CN103547296B

CN103547296B - 用于抑制和检测蛋白质的分子和方法

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Publication number: CN103547296B
Application number: CN201280022434.0A
Authority: CN
Inventors: J·希姆科维兹; F·鲁索
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Universiteit Gent; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Universite Libre de Bruxelles ULB
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: AU2017200470A1; CN103547296A; JP2014514917A; ES2679995T3; EP3384939A1; US20140082769A1; CA2829516C; AU2017200470B2; DK2683419T3; LT2683419T; JP6106101B2; CA2829516A1; US20220033448A1; SI2683419T1; EP2683419B1; AU2012228365A1; WO2012123419A1; HRP20181175T1; EP2683419A1

Abstract

本申请属于功能性肽领域，更具体而言属于受控蛋白质聚集领域。本发明公开具有如权利要求中定义的肽结构的分子、和在治疗应用和诊断应用中以及在其他应用例如农业生物学领域和工业生物技术中使用此分子的方法。分子可以用于治愈和/或稳定感染例如细菌、真菌和病毒疾病，也可以用于非感染性人和兽医学疾病。分子还可以用于检测蛋白质生物标记和用于多种疾病的预后和诊断。

Description

用于抑制和检测蛋白质的分子和方法

发明领域

本申请属于功能性肽领域并且更具体而言属于受控蛋白质聚集的领域。本发明公开如权利要求中定义的肽结构的分子、和在治疗应用和诊断用途、以及其他应用例如农业生物学（agbio）领域和工业生物技术中使用此类分子的方法。本发明分子可以用于治疗和/或稳定感染例如细菌、真菌和病毒疾病，也可以用于非感染性人和兽医学疾病。本发明分子还可以用于检测蛋白质生物标记和用于多种疾病的预后和诊断。

背景技术

蛋白质聚集(protein aggregation)由蛋白质错折叠和随后在不溶性凝聚物中的凝集引起。蛋白质聚集基本上是自结合过程，其中许多相同的蛋白质分子形成低可溶性的较高级别的聚结物，最终沉淀。基于其宏观形态，一般分类为有序或无序聚集体。在生理条件下，几乎任何蛋白质都可以在高浓度被诱导以形成无定形聚集体；在相同条件下，一组小得多的蛋白质形成高度有序的富含β的淀粉样蛋白纤维。然而，在微观水平上，这两类聚集体之间的差异是更微妙的。无定形聚集体不只是通过非特异性疏水性接触彼此粘住的错折叠蛋白质的簇。相反，它们也常常富含交叉β结构(cross-βstructure)，并且它们的形成倾向不仅与疏水性还与二级结构倾向和电荷相关，暗示特定的形成机制（Chiti等人，PNAS99:16419–16426（2002）；Chiti等人，Nature424:805–808（2003）；Chiti等人，NatStructBiol9:137–143（2002））。另一方面，并非所有报道的聚集体和纤维都富含β-结构，这是因为已报道过保留天然样光谱性质和甚至酶促活性的无定形聚集体和纤维。在这些情况下，提出聚集通过其他寡聚机制发生，例如三维结构域交换（Rousseau等人，PNAS98：5596–5601，2001；Liu和Eisenberg，Protein Sci11：1285–1299，2002），如蛋白质二聚体中常可见的。关于蛋白质聚集的关注很大程度上受到下述观察的鼓舞：许多人类疾病的特征在于由一种或非常有限数目的蛋白质组成的蛋白质沉积物。

已知与正常可溶性蛋白质转换为构象改变的不溶性蛋白质在病因上关联的此类疾病的例子是，例如出现在阿尔茨海默氏病和脑淀粉样蛋白血管病中的淀粉样蛋白β肽、帕金森氏病的路易体中的α-突触核蛋白沉积物、克-雅二氏病中的朊病毒、肌萎缩侧索硬化中的超氧化物歧化酶、和额颞痴呆和皮克氏病中神经原纤维缠结中的τ。迄今，蛋白质聚集主要作为引起疾病的不期望现象被研究，并且目前广泛认为，交叉-β介导的聚集是最频繁出现和生物学相关的聚集机制。尽管蛋白质聚集长久以来被视为由非特异性疏水作用介导的无序过程，但目前明确的是，尤其是淀粉样蛋白聚集在许多情况下基本上是一个特异的自结合过程。在体外和体内形成的聚集体一般富含一种特定蛋白质，并且尽管聚集在体外是自发过程，但在细胞环境中这个过程由伴侣蛋白主动控制。引起错折叠的蛋白质发生聚集的最常见机制是，来自相同蛋白质的特定多肽区段自结合为生长的分子间β片层（例如Makin等人，PNAS102（2）：315-20（2005）；Sawaya等人，Nature447（7143）:453-7（2007））。这些聚集成核区段一般很短，由5-15个残基组成，并且可以使用可获得的生物物理学算法精确预测。目前存在大量数据显示，各单链之间相互作用以形成分子间β片层，并且这个结构形成聚集体的骨架。聚集序列在球状蛋白质中是非常常见的，并且在α、β、α+β和α/β蛋白质中以大约相同的频率发生（SCOP分类：LoConte等人，Nucleic Acids Res28:257–259（2000））（Linding等人，JMol Biol342：345–353（2004））。如通过移植实验显示的，这些短的具有聚集倾向的区段足以诱导蛋白质聚集，所述移植实验证实，将来自聚集蛋白质的聚集成核区段移植到非聚集蛋白质上，可以将聚集倾向和聚集结构从前者转移到后者（Esteras-Chopo等人，PNAS102：16672-16677，2005）。

可以认为，聚集敏感的蛋白质序列是球状蛋白质结构存在所付出的代价：因为三级侧链相互作用主要发生在疏水核中，跨这个区域的蛋白质区段一般具有聚集的倾向。然而，对于天然球状蛋白质，聚集一般不是问题，因为聚集倾向蛋白质区段一般被蛋白质结构隔离从而防止自结合。另一方面，在蛋白质翻译和折叠过程中，或在细胞应激或失稳突变的情况下，部分解折叠的状态发生自结合和诱导聚集和淀粉样变的可能性高得多。

因为大多数蛋白质在其一级结构内包含聚集倾向肽序列，并且因为聚集是序列特异性的，所以先前成功证实了，可以开发用于特异性诱导所选靶蛋白质聚集的一般策略（参见WO2007071789）。在后面一种方法中，使靶蛋白质暴露于载体，该载体展示靶特异的具有聚集倾向的短肽（即，衍生自所选靶蛋白质的β聚集区；令人惊讶地证实，暴露于得自该蛋白质的短聚集成核区构成了聚集的充分条件）。该载体（命名为增溶性部分，参见例如WO2007071789中的图1及其图注）是将该区域暴露于靶之前防止该β-聚集区聚集——并因此稳定该β-聚集区——所必需的。

提供如下进一步的改善的干扰物（interferor）分子将是有利的，所述分子不需要载体或增溶部分而可以保持在溶解状态中并仍可以通过共聚集成功抑制蛋白质的功能。此类分子将更易于合成或产生。此外，有利的是精确地确定如下结构决定簇，所述结构决定簇一方面允许分子就此保持可溶，同时另一方面能够诱导靶蛋白质的聚集。此外，能够以有利的动力学诱导稳定的分子间β聚集体形成的分子，对于诊断和治疗应用（‘红色’生物技术）、以及农业生物技术应用（‘绿色’生物技术）、海洋和淡水生物应用（‘蓝色’生物技术’）、工业（‘白色’）生物技术或研究应用，可以是非常有用的。

发明概述

本发明提供可以在接触后引起所选蛋白质聚集的改良分子（在本文中还称为干扰物分子）。这些改良的干扰物分子不再需要增溶部分的存在，同时保留稳定性性质（即，防止过早聚集），并且同时还能够引起与靶蛋白质的共聚集。过早聚集(prematureaggregation)意指，分子发生自身聚集，从而使得它们不能实现靶蛋白质的聚集或抑制。

令人惊讶地发现，侧接具有低β片层形成潜力的序列或残基（即，聚集破坏残基）的聚集诱导序列不仅更可溶，还同时保留极度有效以及特异的聚集诱导性质。本文描述的分子可以具有一个以上聚集诱导区——其每一个都在侧翼具有聚集破坏残基，最特别地，聚集诱导区通过接头分开。如果所靶向的蛋白质是生物活性或功能的，则诱导聚集一般导致蛋白质的功能抑制。如由所附实施例显而易见的，本发明的改良干扰物具有重要的治疗和诊断应用、并可以用于农业生物学、白色生物技术应用和用作研究工具。

因此，根据第一个方面，本发明提供具有下述结构的分子：

(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中n是1–5的整数，并且i随每次重复从1增加到n；并且其中

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、H、G和Q；更特别地，选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸；最特别地，选自R、D和P的1–4个氨基酸；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，和优选无，P、R、K、D或E残基；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

特别地，对于其中n=1的分子，可以应用另外的限制。例如，对于其中n是1的分子，可以考虑如下的一组限制：

-X₁和X₂是选自R、K、E、D和P的1或2个氨基酸；和

-Y₁是6–11个连续氨基酸的区段，

-其中至少75%是疏水性氨基酸，

-其中至少50%的氨基酸是脂肪族或F残基，

-其中不存在P、R、K、D、E或H残基，

-其中不存在超过一个C、M、N、Q、W、G、S、A或T残基，

-其中不存在超过3个Y或F残基，

-其中不存在两个连续的相同非脂肪族残基，

-其中不存在超过2个连续的相同脂肪族残基，

-其中不存在两个连续的非芳香族极性残基，

-其中不存在超过50%的相同残基，

-其中第一个和/或最后一个残基是脂肪族或F残基，

-其中A和G残基的总和不超过2，

-其中A、G和S残基的总百分比不超过25%，

-其中C、M、N、Q和W残基的总百分比不超过25%，

-和其中除V外的小残基(即选自A、C、G、S、N、T)的总百分比不超过25%。

技术人员理解，因为Z_i是各X_2i-1-Y_i-X_2i单位之间的接头，并且Z_n是在分子的一个末端上的任选接头，所以式(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n等价于式(Z_i-X_2i-1-Y_i-X_2i)_n，其中Z₂至Z_n各是接头，并且Z₁独立地选自接头或无。作为表述“Z_n(或等价的N末端Z₁)是无”的替代，也可以说，该部分不存在——即，Z_n是接头或不存在(或完整地：每个Z_i独立地选自接头，并且Z_n(或等价的N末端Z₁)是接头或不存在)。

备选式因此也可以是：(X_2i-1-Y_i-X_2i)_n——其中X_2i-1和_X2i、Y_i、i和n如上定义——其中该n个单位通过独立地选择的接头融合在一起。该分子可以进一步在N和/或C末端上包含另外的接头。根据此式，接头存在于第i个单位的X_2i部分和随后的第(i+1)个单位的X_2i-1部分之间，并且在分子中存在总共(n-1)个接头(即Z_i至Z_n-1或Z₂至Z_n)；最后一个接头(分别为Z_n或Z₁)是接头或不存在。重新表述该式的另外一种方式是Z₀-(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中X_2i-1和X_2i、Y_i、i和n如上定义，每个Z_i是接头，并且Z₀和Z_n独立地选自接头或无(即，该分子具有C或N末端接头、无C和N末端接头、或具有C和N末端接头两者)。

尽管本发明分子典型地由上文描述的结构组成，但还可以设想，分子基本上由该结构组成。这意指，根据特定实施方案，分子可以在N或C末端上含有其它氨基酸(即，N或C末端融合至其它氨基酸)，特别是1–10个氨基酸，更特别是1–5个氨基酸。此另外的氨基酸特别可以考虑用于其中n是至少2的实施方案。该另外的氨基酸尤其地可以不具有特异性谱，即它们不是疏水区段例如Y_i部分（一个或多个）——换言之，它们含有小于50%的疏水性残基——或它们不只选自构成编号X部分的残基。然而，在一些情况下，特别当X部分不含荷电氨基酸时，可以考虑另外地侧接一个或两个疏水性氨基酸(在X部分的非侧接Y部分的一侧上)。在如下情况下这尤其可以如此：其中(不荷电)X部分和疏水性氨基酸与蛋白质中侧接对应于Y_i部分的序列的蛋白质序列相同；换言之，其中，分子中在序列上对应于蛋白质序列的该部分除了包含Y_i部分还包含至少一个X部分。然而，最特别地，该分子在N和C末端上都由X部分结束。

如所述的，在上式中，n是1–5的整数，并且i随着每次重复从1增加到n。换言之，i起始于1，并且随着每次重复而增加1，直至达到n；或i是重复的次数(并且是1–n的整数)。

该式因此涵盖下述结构：

X₁-Y₁-X₂-Z₁（即n=1），

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂（即n=2），

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂-X₅-Y₃-X₆-Z₃（即n=3），

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂-X₅-Y₃-X₆-Z₃-X₇-Y₄-X₈-Z₄（即n=4），和

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂-X₅-Y₃-X₆-Z₃-X₇-Y₄-X₈-Z₄-X₉-Y₅-X₁₀-Z₅（即n=5），其中每个编号的X、Y和Z如上定义。

应当注意，分子是线性的，以确保Y_i部分可以与待靶向的蛋白质接触。分支的线性分子（其中至少两个重复X_2i-1-Y_i-X_2i单位独立地通过接头附着至另一个X_2i-1-Y_i-X_2i单位）和环状分子仅在Yi部分可接近其他分子的情况下才考虑。

上式中的Y_i是聚集诱导序列，所述聚集诱导序列是指β-聚集诱导序列。最特别地，序列是非淀粉样蛋白β-聚集序列（有时被称为无定形β-聚集序列）。淀粉样蛋白和非淀粉样蛋白β-聚集在高级结构、聚集动力学和适于聚集的蛋白质序列上是不同的（Rousseau等人，Current Opinion in Structural Biology16:118–126，2006）。事实上，氨基酸偏好在淀粉样蛋白纤维中比在无定形交叉-β聚集体中具有高得多的位置特异性。例如，在淀粉样蛋白六肽中，位置3和4是极端选择性的，仅一些氨基酸类型与高级淀粉样蛋白结构相容。另一方面，位置1、2和6具有高得多的耐受性，几乎任何残基类型都允许淀粉样蛋白形成（Lopez dela Paz等人，PNAS101:87-92，2004）。相比之下，对于β-聚集的发生，只要序列在整体上具有形成β伸展构象的良好倾向、并且具有足够的疏水性和/或电荷中性，六肽的任何位置都可以容纳几乎任何残基（Fernandez-Escamilla等人，Nat Biotechnol22:1302-1306，2004）。因此，与β聚集序列相比，淀粉样生成序列(amylogenic sequence)更具有位置特异性、并且更耐受极性和荷电残基。这也将对两个过程的动力学产生影响。由于其较不严格的构象要求，β-聚集一般比淀粉样变(amyloidosis)快速得多。然而，注意，在与高级交叉-β淀粉样蛋白结构相容的序列和形成无定形交叉-β聚集体的序列之间仅存在细微的分界线（Lopez dela Paz等人，PNAS101:87-92，2004；Rousseau等人，Current Opinion in StructuralBiology16:118–126，2006）。尽管本文主要考虑无定形聚集（这是因为在一些情况下淀粉样蛋白聚集是不期望的（并且因此应是被排除的）），但是对于许多应用，聚集体的性质并不重要。因此，本发明也考虑淀粉样蛋白聚集体。

已经发现，鉴于对极性和荷电残基的限制，如上定义的序列具有高β-聚集趋势（这可以使用例如算法例如TANGO，Zyggregator，……进行测定），特别是非淀粉样蛋白β-聚集趋势。

