CN103604894A - 高效液相色谱法分离测定硼替佐米手性异构体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种硼替佐米异构体的分离测定方法，该方法采用固定相硅胶表面涂敷的是直链淀粉一三(3，5一二甲苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱，流动相采用流动相A即含有0.1％三氟乙酸的正己烷溶液和流动相B即1：1的无水甲醇／异丙醇溶液的组合，流速为0.1-0.7ml／min，柱温为25-40℃，能够有效分离硼替佐米及其三个手性异构体，分离度达到1.7-4.2，峰形好，理论塔板数高，能够用于硼替佐米原料药生产质量控制。

Description

高效液相色谱法分离测定硼替佐米手性异构体的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，具体涉及抗癌药硼替佐米异构体的分离测定方法。

背景技术

硼替佐米是一种人工合成的二肽硼酸盐，属于可逆性的蛋白酶体抑制剂，可以选择性地与蛋白酶体活性位点的苏氨酸结合，抑制蛋白酶体26S亚单位的糜蛋白酶／胰蛋白酶活性。同时，他还可以提高其它抗肿瘤药物的抗肿瘤作用，与许多药物合用呈现协同或增敏作用，而不是单纯的相加作用。通过全新的机制达到抗骨髓瘤的作用。国内外临床研究表明硼替佐米单药以及同常规化疗药物组成的联合化疗方案对初始治疗，以及复发难治的MM患者均有良好疗效。它被视为治疗复发性与顽固型多发性骨髓瘤的突破性疗法，研究显示此药可减缓、逆转或停止曾接受两种以上疗法但失败的患者病情继续恶化。以硼替佐米为主的联合化疗方案已被美国国家综合癌症协作网推荐作为多发性骨髓瘤患者治疗的重要选择之一。

该化合物开发成注射剂(注射用硼替佐米)，目前已经在澳大利亚、比利时、丹麦、奥地利、芬兰等二十几个国家上市，2005年在国内上市，原研厂家为美国千年制药公司。硼替佐米化学名为[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪甲酰)氨基]丙基]氨基]丁基]-硼酸，其结构式为：

出于对药物的安全性考虑，必须严格控制硼替佐米原料药的杂质含量。由上述硼替佐米结构式可知，其含有两个手性中心，存在除硼替佐米外三个手性异构体BIO1、BIO2、BIO3，结构式如下：

在进行硼替佐米质量控制时需严格控制异构体的含量，由于异构体之间性质接近，采用现有技术对硼替佐米的高效液相色谱分析方法难以分离测定异构体的含量。文献“Development and Validation of a Stability Indicating LC Method for the Assay and RelatedSubstances Determination of a Proteasome Inhibitor Bortezomib”中公开的液相色谱方法对硼替佐米及其9个相关杂质的分离情况，其中包含上述硼替佐米的BIO1、BIO2两个手性异构体，而BIO3未在该文献考察范围内，该方法采用RP18色谱柱，流动相A：乙腈／水(0.1％甲酸)，流动相B：甲醇／水(0.1％甲酸)，检测波长270nm，流速1.0ml／min，柱温35℃，进样量20ul，对于硼替佐米的手性异构体的分离结果是仅仅能将BIO1、BIO2的重叠峰与硼替佐米分开，BIO3峰与硼替佐米峰重叠，因此该方法未能实现硼替佐米及其余三个手性异构体的分离。

为保证硼替佐米原料药的质量和使用到临床的安全性，需要寻找一种可靠有效地分析方法分离测定硼替佐米的手性异构体。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供了一种采用高效液相色谱法对硼替佐米手性异构体的分离测定方法，能够有效分离硼替佐米及其3个手性异构体，实现硼替佐米原料药中手性杂质的质量控制。

本发明提供的一种高效液相色谱法分离测定硼替佐米异构体的方法，其特征在于，该方法采用的色谱条件为：色谱柱采用固定相硅胶表面涂敷的是直链淀粉一三(3，5一二甲苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱，流动相采用流动相A即含有0.1％三氟乙酸的正己烷溶液和流动相B即1：1的无水甲醇／异丙醇溶液的组合，流速为0.1-0.7ml／min，柱温为25-40℃。

