CN103620410B - 通过免校正分析法确定活性浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
一种确定液体样品中分析物的活性浓度的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在至少两个不同的流速下以及在部分或完全传质限制的条件下，使样品层流与支持配体的固相表面或表面区域接触，所述配体能够特异性结合所述分析物；(b)确定配体支持表面或表面区域上分析物与配体的初始结合速率dR/dt，和(c)将步骤(b)中获得的初始结合速率数据拟合到动力学相互作用模型以获得活性分析物浓度，所述模型包含用于传质的项，其中步骤(a)和(b)在液体样品的多个不同的稀释度下进行，和其中在步骤(c)中将所述液体样品的所述多个稀释度中的至少数个包含在初始结合速率数据至动力学相互作用模型的整体拟合中。
Description
发明领域
本发明涉及诸如蛋白质等生物分析物浓度的确定，以及更具体地涉及所述生物分析物的活性浓度的确定。
发明背景
存在很多方法来确定蛋白质及其它生物分子的浓度，所述方法的大部分涉及将样品与标准制品进行比较。然而在许多情况下，没有可得的标准物或者标准物的活性并不确定。
很多时候，亦重要的是了解生物分析物的活性浓度而非总浓度，所述总浓度可能包含功能上无活性的分子。例如生物治疗药物的开发和生产即是这样的情况。然而，用于蛋白质浓度测定的许多已建立的方法并未区分活性分子与非活性分子。
因此，鉴于例如蛋白质的总浓度通常通过并未区分活性分子与非活性分子的UV或NIR吸收光谱法测定，生物分子的活性浓度可通过生物传感器技术方便地测定，其中将含有所述生物分子的样品与其上具有固定化的特异性配体的传感器表面接触，并监测表面上的缔合/解离过程。在此情况下，是配体的选择限定正被测定的活性。
常规而言，活性浓度使用校正曲线来测定。然而在利用生物传感器技术开发活性浓度的测定时，可利用分析物的扩散性质与分析物浓度之间的关系来确定分析物浓度而无需参考校正标准物。因此，如果已知分析物的扩散系数，即可计算所述分析物浓度。这类浓度测定当研究中的分析物无可得的满意校正物时可以是有用的，通常称为免校正浓度分析法(CFCA)并且依赖于在以下条件测定不同流速下的分析物结合，在所述条件中观测的结合速率部分地或完全地受限于分析物分子至传感器表面的传递，即部分地或完全地受控于扩散。
利用表面等离振子共振检测，CFCA由Karlsson,R.,等(1993),J.Immunol.Methods166(1):75-8首先阐述，并由Sigmundsson,K.,等(2002)Biochemistry41(26):8263-76进一步阐述。此方法已在商业Biacore?系统(由GEHealthcare,Uppsala,Sweden销售)中实施。
在Biacore?仪器中，样品用微流系统注入并通过层流传递至传感器表面。分子通过扩散控制的传递过程自主体溶液到达传感器表面。除分析物分子的浓度之外，影响传递速率的因素还包括扩散系数、流动池尺寸和流速。传递速率与结合速率之间的平衡决定所观测到的结合将是传递限制的还是反应限制的。对于成功的CFCA，观测的结合速率必须如上所述地至少部分受限于传递。
本发明的一个目标在于为部分或完全传递限制下的免校正浓度分析提供上述方法的改进。
发明概述
上述目标以及其它目标和优势通过用于确定活性浓度的方法获得，所述方法基于如上所概述的用于CFCA的方法但其中以多个样品稀释度进行测定并将数个(或全部)稀释度包含在整体拟合中，同一拟合标准应用于数个稀释度。这使所述分析法更稳健并扩展动态范围。
因此在一方面，本发明提供确定液体样品中分析物的活性浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在多个不同的流速下以及在部分或完全传质限制的条件下，使样品层流与支持配体的固相表面或表面区域接触，所述配体能够特异性结合所述分析物；
(b)确定配体支持表面或表面区域上分析物与配体的初始结合速率dR/dt，和