对于本文描述的分子而言特异的是，聚集诱导序列（具有高β-片层形成潜力）侧接具有低β-片层形成潜力或甚至‘破坏’β-片层的残基，即所谓的守门残基(gatekeeperresidues)。这些残基是式中编号X的部分。令人惊讶地发现，通过此类特定残基划界的聚集诱导序列不仅比侧翼不具有此类守门者的序列更可溶，还同时保留非常良好和特异性的聚集诱导性质。后者尤其是令人惊讶的，因为一般认为，在蛋白质中，在疏水性序列中散布极性或荷电残基会防止聚集。在本文描述的分子中，侧翼的守门者在某种程度上确保聚集诱导序列可以被正确呈递给目的蛋白质。不束缚于特定机制，这可能通过在守门残基和目的蛋白质之间的稳定相互作用（例如H-键或电荷互补性）而有帮助。这还可以导致增加的相互作用特异性。应当注意，聚集趋势部分地由环境决定，上文列出的性质尤其可以在生理条件例如生理pH范围考虑。但这不意味着本发明方法局限于生理条件，因为例如蛋白质的检测可以在非生理条件下发生。

X_2i-1和X_2i是1–4个独立地选择的特异性氨基酸的连续区段：R、K、E、D、P、N、S、A、H、G和Q。尽管这些氨基酸都可以使用，但当使用在疏水Yi段中很少存在或甚至不存在的残基时，特别是使用荷电和/或非疏水性残基，特别是R、K、E、D、P、N、S、H、Q和G（注意，尽管G典型地被视为疏水性残基，但侧链的不存在及其很小的尺寸导致它不特别有利于β片层聚集），更特别地R、K、E、D、P、和H（即，荷电残基，包括H，或脯氨酸），甚至更特别地R、K、E、D和P（即，荷电残基或脯氨酸——其由于特定侧链而可以诱导弯曲并是良好的破坏肽），最特别地R、K和P（正电荷残基或脯氨酸）、或R和P（非疏水性正电荷残基或脯氨酸）时，获得最佳结果。备选地，R、D和P被考虑为守门者：R是比（疏水性）K更大的非疏水性残基，并且因此对于β-片层形成更具有破坏性。而D较小，它的电荷更靠近肽或蛋白质的主链，更难以抵消。根据非常特别的实施方案，最特别地，当n是1时，K不考虑为守门者–因此，X部分的氨基酸选自R、E、D、P、N、S、A、H、G和Q或其子集。

如进一步解释的，对于其中n=1的实施方案，可以对分子应用另外的限制。这不是因为这些分子是无功能的，而是因为现有技术可能已描述过具有相同的此处所述的一般结构的肽性质的分子（用于不同目的）。如详述中描述的，限制尤其可以针对在特异性部分中考虑的残基的长度和性质。尽管这些更严格的限制一般仅是n=1的分子所需的，但它们也可以设想用于n=2（或甚至更大的n）。

根据特定实施方案，每个X_2i-1和X_2i是1或2个氨基酸。更远离聚集序列的残基对保持分子在溶解状态中发挥较少的作用。根据备选的但非排他性的实施方案，每个X_2i-1和X_2i具有不超过2的总电荷。可替代地，两个X部分中的氨基酸总数目是5或更少，特别是4或更少。可替代的实施方案提供，围绕疏水性Y区的两个X部分的总电荷小于5，特别是4或更少。这个段落中的实施方案最特别设想用于其中n是1的分子或其中n是2的分子。

本文的式中所述的Y_i是β-聚集序列。更特别地，它是独立地选择的4–17、特别是4–16、或4–15个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T。特别地，不超过1个，和优选无，P、R、K、D或E残基存在于序列中。然而，根据非常特定的实施方案，可以存在选自R、K、D和E的两个残基，只要净电荷是零（即，如果它们的电荷是相反的）即可。因为K在疏水段中比R更可以被考虑，所以选自K、D和E的两个残基可以存在于Yi部分中。因为电荷在这些实施方案中需要是零，所以这等于说存在两个荷电残基，其中之一是K残基，并且另一个选自D和E残基。根据进一步特定实施方案，无P、R、K、D或E残基存在于Yi部分中，或存在具有互补电荷的两个荷电残基（使得净电荷是零）。

聚集序列的长度一般受所需特异性、合成容易性和目的蛋白质的序列影响。根据特定实施方案，至少一个和特别地所有的Y_i是4-17个氨基酸、4-16个氨基酸、4-15个氨基酸、4-14个氨基酸、4-13个氨基酸，特别是4-11个氨基酸、4-10个氨基酸、4-9个氨基酸、或4-8个氨基酸的区段。根据进一步特定实施方案，Yi段的长度是至少5个氨基酸。相应地，至少一个和特别地所有Y_i是5-13个氨基酸，特别是5-11个氨基酸、5-10个氨基酸、5-9个氨基酸、或5-8个氨基酸的区段。根据进一步特定实施方案，Yi段的长度是至少6个氨基酸。相应地，至少一个和特别地所有Y_i是6-13个氨基酸，特别是6-11个氨基酸、6-10个氨基酸、6-9个氨基酸、或6-8个氨基酸的区段。最特别地，至少一个和特别地所有Yi是6或7个氨基酸的区段。短于16个氨基酸的区段特别考虑在其中n是1的实施方案中。

应当指出，比16个氨基酸长的区段（例如，高达20个氨基酸）是可以的，但几乎不增加对目的蛋白质的特异性（参见图2），而它们的确增加合成的困难和成本、以及降低分子的可溶性。合成和处理的容易性也是为何在本文中特别考虑其中n是1或2的分子的原因。然而，对于转基因方法或当分子重组产生时，长度是（成本）限制少得多的因素，特别地在这些方法中，也可以考虑使用更长的分子来工作。

本发明的一个目的是，提供能够特异性下调（特别是以序列依赖性方式）蛋白质的分子。因此，根据一个具体方面，分子中至少一个Y_i是4–16个氨基酸的区段，其等同于蛋白质中天然存在的连续区段。根据进一步具体方面，这是分子中的一个以上Y_i，特别是分子中的两个Y_i或至少两个Y_i，更特别地分子中的所有Y_i的情况。所设想的各种不同长度也适用于这个实施方案。

这依赖于如下令人惊讶的观察：非淀粉样蛋白β-聚集是序列特异性的。事实上，一般公认，与淀粉样蛋白聚集不同，对于β-聚集的发生，只要序列在整体上具有形成β伸展构象的良好倾向并且具有足够的疏水性和/或电荷中性，几乎任何残基都可以被容纳在任何位置上，所以无定形β-聚集不具有序列特异性，而是疏水和H-键相互作用依赖性的。令人惊讶地，一个给定序列对于相同序列区段比对于其它疏水序列具有高得多的聚集趋势，从而它可以用于特异性聚集（抑制和/或检测）复杂混合物中的蛋白质。

根据特定实施方案，该至少一个在蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段，在基因组编码该蛋白质的生物体（或物种）中，是独特于该蛋白质的。换言之，该序列与所述生物体/物种的蛋白质组中的仅一种蛋白质序列对应或相同。结果是，如果将此分子施用于所述物种的生物体，则仅该蛋白质被下调。

根据可替代实施方案，序列不必独特于蛋白质，而可以独特于生物体或物种。当本文描述的分子同时施用于超过一个不同物种（例如微生物的混合物），而仅在一个物种中蛋白质(一种或多种)需要被下调（例如，以靶向病原性物种，而不干扰有益生物体）时，可以考虑这点。根据进一步特定实施方案，序列对于蛋白质是独特的且对于生物体/物种是独特的。

代替物种，上述考虑也可应用于生物体的属、科、目或纲，但是序列保守和发现独特序列的可能性随着分类学等级的增加而降低。

根据另外其他可替代实施方案，该至少一个在蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段存在于基因组编码所述蛋白质的生物体或物种的一种以上蛋白质中。即，在，该序列与所述生物体/物种的蛋白质组中的一种以上蛋白质序列对应或相同。这允许超过一种蛋白质被下调。另外一个（非唯一性）替代方案是，序列段存在于超过一个生物体/物种的蛋白质中。因此，该序列与至少两个不同生物体/物种的蛋白质组中的至少一种蛋白质序列对应或相同。这允许下调超过一个生物体中的蛋白质。这可以用于交叉反应中（例如以允许在不同物种的受试者中使用一种分子）。然而，也特别考虑，向受试者施用仅一种分子，同时下调（特别是感染性）生物体中的蛋白质。当然也可以考虑两者的组合，即，该区段存在于超过一种蛋白质和超过一个生物体/物种中。此处同样，物种可以替换为生物体的属、科、目或纲。

应当指出，超过一种蛋白质或超过一个生物体/物种的靶向也可以使用具有至少两个Yi区的分子来实现，其中至少两个Yi区对应于至少两种不同蛋白质中的区段、和/或对应于至少两个不同生物体/物种/等中的区段。该至少两个Yi区可以（各自独立地）独特于蛋白质或生物体，或可以出现在一种以上蛋白质或生物体中。

典型地，等同于蛋白质中天然存在的区段的Yi段将与该蛋白质的区段完全相同。然而，在一些情况下，考虑可以使用不同但紧密相关的序列，即具有一个或两个置换的序列。为了维持特异性，考虑对于非保守置换，对于小于6个氨基酸的Yi段，仅一个氨基酸差异是耐受的。对于至少6个氨基酸（特别是至少7个或至少8个氨基酸）的序列，可以置换一个或两个氨基酸。因此，根据特定实施方案，至少一个Y_i与天然存在的蛋白质中的区段相比，当该Y_i的长度小于6个氨基酸时，相差不超过一个氨基酸置换；或至少一个Y_i与天然存在的蛋白质中的区段相比，当该Y_i的长度是至少6个氨基酸时，相差一个或两个氨基酸置换。在此情况下，置换典型地是相对于目的蛋白质中存在的区段而言的（即，除了该一个（或两个）氨基酸置换以外，Yi段与目的蛋白质中存在的区段相同）。如技术人员将认识到的，制备（特别是非保守）置换可能导致改变的特异性（即，使得该区域与生物体中的另一种蛋白质相同），因此如果改变的靶向是不期望的，则应当检查这是否发生。（在一些情况下，靶向超过一种蛋白质可能是期望的，还参见下文）。为了确保置换不导致太多的特异性丧失，优选置换仅在一个或两个Yi区中进行。根据特定实施方案，如果存在具有置换的氨基酸的Yi区，则存在其中不发生置换的至少一个其他Yi区。

根据特定实施方案，置换是用守门残基，特别是选自R、K、E、D、P、N、S、A、H、G、Q的残基，更特别是选自R、K、E、D和P，最特别是选自R、K和P残基的残基。

根据可替代实施方案，置换是保守置换。这可以考虑用于如下情况：当考虑下调蛋白质家族、并且这些蛋白质共享保守但并不相同的序列基序时。在此情况下，这些紧密相关的蛋白质的聚集可以使用共有序列基序来实现（即，相似但并不相同的序列，其中‘相似’为在序列比对的情形下使用的）。然而，当序列匹配不是100%时，聚集的效率可能较低。

根据再进一步可替代实施方案，为了增强聚集，置换是将具有相对低β-片层倾向的残基置换为具有更高β-片层倾向的残基。一般地，具有低于100的Chou-Fasman P（b-片层）得分的残基可以替换为具有P（b-片层）得分>100的残基。

值得注意的是，置换始终是用相同数目的残基，缺失或插入将消除该特异性β-聚集。

根据特定实施方案，n大于一（即二至五），意指超过一个Yi区存在于分子中（至少两个，且高达五个）。为了靶向蛋白质，仅需要一个相同于该蛋白质中的区段的Y_i区存在于该分子中。其它Y_i区可以例如是合成的聚集诱导序列。然而，一般地，根据用于检测或下调蛋白质的特定实施方案，当n高于一时，至少两个且特别是每一个Y_i都是天然存在于蛋白质中的4–16个连续氨基酸的区段（上述考虑独立地适用于每个区段）。根据进一步特定实施方案，该至少两个Y_i在相同蛋白质中出现。这增加引起该蛋白质聚集的可能性。根据进一步特定实施方案，所述至少两个Y_i是部分重叠的。当目的蛋白质具有满足分子Y_i区标准的长区段时，可以出现该情况。在这种情况下，分子的一个Yi可以对应于蛋白质中的该区段的一个部分，而另一个Yi对应于相同区段的另一个部分重叠的部分。根据再进一步的特定实施方案，该至少两个Y_i是相同的。因此，当两个Yi区对应于相同蛋白质中的区段时，它们可以是相同或不同的。

然而，在可替代实施方案中，考虑该至少两个Y_i可以用于实现超过一种蛋白质的靶向。因此，在这些实施方案中，至少两个Y_i衍生自（至少两种）不同蛋白质，即在其长度上，该至少两个Y_i的序列与至少两个不同蛋白质序列对应或相同。蛋白质数目可以高达Y_i区的数目，但是当然地，也可以例如用4个Y_i区靶向两种不同蛋白质。

类似地，根据可替代实施方案，该至少两个Y_i可以用于实现超过一个生物体/物种的靶向。因此，在这些实施方案中，至少两个Y_i衍生自（至少两个）不同生物体/物种，即该至少两个Y_i的序列与至少两个不同生物体/物种的蛋白质组中的至少一种蛋白质序列对应或相同。此处同样，物种可以替换为生物体的属、科、目或纲。

如先前提及的，β-聚集序列对于极性且特别是荷电残基的存在，比淀粉样生成序列，更不耐受。相应地，在特定实施方案，至少一个Y_i、特别是至少两个Y_i、更特别是每个Y_i，的总电荷不高于1。根据进一步具体实施方案，至少一个Y_i、特别是至少两个Y_i、更特别是每个Y_i中的荷电残基数目不高于1。而最特别地，Y_i部分中的荷电残基或脯氨酸的数目是零。

如上式中概述的，本文描述的分子也含有接头部分Z_i。根据特定实施方案，分子仅含有内部接头且不含N或C末端接头。因此，在特定实施方案中，Z_n是无（或是具有零个连接单位的接头）。

接头部分的性质对于本发明并不重要，但优选不使用长的柔性接头。根据特定实施方案，每个Z_i独立地选自0–20个相同或不同单位的区段，其中单位是氨基酸、单糖、核苷酸或单体。不同单位可以是相同性质的不同单位（例如不同氨基酸、或一些共聚物）。它们还可以是不同性质的不同单位，例如具有氨基酸和核苷酸单位的接头，或包含两种或更多种不同单体的杂聚物（共聚物）。根据特定实施方案，除Z_n外的至少一个且特别是每个Z_i的长度是至少1个单位。根据其他特定实施方案，Z_n是0个单位。根据特定实施方案，除Z_n外的所有Z_i接头都是相同的。根据进一步实施方案，所有Z_i部分都是相同的。

根据具体实施方案，至少一个且特别是所有Zi是具有相同性质的0–10个单位，特别是相同性质的0–5个单位。根据特定实施方案，除Z_n外的至少一个Zi部分且特别是所有Z_i部分是肽或多肽接头。特别考虑的此类接头的序列包括但不限于，PPP、PP或GS。接头还可以具有化学性质。特别考虑的化学接头包括PEG和Ttds（亦称4,7,10-三氧杂十三烷-13-琥珀酰胺酸）。