手性色谱柱(Chiral HPLC Columns)是由具有光学活性的单体，固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phases)。对于手性异构体的分离，不同化学性质的异构体需采用不同类型的手性柱，如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。市场上可选择的手性色谱柱越来越多，根据固定相的化学结构，将手性色谱柱分为以下几种：刷型、多糖型、环糊精型、大环抗生素型、蛋白质型、配位交换型、冠醚型等。发明人曾尝试选择分离手性化合物较常用的环糊精型的多个手性色谱柱进行硼替佐米及其手性异构体的分离测定，但是无论如何调整流动相及其它色谱条件都无法将各峰分离，色谱峰的信号较弱且峰形差。发明人对多糖衍生物型色谱柱进行考察，包括固定相硅胶表面涂敷纤维素衍生物和直链淀粉衍生物的多个色谱柱。对固定相为硅胶表面涂敷的是纤维素衍生物的色谱柱考察时，首先选用的色谱条件为：仪器----Shimazu高效液相色谱仪；试剂----硼替佐米对照品及异构体对照品BIO1、BIO2、BIO3；色谱柱----Chiralcel OD-RH5μm250mm×4.6mm；检测器及检测波长----UV270nm；流动相----A：正己烷B：异丙醇；流速----0.5ml／min；进样量----10μl；柱温----室温；测定法----取样品溶液10μl，进样，记录色谱图。在上述已有色谱条件下，通过改变多个流动相比例考察分离效果，结果见下表：

流动相比例	分离度	备注
			A：B=60：40	1.3、1.2、0.8	分离度不好，且理论板数较低
A：B=70：30	1.4、1.7	得到三个色谱峰，且峰形较差，理论板数低
			A：B=80：20	1.3、1.4	得到三个色谱峰，且理论板数较低
A：B=90：10	1.1、1.6、2.6	理论板数较低，且拖尾严重

根据上述结果，发明人尝试在流动相中加入极性较大的无水甲醇，以及三氟乙酸以期望提高分离度和得到较好的色谱峰形，调整流动相A为正己烷(0.1％三氟乙酸)，流动线B为无水甲醇：异丙醇(1：1)，比例为90：10，同时通过调整流速考察分离情况，结果见下表：

流速ml／min	分离度	备注
			1.0	2.2	得到2对非对映色谱峰，且理论板数较低
0.7	2.7	得到2对非对映色谱峰，且理论板数较低
			0.7	1.6、0.9、1.4	异构体分离，理论板数较低，且峰有拖尾
0.3	1.3、1.5、1.1	异构体分离，分离度达不到要求

由上表可知，流速为0.3ml／min时，异构体与主成分能分离，但分离度达不到基线分离，色谱峰形差，且理论板数较低。在此色谱条件下，更换其它纤维素衍生物色谱柱进行考察。

由上述多次考察结果可知，以纤维素衍生物为固定相的色谱柱能够将硼替佐米及其手性异构体分开，但分离效果不理想，达不到基线分离，色谱峰拖尾。于是发明人将色谱柱更换为固定相为硅胶涂敷直链淀粉衍生物的色谱柱进行继续考察，同时对柱温的影响进行考察。

仪器：Shimazu高效液相色谱仪，正己烷，异丙醇，无水甲醇。

试剂：硼替佐米对照品及异构体对照品BIO1、BIO2、BIO3

检测器及检测波长：UV-270nm

流动相：A：正己烷(0.1％三氟乙酸)；B：(无水甲醇：异丙醇=1：1)

流动相比例A：B=90：10

流速：0.3ml／min，

进样量：5μl

柱温：见下表

测定法：取样品溶液5μl，进样，记录色谱图。

结果如下表：

上述两种色谱柱为固定相为硅胶表面涂敷直链淀粉一三(3，5一二甲苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱，均为日本大赛璐公司生产的手性柱，其它公司也申请同类型的手性柱，如美国赛分科技生产的Chiralomix SA手性柱，广州研创生产的CHIRALCN AD-H手性柱等。由上表结果可知，该类手性色谱柱能够达到理想的分离效果，而在考察柱温对分离度的影响时却意外的发现，并非为本领域技术人员所认为的正相洗脱系统中降低柱温有利于提高分离度，而是柱温越高，分离度更好，特别是柱温40℃时，分离度最好。

基于上述筛选过程，进一步优化了色谱条件，所述流动相A与流动相B的体积比优选90：10；所述流速优选0.2-0.5ml／min，最优选0.3ml／min；所述柱温优选30-40℃，最优选40℃；检测器为紫外检测器，波长选择270nm，进样量为5μl或10μl，优选5μl。

在注入高相液相色谱仪前，硼替佐米样品溶液配制时采用无水甲醇溶解，并用流动相溶液稀释配置成每1ml中含0.5mg样品的溶液。

本发明提供了一种硼替佐米异构体的分离测定方法，该方法色谱条件下能够有效分离硼替佐米及其三个手性异构体，分离度达到1.7-4.2，峰形好，理论塔板数高，能够用于硼替佐米原料药生产过程中的质量控制。

