CN103614379B - 一种靶向FoxQ1基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向FoxQ1基因干扰siRNA及其应用，所述siRNA的序列为：正义链：5′-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3′，反义链：5′-UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3′。本发明运用荧光定量RT-PCR、Western Blot、CCK8法、Transwell小室模型、流式细胞术等现代分子生物学技术，成功构建出靶向FoxQ1基因干扰siRNA，通过在细胞水平和动物水平研究干扰FoxQ1基因后对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及化疗敏感性的影响，及对裸鼠成瘤能力的抑制作用，确定以FoxQ1作为靶点治疗肺癌的可能性和协助化疗治疗肿瘤的作用，该siRNA在特异性地沉默FoxQ1基因中的具有广泛的应用前景。

Description

一种靶向FoxQ1基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向FoxQ1基因的干扰siRNA及其抗非小细胞肺癌的用途。

背景技术

肺癌是当今世界上发生率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，每年世界上约有135万人被诊断为肺癌，近年来，肺癌引起的死亡人数已超过乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等，成为癌症死亡的首要原因。其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的肺癌类型，相当多的患者属于对传统治疗无效的难治性肺癌。尽管近年来多学科综合治疗模式的进展使得非小细胞肺癌的治疗效果有了较大的提高，但由于转移和耐药等原因，目前死亡率仍然很高，总的五年生存率仅15％左右。因此迫切需要寻求新的诊断指标和加强综合治疗，探索新的治疗策略及治疗靶点，成为肺癌研究最受关注的领域之一。

肿瘤的发生发展是一个多阶段、多步骤、多基因参与的病理过程，涉及到原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的异常表达，在本质上是一种多基因异常的疾病。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是目前日趋发展和逐渐成熟的一门新兴的基因沉默技术，是内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)在基因的转录后水平上，介导细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制具有与dsRNA同源序列的基因的表达的过程，属序列特异性的转录后基因沉默，具有高效性、特异性、位置效应、竞争效应和可传播性的特点。大量研究表明，RNAi是广泛存在于生物界的古老现象，不同的有机体，包括植物、果蝇、线虫及一些哺乳动物细胞中都存在RNAi现象。RNAi在生物进化上是保守的，是生物体抵御病毒或其他外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制，是包括人类在内的从低等真核生物到哺乳动物体内天然存在的基因沉默机制，其抑制靶基因表达的效率远比反义核酸高，持续时间也更长。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制某些癌变过程中的重要基因的突变或过量表达，从而达到基因治疗的目的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对各种恶性肿瘤的RNAi已经取得了肯定的效果。RNAi现象的发现为基因治疗研究提供了强有力的工具。siRNA对靶基因的抑制效率明显高于反义核酸，与反义核酸相比，siRNA用量更低，并且克服了反义核酸的一些缺点，如寡聚物的非特异性结合、易降解等。化学合成的siRN能快速转入细胞中并且发生作用，与此同时，化学合成的siRNA费用高，容易降解，仅瞬时表达，且其左右只能持续一周时间。不利于进一步长期稳定的进行机理研究。

Forkhead(Fox)转录因子家族成员通过招募共激活因子调节基因转录，参与细胞生长、分化、凋亡、迁移等多种生物学过程，其突变和表达异常与发育畸形、代谢性疾病以及肿瘤发生有关。FoxQ1是Fox转录因子家族较新的成员之一，位于人类染色体6p23-25，早期研究发现FoxQ1与毛囊发育及细胞分化有关；现已被证实在人类某些恶性肿瘤发生发展中扮演着非常重要的角色。另外，FoxQ1受转化生长因子-β(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导上调，参与上皮细胞形态重塑及分化。最新研究发现FoxQ1在肠癌组织中表达显著增高，Kaneda等研究表明FoxQ1调控抑癌基因p21的表达，在肠癌发生、发展中起重要作用。Zhang等报道大多乳腺癌组织高表达FoxQ1，在体外乳腺癌细胞中过表达FoxQ1，可促进细胞增殖和克隆形成，增强癌细胞侵袭力，在体内过表达FoxQ1能促进乳癌细胞肺转移。