一般地，不使用长接头。然而，根据其中Yi部分对应于超过一种蛋白质的聚集诱导区的特定实施方案，考虑可以使用长接头。事实上，为了确保该分子可以（例如同时）与超过一种蛋白质相互作用，增加不同靶向Yi部分之间的距离可以是有利的，这使得相互作用不因空间位阻而受阻。在这些情况下，Zi接头可以是0–100个相同或不同单位的区段，其中单位是氨基酸、单糖、核苷酸或单体；或0-90、0-80、0-70、0-60、0-50、0-40、0-30或0–20个单位。特别地，Zi接头的最小长度是至少1个单位、至少2个单位、至少3个单位、至少4个单位或至少5个单位。

在Yi部分与两种不同蛋白质的聚集区相同的情况下，该分子被称为双特异性的（对于三种蛋白质，三特异性，等等）。

根据特定实施方案，本文描述的分子的总长度不超过60、55或50个氨基酸。更特别地，长度不超过40个氨基酸、30个氨基酸、25个氨基酸或甚至20个氨基酸。

特别考虑的分子是其中n=1或n=2的那些，例如具有下述结构的那些：X₁-Y₁-X₂-Z₁（即n是1），其中X₁和X₂总共不超过5个氨基酸；Y₁是4–10个氨基酸的区段，并且Z₁是0个单位的区段；以及X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂（即n是2），其中Z₁是接头，并且Z₂是无。

分子可以进一步包含（或可以进一步融合至）其他部分。特别考虑，分子进一步包含可检测标记。可检测标记可以在N或C末端上或甚至内部融合至该分子（例如通过接头，或接头可以用作可检测标记）。可替代地，可检测标记可以指在分子的X-Y-Z部分中的一个或多个中使用一个或多个标记的氨基酸（例如荧光或放射性标记的氨基酸）。

因为与蛋白质中的区域相同的Yi部分可以特异性靶向该蛋白质（当该序列对基因组编码所述蛋白质的生物体中的该蛋白质具有独特性时），所以可以附着至分子的另一部分是小分子或药物，这样，小分子或药物可以被靶向至需要将其递送至的正确蛋白质、细胞区室、细胞类型、……。在这些情况下，Yi区中的至少一个将与如下蛋白质的序列相同，所述蛋白质存在于需要将药物或小分子递送至的位置处。

可以附着至分子的另一部分是增加该分子的可溶性的部分。此类部分是本领域众所周知的，并且例子包括但不限于PEG（聚乙二醇）或PEG衍生物、肽、蛋白质或蛋白质结构域。所述部分的性质将取决于应用，可以由技术人员确定。

应当指出，对于其中存在Z_n的实施方案，可检测标记（或其他部分，如增溶标签）可以融合至Z_n接头部分。（尽管该表示方式导致标签加在C末端上，但也可以考虑N末端标签–这对应于（Z_i-X_2i-1-Y_i-X_2i）_n的等价表示方式，其中Z₂至Z_n各是接头，并且Z₁是与标签融合的接头）。

在有其他部分融合至分子的情况下，在特定实施方案中考虑，这些部分可以从分子上去除。一般地，这可以通过掺入特异性蛋白酶切割位点或等价方法来完成。切割位点可以分开掺入或可以是外部Z_n接头（或如果该部分在N末端，则外部Z₁接头）的一个组成部分。根据非常特定的实施方案，该部分可以是内部Zi接头的一个部分，或甚至可以是整个Zi接头。

在许多典型应用中，本文描述的干扰物分子可以就此使用或加入。然而，根据一个非常特定的方面，考虑这些分子作为编码分子的核酸而提供。不言而喻的是，根据这些实施方案的干扰物分子完全具有多肽性质，因为它们需要能够被编码。即，干扰物分子中存在的所有编号的X、Y和Z部分都具有多肽性质。

因此，根据这些实施方案，提供编码（或其序列编码）具有如上所述的结构，特别是下述结构，的分子的核酸分子：

(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；并且其中

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、H、G和Q；更特别地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸；最特别地选自R、D和P的1–4个氨基酸；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

特别考虑，在加以必要修改后，核酸序列编码具有本文描述的所有限制和变化的分子。因此，编码的多肽基本上如本文描述的，即，针对与该方面相容的干扰物分子提及的变化也考虑为适用于核酸序列编码的多肽的变化。例如，规定X或Y部分的序列或长度的实施方案与核酸中的编码相容，而其中Z部分具有非氨基酸性质的实施方案则不相容。

根据特定实施方案，编码的多肽序列是非天然存在的多肽。根据进一步特定实施方案，核酸分子是人工基因。因为核酸方面在利用转基因表达的应用中是最为特别合适的，故特别考虑这样的实施方案，其中核酸分子（或人工基因）融合至增加基因产物的可溶性和/或稳定性的另一部分上，特别是融合至编码部分的其它核酸上。事实上，由于产物的快速降解，肽的转基因表达有时可以是困难的。

在此方面还提供，包含编码（或具有编码的序列）如本文描述的分子的核酸分子的重组载体。这些重组载体理想地合适作为媒介物，以携带目的核酸序列进入表达待下调的蛋白质的细胞、并且驱动核酸在所述细胞中表达。重组载体可以在细胞中作为分离的实体（例如作为质粒或病毒或非病毒载体）维持，或可以整合到细胞的基因组内。

相应地，本文提供细胞，其包含编码（或具有编码的序列）如本文描述的分子的核酸分子，或包含含有编码此干扰物分子的核酸分子的重组载体。细胞可以是原核或真核细胞。在后面一种情况下，它可以是酵母、藻类、植物或动物细胞（例如，昆虫、哺乳动物或人细胞）。根据特定实施方案，以细胞系的形式提供细胞。

然而，细胞还可以是生物体的一部分（或例如干细胞）。相应地，在特定实施方案中，提供非人转基因生物体，其包含编码（或具有编码的序列）如本文描述的分子的核酸分子，或包含含有编码此干扰物分子的核酸分子的重组载体。生物体可以是任何生物体（包括微生物）。特别考虑，转基因生物体是非人哺乳动物生物体。根据另外其他可替代实施方案，转基因方法用于非人动物中，例如用于疾病的动物模型中进行靶标确认。这可以在哺乳动物（转基因小鼠）或其他脊椎动物中，或甚至在非脊椎动物例如线虫（例如秀丽隐杆线虫（C.elegans））或果蝇（例如黑腹果蝇（D.melanogaster））中。

根据可替代的特定实施方案，转基因方法（即，提供在核酸中编码的干扰物分子，而非直接作为多肽提供）特别合适于在植物中使用。相应地，本文提供植物、或植物细胞、或植物种子，其含有如本文描述的核酸分子、人工基因或重组载体。或者，本文提供的细胞或转基因生物体是植物、植物细胞或植物种子。

根据进一步方面，本文描述的分子可以用于下调或抑制蛋白质的功能。一般地，这通过诱导该蛋白质的聚集来实现。根据这些实施方案，提供用于下调蛋白质功能的方法，其包括使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

特别地，对于其中n=1的分子，可以应用另外的限制。例如，X1和X2可以各自是1或2个氨基酸，而非1–4。X1和X2还可以选自P、R、K、D、E。Y1部分的长度可以进行适应调整。

这些限制无一是导致分子下调所必需的，但它们描述特别良好工作的实施方案。对于其中n是1的用于下调蛋白质的方法，还考虑的一个特定限制是Y₁为4–11个连续氨基酸的区段。另一个特定限制（其，如同本文的大多数限制，可以组合）是Z₁不是氨基酸接头。根据甚至进一步的特定实施方案，Z1是无（即，0个单位的接头）。

对于该分子，适用与上文相同的考虑和限制。特别地，应当指出，如之前描述的，只要可以实现功能的下调，在存在于蛋白质中的Yi中的一个或两个置换是可以耐受的。

根据进一步特定实施方案，提供这些方法用于疾病情形中下调蛋白质、或用于作出诊断。换言之，在这些实施方案中，具有下述结构的分子用作药物或诊断剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1到n（或i随着每次重复而从1增加到n）；

-每个Y_i独立地选自4–15个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

此处同样，特别考虑，如果n是1，则Y₁是4–11个连续氨基酸的区段。同样，如果ni是1，则特别考虑Z₁不是氨基酸接头。根据进一步实施方案，Z₁是无。

如本文使用的，方法和用途通常是可互换的，即，分子用作药物，或更特别地，分子用于特定疾病的治疗中，等价于包括使用（例如接触）该分子的用于治疗疾病的方法，等价于分子用于制造用于治疗疾病的药物的用途。因此，‘第二医药用途’权利要求、‘治疗方法’权利要求和所谓的‘瑞士型’权利要求在本文中可互换使用，并且当列出其中之一时，也意味着其他。

因为分子提供用作药物或诊断剂、或用于治疗或诊断方法中，所以还考虑它们可以作为药品提供。相应地，提供包含如本文描述的分子的药物组合物。特别地，药物组合物包含具有下述结构的至少一种分子和药学可接受的载体：

（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；并且其中

-每个Y_i独立地选自4–15个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

更特别地，提供包含具有下述结构的至少一种分子和药学可接受的载体的药物组合物：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；并且其中

-每个Y_i独立地选自4–15个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的4–15个连续氨基酸的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，在药物组合物中，分子中的至少一个Y_i存在于组合物将施用于的受试者中待下调的蛋白质中。应当指出，这不意味着，这种蛋白质在受试者的基因组中编码。事实上，对于患有感染的受试者，考虑施用靶向感染性生物体而不是受试者自身的蛋白质的分子。

根据特定实施方案，分子可以以冻干形式与生理学缓冲液一起提供。根据特定实施方案，药物组合物如果是液体的，则在生理学pH提供，特别是pH5-9，更特别是pH6-pH8。

在特定实施方案中，分子可以用于下调在疾病情形中需要进行下调的（一种或多种）蛋白质。

相应地，提供结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子用于疾病的治疗或预防中使用，其中

-n是1–5，并且i从1运行到n（或i随着每次重复而从1增加到n）；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与疾病相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

如先前提及的，提供用于在疾病治疗或预防中使用的分子，等价于说，提供了在有需要的受试者中治疗或预防疾病的方法，其包括：给受试者施用具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子，其中：

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

另一种等价的表述方式是，提供具有这个结构的分子用于制造治疗疾病的药物的用途。

受试者特别是动物，更特别是哺乳动物（例如猫、犬、兔、马、牛、猪、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠、大鼠、猴、其他灵长类动物……），最特别是人。

特别考虑的疾病包括但不限于癌症、老年性黄斑变性（AMD）和炎症。因此，分子可以提供用于治疗这些疾病（或提供方法用于治疗这些疾病；或分子用于制造治疗这些疾病的药物的用途），其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的区段，所述蛋白质的表达或过表达与癌症、AMD或炎症/炎性疾病相关。

最特别地，在癌症中待下调的蛋白质是VEGFR-2或EGFR。同样最特别地，在AMD中待下调的蛋白质是VEGFR-2。最特别考虑的，在炎性疾病中下调的蛋白质包括TNF-α和IL-1β。

根据进一步方面，分子用作感染性疾病中的药物。即，它们用于下调在受试者中引起感染的生物体中的蛋白质的功能，此类生物体如病毒、细菌、真菌或大寄生物例如蜱、螨虫、线虫、扁形虫等。相应地，提供具有下述结构的分子用作抗病原化合物：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、A、H、G和Q；更特别地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是病原性生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

这等于说，提供预防或治疗有需要的受试者中的病原性感染的方法，其包括：

给受试者施用具有下述结构的分子：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

另一种等价说法是，提供具有该结构的分子用于制造治疗病原性生物体感染的药物的用途。

根据非常特定的实施方案，Yi区可以含有正好2个荷电残基（选自R、K、D、E），只要Yi区的净电荷是零即可。然而，更特别地，Yi区不含任何荷电残基（或关于这一点，脯氨酸）。

病原体可以是病毒生物体。相应地，提供具有下述结构的分子用作抗病毒剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是病毒生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

这等于说，提供预防或治疗有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

另一种等价说法是，提供具有该结构的分子用于制造治疗病毒生物体感染的药物的用途。

特别地，分子用作抗微生物剂。因此，提供具有下述结构的分子用作抗微生物剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是微生物生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

这等于说，提供预防或治疗有需要的受试者中的微生物感染的方法，其包括：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

另一种等价说法是，提供具有该结构的分子用于制造用于治疗微生物生物体感染的药物的用途。

这些方法的其它步骤可以包括对病原性病毒或微生物生物体的存在的评估（或测量）。

根据其中病原体是微生物生物体的特定实施方案，微生物生物体的蛋白质是选自下述的微生物生物体的蛋白质：革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌、原生动物、古细菌、真菌（例如酵母和霉菌）。更特别地，它是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌和真菌的蛋白质。

根据特定实施方案，病原性生物体是抗药性生物体、株或变体。因此，病原性生物体的蛋白质是来自抗药生物体、株或变体的蛋白质。如实施例部分中所示的，施用针对这些生物体的分子也将对这些生物体具有作用。

抗药性的一个特定例子是抗生素抗性。根据特定实施方案，微生物生物体的蛋白质是来自抗生素抗性生物体、株或变体的蛋白质。如实施例部分中所示的，施用针对这些生物体的分子也将对这些生物体具有作用。更特别地，提供用于施用的方法，其中如本文描述的分子每天施用至少一次，持续至少十天。特别地，该治疗方案不伴随抗生素抗性的发展。因此，这些实施方案预计，MIC值经过该时间段不增加超过四倍，或不加倍。最特别地，考虑在延长施用过程中，干扰物分子对于特定微生物生物体的MIC值保持低于干扰物分子对于该特定微生物生物体的临床折点(breakpoints)。

根据特定实施方案，分子可以用于杀死病原性（例如微生物）生物体，或该方法导致病原性（例如微生物）生物体的杀死。根据再进一步特定实施方案，分子成功地快速杀死病原性（例如微生物）生物体，特别在一小时或更少时间内、或在30分钟或更少时间内。根据可替代实施方案，使用分子的方法抑制病原性（例如微生物）生物体的生长和/或繁殖，而不杀死它。在此处，病毒也视为‘活’生物体，例如病毒滴度的减少指示杀死病毒生物体，而例如病毒滴度的稳定指示繁殖的抑制。

根据特定实施方案，病原性/病毒/微生物生物体的蛋白质是必需蛋白质，即如果生物体耗尽该蛋白质，则它不能存活。根据其他（非排他性）特定实施方案，病原性（例如微生物）生物体的蛋白质涉及生物膜形成。根据进一步实施方案，提供治疗或预防生物膜形成的方法，其中病原性（例如微生物）生物体的蛋白质涉及生物膜形成。根据再进一步的实施方案，生物膜形成在物体，特别是可植入装置例如导管或支架上。

因此，根据这些实施方案，提供预防、抑制或逆转表面上微生物生物膜生长的方法，其包括使该表面与具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子接触，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；其中至少一个Yi是微生物生物体的蛋白质中存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，微生物生物体的蛋白质是涉及生物膜形成的蛋白质。待预防、抑制或逆转在其上形成生物膜的表面可以是生物的或非生物的表面。特别考虑的表面是可植入装置的表面，例如导管或支架的表面。

关于非生物表面，由本文描述的分子涂布的装置也考虑在本发明的范围内。该装置的涂布可以直接通过将该分子应用于该装置来完成。可替代地，它们可以使用（交联）接头而涂布到该装置上。该装置可以是完全涂布的（例如通过将该装置浸入该分子的溶液中），或可以仅该装置的部分是涂布的。特别考虑该装置由针对微生物生物体中存在的蛋白质的分子涂布，所述蛋白质特别是涉及生物膜形成的蛋白质。

因此，提供至少部分由具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子涂布的可植入装置，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