(c)将步骤(b)中获得的初始结合速率数据拟合到动力学相互作用模型以获得活性分析物浓度，所述模型包含用于传质的项，
其中步骤(a)和(b)在液体样品的多个不同的稀释度下进行，和
其中在步骤(c)中将所述液体样品的所述多个稀释度中的至少数个包含在初始结合速率数据至动力学相互作用模型的整体拟合中。
在优选的实施方案中，所述方法在两个大不相同的流速下进行。
在另一个优选的实施方案中，所述不同的流速通过在单个接触(例如注入)周期中改变流速来获得。
在再另一个优选的实施方案中，使用至少三个以及优选至少五个不同的样品稀释度。
在又另一个优选的实施方案中，所述方法还包括如下确定活性浓度：通过使液体样品层流与多个固相表面或表面区域(各表面或表面区域具有不同的配体密度)接触，根据初始结合速率确定对应于所述表面或表面区域上的传递限制的相互作用的初始结合速率，和根据所述结合速率确定活性分析物浓度。
其它优选的实施方案在从属权利要求中阐述。
本发明的方法可通过在诸如计算机等电子数据处理设备上运行的软件来方便地实施。可用任何合适的计算机可读介质向计算机提供这类软件，所述介质包括记录介质、只读存储器或者电信号或光信号，所述信号可经由电缆或光缆或者通过无线电或其它方式传输。
因此本发明的另一方面涉及计算机程序产品，所述产品包括用于使计算机执行上述方面所提及方法的方法步骤的指令。
通过参考以下详述和附图，将获得本发明的更完整的理解及其另外的特征和优势。
附图简述
图1为对于常规CFCA中的两个不同流速，将结合对时间数据拟合的曲线图。
图2为在同一时间分析的数个浓度下，将结合对时间数据整体拟合的曲线图。
发明详述
除非另有规定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有的意义与本发明相关领域的技术人员通常理解的意义相同。同样，除非另有规定，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”意指包括复数所指物。
如上所述，本发明涉及液体样品中的分析物(通常为生物分析物)的活性浓度的确定。简单说来，所述方法包括在至少部分传递限制下对液体样品的数个稀释度进行免校正浓度分析，所述液体样品含有其浓度待测的分析物；以及将数个或全部稀释度包含在浓度数据的整体拟合中，同一拟合标准应用于数个稀释度。
优选在活性浓度测定中使用相互作用分析传感器，其通常为生物传感器。
在更详细阐述本发明之前，将简要描述生物传感器的概念以及相互作用动力学的检测。
生物传感器通常基于免标记技术，其检测传感器表面的性质变化，所述性质例如质量、折射率或固定化层的厚度。用于本发明目的的典型生物传感器是基于在传感器表面的质量检测以及特别地包括光学法和压电或声波法。基于光学检测法的代表性传感器包括检测质量表面浓度的传感器，例如基于反射-光学法的传感器，包括例如基于隐失波的传感器，包括表面等离振子共振(SPR)传感器；受抑全反射(FTR)传感器，以及波导传感器，包括例如反射干涉光谱(RIfS)传感器。压电和声波传感器包括表面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)传感器。
基于SPR和其它检测技术的生物传感器系统市购可得。示例性的这类SPR-生物传感器包括基于流通池的Biacore?系统(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)和ProteOn?XPR系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)，其利用表面等离振子共振来检测样品中的分子与固定在传感表面上的分子结构之间的相互作用。随着样品经过传感器表面，结合的进度直接反映相互作用发生的速率。进样之后通常接着缓冲液流，在此期间检测器响应反映表面上复合物的解离速率。来自所述系统的典型输出为描述分子相互作用随时间的进度的图表或曲线，包含缔合阶段部分和解离阶段部分。此结合曲线常常称为“传感图”，其通常在计算机屏幕上显示。
