CN103621316B

CN103621316B - 一种以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法

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Publication number: CN103621316B
Application number: CN201310710974.4A
Authority: CN
Inventors: 王谦; 郭苗; 刘敏; 马旭光
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: CN103621316A

Abstract

本发明涉及一种黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，包括如下步骤：A、黄浆水的预处理：将新鲜黄浆水过滤，分装，进行62℃,30min巴氏灭菌,灭菌后的黄浆水保存备用；B、以黄浆水为原料，以废糖蜜为底物，选择确定液体发酵培养基为：废糖蜜0.5-3.0%，MgSO4·7H2O0.1%，KH2PO40.2%，VB10.01g/L，0.05-1.5%增稠剂，杂木屑粉末0.2%，以预处理的黄浆水补足100%，调节pH至4.5-6.5；C、液体发酵条件为pH4.5-6.5、接种量10%、温度25-31℃、摇床转速160r/min、培养49-120h；D、将步骤C发酵所得桃红侧耳液体菌种按10%的接种量接至含杂木屑粉末的麦粒基质种瓶中。本发明充分利用了黄浆水和废糖蜜的营养成分，有利于缩短大杯蕈的制种周期和生产周期。

Description

一种以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法

技术领域

本发明涉及一种以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，属于食用菌液体发酵技术领域。

背景技术

我国是大豆的故乡，有着上千年的大豆种植和食用的历史，大豆制品种类很多、消费量大。黄浆水是豆制品生产过程中产生的废水，在豆腐加工过程中加入约10倍于大豆干重的水来研磨成浆，其中约有1/2-1/3的液体在随后的加工过程中被沥出，因其呈黄色，也被称为“黄泔水”。黄浆水富含丰富的营养物质，包括大量的蛋白质、糖类、油脂和少量的生理活性成分，并含有多种金属元素如钙、铁、锌、锰、镁、铜、钠、钾，直接排放黄浆水不仅造成资源的浪费，还严重污染环境,不利于循环经济的发展。利用黄浆水的优点还有来源广泛,不需费用,取材容易,保存方便。目前黄浆水的价值逐渐被人发现，并已开始利用，研究最多的是发酵黄浆水生产VB₁₂，以及利用黄浆水进行乳酸发酵、醋酸发酵等。

废糖蜜是制糖厂的一种副产品，常见甘蔗废糖蜜、甜菜废糖蜜。每公斤废糖蜜中含有480-520g的总糖分，其中蔗糖和还原糖比重最大，废糖蜜还含有多种氨基酸、无机盐和丰富的维生素和促生素。因废糖蜜含有丰富的营养物质，可为微生物生长提供充足的养分，常被用于发酵酒精、酵母和柠檬酸，也被用作动物饲料或制作青贮饲料。

黄浆水和废糖蜜两种食品生产中的副产品富含丰富的营养物质，前者富含蛋白质，后者富含糖类物质，两者结合可作为很好的食用菌液体培养基进行食用菌的发酵研究，以黄浆水配制培养基发酵食用菌获得多糖的研究已有报道，而黄浆水和废糖蜜发酵大杯蕈制备液体菌种还未见报道。

大杯蕈（Clitocybe maxima）属担子菌亚门（Basidiomycota）,层菌纲（Hymenomycetes）,伞菌目（Agaricales）,口蘑科（Tricholomataceae）,杯伞属（Clitocybe），又名大杯伞、大漏斗菌，俗名猪肚菇。大杯蕈子实体为中大型，群生或单生，浅漏斗状，菌盖棕黄色至黄白色，菌肉白色。大杯蕈菌盖中氨基酸含量为干物质的17%左右，其中8种人体必需氨基酸占氨基酸总量的45%，较一般食用菌要高，其亮氨酸、异亮氨酸含量居一般食用菌之冠；脂肪含量为11%左右；其菌柄转化糖含量高达48%，足知其营养之丰富和全面。此外，大杯蕈子实体中还含有若千种对人体有益的微量元素，如钴、钡、铜、锌及磷、铁、钙等，其中多数元素对于调节人体营养平衡、促进代谢、提供机能等方面，有着其他元素不可替代的重要作用。大杯蕈因其子实体具清脆、爽嫩、鲜美的口感而广受消费者的欢迎，鲜销和制罐均可。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以豆制品生产中产生的废弃黄浆水为发酵原料,加配废糖蜜为补充碳源，并在此液体培养基中加入杂木屑粉末，提前进行底物诱导，发酵大杯蕈制备液体菌种，并接种至添加同样杂木屑粉末的麦粒基质中制备菌种的方法。