根据进一步方面，提供筛选新化合物的方法。这些化合物是本文描述的分子并且可以用作抑制性化合物或检测中的化合物。筛选方法包括步骤：

a）在至少一种蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

b）合成具有下述结构的分子:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）使步骤b）中制备的分子与步骤a）的蛋白质接触；和

d）评估蛋白质的功能和/或聚集。

这些方法具有特定优点：它们可以用于无偏筛选，这是因为可以使用生物体的蛋白质组的任何蛋白质。可替代地，它们可以用于选择性筛选，例如以发现新靶（即，尚未被抑制性化合物靶向的蛋白质）。根据这些实施方案，步骤a）中的蛋白质不是已知的抑制性化合物的靶。

在步骤c）中使分子与蛋白质接触可以是完全在体外的，例如在试管或板中与纯化的蛋白质接触。然而，该方法还可以用于细胞系统中：步骤b）中制备的分子可以例如通过将分子加入细胞系中而与蛋白质接触。分子与蛋白质接触的方式将例如取决于蛋白质所在的生物体或细胞，因为这将决定蛋白质在自然界中或在体外条件下的可及性。

功能可以例如使用合适的报道读出手段而进行评估。如果筛选的是检测化合物而不是抑制性化合物，则典型地对化合物的存在或聚集进行的检测将构成读出，而非是功能读出。然而，可以考虑相同化合物可以用于抑制和检测两者（参见例如实施例4）。

这些方法也可以用于筛选改良化合物（代替仅仅筛选新化合物）。例如，当抑制性化合物是已知的时，可以例如通过改变用于X部分的残基，通过尝试不同接头，通过缩短或延长Yi部分等，筛选这种化合物的变化。

对于抗病原化合物（即其中步骤a）中的蛋白质是病原性生物体的蛋白质）的筛选，特别考虑，接触可以通过将分子加入病原性生物体或将分子施用于病原性生物体来完成，尤其是对于病原性微生物。

还特别考虑的是，如果该至少一种蛋白质是病原性生物体的蛋白质，则步骤d）中评估蛋白质的功能和/或聚集可以通过评估病原性生物体的存活、繁殖和/或生长来完成。

此处同样，步骤a）中鉴定的4–16个连续氨基酸的至少一个区域可以出现在病原性生物体的超过一种蛋白质中。因为以这种方式可以靶向超过一种蛋白质，故这可能增加成功机会。

同样地，步骤a）中鉴定的4–16个连续氨基酸的至少一个区域可以出现在超过一种病原性生物体的至少一种蛋白质中。这允许用相同化合物靶向超过一种病原性生物体，类似于例如广谱抗生素。

根据进一步方面，提供筛选新的抗微生物化合物的方法。这些方法包括步骤：

a）在至少一种微生物蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

b）合成具有下述结构的至少一种分子:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的微生物生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入在其基因组中编码步骤a）的蛋白质的微生物生物体；和

d）评估微生物生物体的存活和/或生长或繁殖。

在评估存活中，可以测定MIC值。为了鉴定具有抗微生物活性的化合物，即将分子分类为命中物，MIC应特别是低于100μg/ml。

在涵盖鉴定抗微生物化合物的新靶的方法的实施方案中，特别考虑，步骤a）中的微生物蛋白质不是已知的抗生素靶标。这使得鉴定的化合物因为应对不同靶标而在联合治疗中特别有用。

另一个特别的优点是，可以执行筛选方法，而无针对特定蛋白质作为目的靶标的选择偏向。事实上，可以分析微生物生物体的整个蛋白质组，并且合适的序列可以用于本文描述的分子中，并且测试有效性。这使得有很高的机会得到新靶。此外，当进行此分析时，可以考虑步骤a）中鉴定的区域是在蛋白质组中出现超过一次的区域。更特别地，步骤a）中鉴定的4–16个连续氨基酸的至少一个区域可以在微生物生物体的超过一种蛋白质中出现。

因为在许多情况下期望靶向超过一种微生物生物体（例如广谱抗微生物剂），所以还可以确保步骤a）中鉴定的4–15个连续氨基酸的至少一个区域在一种以上微生物生物体的蛋白质或至少一种蛋白质中出现。

最特别地，此处靶向的微生物生物体是病原性微生物生物体。为了确保不杀死有益的微生物生物体（例如在受试者的肠菌群中的有益微生物），可以检查：在微生物生物体中鉴定的区段是否是对病原性生物体(一种或多种)特异的，并且在有益微生物中不存在。

根据进一步方面，分子用于检测中或用作诊断。相应地，提供了用于检测和诊断的方法。因此，提供检测样品中的蛋白质的方法，其包括步骤：

a）使怀疑含有蛋白质的样品与具有下述结构的分子（即至少一种分子）接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是待检测的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

b）检测与蛋白质反应的分子的存在。

样品可以就此提供或可以进行预处理。检测可以是直接或间接的（即检测反应的或未反应的级分），并且可以通过检测分子（例如标记的分子）或蛋白质（例如（未）反应级分的检测）来完成。检测方法的性质对于本发明并不重要，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法（例如基于抗体的、基于质量的、基于吸附的、……）。

根据特定实施方案，天然存在于待检测的蛋白质中的该至少一个Y_i对于所述样品中的所述蛋白质是独特的。因此，例如，在人来源的样品中，也存在于待检测的蛋白质中的该序列仅在人基因组中编码一次（或仅在人蛋白质组中出现一次），即在待检测的该蛋白质（编码其的序列）中。尽管该独特性不总是必需的——例如，当不同蛋白质具有相同的聚集序列且一起检测时，它们仍可以例如基于大小进一步区分——但是特别考虑该独特性以利于检测。‘在所述样品中’对于确定蛋白质区段的独特性是重要的：例如，如果样品是预处理的，则与在复杂混合物或来自不同（微）生物体的样品中的检测，它可能含有较少的不同蛋白质。

根据非常特定的实施方案，Yi区可以含有正好2个荷电残基（选自R、K、D、E），只要Yi区的净电荷是零。然而，更特别地，Yi区不含任何荷电残基（或关于这一点，脯氨酸）。

应当注意，本发明检测方法高度类似于已确立的方法，典型地基于抗体的检测方法。显著差异是特定分子的使用。事实上，应当注意，在本文描述的检测方法中，如本文定义的分子发挥与抗体相似的作用。因此，在通常基于抗体的检测方法中，本文描述的分子可以代替至少一种抗体。例如，其中至少一个Y_i是待检测的蛋白质中天然存在的区段的分子可以替换检测试验中的一级抗体（并且可以是标记的‘一级干扰物’），其中Yi是用于检测的一级抗体中天然存在的区段的分子可以替换二级抗体。可替代地，二级干扰物分子可以针对融合至一级抗体的标签或标记，或可以针对与之融合的‘一级干扰物’或部分。与抗体一样，‘一级干扰物’也可以充当捕获试剂，其中检测的剩余部分用抗体（或例如用另一种一级干扰物和抗体）进行。该设置通常被称为夹心测定。

根据特定实施方案，用于检测的分子包含可检测标记。根据进一步具体实施方案，步骤b）中的检测是通过可检测标记的检测。

根据特定实施方案，该方法另外包括，在步骤b）中的检测前，分离与蛋白质反应的分子和未与蛋白质反应的分子。可替代地，该方法可以包括，在步骤b）中的检测前，分离与分子反应的蛋白质和未与分子反应的蛋白质。

步骤b）中的检测可以是直接或间接的，例如通过检测分子的未反应级分。检测可以是定性、半定量或定量。

根据特定实施方案，样品来自受试者，特别来自动物或植物受试者，更特别来自哺乳动物受试者，最特别来自人受试者。

然而，可以使用可能含有蛋白质的任何样品，并且根据特定实施方案，样品不来自生物体。对于白色生物技术中的应用，这尤其如此，其中例如进行分析，以检查产品纯度，或用于检测食物或饲料中的蛋白质，或用于检测水中的污染蛋白质等。

尽管检测蛋白质可以是该方法的最后一个步骤，但常常跟着进行下一个步骤——将所检测的蛋白质的存在（或不存在或量）与特定状态关联。例如，在提及的白色生物技术应用中，蛋白质的存在可以给出污染或纯度的指示。例如，在来自植物材料的样品中，所检测的蛋白质的量可以指示哪个植物株产生最多的特定产品，所述信息例如可以用于选择植物用于进一步育种。

根据特定实施方案，在样品中检测到的蛋白质的存在、不存在或量指示疾病状态。此类疾病状态可以是例如疾病的存在、疾病的不存在、疾病的进展（例如恶性、转移、对药物疗法的应答、复发）。与疾病状态相关的蛋白质，例如生物标记，的例子在本领域有充分文献报道。此类蛋白质的非限制性例子包括CRP（常用于监控炎症）和PSA（用于前列腺癌的早期检测），以及同样是炎症标记的IL-1β和TNF-α。根据进一步具体实施方案，这些方法另外包括步骤c）：使样品中检测到的蛋白质的存在、不存在或量与受试者中的疾病状态关联。如同样由这些标记可见的，特别考虑，诊断的疾病是癌症和炎性疾病。

等价地，本发明提供具有下述结构的分子用于在所述疾病状态的诊断中使用:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是指示疾病状态的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

此处同样，癌症和炎性疾病是特别考虑的两类疾病（或类似的，提供分子用于制造疾病（例如癌症、炎性疾病）的诊断剂的用途）。

因为本文考虑例如体外诊断，所以也提供试剂盒，包含如本文描述的至少一种分子（包括编码此分子的核酸分子或如本文描述的重组载体）和至少合适的缓冲液。

作为试剂盒的一种特别形式，可以提供含有具有下述结构的至少两种分子的固相载体:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

根据特定实施方案，分子通过接头连接至固相载体。该至少两种分子一般将是至少两种不同的分子。固相载体的特定例子包括但不限于微阵列、预包被的板、纳米颗粒和芯片实验室(lab-on-a-chip)装置。因为这些装置中的许多用于检测超过一种蛋白质（常甚至同时高达数十或数百种蛋白质），故考虑提供包含至少5种分子、至少10种分子、至少20种分子、至少50种分子、至少100种分子、至少200种分子、至少500种分子或至少1000种分子的固相载体。

根据进一步具体方面，分子用于下调植物、植物细胞或植物种子中的蛋白质的功能。相应地，提供用于下调植物或植物细胞或植物种子中的蛋白质的生物功能的方法，其包括使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物、植物细胞或植物种子中的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，分子是由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列存在于重组载体上，并且在引入植物细胞、植物种子或植物内之后，在所述植物细胞、植物种子或植物中产生所述多肽。

本发明还提供农业化学组合物。这些组合物包含具有下述结构的至少一种分子和农学上可接受的载体:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

对于农业化学组合物，该至少一个Yi特别是植物、植物细胞或植物种子中或上的蛋白质中天然存在的区段。这可以是植物（一般为农业化学组合物应用于其上或附近的植物）的蛋白质，或可出现在植物上的植物害虫的蛋白质。

附图简述

图1：根据性质分组氨基酸的文氏图。由Livingstone&Barton，CABIOS，9，745-756，1993适应性修改。

图2：在不同生物体的蛋白质组中，对于给定的肽长度，独特序列的百分比。为了生成该图，获得生物体的基因组序列，生成在基因组中编码的长度X的所有肽，随后计算每种肽出现的频率，并且对独特的级分（即独特序列相对于该长度的所有序列）进行作图。

图3：在诱导和阻遏条件下表达Als3聚集子（aggregator）构建体的菌株的成熟生物膜的定量。成熟生物膜在硅氧烷正方形盘上在琥珀酸（白色条）或YNB，4%D-葡萄糖（黑色条）中生长48小时。白色念珠菌（C.albicans）SC5314用作对照。与对照相比较，当诱导时，表达Als3p干扰物的重组菌株显示显著减少的生物膜形成能力（*p<0.001）。定量通过CFU计数执行，并且数据呈现为与对照（100%）相比较的活细胞百分比。标准差由两次独立实验进行计算。

图4：诱导的白色念珠菌干扰物构建体展示了对上皮细胞系TR-146的减少的粘着（小图A）和侵袭（小图B）。

图5：候选肽F9导致生物膜形成的强抑制。在不同浓度（250μM、50μM和10μM）的肽E1（RNGIVIVATTR（SEQ ID NO：7））、肽E2（RLQQYTLLLIYLSVATAK（SEQ ID NO：8））和肽F9（RKLLFNLGSRNGIVIVATTR（SEQ ID NO:（9））的存在下，在96孔聚苯乙烯孔板上白色念珠菌SC5314的生物膜形成。（A）肽仅在念珠菌粘附期中加入，并且成熟生物膜发展在新鲜的RPMI1640-MOPS中继续，而在（B）上，肽在整个生物膜发展期，包括粘附期中存在。生物膜通过XTT还原试验进行定量。对照（100%）仅含有具有终浓度1%的DMSO的新鲜培养基。肽E1和F9的存在导致生物膜形成的显著减少（*p<0.001）。数据代表，与对照（100%）相比较，肽处理的念珠菌细胞的代谢活性百分比。标准差由三次独立实验进行计算。肽的每个浓度一式三份地进行测试。

图6：肽F9减少白色念珠菌SC5314在聚苯乙烯上的粘附和生物膜形成。（A）在肽F9（50μM、10μM和2.5μM）的存在下，在96孔聚苯乙烯平板上的白色念珠菌SC5314粘附。在37℃粘附90分钟后执行XTT还原试验。（A）在粘附期中用不同浓度的肽预处理的念珠菌细胞的体外成熟生物膜形成。进一步的生物膜发展（48小时）在RPMI1640-MOPS中继续。对照样品用1%DMSO（100%）处理。白色念珠菌als3Δ/als3Δ用作对照。肽F9显著降低粘附和进一步的成熟生物膜发展（*p<0.001）。数据代表，与对照（100%）相比较，在粘附（90分钟）或48小时生物膜形成后，肽处理的念珠菌细胞的代谢活性百分比。标准差由五次独立实验进行计算。肽的每个浓度一式三份地进行测试。

图7：肽处理的白色念珠菌SC5314细胞在体内降低了聚氨酯导管上形成生物膜的能力。白色念珠菌SC5314细胞在37℃在粘附期过程中（90分钟）在肽F9（50μM）的存在下温育。其后，洗涤导管且皮下植入。生物膜形成6天。白色念珠菌als1Δ/als1Δals3Δ/als3Δ用作对照。白色念珠菌als3Δ/als3Δ形成类似于野生型的生物膜。白色念珠菌细胞在粘附期过程中用肽F9处理导致了较少的体内成熟生物膜形成（*p<0.001）。数据呈现为每个装置获得的Log₁₀CFU的平均值。总共研究了20个装置。在每个实验中，每个菌株或条件使用两只动物。

图8：肽F9降低了白色念珠菌SC5314粘附至聚氨酯导管的能力。白色念珠菌SC5314细胞在粘附期过程中（在37℃，90分钟）用肽F9（50μM）处理。将装置洗涤且通过CFU计数执行附着的念珠菌细胞的定量。与对照相比较，白色念珠菌als3Δ/als3Δ和白色念珠菌als1Δ/als1Δals3Δ/als3Δ显著更少粘附（*p<0.001）。用肽F9处理的野生型念珠菌细胞展示了与未处理的细胞相比较减少的粘附性质（*p<0.001）。数据呈现为在粘附期后每个装置获得的Log₁₀CFU的平均值。总的，对于测试的每个菌株或条件，使用9个导管。