在肺癌的研究中，课题组已在前期实验中证实并于PLOS ONE杂志报道(PMID：22761930；doi：10.1371)，FoxQ1在大多数非小细胞肺癌(NSCLC)组织中呈高表达，并且与肿瘤恶性程度和患者预后密切相关，FoxQ1高表达的患者五年生存率明显低于低表达该基因的患者。因此，运用RNA干扰对NSCLC中FoxQ1进行抑制，会抑制NSCLC的生长，对NSCLC的生物学特性产生影响。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种靶向FoxQ1基因干扰小分子siRNA，使其能够特异性地沉默FoxQ1基因。本发明目的另一目的是提供含有该干扰小分子siRNA的载体。本发明还有一目的是提供该干扰小分子siRNA的应用。

本发明针对FoxQ1的siRNA序列，可以是化学合成的也可以是通过表达载体稳定表达。针对FoxQ1的siRNA序列，用脂质体、生物材料载体、病毒载体等形式来输送siRNA序列。本发明针对FoxQ1基因的编码区序列，根据相对应的siRNA设计原则设计一对siRNA序列，并且通过转染人肺腺癌细胞，检测了对FoxQ1基因的沉默效率，证实其有效性和特异性。然后将有效的siRNA片段设计成插入pGPU6/GFP/Neo载体的发夹siRNA插入片段，构建能够稳定表达shRNA的表达载体。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种靶向FoxQ1基因干扰siRNA，所述siRNA的序列如下：

正义链：5′-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3′，

反义链：5′-UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3′。

一种克隆有所述的靶向FoxQ1基因干扰siRNA的载体。

所述的载体的构建方法：将特异性地沉默FoxQ1基因的siRNA序列设计成能够插入载体中的发夹siRNA插入片段，然后与pGPU6/GFP/Neo载体进行连接，得到用于抗非小细胞肺癌生物学行为的干扰小分子RNA。

所述的靶向FoxQ1基因干扰siRNA在特异性地沉默FoxQ1基因中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明运用荧光定量RT-PCR、Western Blot、CCK8法、Transwell小室模型、流式细胞术等现代分子生物学技术，成功构建出靶向FoxQ1基因干扰siRNA，通过在细胞水平和动物水平研究干扰FoxQ1基因后对肺癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡及化疗敏感性的影响，及对裸鼠成瘤能力的抑制作用，确定以FoxQ1作为靶点治疗肺癌的可能性和协助化疗治疗肿瘤的作用，该siRNA在特异性地沉默FoxQ1基因中的具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是四株肺腺癌细胞中FoxQ1基因mRNA和蛋白的表达水平的FoxQ1基因表达结果图；

图2是四株肺腺癌细胞中FoxQ1基因mRNA和蛋白的表达水平的溶解曲线图；

图3是四株肺腺癌细胞中FoxQ1基因mRNA和蛋白的表达水平的扩增曲线图；

图4是四株肺腺癌细胞中FoxQ1基因mRNA和蛋白的表达水平的FoxQ1蛋白表达图；

图5是四株肺腺癌细胞中FoxQ1基因mRNA和蛋白的表达水平的灰度值扫描图；

图6是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞增殖能力的影响结果图；

图7是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的侵袭能力的变化结果图；

图8是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的迁移能力变化的变化结果图；

图9是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞侵袭迁移能力的细胞统计图；

图10是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞凋亡能力的凋亡相关指标的变化结果图；

图11是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞凋亡能力的各指标条带灰度值扫描图；

图12是FoxQ1基因干扰后对肺腺癌细胞凋亡能力的流式凋亡结果；

图13是稳转细胞株构建过程中的鉴定结果图；

图14是FoxQ1基因干扰后对裸鼠动物成瘤的各组肿瘤图片；

图15是FoxQ1基因干扰后对裸鼠动物成瘤的生长曲线图；

图16是siRNA协同顺铂的作用的肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性改变结果图；

图17是siRNA协同顺铂的作用的注射顺铂后各组肿瘤图片；

图18是siRNA协同顺铂的作用的注射顺铂后各组肿瘤生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明是实施方式不限于此。