本发明的技术方案是这样实现的：这种以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，包括如下步骤：

A、黄浆水的预处理：将新鲜黄浆水过滤，分装，进行62℃,30min巴氏灭菌,灭菌后的黄浆水保存备用；

B、以黄浆水为原料，以废糖蜜为底物，选择确定液体发酵培养基为：废糖蜜0.5-3.0%，MgSO4·7H2O0.1%，KH2PO40.2%，VB10.01g/L，增稠剂0.05-1.5%，杂木屑粉末0.1-0.5%，以预处理的黄浆水补足100%，调节pH至4.5-6.5；

C、液体发酵条件为pH4.5-6.5、接种量10%、温度25-31℃、摇床转速160r/min、培养49-120h；

D、将步骤C发酵所得大杯蕈液体菌种按10%的接种量接至含杂木屑粉末的麦粒基质种瓶中。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤A所述的黄浆水是指生产豆制品所得的新鲜黄浆水。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤B所述液体发酵培养基中废糖蜜底物应用比例选择为2.5%。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤B所述液体发酵培养基中增稠剂包括羧甲基纤维素钠、琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、果胶其中一种或几种。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤B所述液体发酵培养基中增稠剂选择为琼脂0.3%。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤B所述液体发酵培养基中杂木屑粉末选择为0.3%。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤C所述液体发酵条件选择为pH6.0。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤C所述液体发酵终点时间选择为96h。

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤C所述液体发酵温度选择为28℃

所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，步骤D所述的麦粒基质制作过程为：煮沸10-30分钟至麦粒中央仍有一半白芯，按麦粒79%，杂木屑粉末20%，生石灰1%的比例进行拌料，分装入250g种瓶中，装量为每瓶150g,121℃高压灭菌30min，温度降至常温后接种。

本发明充分利用了黄浆水和废糖蜜的营养成分，将其变废为宝,且降低了环境污染；加入杂木屑粉末可达到提前诱导纤维素酶、半纤维素酶的作用，加入增稠剂使得到的液体菌球数量多、小，从而在含杂木屑的麦粒基质中发菌快，有利于缩短大杯蕈的制种周期和生产周期。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施方式做进一步说明，本发明所用大杯蕈菌种为上海农科院食用菌研究所保藏。

以黄浆水发酵大杯蕈制备液体菌种的方法，包括如下步骤：

A、黄浆水的预处理；

B、以黄浆水为原料，优化大杯蕈液体发酵配方，基本配方重量比例包括：废糖蜜0.5-3.0%，MgSO4·7H2O0.1%，KH2PO40.2%，VB10.01g/L，增稠剂0.05-1.5%，杂木屑粉末0.1-0.5%，以预处理的黄浆水补足100%，调节pH至4.5-6.5。

C、液体发酵基本条件为pH4.5-6.5、接种量10%、温度25-31℃、摇床转速160r/min、培养49-120h；

D、将步骤C发酵所得大杯蕈液体菌种按10%的接种量接至含杂木屑粉末的麦粒基质种瓶中，培养后进入产业应用环节。

上述方法中有关技术参数选择如下：

步骤A所述的黄浆水是指生产豆制品所得的新鲜黄浆水。其中：

A-1、将当日生产豆制品产生的新鲜黄浆水取回后，进行四层纱布过滤滤去豆渣和杂质；

A-2、将过滤后的黄浆水分装入500mL三角瓶内，每瓶装液200ml，进行62℃,30min巴氏灭菌,灭菌后的黄浆水保存备用。

步骤B所述液体发酵培养基的组分优化选择如下：

B-1、补充碳源废糖蜜加入量的优化选择：MgSO₄·7H₂O0.1%，KH₂PO₄0.2%，VB₁0.01g/L配置培养基，以预处理的黄浆水补足100%，，调节pH至6其中废糖蜜分别设置0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%六个浓度梯度；按D步骤所确定的发酵条件进行，以发酵菌球数量和菌丝体干重为指标筛选最适配方，结果为：大杯蕈液体配方为废糖蜜2.5%，MgSO₄·7H₂O0.1%，KH₂PO₄0.2%，VB₁0.01g/L，以预处理的黄浆水补足100%；

B-2、增稠剂的优化选择：

按上述步骤B中配方配制液体培养基，按D步骤所确定的发酵条件进行，选择羧甲基纤维素钠、琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、果胶五种增稠剂，并分别设置四种浓度：羧甲基纤维素钠0.1、0.5、1.0、1.5%，琼脂0.2、0.3、0.4%，海藻酸钠0.1、0.2、0.3%、卡拉胶0.05、0.10、0.15%、果胶0.1、0.2、0.3%，实验设置空白对照，每个浓度设三个平行，实验重复3次。

发酵96h后，测量菌丝体干重、菌球直径和菌球密度，结果显示，添加0.10%的卡拉胶的液体培养基发酵大杯蕈得到的菌丝体干重最大、菌球直径小且均匀，所以选择琼脂作为增稠剂，0.3%为其优化添加浓度。