图9：肽F9降低白色念珠菌SC5314粘附且侵袭上皮细胞的能力。在白色念珠菌SC5314粘附（1小时）（A）和侵袭（3小时）（B）上皮细胞系TR-146的过程中，施用三个不同浓度（50μM、10μM和2.5μM）的肽F9。真菌细胞在上皮细胞内的粘附和侵入部分用calcofluorwhite染色，并且用Alexa Fluor488二级抗体复染色。通过表面荧光观察盖玻片。粘附细胞的百分比计算为涂在盖玻片的整个表面上的一百个区域上的粘附念珠菌细胞的平均值。白色念珠菌als3Δ/als3Δ的粘附和侵袭能力显著降低（*p<0.001）。侵袭白色念珠菌细胞的百分比通过将内化的细胞数目除以粘附细胞的总数目进行确定。在每个盖玻片上计数至少100个真菌细胞。标准差由三次独立实验进行计算，并且肽的每个浓度一式两份地进行测试。

图10：野生型、纯合缺失突变体和Cnb1转化体在正常启动子诱导/阻遏条件下具有相似表型。当通过将SDS（0,01%）加入培养基来诱导应激时，转化体在启动子阻遏条件（SD培养基）下显示类似于野生型的表型，而在启动子诱导条件（SCAA培养基）下的表型显示与纯合缺失突变体更大的相似性。显示的数据代表4个构建体。

图11：在其最小抑制浓度（MIC）和2x MIC时，不同干扰物分子处理的表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）的杀死动力学。

图12：在金黄色葡萄球菌ATCC中的抗性发展监控。

图13：在MRSA中的长期抗性发展研究。红线和箭头描述由于从培养基中撤出肽1天而导致的C30的2倍抗性下降。

图14：干扰物肽的溶血性质。

图15：在亚MIC经过15天培养的金黄色葡萄球菌的抗性曲线。

图16：在不同浓度的肽干扰物C30和Hit50下，来自人胚胎肾细胞的乳酸脱氢酶释放。

图17：在两种不同的抗细菌肽干扰物（化合物30和Hit50）的存在下，在24小时温育期后的人上皮肾细胞系回收百分比。该图显示用100μg/mlHit50处理的HEK细胞的百分之90回收。生长抑制是由于作为缓冲液的DMSO的存在，而不是由于干扰物肽（用于增溶干扰物肽的缓冲液是在超纯水中的50%DMSO）。

图18：按时间表示的、用多种干扰物肽处理的细胞的绿色荧光强度测量结果。溶葡萄球菌素（该图中的上方线）在此处代表裂解对照，这是因为已知溶葡萄球菌素非常快速地破坏葡萄球菌细胞壁，并且导致快速的细胞内容物释放。该图中的下方线代表缓冲液。

图19：用多个浓度的干扰物肽C30处理的细胞的绿色荧光强度（SytoxGreen）测量。

图20：未处理的细菌（A）、DMSO处理的细菌（B）、通过CCCP对照去极化的细菌（C）、用溶葡萄球菌素处理的细菌（G）、在0（D）、5（E）和15（F）分钟时间点测量的用C30（25μg/ml）处理的细菌的膜电位（DiOC₂红/绿荧光点图）。

图21：硫代黄素T淀粉样蛋白诊断染料与用不同浓度的化合物C30处理的金黄色葡萄球菌的结合。注意，在培养基中增溶的肽干扰物C30也给出一定的背景荧光。

图22：刚果红淀粉样蛋白诊断染料与用递增浓度的化合物C30处理的细菌细胞的结合。

图23：未处理的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）（左图）和用化合物C30以3xMIC处理5分钟（右图，上）或20分钟（右图，下）的SEM显微照片。存在处理细胞的明显细胞壁收缩，具有明显的内容物释放。另外，细胞看起来更短，指示受阻的细胞分裂。细胞表面上不存在可见孔，也不存在坑。

图24：未处理的（A）和C30处理的（B）金黄色葡萄球菌ATCC的SEM显微照片。在含有分裂隔的细胞的数目上存在显著差异，提示用C30处理的细胞中受阻的分裂。在处理一小时后，一些细菌细胞开始丧失其内容物。

图25：，C30处理的（右图）和DMSO处理的（左图）金黄色葡萄球菌（在处理20分钟后固定）的透射电子显微照片。细胞是圆形和完整的，具有界限明确的细胞膜。一些间体样结构可以在处理的细胞群体中看到（指示箭头）。

图26：用C30以4xMIC处理20分钟的葡萄球菌的TEM显微照片。细胞质内容物开始收缩，然而，未能够观察到明显的细胞裂解。DNA区具有极高电子密度，暗示DNA浓缩，这是细胞凋亡的晚期征兆。

图27：暴露于带FITC标签的C30的金黄色葡萄球菌的免疫标记的超薄切片（上两行，图像A至F）和免疫标记的未暴露于肽的切片（底行，未标号的图像）的透射电子显微照片。红色箭头显示肽聚集体。肽处理的细胞的分裂隔显示不规则形状，并且细胞分裂是不对称的。肽被细胞吸收并且聚集体位于细胞质中。

图28：肽Hit1（序列：RWVSMLLRRGSRWVSMLLRR（SEQ ID NO：31））和Hit57A（序列：RFFIGLSRRGSRIQAYLYRR（SEQ ID NO：78））有效减少受感染的细胞单层中的细菌数目。所有化合物都以100μg/ml使用。

图29：用抗ClpC肽探测的印迹。

图30：含有不同浓度肽的点的链霉抗生物素蛋白-HRP信号强度。

图31：在嗜中性粒细胞减少症小鼠大腿模型中，比较静脉内和腹膜内递送的万古霉素与化合物C30的抗金黄色葡萄球菌MRSA326的功效。

图32：在用10μM（小图A，B）或1μM（小图C，D）抗病毒干扰物、Tamiflu或PBS处理的细胞上的多级(multistep)病毒生长曲线。Hpi，感染后小时。

图33：在全部或一个子集的微型复制子(minireplicon)组分转染后的相对萤光素酶活性。“Mx1”：除了所有微型复制子组分外，还转染了Mx1的表达载体。

图34：在针对不同病毒蛋白质的干扰物的存在下，相对萤光素酶活性。R-GS、R-PP、D-PP、R-PS指示使用的守门者（在连字符前）和内部接头（在连字符后）的性质。

图35：在针对不同内部病毒蛋白质（M1和NS1）（其不涉及微型复制子试验）的干扰物的存在下的相对萤光素酶活性。对照值=1。R-PP、D-PP、R-PS指示使用的守门者（在连字符前）和内部接头（在连字符后）的性质。

图36：借助于特异性干扰物的检测技术的示意图。

图37：来自完全细菌BL21细胞裂解物的β-Gal的蛋白质印迹和PepBlot分析。泳道1显示用兔多克隆抗β-Gal抗体的检测；泳道2显示用Tango1肽干扰物（b～RLAVVLQR（SEQ IDNO：79））的检测；泳道3显示用Tango2肽干扰物（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80））的检测；并且泳道4显示与脱靶肽干扰物（b～RPITVNPPFR（SEQ ID NO：81））的相互作用。使膜暴露于化学发光HRP底物100秒。上方箭头指示，β-Gal蛋白质在印迹上的预测位置。下方箭头指示非特异性结合产物，这推测是游离SRP。

图38：野生型和突变型Tango2肽与来自整个BL21细胞裂解物的β-Gal的结合特异性的PepBlot分析：泳道1–野生型肽（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80））；泳道2–mut_1肽（b～RVPIWSLGNR（SEQ IDNO：82））；泳道3–mut_2肽（b～RVIPWSLGNR（SEQ ID NO：83））；和泳道4–mut_3肽（b～RVIPESLGNR（SEQ ID NO：84））。使膜暴露于化学发光HRP底物100秒。箭头指示β-Gal在膜测试条上的位置。

图39：Tango2肽（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80））与来自整个BL21细胞裂解物的β-Gal的结合动力学的PepBlot分析。使膜中分离的蛋白质暴露于结合缓冲液中的Tango2干扰物肽不同时间点：泳道1–不暴露于肽；泳道2–30秒；泳道3–5分钟；泳道4–10分钟；泳道5–15分钟；泳道6–30分钟；泳道7–45分钟；和泳道8–60分钟温育。使膜暴露于化学发光HRP底物100秒。箭头指示β-Gal在膜测试条上的位置。

图40：掺在非诱导的完全BL21细胞裂解物中的不同β-gal蛋白质水平的分析。使用（A）Tango2肽干扰物（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80））和PepBlot、和使用（B）兔多克隆抗β-Gal抗体和WB，进行检测。泳道1–无β-Gal；泳道2–11.6ngβ-Gal；泳道3–58ngβ-Gal；泳道4–116ngβ-Gal；泳道5–290ngβ-Gal；泳道6–580ngβ-Gal；泳道7–870ngβ-Gal；和泳道8–1160ngβ-Gal。使膜暴露于化学发光HRP底物100秒。箭头指示β-Gal在膜上的位置。

图41：比较Tango2肽干扰物（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80））（带圆圈的黑线）和抗β-Gal抗体（带三角形的红线）对掺在非诱导的完全BL21细胞裂解物中的不同β-gal蛋白质水平的PepBlot和WB检测信号密度。

图42：守门残基对基于干扰物肽的PepBlot检测的特异性的影响，所述检测为检测完全大肠杆菌（E.coli）裂解物中的β-gal，在相邻泳道中存在血清蛋白质。检测在竞争平台上执行，其中每个膜的泳道1含有7%临床血清，而泳道2是完全大肠杆菌BL21细胞裂解物中的β-gal。肽在两个末端上用生物素标记并且通过Ttds接头连接。含有分开的血清和大肠杆菌蛋白质的膜与25nM干扰物肽一起温育15分钟，随后与SRP-HRP缀合物温育，暴露于化学发光HRP底物120秒。注意，对于血清观察到的高MW条带是由于SRP-HRP缀合物的交叉反应引起的。

图43：比较多种肽结合β-Gal的亲和力的实验传感图。Tango1（红色）、Tango2（绿色，最高曲线）、脱靶肽（黄色）和缓冲液参考（黑色）。注意，这些肽（1μM）在相同芯片上流动，其中每次接触后进行表面再生步骤。

图44：比较野生型和突变型Tango2肽结合β-Gal的亲和力的实验传感图：Tango2wt（红色，最高曲线）、Tango2Mut_1（绿色）、Tango2Mut_2（黄色）、Tango2Mut_3（蓝色）和缓冲液参考（黑色）。注意，这些肽（1μM）在相同芯片上流动，其中每次接触后进行表面再生步骤。

图45：来自肽（His）₆～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：80）与传感器芯片上固定的β-Gal结合的动力学分析的拟合数据的代表性传感图。实线是实验传感图，在应答上叠加的点线是拟合曲线。从下到上的分析物浓度是0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM和4.0μM。中间曲线（2μM）一式两份运行。注意，肽（1μM）在相同芯片上流动，在每次接触后具有表面再生步骤。

图46：比较单个Tango2（实线）和串联Tango2（虚线）肽结合β-Gal的亲和力的实验传感图。缓冲液参考显示为点线。注意，肽（1μM）在相同芯片上流动，在每次接触后具有表面再生步骤。

图47：Tango1（三角形）和Tango2肽（正方形）与β-Gal的共聚集动力学的比较。干扰物肽和β-gal的浓度是10μM。黑色圆圈代表在不存在肽的情况下的β-gal。箭头指向在各时间点使用DLS测量的颗粒的流体力学半径（RH）。

图48：单个Tango2肽（正方形）和串联重复Tango2肽（三角形）与β-Gal的共聚集动力学的比较。干扰物肽和β-gal的量是10μM。黑色圆圈代表在不存在肽的情况下的β-gal。箭头指向在各时间点使用DLS测量的颗粒的流体力学半径（RH）。

图49：肽浓度对Tango2肽与β-gal共聚集的动力学的影响。肽与β-gal摩尔比是1:5（三角形）、1:2（正方形）和1:1（菱形）。黑色圆圈代表在不存在肽的情况下的β-gal。箭头指向在各时间点使用DLS测量的颗粒的流体力学半径（RH）。

图50：Tango2干扰物肽对β-gal的酶促活性——将非荧光底物FDG切割为发荧光的荧光素——的影响。最高荧光强度获自不含干扰物的10μM天然β-Gal，随后为10μMβ-Gal+1μM肽干扰物，随后为10μMβ-Gal+5μM肽干扰物。在10μMβ-Gal+10μM肽干扰物的条件下未观察到荧光。

图51：在20mM PB，pH6.8中天然β-Gal（实线）和β-Gal-Tango2肽干扰物共聚集体悬浮液（点线）的衰减全反射FT-IR光谱。

图52：在20mM PB，pH6.8中天然β-Gal（实线）和β-Gal-Tango2肽干扰物共聚集体悬浮液（点线）的CD光谱。

图53:（A）天然β-Gal和（B）β-Gal-Tango2肽干扰物共聚集体的EM。

图54：使用肽干扰物b～RQWVLTAAR（SEQ ID NO：85）（小图A）和兔单克隆抗PSA抗体（小图B）的PSA的PepBlot和WB分析。膜含有掺在5%人血清中的1.55μg PSA。箭头指示在印迹上的PSA位置。使具有干扰物肽和抗PSA抗体的膜分别暴露于化学发光HRP底物180秒和10秒。PepBlot和WB中显而易见的高分子条带分别由于SRP-HRP缀合物和二级抗体-HRP的非特异性结合引起。

图55：使用干扰物肽b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）（小图A）和兔单克隆抗CRP抗体（小图B），掺在5%人血清中的1.25μg CRP的PepBlot和WB分析。使具有干扰物肽和抗CRP抗体的膜分别暴露于化学发光HRP底物60秒和10秒。箭头指示在印迹上的CRP位置。在干扰物和抗体印迹中显而易见的高分子条带分别由于SRP-HRP缀合物和二级抗体-HRP的非特异性结合引起。

图56：使用肽干扰物b～RWSFYLLYYTR（SEQ ID NO：87）（小图A）和抗β-2M抗体（小图B），掺在5%人血清中的0.6μgβ-2M的PepBlot和WB分析。使具有干扰物肽和抗β-2M抗体的膜分别暴露于化学发光HRP底物180秒和10秒。箭头指示在印迹上的β-2M位置。

图57：使用兔单克隆抗CRP抗体通过WB和使用干扰物肽b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）通过PepBlot，在临床血清样品中检测CRP。

图58：使用干扰物肽b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）通过PepBlot，在20个患者的临床血清样品中检测CRP（上图）。通过免疫比浊测定法测定的临床血清中的CRP浓度在1μgml^-1至317μg ml^-1的范围内。下图显示，通过肽b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）检测的CRP条带信号强度，与在临床实验室用免疫比浊测定法独立测定的浓度相比较的图。

图59:（A）使用肽b～RWQVLASD（SEQ ID NO：88）（泳道2）和b～RQWVLTAAR（SEQ IDNO：85）（泳道3），通过PepBlot，检测在人精浆中分泌的PSA。对PSA的C末端序列特异的单克隆抗体（EP1588Y）的WB显示于泳道1中。（B）使用串联重复干扰物肽b～RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR（SEQ ID NO：89）的PSA检测。生物素（b）通过‘Ttds-APAA’（SEQ ID NO：77）接头连接至肽，并且两个聚集序列通过‘GSGSAPAA’（SEQ ID NO：90）接头连接。注意，单个和串联重复肽的浓度分别为250nM和250pM。使膜暴露于化学发光HRP底物36秒。