下面结合具体实施方式的实施例以及说明书附图以及进行进一步说明。

说明书附图

附图1实施例一中定位溶液1(BIO1)色谱图

附图2实施例一中定位溶液2(BIO2)色谱图

附图3实施例一中定位溶液3(BIO3)色谱图

附图4实施例一系统适应性溶液色谱图(硼替佐米，BIO1，BIO2，BIO3)

附图5实施例二系统适应性溶液色谱图(硼替佐米，BIO1，BIO2，BIO3)

附图6硼替佐米原料药样品色谱图

具体实施方式

实施例一

仪器：SHIMAZU LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-10AVP紫外检测器，CTO-10ASVP柱温箱；

色谱柱：Chiralomix SA色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)；

流动相：正己烷(0.1％三氟乙酸)：(无水甲醇：异丙醇=1：1)=90：10；

柱温：40℃；

流速：0.3ml／min；

检测波长：270nm；

定位溶液1的配制：精密称取硼替佐米异构体BIO1适量，加无水甲醇溶解并制成10μg／ml；定位溶液2的配制：精密称取硼替佐米异构体BIO2适量，加无水甲醇溶解并制成10μg／ml；定位溶液3的配制：精密称取硼替佐米异构体BIO3适量，加无水甲醇溶解并制成10μg／ml；系统适用性溶液的配制：取硼替佐米对照品及异构体BIO1、BIO2、BIO2对照品，加无水甲醇适量溶解后加流动相稀释并制成10μg／ml；

测定：各取定位溶液1、定位溶液2、定位溶液3及系统适用性溶液各5μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，图谱见附图1-4。系统适用性溶液按BIO3、硼替佐米、BIO1、BIO2的顺序出峰，各峰之间的分离度和理论板数如下表：

项目	BIO3	硼替佐米	BIO1	BIO2
					分离度	---	1.7	4.2	1.8
理论板数	13263	7723	9554	6097
					拖尾因子	1.2	1.2	1.2	1.1

实施例二硼替佐米原料药中异构体的测定

色谱条件与系统适用性试验采用手性色谱柱(Chiralpak AD-H，4.6×250mm)；以正己烷(0.1％三氟乙酸)：(异丙醇：无水甲醇=1：1))=90：10为流动相；流速为0.3ml／min；柱温40℃；检测波长270nm；取硼替佐米对照品及异构体对照品，加无水甲醇适量溶解后加流动相稀释并制成每1ml含10μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液，精密量取此溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图5)，按BIO3、硼替佐米、BIO1、BIO2的顺序出峰，系统适用性试验结果：

项目	BIO3	硼替佐米	BIO1	BIO2
					分离度	---	1.5	3.5	1.9
理论板数	12710	5420	8222	5352
					拖尾因子	1.2	1.2	1.2	1.1

测定法取硼替佐米原料药约50mg，精密称定，置10ml量瓶中加无水甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取此溶液加流动相稀释并制成每1ml中含0.5mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液，精密量取供试品溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图(附图6)，按峰面积归一化法计算，含BIO1应不得过0.20％，含BIO2应不得过0.20％，含BIO3应不得过0.20％。

硼替佐米原料药样品中异构体的测定结果：

批号	BIO3	BIO1	BIO2
				2013001	未检出	0.027％	0.022％

结果表明：本方法能够很好的对硼替佐米原料中手性异构体进行含量控制。

Claims (10)

1.一种采用高效液相色谱法分离测定硼替佐米及其手性异构体的方法，其特征在于，该方法采用的色谱条件为：色谱柱采用固定相硅胶表面涂敷的是直链淀粉一三(3，5一二甲苯基氨基甲酸酯)的手性色谱柱，流动相采用流动相A即含有0.1％三氟乙酸的正己烷溶液和流动相B即1：1的无水甲醇／异丙醇溶液的组合，流速为0.1-0.7ml／min，柱温为25-40℃。

2.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述流动相A与流动相B的体积比为90：10。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流速为0.2-0.5ml／min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流速为0.3ml／min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为30-40℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柱温为40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测器为紫外检测器，波长选择270nm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进样量为5μl或10μl。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进样量为5μl。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，样品在注入高相液相色谱仪前用无水甲醇溶解，并用流动相溶液稀释配置成每1ml中含0.5mg样品的溶液。

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