B-3、添加杂木屑粉末提前进行底物诱导的优化选择：

将干燥的杂木屑粉碎，过80目筛，分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的添加量加入到液体培养基中，按步骤C所确定的条件进行发酵，设置空白对照，每个浓度设三个平行，实验重复3次，

培养96h后，接种至含杂木屑粉末的麦粒基质中，测定满肩时间、长速及满瓶时间，筛选出大杯蕈液体菌种杂木屑粉末的优化添加量为0.3%。

步骤C液体培养条件的优化选择如下：包括初始pH、温度、摇床转速、接种量、发酵时间；

C-1、pH值优化选择：按照步骤B所筛选出的培养基配方配置液体培养基，121℃，灭菌30min。在接种量10%、温度25℃、摇床转速150r/min、培养4d的条件下，设置4.5、5.5、6.5、7.5、8.5六个不同初始pH值。结果显示，大杯蕈菌丝在设置的初始pH范围内均能生长，当pH4.5-6.5时，菌丝体干重呈上升趋势，当pH值为6.5时，菌丝体干重最大；继续提高pH值，菌丝体干重逐渐减少。本方法中发酵大杯蕈作为液体菌种使用，无需发酵到最大干重，所以确定pH6.0为初始pH。

C-2、接种量的优化选择：在pH6.0、温度25℃、摇床转速150r/min、培养4d的条件下，设置3%、6%、9%、12%、15%、18%六个不同接种量。结果显示，接种量在3%-12%时，菌丝干重呈上升趋势；接种量为12%时菌丝干重达到最大；接种量为12%-18%时，菌丝体干重有所下降，可能是因为相对于转速为150r/min时，接种量过大，菌球过于密集，培养液黏度增加，溶氧过少，影响了菌球的呼吸作用导致菌球不能正常生长，数量没有增多反而下降，所以此处接种量选择10%为宜。

C-3、培养温度的优化选择：在pH6.0、接种量10%、摇床转速150r/min、培养4d的条件下，设置19、22、25、28、31、34℃六个不同温度。结果表明，大杯蕈液体摇瓶随温度上升菌丝体重量不断增加，25℃-28℃时菌丝体干重上升明显，28℃-31℃时趋于平缓，31℃达到最大，后随温度上升菌丝体干重变化不大，34℃时菌丝干重有所下降，因而确定28℃-31℃为最适温度，此处选择28℃为优化发酵温度。

C-4、摇瓶转速的优化选择：在初始pH6.0、接种量10%、温度28℃、培养4d的条件下，设置100、120、140、160、180、200r/min六个不同转速。随着转速增大，菌丝体干重增大，菌丝体直径变小，当转速为160-180r/min时，菌丝体干重上升趋于平缓，当转速为180r/min时，虽然菌丝体干重最大，菌球直径最小，但菌丝活力即将变弱，所以选择160r/min为适宜转速。

C-5、发酵时间的优化选择：配制液体培养基，调整初始pH6.0，设置48、72、96、120、144、168h六个培养时间，以10％接种量接种后放入摇床，160r/min，28℃培养，当培养至120h时，菌丝体重量达到最大，但作为液体种子使用，菌龄为96h的菌丝体处于对数生长期，生命力更加旺盛，接种后有利于菌丝生长，所以选择96h作为发酵终点。

步骤D液体菌种接入含杂木屑粉末麦粒基质中具体处理方法如下：

D-1、麦粒的煮制时间，因液体菌种已有一定粘稠度，故麦粒作为液体菌种培养基质的煮制时间要有所不同，煮沸10-30分钟至麦粒中央仍有一半白芯，按麦粒79%，杂木屑粉末20%，生石灰1%的比例进行拌料，分装入250g种瓶中，装量为每瓶150g,121℃高压灭菌30min，温度降至常温后可接种。

这样处理的麦粒基质不仅提供了养分，避免了麦粒熟烂，保持了较好的分散度，利于液体菌种的分散和生长，其发菌时间比常规方法制种的发菌时间缩短了20％。

D-2、将上述步骤发酵所得的大杯蕈液体菌种按10%的接种量接至每个种瓶中，测量满肩时间、长速以及满瓶时间。以常规方法处理的纯麦粒基质作为空白对照。结果表明，使用本发明方法接种的种瓶，大杯蕈满肩时间和满瓶时间分别为4d和11d，而对照组的满肩时间和满瓶时间分别为6d和15d，满瓶时间缩短了26%，这大大缩短了制种周期，从而缩短生产周期。

综上所述，以黄浆水、废糖蜜为主要原料发酵大杯蕈备液体菌种，并接种至含杂木屑粉末的麦粒基质中作为栽培菌种的技术工艺，充分利用了食品加工副产物-黄浆水和废糖蜜，不仅降低制种成本，还大大缩短了大杯蕈液体菌种制种时间。