图60：掺在5%人血清中的5μg IL1β的PepBlot（即基于干扰物的）检测。

图61：掺在5%人血清中的5μg TNFα的PepBlot检测。

图62：使用肽b～RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR（SEQ IDNO：91），定量检测掺在完全大肠杆菌细胞裂解物中的不同β-gal水平。生物素（b）通过‘Ttds-APAA’（SEQ ID NO：77）接头连接至肽，并且两个聚集序列通过‘GSGSAPAA’（SEQ ID NO：90）接头连接。

图63：肽b～RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR（SEQ ID NO：91）与β-Gal相互作用的动力学表征。靶蛋白质β-Gal的浓度在范围31pM-1μM中。

图64：肽b～RILIFWSRGSGSAPAARILIFWSR（SEQ ID NO：92）与CRP相互作用的动力学表征。靶蛋白质CRP的浓度在范围37μM-582mM中。

图65：通过使用‘R’侧接的单个干扰物肽（上图）或‘R’侧接的串联重复干扰物肽（下图）微阵列，在临床血清中检测CRP。X轴显示所点上的肽，Y轴指示信噪比。在血清中的CRP浓度是317μg ml^-1。

图66：A，Hek293细胞的磷酸-和总-ERK1/2的蛋白质印迹分析，所述Hek293细胞用mVEGFR2转染，随后在来自不同来源的肽的存在或不存在下过夜饥饿，并且用VEGF（25ng/ml）刺激5分钟。B，对于A中所示的一些肽，磷酸化与总ERK1/2水平的比值的定量。

图67：肽B8针对VEGFR2受体的特异性。对HeLa细胞中的磷酸化ERK1/2的蛋白质印迹分析，其中在DMSO或所示浓度的肽B8的存在下过夜饥饿后，所述HeLa细胞用EGF（25ng/ml）刺激5分钟。未能观察到由针对VEGFR2的肽诱导的ERK1/2磷酸化减少。

图68：在用DMSO（上图）或10μM肽B8（下图）处理的HEK293细胞中表达的mVEGFR2的免疫组织化学染色。

图69：用对照、抗VEGFR2干扰物肽或抗VEGFR2mAb处理的小鼠眼中的脉管新生血管化。Y轴指示在损伤的全部边界区域上的TRITC阳性面积%。

图70：在针对EGFR的肽的存在或不存在下，在EGF刺激后HeLa细胞中的磷酸化ERK1/2水平。Y轴显示相对于阴性对照校正的磷酸-ERK水平。A5的序列，RWGLLLALRPPRWGLLLALR（SEQ ID NO：93）；A11，RTGYLYISRPPRTGYLYISR（SEQ ID NO：94）；A12，RIISAVVGRPPRIISAVVGR（SEQ ID NO：95）；B9，DVWSYGVTDPPDVWSYGVTD（SEQ ID NO：96）；B10，DITGYLYIDPPDITGYLYID（SEQ ID NO：97）；B11，DLLGISLTDPPDLLGISLTD（SEQ ID NO：98）；B12，DWGLLLALDPPDWGLLLALD（SEQ ID NO：99）。

图71：在用hTNF刺激后的不同时间点的A20（上图中的蛋白质印迹）和IL-8（中图中的ELISA）或IL-6（下图中的生物测定）诱导。

图72：与用无血清培养基和2%DMSO（图中的DMSO）处理相比较，在TNF刺激后用不同干扰物处理的A549细胞的IL-8水平的相对诱导。A和B显示2次独立实验的结果。

图73：与用无血清培养基和2%DMSO（图中的DMSO）处理相比较，在TNF刺激后用不同干扰物处理的A549细胞的IL-6水平的相对诱导。

图74.（a）BIN2的TANGO图；峰代表在BIN2蛋白质内具有最高聚集倾向的肽序列。（b）含有与GFPN末端融合的聚集加强子（booster）的bait249表达载体的示意图。（c）包括不同接头和侧翼序列（示出aa序列）但不含任何聚集加强子的bait249表达载体的示意图。

图75.（a-e）在用每个小图上指示的GFP表达构建体瞬时转化的本氏烟草（N.benthamiana）农杆菌浸润(agro-infiltrate)叶中的聚集体形成的CLSM评估。表皮细胞是GFP阳性的，但显示主要在核周区域中的不同定位模式。白色箭头指示不溶性包含体。尺寸条：10μm。

图76.上图：在用35SBIN2GFP和pMDCbait249NF_Tand表达菌株共注射4,5天后，本氏烟草表皮细胞的CLSM图像。在下图中：代表通过ImageJ MBF软件执行的共定位定量的相应图像。指出每个图的Mander’s重叠系数（0<R<1）；尺寸条代表50μm。

图77.在本氏烟草中与35S::BIN2:HA共表达的35S::bait249-GFP变体的共免疫沉淀。在左图中，在与抗GFP珠温育4小时后，植物蛋白质提取物中未结合级分的蛋白质印迹检测，其中用抗HA抗体（左上图）或抗GFP抗体（左下图）检测。在右图中，用抗HA抗体（右上图）或抗GFP抗体（右下图）检测免疫沉淀（IP）的珠。

图78.（a-d）表达35S::bait249R-GFP构建体的拟南芥（Arabidopsis）8D.A.S.T3幼苗的CLSM图像。子叶（a）、下胚轴（b）和根细胞（c）中的表皮细胞显示核周聚集（白色箭头）。根尖显示无明显的细胞溶质聚集和弱GFP信号（d）。（e-h）表达35S::bait249NF_Tand-GFP构建体的拟南芥8D.A.S.T3幼苗的CLSM图像。子叶（e）、下胚轴（f）和根细胞（g）中的表皮细胞显示细胞溶质聚集。根尖显示更弱的GFP强度（h）。示出尺寸条。

图79.（a-d）表达35S::bait249-GFP构建体的拟南芥8D.A.S.T3幼苗的CLSM图像。在植物组织中不可见明显聚集，但在子叶（a）、下胚轴（b）和根尖（d）中的细胞中仅可见弱GFP表达。在根细胞（c）中，圆形体形式的不可溶聚集体的存在是显而易见的（白色箭头）。（e-h）表达35S::bait249NF-GFP构建体的拟南芥8D.A.S.T3幼苗的CLSM图像。诱饵在任何植物组织中均表达，仅在根细胞（g）中显示核周聚集。示出尺寸条。

图80.与抗GFP抗体一起温育的8D.A.S.拟南芥幼苗的免疫金标记的超薄切片的TEM评估。（a）表达35S::bait249R-GFP的下胚轴维管薄壁细胞，显示标记的细胞溶质纤丝物质——在插图中放大。（b-c）根伸长区细胞的细节，显示在细胞溶质中（b）和接近于高尔基体叠层（c）的bait249NF_Tand-GFP的成簇标记。（d）表达bait249NF_Tand-GFP的子叶栅栏细胞，表明核周标记（在插图中放大）。（e）根伸长区细胞，显示在细胞溶质中bait249NF_Tand的细胞质标记。示出尺寸条。

图81.（a）相对于野生型（Col-0）植物提取物，在来自稳定表达BIN2bait249系的转基因拟南芥植物的蛋白质提取物中的高分子量复合物（加框）的非变性PAGE和抗GFP检测。（b,c）在来自表达35S::bait249-GFP、35S::bait249R-GFP、35S::bait249NF_Tand-GFP和35S::bait249NF-GFP的转基因植物的免疫沉淀材料上的FT-IR光谱学。在1616和1680（黑色箭头）处的吸光度值增加指示β-片层聚集体的存在。

图82.（a）与在长日照光周期下8天和在土壤中1.5个月在体外直立生长的Col-0相比较，35S::bait249R-GFP和35S::bait249NF_Tand-GFP拟南芥幼苗的表型。还表示了在50个8D.A.S.幼苗/系上平均的根和下胚轴长度的定量。（b）与Col-0和三重GSKs组II T-DNA突变体（trGSKsII_k.o.）相比较，35S::bait249R-GFP和35S::bait249NF_Tand-GFP拟南芥4D.A.S.幼苗系的Brazzinazole抗性剂量反应测定试验。在图中表示了在50个幼苗/系上平均的下胚轴长度的相应定量。

图83a）在长日照条件下在体外生长的8D.O.拟南芥幼苗中，BR-生物合成基因DWF4和CPD和编码BR应答性NAC转录因子（At5g46590）的基因的相对表达水平。b）在相同实验条件下测量的伴侣基因（HSP70、HSP90-1、HSP101、HSC70-1、HSC70-2和HSC70-3）表达水平。在每种情况下，mRNA量针对作为参考基因的CDKA1水平标准化。

图84.在拟南芥植物中35S::bait249R-GFP细胞毒性的TEM超微结构评估。显示了在Col-0（a,c）和突变体（e,g）中下胚轴和根细胞之间的低放大率比较。在Col-0（b,d）和突变体（f,h）中的相同区域的高放大率显微照片。示出尺寸条。

图85.上图：在诱导24小时后，表达35S::BIN2-GFP和pMDC::bait249NF_Tand_RFP的8D.A.S.拟南芥幼苗的CLSM图像。在下图中：代表通过ImageJ MBF软件执行的共定位定量的相应图像。示出每个图的Mander’s重叠系数（0<R<1）。

发明详述

定义

本发明将就一些特定实施方案并参考附图进行描述，但本发明并不限于此，而仅受权利要求限制。权利要求中的任何提及表示都不应解释为限制范围。本文描述的附图仅是示意性而非限制性的。在附图中，为了举例说明目的，一些元素的尺寸可能被夸大，并非按比例绘制。当术语“包括/包含”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他元素或步骤。在使用不定冠词或定冠词的地方，当提及单数名称例如“一个/一种”、“所述/该”时，除非另有具体说明，否则这涵盖该名词的复数形式。

此外，在说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似元素，而不一定用于描述顺序或时间次序。应当理解，如此使用的术语在合适环境下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以与本文描述或举例说明不同的其他顺序操作。

提供下述术语或定义只是为了帮助本发明的理解。除非本文具体定义，本文使用的所有术语都具有与本发明领域技术人员所知相同的含义。关于本领域的定义和术语，技术人员尤其可以参考Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York（1989）；和Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology（Supplement47），John Wiley&Sons，New York（1999）。本文提供的定义不应解释为具有比本领域普通技术人员所理解的范围小的范围。

本文描述的β-聚集诱导分子或聚集成核分子有时被称为“干扰物”或“干扰物分子”。该术语意指如本文描述的含守门者的分子（即具有X_2i-1和X_2i部分的分子），该术语因此不与如WO2007071789中使用的“干扰物”同义。如本文使用的“干扰物”因此应理解为具有（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n结构的分子。如果它们具有完全肽性质，则有时使用术语“干扰物肽”。术语“诱饵”有时也用作同义词，尽管这还可以指聚集区本身。如本文描述的干扰物分子是非天然存在的分子。它们是合成的（在人工的意义上），并且不意欲包含蛋白质片段（由于特异性序列要求，在生物体中发现的天然蛋白质片段不可能落入该定义中）。

如本文使用的，术语“疏水性氨基酸”指下述13种氨基酸：异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、缬氨酸（V）、苯丙氨酸（F）、酪氨酸（Y）、色氨酸（W）、组氨酸（H）、甲硫氨酸（M）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）、丙氨酸（A）、半胱氨酸（C）和甘氨酸（G）。术语“脂肪族氨基酸”指I、L或V残基。术语“荷电氨基酸”指精氨酸（R）、赖氨酸（K）–两者都带正电荷；和天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）–两者都带负电荷。尽管因为在其侧链中的氮在酸性条件下可以被质子化，组氨酸有时被称为带正电荷的，但是除非另有明确说明，它在本文中不被考虑为荷电氨基酸。这是因为该正电荷与在生理条件下R或K残基的正电荷不相当，在本文中重要的是生理条件下的电荷。

本申请自始至终，使用氨基酸的标准单字母符号。一般地，术语“氨基酸”指“蛋白氨基酸”，即天然存在于蛋白质中的那些氨基酸。最特别地，氨基酸为L异构形式。也考虑D氨基酸，但一般具有不同的聚集倾向。

如本文使用的，短语“在蛋白质中天然存在的X个连续氨基酸的区段”（其中X是数目），指这X个氨基酸以相同次序作为不间断的区段存在于生物体的蛋白质中。换言之，该区段对应于蛋白质中跨X个残基长度的该确切序列。

氨基酸区段的“总电荷”是带正电荷的氨基酸的数目总和减去带负电荷的氨基酸的数目总和，或反之亦然。如本文使用的，它始终是绝对值。因此，如果区段含有例如一个带正电荷的残基和三个带负电荷的氨基酸，则该区段的总电荷是二。

如本申请中使用的术语“单体”是可以与其他单体化学结合以形成聚合物的原子或小分子。这可以指天然单体，例如氨基酸（其聚合物是多肽或蛋白质）、核苷酸（聚合物是核酸）、或单糖–例如葡萄糖（其聚合物是淀粉、糖原或葡萄糖）；或木糖（木聚糖为其聚合物）。然而，最特别地，单体在本文中用于指在这三个种类外的有机分子，其可以形成合成的或其他天然的聚合物，例如氯乙烯或异戊二烯。最特别考虑的单体是环氧乙烷，其寡聚物或聚合物是聚乙二醇（PEG），有时也称为聚氧化乙烯（PEO）或聚氧乙烯（POE）。

在单体的情况中，“具有相同性质的单位”在本文中用于指具有相同的通式结构、但不一定完全相同的单体。例如，两个不同氨基酸是具有相同性质的单位，而氨基酸和单糖是具有不同性质的单位。

如本文使用的“受试者”一般指“动物受试者”和“植物受试者”。“动物受试者”在本文中用于指脊椎动物生物体、更特别是哺乳动物、最特别是人。特别考虑的哺乳动物受试者是作为宠物饲养的那些，例如犬、猫、兔、沙鼠、仓鼠、栗鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、驴、骡、雪貂、侏儒山羊(pygmy goat)、大肚猪(pot-bellied pig)，禽类宠物例如金丝雀、长尾鹦鹉、鹦鹉、鸡、火鸡；爬行动物宠物，例如蜥蜴、蛇、陆龟和海龟；和水生宠物，例如鱼、蝾螈和青蛙。其他特别考虑的动物是用于毒物学分析的物种，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猪、猴、雪貂和绵羊。还特别考虑的是家畜动物例如羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、牛（母牛）、鹿、驴、大额牛、山羊、马、美洲驼、骡、猪、矮种马、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。如本文使用的“植物受试者”指来自植物界的活生物体。特别考虑的植物包括商品作物（即生长用于获利的作物）例如但不限于玉蜀黍、稻、小麦、大豆、大麦、高粱、粟、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、fonio、单粒小麦、硬粒小麦、马铃薯、咖啡、可可、木薯、茶、橡胶树、椰子树、油椰、甘蔗、甜菜、香蕉树、橙树、菠萝树、苹果树、梨树、柠檬树、橄榄树、花生树、四季豆、莴苣、番茄、胡萝卜、夏南瓜、花椰菜、油菜籽、麻风树、芥菜、荷荷巴(Jojoba)、亚麻、向日葵、绿藻、黄麻、棉花、大麻（或大麻（Cannabissativa）的其他品系）、卡诺拉(canola)或烟草。

如本申请自始至终使用的“生物体”指，任何具有共同边界的生活系统（例如动物、真菌、微生物或植物）、以及病毒（因为这些也是含有蛋白质的分离实体（‘具有共同边界的系统’））。特别考虑的生物体是受试者（参见上文），考虑的不是受试者的生物体包括非脊椎动物生物体如果蝇属物种或隐杆线虫属（Caenorhabditis）物种。还特别考虑的是微生物和/或病原性生物体。

