.1mM、Na₂SiO₃0.5mM、NaFe(III)–EDTA0.05mM、H₃BO₃0.01mM、MnCl₂0.005mM、ZnSO₄0.005mM、CuSO₄0.0005mM、Na₂MoO₃0.0001mM，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0；

水培在人工气候室内进行，采用日光灯管照明，光照强度2000lx，保持室温白天20℃，晚上18℃，温度波动1-2℃。

7.一种制备麦绿素产品的方法，所述方法包括：

(1)取大麦小孢子发育处于单核早期和/或中期的小穗，低温处理2-3周；

(2)收获小孢子，培养小孢子，再生获得纯合加倍单倍体；和

(3)水培所述纯合加倍单倍体，筛选获得相对于步骤(1)的所述大麦小孢子未经前述步骤处理而获得的大麦的叶绿素含量和茎蘖数而言叶绿素含量提高和/或茎蘖数增多的大麦；和

(4)将所述大麦制备成麦绿素产品；

其中，所述步骤(2)包括：

(2a)消毒所述穗子，然后清洗；

(2b)从所述穗子分离小孢子；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(1)之前还包括：

(b)培养所述品种，获得步骤(1)所述的小孢子；和

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)之后还包括：

将小孢子培养获得的再生植株放入大麦水培营养液中培养，进行再次筛选，选出叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦，并收集其种子；其中，所述叶绿素含量高和/或茎蘖数多的大麦指在所筛选批次中叶绿素含量和/或分蘖数排在前20％的大麦；所述大麦水培营养液的配方如下：NH₄NO₃0.2mM、KNO₃5mM、Ca(NO₃)₂2mM、MgSO₄2mM、KH₂PO₄0.1mM、Na₂SiO₃0.5mM、NaFe(III)–EDTA0.05mM、H₃BO₃0.01mM、MnCl₂0.005mM、ZnSO₄0.005mM、CuSO₄0.0005mM、Na₂MoO₃0.0001mM，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述再次筛选是在人工可控环境下采用水培方式进行筛选，所述人工可控环境包括：在人工气候室内采用日光灯管照明，光照强度1500-2500lx；保持室温白天18-22℃，晚上16-22℃，白天、夜晚的温度波动1-2℃。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述麦绿素产品选自：大麦纤维食品、大麦叶促康食品、麦草叶饮料、麦绿素可乐、青麦酶营养品，以及在大麦嫩叶汁粉中添加糊精、酵母、胡萝卜粉、高丽参粉的营养滋补品。

13.如权利要求7所述的方法，其特征在于，采用以下大麦水培营养液进行水培，该营养液配方如下：NH₄NO₃0.2mM、KNO₃5mM、Ca(NO₃)₂2mM、MgSO₄2mM、KH₂PO₄0.1mM、Na₂SiO₃0.5mM、NaFe(III)–EDTA0.05mM、H₃BO₃0.01mM、MnCl₂0.005mM、ZnSO₄0.005mM、CuSO₄0.0005mM、Na₂MoO₃0.0001mM，使用前溶液pH值用稀盐酸调节至6.0；