关于本发明的有关对比研究说明：

1、以黄浆水、废糖蜜替代碳氮源作为原料，发酵大杯蕈制备液体菌种的成本优势非常明显，利用了食品加工中的废弃物：黄浆水和废糖蜜含有丰富的可被食用菌利用的营养物质，丢弃不仅浪费还严重破坏环境，用来制备大杯蕈液体菌种，比起以葡萄糖、蛋白胨作为碳氮源的传统液体培养基配方成本大大降低，而且取材方便。

2、将琼脂作为增稠剂添加到用黄浆水和废糖蜜配制的液体培养基中，大杯蕈的菌球直径明显减小，且菌球大小均匀，更有利于作为液体种子使用。

表1添加0.3%琼脂对于大杯蕈菌球直径、菌球数量和生物量的影响

注：ck为不添加增稠剂的黄浆水、废糖蜜培养基

由表1可以得出，添加0.3%琼脂的培养基发酵大杯蕈所得的菌球中，直径小于2mm的菌球比例高达99.6%，说明菌球小且均匀，菌球数量大大多于对照组，作为液体菌种时，在接种量相同的情况下，萌发点更多，进而长速快，大大缩短了满瓶时间，提高了制种效率。

3、本发明发酵时菌龄的选择与一般液体发酵时有所不同，液体培养条件筛选实验确定了菌龄即发酵时间为96h，一般制备食用菌液体培养目的是多糖等次生代谢产物时，使用菌龄处于稳定期的液体培养产物，因为此时的生物量最大；但本发明选择处于增殖生长期作为其发酵终点，即发酵至96h即进入使用，菌丝体活力最强。

表2菌龄对大杯蕈液体菌种在麦粒基质中长速的影响

由表可以得出，发酵120h时的菌球数量和生物量为最大，但发酵至96h时的菌种接至麦粒基质中的长速虽然此时菌丝体数量少于稳定期，但菌丝活力强，接种至麦粒基质中，菌丝体萌发快，因而长速更快。

4、本发明中大杯蕈液体菌种中分别添加0.2%的杂木屑粉末至液体培养基，目的是提前诱导菌丝体产生纤维素酶和半纤维素酶，将其接种至含20%杂木屑粉末的麦粒基质中后很快适应基质环境，萌发快，长速快，从而缩短制种时间。99%杂木屑粉末+1%生石灰记为1号，20%杂木屑粉末+79%麦粒+1%生石灰记为2号，99%麦粒+1%生石灰记为3号。

表3不同栽培种基质对大杯蕈液体菌种长速的影响

由表看出，液体菌种在含20%杂木屑粉末的麦粒基质中，满肩时间最短，长速最快，满管时间短于其他配方，原因则是由于麦粒基质对于全木屑基质有分散度高的优点，再加之麦粒基质添加木屑粉末，接种已经过木屑粉末诱导产酶的液体菌种，长速快与纯木屑基质和纯麦粒基质。

Claims

1.一种以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征包括如下步骤：

B、以黄浆水为原料，以废糖蜜为底物，选择确定液体发酵培养基为：废糖蜜0.5-3.0％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，KH₂PO₄ 0.2％，VB₁ 0.01g/L，0.05-1.5％增稠剂，杂木屑粉末0.1-0.5％，以预处理的黄浆水补足100％，调节pH至4.5-6.5；

C、液体发酵条件为pH4.5-6.5、接种量10％、温度25-31℃、摇床转速160r/min、培养49-120h；

D、将步骤C发酵所得大杯蕈液体菌种按10％的接种量接至含杂木屑粉末的麦粒基质种瓶中。

2.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤A所述黄浆水是指生产豆制品所得的新鲜黄浆水。

3.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤B所述液体发酵培养基中废糖蜜底物应用比例选择为2.5％。

4.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤B所述液体发酵培养基中增稠剂包括羧甲基纤维素钠、琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、果胶其中一种或几种。

5.根据权利要求4所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤B所述液体发酵培养基中增稠剂选择为琼脂0.3％。

6.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤B所述液体发酵培养基中杂木屑粉末选择为0.3％。

7.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤C所述液体发酵条件选择为pH6.0。

8.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤C所述液体发酵条件为终点时间选择96h。

9.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤C所述液体发酵温度选择为28℃。

10.根据权利要求1所述的以黄浆水为主要原料制备大杯蕈液体菌种的方法，其特征在于：步骤D所述的麦粒基质，其制作过程为：煮沸10-30分钟至麦粒中央仍有一半白芯，按麦粒79％，杂木屑粉末20％，生石灰1％的比例进行拌料，分装入250g种瓶中，装量为每瓶150g,121℃高压灭菌30min，温度降至常温后接种。