如本文使用的“感染”指宿主生物体（一般为受试者）被寄生物或病原性物种（生物体）建群。感染性病原体或寄生物寻求使用宿主的资源以繁殖，常导致感染性疾病。“感染性疾病”在本文中用于指由带该疾病的生物体或受试者中或上存在的外部生物体（病原体）引起的任何类型的疾病。感染通常视为由微生物或微寄生物如病毒、朊病毒、细菌和类病毒引起，但较大的生物体如大寄生物和真菌也可以引起感染。可以引起感染的生物体在本文中被称为“病原体”（在它们引起疾病的情况下）和“寄生物”（在它们以宿主生物体为代价而获益、从而减少宿主生物体的生物学康健的情况下，甚至不存在明显疾病），并且包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生生物（例如疟原虫属（Plasmodium）、疫霉属（Phytophthora））和原生动物（例如疟原虫属、内阿米巴属（Entamoeba）、贾第虫属（Giardia）、弓形虫属（Toxoplasma）、隐孢子虫属（Cryptosporidium）、毛滴虫属（Trichomonas）、利什曼原虫属（Leishmania）、锥虫属（Trypanosoma））（微寄生物）和大寄生物例如蠕虫（例如线虫如蛔虫、丝虫、钩虫、蛲虫和鞭虫，或扁形虫如绦虫和吸虫），以及外寄生物例如蜱和螨虫。拟寄生物，即使宿主生物体失去生殖能力或杀死宿主生物体的寄生生物体，考虑在术语寄生物内。在分子可以直接施用于外寄生物而不通过宿主生物体的特定实施方案中，考虑外寄生物不包括在引起感染的寄生物的含义内。

注意，尽管感染性疾病通常用于动物、特别是哺乳动物、最特别是人受试者，但本文考虑感染性疾病同样应用于植物（尤其当提及生物体中的疾病时）。事实上，植物病原体也可以在植物中引起感染，并且包括但不限于真菌（例如子囊菌纲（Ascomycetes）、担子菌纲（Basidiomycetes）、卵菌纲（Oomycetes））、细菌、植原体（Phytoplasma）、螺原体（Spiroplasma）、病毒、线虫、原生动物和寄生植物。

如本申请中使用的“农害”或“植物农害”指对植物，特别是在农业中使用的植物，引起损害的生物体。注意，术语“植物农害”以农害靶向植物的意义使用，它不一定是该农害是植物物种的情况。事实上，农害尤其是动物（啮食或破坏植物的脊椎动物或无脊椎动物）、其他植物（作物杂草和寄生植物）、微生物和病毒。最特别地，农害是无脊椎动物（例如昆虫（包括农业农害昆虫，观赏植物的昆虫农害、林木的昆虫农害、人、动物或植物病原体的昆虫载体。例子包括但不限于蚜虫、毛虫、蝇、黄蜂等）、线虫（在土壤中自由生活或特别是寄生植物根的物种，例如根结线虫、大豆胞囊线虫和马铃薯胞囊线虫）、螨虫（例如蛛螨、跗线螨(thread-footed mite)和瘿螨）和腹足类（包括蛞蝓例如灰括蝓属物种(Deroceras spp.)、Milax spp.、Tandonia sp.、蛞蝓属物种（Limax spp.）、阿勇蛞蝓属物种(Arion spp.)和Veronicella spp.，和蜗牛例如大蜗牛属物种（Helix spp.）、Cernuella spp.、Thebaspp.、Cochlicella spp.、玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、琥珀螺属物种(Succineaspp.)、Ovachlamys spp.、Amphibulima spp.、Zachrysia spp.、巴蜗牛属物种(Bradybaenaspp.)和福寿螺属物种（Pomacea spp.））、病原性真菌（包括子囊菌纲（例如镰刀菌属物种（Fusarium spp.）、根串珠霉属物种（Thielaviopsis spp.）、轮枝孢属物种（Verticilliumspp.）、Magnaporthe spp.）、担子菌纲（例如丝核菌属物种（Rhizoctonia spp.）、层锈菌属物种（Phakospora spp.）、柄锈菌属（Puccinia spp.））、和真菌样卵菌纲（例如腐霉属物种（Pythium spp.）和疫霉属物种）、细菌（例如伯克霍尔德菌属物种（Burkholderia spp.）和变形菌门（Proteobacteria）例如黄单胞菌属物种（Xanthomonas spp.）和假单胞菌属物种（Pseudomonas spp.））、植原体、螺原体、病毒（例如烟草花叶病毒和花椰菜花叶病毒）、和原生动物。术语“农害”显示与感染相关的“病原体”和“寄生物”显著重叠，特别是对于微生物和病毒。然而，对于植物农害，以植物为食的外寄生物和（无脊椎）动物始终包括在该定义内。

“非感染性疾病”是并非感染性疾病的所有疾病，即不由病原体引起且不能从一个个体分享到另一个的那些疾病。非感染性疾病可以由环境、营养缺乏、生活方式选择或遗传继承引起，并且包括例如大多数形式的癌症、哮喘和心脏病。最特别考虑的非感染性疾病类别是由具有该疾病的生物体的自身蛋白质引起的那些生理学病症（例如通过异常表达或通过突变）。

如本申请中使用的，术语“抗药性”指药物在治愈疾病或状况中的有效性降低。特别地，它适用于病原体获得的抗性的情况下。当生物体对超过一种药物有抵抗力时，它被说成是多药抗性的。如本文使用的术语“抗生素抗性”是其中微生物能够在暴露于抗生素后存活的一类抗药性。为了实践中确定抗生素抗性，可以使用临床折点。抗生素折点是用于预测成功的抗生素治疗的最大MIC（最小抑制浓度，在温育后将抑制微生物的可见生长的抗微生物剂的最小浓度）阈值。在抗生素给药间隔过程中，具有等于或低于该阈值的MIC的生物体预期被（至少）抑制或杀死。换言之，如果抗生素对于给定生物体的MIC值高于该抗生素对于该给定微生物的折点值，则该微生物被说成是抗性的。临床折点通过欧洲药敏试验联合委员会（EUCAST）进行测试并监控，并且折点值可以在其站点找到。临床折点也通过美国的临床实验室标准化协会（CLSI）分开确定，被FDA认可。

药物抗性且特别是抗生素抗性可以是自然抗性（例如因为由药物靶向的蛋白质不存在于生物体中）或可以是获得的抗性（例如通过可以发生在药物所靶向的基因中的突变，或通过例如可以增加流出泵的活性从而使得药物（例如抗生素）从微生物生物体中去除的突变）。可替代地，抗性可以通过水平基因转移而获得，意思是（对于抗生素）对特定抗生素具有抗性的微生物生物体与对该抗生素敏感的微生物生物体（来自相同或不同物种）交换遗传信息，使得敏感生物体具有抗性）。

如本文使用的，“生物膜”是微生物聚集体，其中细胞彼此粘附和/或粘附到表面。这些粘附细胞常常嵌入自身产生的基质内，基质一般由细胞外DNA、蛋白质和多糖组成，具有多种构型。生物膜可以含有许多不同类型的微生物，例如细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。然而，也可以出现单一物种生物膜。由于膜的致密和受保护的环境，在生物膜中生活的微生物通常具有与相同物种的自由漂浮（浮游生物）微生物显著不同的性质。例如，因为致密的细胞外基质和细胞外层保护群落的内部，故常观察到对去污剂和抗生素增加的抗性。生物膜形成是植入外科常遇到的问题，因为生物膜可以在植入装置的惰性表面上形成，植入装置例如导管、支架、人工心脏瓣膜和宫内避孕器。

如本文使用的术语“序列同一性”指序列在比较窗上在核苷酸-核苷酸基础或氨基酸-氨基酸基础上是相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过下述进行计算：在比较窗上比较两个最佳比对的序列，确定在其上相同核酸碱基（例如A、T、C、G、I）或相同氨基酸残基（例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met）在两个序列中出现的位置的数目，以获得匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目（即窗口大小），并且将结果乘以100，以获得序列同一性百分比。为了本发明的目的，“序列同一性”应理解为意指由DNASIS计算机程序（用于windows的版本2.5；可从Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，Calif.，USA获得）计算的“匹配百分比”，其中使用如伴随该软件的参考手册中使用的标准缺省值。“相似性”指相同或构成保守置换的氨基酸的数目百分比。相似性可以使用序列比较程序例如GAP（Deveraux等人1984，NucleicAcids Research12，387-395）进行确定。以这种方式，与本文述及的那些序列具有相似或实质上不同长度的序列可以通过将空位插入比对中，而进行比较，所述空位可以例如通过GAP使用的比较算法进行确定。

如本文使用的“微阵列”指在固体基底上的2D阵列。它可以用于多重测定，即在单一测定试验中同时测量多重分析物（高达数打或更多）。它可以是利用微流控的芯片实验室装置。作为固体基底，一般使用玻璃载玻片或硅薄层凝胶，但同样可以使用其他材料（例如硝酸纤维素、塑料、……）。因为本文给出的分子与蛋白质结合，所以由分子涂布的微阵列也可以被称为蛋白质微阵列、蛋白质结合微阵列或蛋白质芯片。蛋白质微阵列一般用于生物医学应用中，以测定生物样品中的蛋白质的存在和/或量（称为相对定量）。一般地，在本文描述的微阵列中，本申请的分子用作捕获分子被点在微阵列上或在微阵列上合成。

分子的结构

一般结构

本文提供的分子可以用下式进行描述：

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、H、G和Q；更特别地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸；最特别地选自R、K和P的1–4个氨基酸；

-每个Z_i是独立地选择的接头，并且Z_n是接头或不存在。

该式因此涵盖下述结构：

X₁-Y₁-X₂-Z₁（即n=1），

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂（即n=2），

X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂-X₅-Y₃-X₆-Z₃（即n=3），

Y_i部分：聚集成核区

这些分子中的编号Y_i部分是β-聚集诱导区。即，这些区域负责诱导分子的聚集，特别是与靶蛋白质接触时。此处，我们将更详细地解释这些区域的序列限制性。

对全长蛋白质的聚集动力学的突变研究揭示，在聚集和理化性质例如β-片层倾向、疏水性和电荷之间存在简单相关性。这促使了计算机算法的开发，所述算法可以鉴定蛋白质的氨基酸序列中的聚集倾向区。其中之一是Dobson等人（Pawar等人，J Mol Biol350：379–392（2005））的Zyggregator算法，其通过比较给定氨基酸序列的聚集倾向得分与针对一组相似长度的序列计算的平均倾向，而鉴定聚集倾向序列。另一方面，统计力学算法TANGO（Fernandez-Escamilla等人，Nat Biotechnol22:1302–1306（2004））平衡上文提及的理化参数，补充了氨基酸完全埋在聚集状态中的假定：这意味着它变得完全去溶剂化且熵受限。TANGO由输入序列生成大量片段样品，针对这些片段考虑竞争性结构倾向，例如螺旋或发夹形成。所有片段随后以全局分配总和(global partition sum)进行平衡，这使得可以鉴定占优势地形成聚集体的序列区。TANGO算法对于一组176个实验验证的肽具有超过90%的准确度（Fernandez-Escamilla等人，Nat Biotechnol22:1302–1306（2004））。重要的是，Zyggregator算法和TANGO对于肽和变性蛋白质均表现良好。

对于球状蛋白质，部分折叠的分子可以重折叠为天然状态或错折叠成聚集状态。因此，两个反应处于竞争中，并且动力学的精确理解是预测在折叠或重折叠/聚集方面的最终结果必需的。因此，在本发明中，重要的是鉴定动力学上有利于聚集诱导的序列。

最特别地，序列是非淀粉样蛋白β-聚集序列（有时被称为无定形β-聚集序列）。淀粉样蛋白和非淀粉样蛋白β-聚集在高级结构、聚集动力学和适于聚集的蛋白质序列方面不同（Rousseau等人，Current Opinion inStructural Biology16:118–126，2006）。比较由TANGO或Zyggregator预测的β-聚集的序列空间与淀粉样变性的序列空间（例如来自实验研究，例如Lopez de la Paz和Serrano，PNAS101：87–92，2004），揭示在这两个过程之间的相似性以及有意义的差异。事实上，因为淀粉样蛋白形成和无定形交叉-β聚集均要求与β-链构象相容的氨基酸组成，所以可以预期序列空间上的重叠。然而，无定形交叉-β聚集物的结构不清楚明确、且似乎特征在于高灵活度。另一方面，淀粉样蛋白纤维的结构是准晶体的。因此，氨基酸偏好性在淀粉样蛋白纤维中比在无定形交叉-β聚集体中具有大得多的位置特异性。考虑序列空间中的重叠，特定实施方案预计，至少一个Yi部分的β-聚集序列至少适于无定形β-聚集。根据这些实施方案，考虑无定形β-聚集，并且还可以发生或不发生淀粉样蛋白聚集–这并不重要，只要至少存在非淀粉样蛋白β-聚集即可。

由于较不严格的构象要求，β-聚集一般比淀粉样变性快得多，尽管也已观察到快速的淀粉样变性。因为β-聚集体常被观察到是纤维形成途径上的前体，所以这些前体聚集体的稳定性强烈影响淀粉样变性的动力学。如在酵母朊病毒蛋白质中观察到的，极性的淀粉样生成序列具有低得多的β-聚集倾向，并且因此对于淀粉样变性的动力学更有利得多。总之，无定形交叉-β聚集和淀粉样变性可以共同出现，并且两个过程的稳定性和动力学由满足两个过程的结构需求的程度来决定。

因此，为了动力学有利于聚集的诱导，期望不仅仅使用β-聚集序列，而使用非淀粉样蛋白β-聚集序列。相应地，在特定实施方案中，至少一个Y_i区不是淀粉样蛋白β-聚集序列。这样可以实现靶蛋白质的快速聚集。一般高度疏水性序列具有形成无定形交叉-β聚集的强趋势，而由于空间约束而不形成淀粉样蛋白纤维。另一方面，一般更极性的序列更可能形成淀粉样蛋白纤维。在这两个极端之间，可能观察到整个行为谱。特别地，Tango算法非常适合于鉴定具有高聚集倾向和低淀粉样蛋白倾向的β-聚集序列。事实上，该算法提供分离淀粉样蛋白倾向和β-聚集倾向的分数。

Tango算法已在其他地方更详细地描述（特别是Fernandez-Escamilla等人，Nat.Biotechnol.22:1302-1306，2004，尤其是在第1305和1306页的方法部分，特别引入本文作为参考。关于用于TANGO算法校正和测试的方法和数据集的更多细节，还参见相同文章的补充备注1和2；更多背景也可以在WO2007071789中找到）。简言之，为了预测肽的自结合区，TANGO简单地计算相空间(phase-space)的分配函数(partition function)。为了估计特定氨基酸序列的聚集趋势，作出下述假定：（i）在有序β-片层聚集体中，主要二级结构是β-链。（ii）参与聚集过程的区域是完全被掩埋的，由此付出代价——全部的溶剂化收益和成本、全部的熵，优化其H-键势能(H-bond potential)（即，在聚集体中形成的H-键的数目与被受体补偿的供体基团的数目有关。过量供体或受体是不能满足的）。（iii）在选择窗中的互补电荷建立有利的静电相互作用，而在窗内以及窗外的肽的总体净电荷不利于聚集。TANGO可以在万维网上访问。

一个序列区段的高Tango得分一般对应于具有高（和动力学有利的）β-聚集倾向的序列。因此，不是太极性和相当疏水的“高tango得分序列”的序列空间定义理想的Y_i（或β-聚集诱导、聚集成核）部分。