因此使用Biacore?系统不仅有可能实时确定样品中特定分子或分析物的存在和浓度，还有可能实时确定另外的相互作用参数(包括分子相互作用中的缔合(结合)和解离的动力学速率常数以及表面相互作用的亲和力)，而无需使用标记，并且常常无需纯化所涉及的物质。
在下文中，将参考Biacore?系统类型的SPR传感器，在很大程度上阐述本发明，其仅用于说明而并非限制。
如上所述，Biacore?系统以及类似传感器系统，测定与分析物的总浓度不同的活性分析物浓度，传感器表面上配体的选择限定正被测定的活性的种类。
当将分析物以使得分析物接触传感器表面的方式注入例如Biacore?系统类型的层流系统时，其会产生结合事件。分析物/配体相互作用的速率将通过相互作用动力学以及通过流动系统的传递效率来确定。
对于生化相互作用，相互作用发生的速率通过正向(缔合)过程和逆向(解离)过程之间的差值给出。对于分析物A与表面结合的(固定的)捕获分子或配体B(其不扩散或不受传质限制)之间的可逆1:1相互作用
(1)
其中ka和kd分别为缔合和解离的速率常数。
缔合速率由ka[A][B]给出以及解离速率由kd[AB]给出。因此结合的净速率(即形成的复合物B的表面浓度变化)为
(2)
在时间t之后，表面上未结合的配体B的浓度为[BT]-[AB]，此处[BT]为配体B的总浓度或最大浓度。代入上述方程(2)得到
(3)
按照检测器响应单位(在Biacore?系统中复合物的形成观测为响应的增加，以共振单位(RU)衡量)，这可表达为
(4)
此处R为以响应单位计的响应，C为样品中分析物的浓度，Rmax为在分析物(A)与表面上所有配体(B)结合时获得的响应，即最大的分析物结合能力。
动力学速率常数ka和kd通常如下计算：通过将优选许多不同浓度的分析物以及亦优选传感器表面上至少一种其它配体密度的响应数据拟合至上述方程(4)，或者拟合至其积分形式：
(5)
用于动力学和亲和力数据分析的软件市购可得。因此，例如通过Biacore?仪器产生的动力学和亲和力数据的评价通常用专用的BIAevaluation软件(由GEHealthcare,Uppsala,Sweden提供)进行，该软件将数值积分用于计算微分速率方程和将非线性回归用于通过找出得到最接近拟合的变量的值，将残差平方和降至最小，来拟合动力学和亲和力参数。所述“残差”为各点处计算曲线与实验曲线之间的差值，平方残差用于平均加权实验曲线上下的偏差。残差平方和通过以下方程表达：
(6)
此处S为残差平方和，rf为给定点处的拟合值以及rx为相同点处的实验值。例如，对于上述分子相互作用，这类软件辅助的数据分析，在扣除背景噪声之后通过试图将上述样品1:1结合模型与测定数据拟合来进行，所述模型如通过上述方程(4)-(5)所表达。
通常将所述结合模型与使用不同分析物浓度C(和/或使用不同水平的表面衍生化Rmax)获得的多条结合曲线同时拟合。这称为“整体拟合”，并且基于传感图数据，这类整体拟合确定单个的整体ka或kd是否会给所有数据提供良好拟合。
然而，上述仅对非扩散限制或非传质限制的反应有效。
因此，对于与传感器表面结合的分析物，必须使分子自主体溶液传递至传感器表面，这是扩散限制的过程。在用于Biacore?和类似生物传感器系统的层流条件下，传递速率与主体溶液中分析物的浓度成比例。
在给定的分析情况下，在任何时间观察到的结合速率将通过净生化相互作用速率与传质速率的相对大小来确定。如果相互作用远快于传递，那么观测的结合将完全受传递过程限制。当解离期间分析物自表面的扩散并不足够快从而导致再结合时亦是如此。反之，如果传递很快而相互作用很慢，那么观测的结合将仅表示相互作用动力学。当两个过程的速率为相似数量级时，所结合由两个速率特征的组合所确定。
总体相互作用过程可通过以下示意图表示
A主体?A表面+B?AB(7)
自主体溶液至表面的传质速率通过下式给出
此处A表面为传感器表面的分析物浓度，A主体为主体溶液中的分析物浓度以及km为传质系数。
因此描述结合相互作用的微分方程将包含分析物至表面的传质的项，其对应于上述方程(8)。对于流动池，当传质影响数据时，认为由一组耦合常微分方程组成并在例如Myszka,D.G.等(1998)Biophys.J.75,583-594中描述的“二室”模型给出结合动力学的合理描述。在此模型中，假定流动池被分为两个室——其中分析物的浓度为恒定的室，和靠近传感器表面的第二室，其中分析物浓度取决于传质速率、配体的表面密度以及反应速率常数。