以下实施例所使用的主要材料为：肺癌细胞系4株：SPC-A-1，A549，HCC827和NCI-H1395，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。兔抗人FoxQ1、Bcl-2、Bax、Fas-L单抗，鼠抗人Caspase-3单抗，购于Abcam。雄性4周龄BALB/c裸鼠，体重18-20g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，裸鼠饲养于南通大学实验动物中心屏障环境中。

实施例1靶向基因FoxQ1的siRNA的设计

检索NCBI GeneBank得到FoxQ1全序列和RNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对FoxQ1进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。在现有的siRNA设计网站上进行初步设计和筛选，然后参照以下设计原则进行筛选。SiRNA序列设计的原则：(1)从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；(2)选择GC含量在30％-50％的siRNA比GC含量偏高的更为有效；(3)避免二级结构重复；(4)sence链的3’端稳定性比5’端低；(5)将潜在的序列与相应基因组数据库进行同源序列搜索，排除与其它编码序列或EST同源的序列。排除aitisense链的5’端连续8个剪辑与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。最终获得1对siRNA序列，为：

正义链：5′-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3′，

反义链：5′-UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3′。

实施例2细胞培养

细胞复苏：从液氮中取出SPC-A-1、NCI-H1395、HCC827、A549细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在1min内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒冻存管表面后，转移至10mL新鲜RPMI-1640培养液中洗涤，1000rpm离心5min。吸除上清，取6mL RPMI1640完全培养基(RPMI1640基础培养基+10％FBS+1％青、链霉素)加入离心管，混匀，转移至培养瓶中，放入于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养，次日更换一次培养液后，继续培养。

细胞传代培养：将长满细胞的培养瓶中的旧培养液弃去，PBS冲洗两遍，加入1mL含0.02％EDTA+0.25％胰酶消化液，消化3～5min，显微镜下观察细胞状态，当细胞体积缩小变圆，间隙变大时，加入5mL含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，用吸管反复吹打瓶底。将吹打好后的细胞悬液分装新的培养瓶中，再加入适量培养液，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。

细胞冻存：选择对数生长期汇合度约90％的细胞，常规消化细胞，收集细胞悬液，离心1000r/min，5min。吸去上清，加入冻存液(DMSO∶FBS＝1∶9)，计数，调整细胞浓度为5×10⁶/mL左右。分管，每管1mL。将冻存管封严，标明细胞种类及冻存日期。依次依次4℃30min，-20℃60min，-80℃24h液氮气层(约-100℃)30min，液氮。

实施例3实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测四株细胞中FoxQ1基因和蛋白的表达

分别提取四株细胞的总RNA和总蛋白，用实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Westem Blot)检测四株细胞中FoxQ1基因和蛋白的表达。具体过程如下：

1实时荧光定量RT-PCR

(1)总RNA提取：收集四株细胞株，至1.5mL RNA-free离心管中，加入1mL Trizol，充分混匀，室温静置5min。加入0.2mL氯仿(三氯甲烷)，剧烈振荡15s，室温静置2min。4℃离心，12000r/min×15min，吸取上清(注意不要吸到下层)至另一个1.5mL离心管中。加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000r/min×10min，弃上清。加入1mL预冷的75％乙醇(用DEPC水配)，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，7500r/min×5min，弃上清。晾干，溶于20μL DEPC水中(65℃促溶10-15min)。紫外分光光度仪测定提取RNA的浓度(单位μg/μL)和纯度，用DEPC水调零，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，表明提取的RNA纯度好。

(2)逆转录为cDNA(reverse transcriptase，RT)：逆转录按照Revert AidTM First Strand cDNA synthesis kit说明书进行。具体反应体系如下：

混匀后离心，42℃孵育60min，终止反应70℃5min。-20℃保存备用。

(3)荧光定量RT-PCR：具体过程参照Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Kit试剂盒进行，反应如下：

用Applied Biosystems7500Real Time PCR System仪进行反应。95℃10min预变性后，进入PCR循环。95℃15s变性，60℃60s退火延伸，反应进行40个循环。

2蛋白免疫印迹法(Western Blot)

(1)总蛋白的提取：收集对数生长期的细胞，加适量裂解液(含1％的PMSF及磷酸酶抑制剂)，振荡器上震荡混匀后冰上裂解20min，12000r/min离心20min，取上清，即为细胞总蛋白。紫外分光光度仪检测提取蛋白的浓度。按照蛋白体积∶SDS-PAGE蛋白上样缓冲液体积＝4∶1的比例，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10min，分装并-80℃冰箱保存备用。

(2)配聚丙烯酰胺凝胶：根据蛋白分子量的大小配置合适浓度的配胶浓度。将用于配胶的玻璃板洗净干燥后，对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上，准备灌胶(用力夹紧，防止漏胶)。先加分离胶，先快后慢，防止气泡产生，一般加至距上端1.5cm处时加去离子水密封，静置40min后弃去离子水，加浓缩胶至顶端，插入梳子，准备上样。

(3)上样电泳：将所有蛋白样品调至等浓度30μg，每孔上样约15～20μl，其中一孔加入预染的蛋白质Marker。起始电压为80V，约40min，待溴酚蓝进入分离胶后，电压改为100V，约60min，当溴酚蓝接近分离胶底部时停止电泳。

(4)转膜：先将合适大小的PVDF膜至于甲醇中活化10min，在再把PVDF膜覆盖在电泳后的凝胶上，PVDF膜和凝胶的非接触面均覆盖滤纸和海绵，置于电转槽中电转，恒流电转300mA×120min。

(5)封闭：电转后，取出PVDF膜，放入现配制的封闭液(含5％脱脂奶粉的1×TBST)中，4℃过夜或室温摇2h。注意膜正面向上。

(6)孵一抗：封闭结束后，取出，放入含有适量1×TBST中洗膜5min×3次；配制含5％脱脂奶粉1×TBST稀释的一抗(抗FoxQ1抗体稀释1000倍，抗β-actin抗体稀释1000倍，各稀释2mL放离心管中)；将洗好的膜放在平板上，膜的正面向上，稀释好的抗体均匀滴加在膜上；室温孵育约2h，再放入4℃过夜。

(7)洗膜，孵二抗：取出PVDF膜，1×TBST液洗3遍，每次10min，边洗边摇。配含5％脱脂奶粉的1×TBST稀释的二抗(二抗稀释1000倍，稀释2mL放离心管中)；将稀释好的二抗均匀滴加在膜上，室温孵育2h；1×TBST(不含脱脂奶粉)清洗，10min×3次。

(8)显影：按化学发光试剂盒说明书将ECL发光液的A、B液等比例混合(使用前配制)；将洗好的膜用滤纸贴角吸干；将膜正面向上放在塑料薄膜上，在膜上滴加A、B混合液；凝胶成像系统拍照、保存。

结果如图1-5所示，其中图1为实时荧光定量RT-PCR检测FoxQ1基因在四株细胞中的表达，图2为溶解曲线，图3为扩增曲线。图4和图5为Western Blot检测FoxQ1蛋白在四株细胞中的表达及灰度扫描图。可见FoxQ1在SPC-A-1细胞中表达最高，NCI-H1395中次之，A549和HCC827细胞中表达较低。