对于单价分析物A与固定的单价配体B反应的上文示例的相互作用，此模型可通过代替上述方程(3)的以下两个微分方程来表示：
此处km为传质系数(描述分析物在室间的扩散运动)，BT为总配体浓度，A表面为传感器表面的游离分析物的浓度，A主体为注入(即初始)分析物浓度，AB为复合物AB的浓度(=结合的分析物的表面密度)，以及ka和kd分别为缔合和解离速率常数。
如在下文中将更详细地阐述，可计算传质系数km，并且将响应数据拟合至方程(9)和(10)将得到动力学速率常数ka和kd。
上文概述的动力学表征传统上利用良好确立的方法进行，其中各样品浓度在分开周期中运行，以及通过在各周期之间再生表面来去除分析物。然而，在更近开发的方法(称为“单周期分析”)中，在单周期中以渐增的(或者变化的)浓度注入分析物，在注入之间不使表面再生。对于这类单周期分析的更详细描述，可参考Karlsson,R.,等(2006)Anal.Biochem.349:136-147(其公开内容通过引用结合到本文中)。
对于上述传质系数km，适用以下方程：
(11)
此处D为分析物的扩散系数(m2/s)，F为通过流动池的液体的体积流速(m3/s)，以及h、w和l为流动池尺寸(高度、宽度、长度(m))。
扩散系数D为分子的大小和形状以及摩擦阻力的函数，所述摩擦阻力由讨论中的溶剂的粘度提供。对于球状分子，扩散系数与半径成反比并因此与分子量的立方根成比例。然而对于诸如蛋白质等非常大的溶质分子，扩散系数对分子量相对不敏感。
如果没有扩散系数的文献值，则其可例如通过分析超速离心或光散射来以实验确定。或者，扩散系数可根据以下方程从分子量和形状系数或摩擦率估计：
(12)
此处D为扩散系数(m2/s)，M为分子量(道尔顿)，f为摩擦率，以及ηrel为20℃下溶剂相对于水的粘度。
因此，可根据方程(9)和(10)计算传质系数km。
对于Biacore?系统，Biacore特有的传质常数kt可通过针对分析物的分子量进行调整并将测定的响应(以RU计)转换成浓度单位来获得：
(13)
此处转换常数109为近似的并且仅对蛋白质分析物和特定的传感器表面SensorChipCM5(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)有效。对于其他分析物/传感器表面，需要用RU转换因子校正系统(1RU等于xng/mm2)。
对于免校正浓度测定的评价，利用分析物的扩散性质之间的关系连同在部分扩散控制条件下的结合速率的分析，由扩散系数计算传质系数，并随后转换成传质常数kt，其用于将实验数据拟合至扩散控制的相互作用模型，借此可获得样品的分析物浓度。
更具体而言，在免校正浓度测定(CFCA)中，使含有分析物(例如蛋白质)的液体样品以数个流速流向固定化配体，确定各流路的初始结合速率(dR/dt)，在Biacore?系统的情况下使用SPR检测技术。然后通常用专用软件通过将结合数据拟合至具有用于分析物浓度的全局变量的模型来评价分析物浓度C。即，将分析物浓度设置为待拟合的参数，以及将km连同分子量MW设置为已知常数，如此约束所述模型以找到同时与所有结合曲线最佳拟合的单一浓度值。
通常仅使用两个流速就已足够，前提是它们相隔甚远，优选尽量相隔远至所用系统所允许的程度。
因此，所述技术在Biacore?系统中的当前实施涉及其中分析物与固定化配体结合的两个结合实验；一个实验以低流速(常常5或10μl/min)进行以及一个实验以高流速(常常100μl/min)进行。在分析中，针对传递(扩散)限制的行为核查响应并将所述响应拟合至动力学模型，其中传递系数为常数而分析物的浓度为拟合的。(详情参考28-9768-788ABiacoreT200SoftwareHandbook[GEHealthcare,Uppsala,Sweden]，其相关的公开内容通过引用结合到本文中)。
一般而言，结合速率应在开始进样后不久测定，因为随着结合接近稳态，所述速率接近零。
免校正测定法通常建立直接结合形式以获得通常需要的高结合能力。