实施例4细胞转染

(1)转染前一天，收集对数生长期的细胞，接种于六孔板内，接种数量为(3.0-8.0)×10⁵，加入2mL无抗培养基；

(2)在250μL RPMI1640基础培养基中加入80nMSiRNA，柔和混匀；

(3)用250μL RPMI1640基础培养基稀释5μL脂质体转染试剂，轻轻吹打3-5次，室温静置5min；

(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹匀3-5次，室温静置20min；

(5)转然后4-6h换液，继续培养24h或48h后，进行转染后的其它检测步骤。

实施例5CCK8法检测转染前后细胞增殖

(1)收集对数生长期细胞(实施例1制备)，调节细胞密度，每孔加入约2000个细胞，加入96孔板，每孔100μL；

(2)细胞贴壁后，使用脂质体转染试剂介导转染(实施例4所述)，取转染后4h时换液时间为CCK8实验0h，分别检测0h、24h、48h、72h细胞增殖情况；

(3)每孔加入10μL CCK8溶液，培养2h后，用多功能酶标仪在450nm(650nm参考)波长测量各孔的吸光度(A)值。

每组设定3个复孔，重复实验3次，取其均值。

结果如图6所示，FoxQ1基因干扰后其增殖能力较阴性对照组合空白对照组明显降低。

实施例6Transwell小室观察转染前后细胞迁移、侵袭能力的改变

Transwell小室模型检测迁移能力的改变：取脂质体转染后的实验组细胞、阴性对照组细胞及未转染的细胞(转染制备方法同实施例4)，分别用0.25％胰蛋白酶消化后，细胞计数后用基培重悬，调整细胞密度为2×10⁵/mL。在上室加入100μL细胞悬液，细胞数为2×10⁴个，下室为含20％胎牛血清的RPMI-1640培养液600μL，37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h。孵育结束后，取出小室，用PBS洗两遍，棉签轻轻擦拭上室滤膜内侧面贴壁细胞，PBS洗两遍。将小室滤膜用4％多聚甲醛固定10分钟，吸去固定液，每孔加入600μL考马斯亮蓝染液，染色5min，吸弃染色液，PBS洗三遍，将上室取出，自然干燥。正置荧光显微镜下拍照并计数膜背面迁移的细胞数，计数每张膜的中央部分和周围部分随机3个视野(共15个视野)，计算平均值。

Transwell小室模型检测侵袭能力的改变：将保存于-20℃冰箱的BD matrigel4℃过夜，变成液态，在冰上将融化好的matrigel用无血清的培养基按照1∶4稀释，混匀，然后加入50μL到Transwell小室，37℃孵育4h，待胶凝固。余步骤同上。

结果如图7-9所示，FoxQ1基因沉默后，SPC-A-1细胞的侵袭迁移能力较阴性对照组合空白对照组明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

实施例7Western Blot和流式细胞术检测干扰前后凋亡能力的改变

转染细胞后，用Western Blot检测转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax，Caspase，Fas-L的变化，并用流式细胞术检测各组凋亡的差异。具体过程如下：

(1)转染前一天，收集对数生长期的细胞(实施例1制备)，接种于六孔板内，接种数量为(3.0-8.0)×10⁵，加入2mL无抗培养基；

(2)细胞转染(同实施例4)，转染48h后，离心收集细胞，2000rpm，5分钟，弃培养基；

(3)冷PBS洗涤两次；

(4)用400μL1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度1×10⁶/mL；

(5)在悬浮细胞中加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，4℃避光孵育15min；

(6)加入10mL PI后轻轻混匀，4℃避光孵育5min；

(7)1小时内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

结果如图10-12所示，图10为Western Blot检测转染前后凋亡相关蛋白Bc1-2，Bax，Caspase，Fas-L的变化，图11为Western Blot条带的灰度值所绘的柱状图。FoxQ1基因干扰后，促凋亡基因Caspase-3、Bax、Fas-L表达较对照组表达增加，而抗凋亡基因Bcl-2表达较对照组表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，各凋亡蛋白在阴性对照组及未转染组之间的表达无差异(P＞0.05)。

流式细胞术检测干扰前后凋亡能力的改变结果如图12，FoxQ1基因沉默后，凋亡细胞占细胞总数的22.8％，而阴性对照及空白对照凋亡细胞数分别占细胞数的4.8％和7.6％。干扰组与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。表明减少FoxQ1的表达后可促进肺癌细胞的凋亡，与Western Blot检测结果是一致的。

实施例8针对FoxQ1的shRNA真核质粒及G418筛选稳定转染细胞株

(1)依据载体说明书的设计原理，将特异性沉默FoxQ1基因的siRNA片段设计成能够插入载体中的发夹siRNA插入片段(如表1所示)，然后与pGPU6/GFP/Neo载体进行连接，构建得到pGPU6/GFP/Neo-siRNA表达载体。载体携带有GFP报告基因及G418筛选位点。