本发明
在典型的CFCA实验中，对样品的数个稀释度进行单独分析和评价。根据本发明，通过将数个(例如至少三个)或全部稀释度包含在浓度数据的整体拟合中使得将相同的拟合标准用于样品的数个稀释度，来获得更稳健的分析以及具有扩展的动态范围的分析。这亦将利于结果的灵敏性分析，因为有可能确定其它浓度值可否用于获得相同或相似品质的整体分析。
作为本发明的方法可如何使用Biacore?系统进行的例示，用于专用Biaevaluation软件的脚本语言可例如如同下述：
总体响应来自复合物形成以及来自折射率变化AB+$1*RI。
短表达式定义：
$1-当注射发生时$1表达式在ton1和toff1之间的注射期间等于1，否则等于0。
$1=(sign(t-ton1)-sign(t-toff1))/2；
S2描述分析物至传感器表面的传递。kt对应于1μl/min处的传递系数。F1为流速。Conc为样品的储存浓度。Dil为得到实际样品浓度的稀释因子。A为传感器表面的分析物的浓度。
$2=F1^(1/3)*kt*(Conc/Dil*$1-A)；
$3只是速率方程。
$3=ka*A*B-kd*AB；
A描述分析物浓度如何随时间变化。初值为0。
A=$2-$3|0；
B描述配体浓度如何随时间变化。初值为Rmax。
B=-$3|Rmax；
AB为复合物如何形成。
AB=$3|0；
kt、F1、Dil、ton1、toff1为常数；
ka、kd、Rmax为整体拟合的(当使用数个配体密度时，可将Rmax局部/整体拟合至子群)；
C为整体拟合的。
具有“全局数据”的情况下，有可能进行拟合的灵敏性分析。这可与动力学分析中的U值分析类似。
这可例如通过以下步骤完成：获得确定的Conc值(如100nM)，然后将所述数据与作为常数输入的已改变的Conc(例如80nM)再拟合，并使用与之前相同的流动参数将所述数据再拟合。当发生显著变化时，计算机例行程序可显示重叠图、残差或chi2并高亮。
以相似的方式，单周期模式中的CFCA为：
AB+偏移*$2;
$1=(sign(t-ton1)-sign(t-tonoff))/2;
$2=(sign(t-tonoff)-sign(t-toff2))/2;
$3=kt1*$1*(Conc-A)+kt2*$2*(Conc-A);
$4=ka*A*B-kd*AB;
A=$3-$4|0;
B=-$4|Rmax;
AB=$4|0
虽然在本发明的方法中可针对各不同流速进行进样，但是对以两个或更多个周期进样的需要可通过上述“单周期”方案克服，其中流速在一个进样期间变化。例如，可以10μl/min进样，并在5-20秒之后将流速增加到100μl/min。在数据分析中，这通过将实际流速输入所用的评价算法来处理。
本发明的方法可任选与新开发的免校正分析法组合，在所述分析法中使用具有变化的配体密度(即不同配体密度的阵列)的传感器表面或表面区域并提供用于确定最大初始结合速率以及因此确定活性浓度的拟合算法。
在与本申请同日提交的我们的共同待审申请“Methodofdeterminingactiveconcentration(确定活性浓度的方法)”(其公开内容通过引用结合到本文中)中描述的此方法，是基于使用以下方程，所述方程用于完全受限于系统的传递系数的反应：
(14)
此处R为检测器响应，km为传质系数，以及C为样品的分析物浓度。即，传感器表面的响应增加dR/dt或结合速率与传质系数和分析物的活性浓度成比例。从方程(14)可见，如果已知完全传递限制下的(初始)结合速率dR/dt和km，则可通过将dR/dt除以km来计算分析物浓度C。
更具体而言，在所述方法中，以许多(优选至少四个)不同的配体密度水平(即固定化水平)测定初始结合速率。对于各固定化水平，使用至少一个固定的流速记录响应。将初始结合速率对固定化水平或最大结合能力Rmax作图，并且其中dR/dt已达到其最大值的结合速率通过数据的外推(通常利用能够进行此外推的算法)来确定。这个最大结合速率对应于传质限制下的结合速率，意味着上述方程(14)适用，并因此可通过将dR/dt除以km来计算活性浓度C。