发夹siRNA插入片段

siRNA
		正义链	5′-GCCAAGCAATTTCTTTAAA-3′
反义链	5′-TTTAAAGAAATTGCTTGGC-3′

(2)将前面筛选的高表达FoxQ1基因的细胞SPC-A-1按3*105个/孔数目接种于6孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱培养24h后，用阳离子脂质体lipofectamineTM2000将上面构建的表达载体进行转染实验(转染方法同实施例4)，转染后4h，换新鲜培养液继续培养。转48h后将细胞消化，进行稀释传代(1∶10)，设置不同梯度筛选合适的G418筛选浓度及合适的细胞接种数量。通过G418加药筛选出稳定转染sh-FoxQ1的细胞株，G418维持浓度为200ng/μL，传代并扩增培养，实时荧光定量RT-PCR检测转染序列是否存在。

结果如图13所示，稳定转染的细胞株其FoxQ1基因的表达持续低于对照组，说明稳转株构建成功。

实施例9肺癌裸鼠动物模型的建立

(1)批量培养稳定转染sh-FoxQ1的细胞，转染空载体的细胞及未转染细胞。

(实施例4)

(2)分别用0.25％胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞，用基培重悬备用。

(3)各组分别接种1x107/200μL至4-6周Balb/c裸鼠背部皮下。

(4)待肿瘤长到1g左右时，进行体内传代，将瘤细胞悬液浓度调整为5-10x107/mL，0.2mL/只，干扰组和对照组分别接种到裸鼠左右胁部皮下，设重复对照。

(5)肿瘤成瘤第七天，随机选择3只裸鼠，腹腔注射顺铂(7.5mg/kg)，观察各组裸鼠肿瘤的生长。

(6)每三天观察，待长出肿瘤后，用皮尺测量肿瘤的长度和宽度，并计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。

结果如图14-15所示，图14为肿瘤取出后，干扰组与阴性对照组肿瘤大体观，干扰组裸鼠的肿瘤较对照组相比体积明显缩小，有统计学意义(P＜0.05)。肿瘤生长曲线如图15所示，干扰组肿瘤生长明显缓慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。

实施例10siRNA协同顺铂的作用

细胞转染后24h，在各组细胞中加入不同浓度的顺铂，采用CCK-8法观察加药48h后，SPC-A-1细胞对顺铂敏感性的改变。具体过程如下：

(1)收集对数生长期细胞，调节细胞密度，每孔加入约5000个细胞，加入96孔板，每孔100μL。

(2)细胞贴壁后，使用脂质体转染试剂介导转染(转染步骤同实施例4)。

(3)转染24h后加入化疗药顺铂，药物终浓度分别为0、0.1、1、10、25、50、100nM。

(4)加入化疗药后48H取出细胞用CCK8法测相应时间试验孔的OD值，步骤同实施例5。

(5)每个浓度下的抑制率＝1-(测得OD值-空白对照OD值)/(阴性对照-空白对照OD值)×100％。用配对资料t检验统计同一时间点各组抑制率是否有统计学差异。

结果如图16图显示，与阴性对照组和空白对照组相比，转染组对化疗药物敏感性明显增强，比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

同时，在动物水平，在裸鼠肿瘤成瘤第七天，随机选择三只裸鼠，腹腔注射顺铂，观察肿瘤生长，测量肿瘤体积及重量，结果如图所示，图17为单纯顺铂组与干扰+顺铂组的肿瘤大体观，图18为各组肿瘤生长曲线。结果表明，干扰组注射顺铂组肿瘤对顺铂的敏感性明显增高，裸鼠肿瘤明显小于对照组，差异有统计学意义。

Claims (4)

1.一种靶向FoxQ1基因干扰siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：

正义链：5′-GCCAAGCAAUUUCUUUAAATT-3′，

反义链：5′-UUUAAAGAAAUUGCUUGGCTT-3′。

2.一种克隆有权利要求1所述的靶向FoxQ1基因干扰siRNA的载体。

3.权利要求2所述的载体的构建方法，其特征在于，具体步骤为：将siRNA序列设计成能够插入载体中的发夹siRNA插入片段，将设计的siRNA序列和pGPU6/GFP/Neo载体进行连接，得到用于抗非小细胞肺癌生物学行为的干扰小分子RNA。

4.权利要求1所述的靶向FoxQ1基因干扰siRNA在制备特异性地沉默FoxQ1基因的药物中的应用。