因此，所述组合分析法将顾及在部分传递限制下的分析(依照本发明的方法)和向完全传递限制的外推(如上文概述)二者，并因此可能变得更稳健。
样品与具有不同配体密度的表面或表面区域的接触可用具有单一传感器表面的分析仪器，通过序贯进样并在注射之间改变配体密度来进行。然而，优选所述方法使用多流道仪器进行，例如BiacoreTMT100、T200或4000(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)或者ProteOn?XPR系统(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)，优选通过平行进样进行。
在用免校正方式确定活性浓度的有利方法中，对许多不同的样品稀释度在部分或完全传递限制下以不同的固定化水平和不同的流速收集(初始)结合速率数据。然后可以选择依照数个备选方案来评价获得的结合速率数据，即通过(i)使用对一个样品数个稀释度的数据的整体拟合的在部分传递限制下的分析法；或者(ii)外推至完全传递限制；或者(iii)(i)和(ii)的组合来评价。
现在将借助于以下非限制性实施例来进一步阐述本发明。
实施例
实施例1
CFCA数据的整体拟合
利用例如改进的Biacore?T200系统通过本发明的方法确定活性浓度的程序可如下进行。
本文描述的实验证实抗体与能够结合抗体的固定化蛋白A衍生物的结合。常规的CFCA分析法在图1中阐述。
在变化的流速下以分开的周期注入分析物。在此情况下将分析物相对于其储存浓度稀释400倍。CFCA分析法得到局部抗体浓度为19.1nM以及因此储存液浓度为7.6μM。
然而在许多情况下，测试样品的数个稀释度很有用但分析变得冗长。通过转向数据的整体拟合，数个浓度在同一时间分析，如在图2中所示。
此曲线图阐述抗体稀释度1:400、1:1200、1:3600和1:10800的整体拟合。以两个流速注入各稀释液，整体测定的储存液的浓度为7.6μM。这即刻证实所述浓度分析为非稀释度依赖的并简化分析。
本发明不限于上述优选的实施方案。可使用各种备选方案、修改和等同物。因此，上述实施方案不应认为是限制本发明的范围，所述范围由随附权利要求限定。
Claims (11)
1.一种确定液体样品中分析物的活性浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在至少两个不同的流速下以及在部分或完全传质限制的条件下，使样品层流与支持配体的固相表面或表面区域接触，所述配体能够特异性结合所述分析物；
(b)确定配体支持表面或表面区域上分析物与配体的初始结合速率dR/dt，和
(c)将步骤(b)中获得的初始结合速率数据拟合到动力学相互作用模型以获得活性分析物浓度，所述模型包含用于传质的项，
其中步骤(a)和(b)在液体样品的多个不同的稀释度下进行，和
其中在步骤(c)中将所述液体样品的所述多个稀释度中的至少数个包含在初始结合速率数据至动力学相互作用模型的整体拟合中，且
所述不同的流速通过在单个接触周期中改变流速来获得。
2.依照权利要求1的方法，其中所述方法在两个大不相同的流速下进行。
3.依照权利要求1或2的方法，其中使用至少三个不同的样品稀释度。
4.依照权利要求3的方法，其中使用至少五个不同的样品稀释度。
5.依照权利要求1或2的方法，所述方法进一步包括使液体样品层流与多个固相表面或表面区域接触，各表面或表面区域具有不同的配体密度；根据初始结合速率确定对应于所述表面或表面区域上的传递限制的相互作用的初始结合速率；和根据所述结合速率确定活性分析物浓度。
6.依照权利要求1或2的方法，其中使用相互作用分析传感器。
7.依照权利要求6的方法，其中所述相互作用分析传感器为生物传感器。
8.依照权利要求6的方法，其中所述相互作用分析传感器基于质量传感。
9.依照权利要求6的方法，其中所述相互作用分析传感器基于隐失波传感。
10.依照权利要求6的方法，其中所述相互作用分析传感器基于表面等离振子共振(SPR)。
11.依照权利要求1或2的方法，所述方法为计算机实施的。
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