当在根据上文的式的分子中，每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基时，获得最佳聚集性质。（但应提及，也可以存在R、K、D、E的2个残基，如果它们是一个带正电荷的残基和一个带负电荷的残基）。根据非常特定的实施方案，Yi区可以含有正好2个荷电残基（选自R、K、D、E），只要Yi区的净电荷是零。然而，更特别地，Yi区不含任何荷电残基（或关于这一点，脯氨酸）。

根据该要求，Yi区段中至少50%的氨基酸是疏水性氨基酸，即是选自I、L、V、F、Y、W、H、M、T、K、A、C和G的氨基酸。根据进一步特定实施方案，至少60%的氨基酸是疏水性氨基酸，至少2/3的氨基酸是疏水性氨基酸，至少70%是疏水性氨基酸，至少75%是疏水性氨基酸，至少80%是疏水性氨基酸，至少85%是疏水性氨基酸，至少90%是疏水性氨基酸，至少95%是疏水性氨基酸，或甚至所有氨基酸都是疏水性氨基酸。可替代地，可以说，Yi区段中的至少3个氨基酸是疏水性氨基酸，特别地至少4个是疏水性氨基酸，更特别地至少5个是疏水性氨基酸，至少6个或甚至超过6个是疏水性氨基酸。

列出的疏水性氨基酸中一些更佳地适合于诱导β-聚集（这是为何存在对序列的另外要求的原因）。根据特定实施方案，疏水性氨基酸不包含G（因为侧链太小）。根据其他特定实施方案，疏水性氨基酸不包含C（这是因为，这可能因可能的二硫桥形成而使事情复杂化）。根据另外其他特定实施方案，疏水性氨基酸不包含K（考虑到该残基的正电荷）。根据另外其他特定实施方案，疏水性氨基酸不包含H（考虑到该残基的部分正电荷）。相应地，特定实施方案涉及，Y_i区段中的疏水性氨基酸选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。

在每个Y_i区段中，存在选自I、L、V和F的至少一个残基（脂肪族残基或F），最特别地存在超过一个此类残基。如果Y_i区段中仅一个残基是I、L、V或F残基，则该区段中的至少一个残基选自Y、W、M、T或A。更特别地，在这些实施方案中，至少两个残基选自Y、W、M、T或A。根据非常特定的实施方案，Y_i区段中的至少两个残基选自I、L、V、F、Y和W（即，来自脂肪族或非荷电芳香族残基）。根据其他特定实施方案，Y_i区段中的至少三个残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。根据进一步特定实施方案，Y_i区段中的至少四个残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。根据其他特定实施方案，Y_i区段中至少40%的残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。根据进一步特定实施方案，Y_i区段中至少50%的残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。根据再进一步特定实施方案，Y_i区段中至少50%的残基选自I、L、V、F和Y（即，是脂肪族残基或F或Y）。根据甚至进一步特定实施方案，Y_i区段中至少50%的残基选自I、L、V和F（即，脂肪族或F残基）。根据再甚至进一步特定实施方案，Y_i区段中至少50%的残基是脂肪族残基，即选自I、L和V。根据可替代的特定实施方案，Y_i区段中至少60%的残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A。根据再进一步特定实施方案，Y_i区段中至少60%的残基选自I、L、V、F和Y（即，是脂肪族残基或F或Y）。根据甚至进一步特定实施方案，Y_i区段中至少60%的残基选自I、L、V和F（即，是脂肪族或F残基）。根据再甚至进一步特定实施方案，Y_i区段中至少60%的残基是脂肪族残基，即选自I、L和V。根据再进一步可替代实施方案，至少三分之二的残基选自I、L、V、F、Y、W、M、T和A；或特别选自I、L、V、F和Y；或更特别选自I、L、V和F（即，是脂肪族或F残基）；或Yi区段中至少三分之二的残基是脂肪族残基（即选自I、L和V）。可替代地，可以说，Yi区段中的至少3个氨基酸选自上述残基，特别地至少4个氨基酸、更特别地至少5个氨基酸、至少6个或甚至超过6个氨基酸。根据进一步特定实施方案，Yi区段中的至少3个氨基酸选自I、L、V或F，特别地至少4个氨基酸是脂肪族残基或F，更特别地至少5个氨基酸是I、L、V或F残基。根据再甚至进一步的实施方案，Yi区段中的至少3个氨基酸是脂肪族残基，Yi区段中的至少4个氨基酸是脂肪族残基，或Yi区段中的至少5个残基是脂肪族残基。

根据其他特定实施方案，某些疏水性残基的数目在Y_i区段中是有限制的。例如在（即，至少一个、最高达每个）Y_i区段中，存在不超过一个C残基。根据其他特定实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个H残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个G残基，特别地存在不超过一个G残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个T残基，特别地存在不超过一个T残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个M残基，特别地存在不超过一个M残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个W残基，特别地存在不超过一个W残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个A残基，特别地存在不超过一个A残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个Y残基，特别地存在不超过一个Y残基。注意，如对于其他实施方案一样，这些实施方案不是排他性的。即，这些限制中的2个或更多个的组合可以应用于给定Y_i区段。

不言而喻的，当存在不超过一定数目的特定残基时，总可以的是，无该特定残基存在。

荷电氨基酸以及脯氨酸一般减小给定Y_i区段的β-聚集潜力。尽管一个荷电残基或脯氨酸、或两个具有相反电荷的荷电氨基酸（根据特定实施方案）一般可以被耐受，但Y_i区段不含P、R、K、D和E残基。可替代地，该区段含有不超过一个P、R、K、D或E残基（即，不超过一个选自P、R、K、D和E的残基）。根据非常特定的实施方案，区段可以含有一个K残基，但不含P、R、D或E残基（考虑到赖氨酸残基的疏水性质）。根据特定实施方案，在Y_i区中不存在P、R、K、D、E残基。根据进一步特定实施方案，在Y_i区段中不存在P、R、K、D、E或H残基。这是因为H残基可以是部分带正电荷的，并且中性Y_i区一般是优选的。

特别考虑，至少一个（和高达每个）Y_i区携带1的最大电荷，并且更特别地不携带电荷。甚至更特别地，考虑荷电残基的数目不高于一，最特别地，在至少一个（和特别地每个）Y_i区中不存在荷电残基。

根据其他非排他性实施方案，Y_i区段，即使当不含荷电残基时，也不含超过75%的极性非荷电残基，即选自Y、W、T、Q、S、N和H的残基（C在此处不视为极性残基，并且H不视为荷电残基）。更特别地，它不含超过67%的极性非荷电残基，甚至更特别地，它不含超过60%的极性非荷电残基（或甚至小于60%的极性非荷电残基）。换言之，即使区段具有多个Y、W或T残基（其为极性、非荷电和疏水性的），仍需要足够的非极性残基。根据进一步特定实施方案，Y_i区段不含超过50%的极性非荷电残基。根据甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段不含超过40%的极性非荷电残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段不含超过三分之一的极性非荷电残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段不含超过25%的极性非荷电残基。

非疏水性、极性非荷电残基（即S、N和Q）可以存在于Y_i区中，但它们的数目优选是有限的。根据其他具体实施方案，存在不超过一个Q残基。根据其他具体实施方案，存在不超过一个N残基。根据可替代实施方案，在Y_i区段中存在不超过一个或两个S残基，特别地存在不超过一个S残基。

非芳香族、极性非荷电残基（即S、N、T和Q）可以存在于Y_i区中，但特别考虑它们彼此不相邻（即不存在2个连续的非芳香族极性非荷电残基）。

如由上文显而易见的，由于特定原因，限制特定残基的存在可以是有利的。限制残基组的和也可以是有利的。根据特定实施方案，Yi区段中的残基不含超过60%的选自C、M、N、Q和W的残基。根据进一步特定实施方案，Yi区段中的残基不含超过50%的选自C、M、N、Q和W的残基。根据进一步特定实施方案，Yi区段中的残基不含超过40%的选自C、M、N、Q和W的残基。根据甚至进一步的特定实施方案，Yi区段中的残基不含超过三分之一的选自C、M、N、Q和W的残基。根据特定实施方案，Yi区段中的残基不含超过25%的选自C、M、N、Q和W的残基。

根据另外其他特定实施方案，Y_i区段，即使当不含荷电残基或脯氨酸时，也含有小于75%的除V外的小残基（即，选自A、T、C、G、S、N），更特别地小于67%的除V外的小残基，甚至更特别地小于60%的除V外的小残基。换言之，即使区段具有多个T和A残基，仍需要足够的大疏水性残基。根据甚至进一步的特定实施方案，Y_i区中不超过50%（但包括50%）的残基是除V外的小残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区中不超过40%的残基是除V外的小残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区中不超过三分之一（即33,33…%）的残基是除V外的小残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区中不超过25%的残基是除V外的小残基。

特别地，考虑极小残基的数目在Y_i区段中是有限的。尽管当C不参与二硫桥形成时C可以视为极小残基，但特别考虑极小残基是A、G和S残基。根据特定实施方案，Y_i区段中不超过50%的残基是A、G和S残基。根据进一步特定实施方案，Y_i区段中不超过40%的残基选自A、G和S残基。根据甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段中不超过三分之一的残基选自A、G和S残基。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段中不超过25%的残基选自A、G和S残基。

可替代或另外地，极小残基的数目可以是有限的。这对于非极性A和G残基是特别正确的。根据特定实施方案，Y_i区段中A和G残基的总数目不超过4。根据进一步特定实施方案，Y_i区段中A和G残基的总数目不超过3。根据甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段中A和G残基的总和不超过2。根据再甚至进一步的特定实施方案，Y_i区段中A和G残基的总和不超过一。

为了实现序列特异性聚集，考虑选择用于诱导聚集的Yi部分具有足够的序列复杂性。这意指，具有太多的特定氨基酸的序列并不特别适于序列特异性聚集。例如，多亮氨酸区段一般不实现序列特异性聚集（即使它是足够疏水性的且可能聚集）。因此，根据特定实施方案，Yi区段中存在不超过3个连续的相同氨基酸。根据甚至更特定的实施方案，Yi区段中存在不超过2个连续的相同氨基酸。根据具体实施方案，Yi区段中仅脂肪族氨基酸可以与相同氨基酸相邻。即，根据这些实施方案，Y_i区段中可以存在仅2个相邻的（连续的）I、L或V氨基酸。根据进一步特定实施方案，Yi区中可以存在不超过3个连续的相同脂肪族氨基酸。根据甚至进一步的特定实施方案，Yi区中可以存在不超过2个连续的相同脂肪族氨基酸。因此，根据这些实施方案，仅两个相同脂肪族氨基酸可以在Yi区段中彼此相邻。

根据可替代但非排他性实施方案，一种非脂肪族氨基酸在Yi区段中存在不超过3次（即，对于非脂肪族残基，相同氨基酸的数目在Yi区段中限制于3）。根据进一步特定实施方案，一种非脂肪族氨基酸在Yi区段中存在不超过两次（或2次）。根据进一步特定实施方案，一种非脂肪族氨基酸在Yi区段中存在不超过1次。根据可替代实施方案，一种非脂肪族氨基酸在Yi区段中存在不超过3次。根据进一步实施方案，一种非脂肪族氨基酸在Yi区段中存在不超过2次。

根据其他特定实施方案，特定氨基酸不构成Yi区段中超过50%的残基（即不超过一半的Yi区段由特定氨基酸组成）。根据进一步特定实施方案，一种氨基酸不构成Yi区段中超过40%的残基。根据甚至进一步的特定实施方案，一种氨基酸不构成Yi区段中超过三分之一的残基。

根据另外其他的特定实施方案，Yi区段不由二氨基酸重复组成，或甚至不含二氨基酸重复。“二氨基酸重复”意指，两个不同残基的三个或更多个、或甚至两个或更多个重复。根据进一步特定实施方案，Yi区段不由三氨基酸重复组成，或甚至不含三氨基酸重复。“三氨基酸重复”意指三个残基的三个或更多个、或甚至两个或更多个重复，所述三个残基中的至少两个是不同的。例如，虽然异亮氨酸和色氨酸在Yi区中是完全可接受的，但仅由IW或IIW重复构成的Yi区也不特别适合于序列特异性聚集。注意，序列特异性聚集不排除这些序列中的任何，但优选使用更复杂的序列以实现特异性聚集。

聚集区段的长度一般是所需特异性与疏水性序列的合成成本和容易性之间的权衡。如图2中所示，为了在给定生物体的蛋白质组内是独特的，序列无需非常长。例如，在人中，在蛋白质中存在的5个氨基酸长度的60%序列是独特的（即此类序列中仅40%出现超过一次）。对于具有较不复杂的基因组的生物体例如大肠杆菌，由基因组编码的5个氨基酸的序列中超过80%的是独特的。由附图可以看出，特异性的增加趋向平缓，从而很少需要使用极长序列来实现特异性。根据特定实施方案，Yi区含有至少5个残基。根据再进一步的特定实施方案，Yi区含有至少6个残基。根据其他非排他性特定实施方案，Yi区含有至多12个残基。根据再进一步的实施方案，Yi区含有至多11个残基。根据甚至进一步具体实施方案，Yi区含有至多10个残基。

在一些情况下，可能期望，使用在给定生物体中并非独特的序列。例如，这适用于针对（非自身）病原体的应用中，其中抑制病原性生物体的生长和/或杀死病原性生物体比靶向仅一种特定蛋白质更重要。如由附图可见的，β-聚集区段一般在这些实施方案中更短，使得可以靶向更多蛋白质。

为了避免不需要的Yi区段延伸，根据特定实施方案，考虑Yi区段的N和/或C末端残基是特别适于β-聚集的残基，特别是选自I、L、V、F、Y、W、A、M和T的残基。根据进一步特定实施方案，Yi区段的N和/或C末端残基（即选自N和C末端残基的至少一个，或第一个和/或最后一个残基）选自I、L、V、F、Y和W。根据进一步特定实施方案，Yi区段的N和/或C末端残基选自I、L、V、F和Y。根据甚至进一步的特定实施方案，Yi区段的N和/或C末端残基选自I、L、V和F。根据再甚至进一步的特定实施方案，Yi区段的N和/或C末端残基选自I、L和V（即，是脂肪族残基）。根据进一步特定实施方案，这些限制应用于Yi区段的N和C末端残基两者。

因为一个目的是提供能够特异地，尤其是以序列依赖性方式，下调蛋白质的分子，所以特别考虑的是这样的分子，其中分子中的至少一个Y_i是4-17（特别是4-16或4-15）个氨基酸的区段，该区段相同于蛋白质中天然存在的连续区段。换言之，蛋白质中的该连续区段是Yi部分的该关连区。根据进一步具体方面，这适用于分子中的一个以上Y_i，特别是分子中的两个Y_i或至少两个Y_i，更特别地分子中的所有Y_i。然而，根据非常特定的实施方案，Yi不同于蛋白质中天然存在的区段。这例如考虑用于具有人工标签的蛋白质，其中Yi与人工标签中的序列相同。此类标签可以是有用的，因为人工序列设计允许更自由地确定序列的聚集倾向。这样，使得可以靶向不具有明显的核心聚集区的蛋白质。

因为至少一个Y_i区段赋予特异性，所以在一些实施方案中，特别考虑，该区段不对应于一个或两个氨基酸的重复区段（其部分）（例如多亮氨酸区段或交替的亮氨酸和缬氨酸）。对于其中n=1的实施方案，这尤其如此。根据进一步特定实施方案，Y_i区段在其序列中含有至少3种不同氨基酸。

然而，根据特定实施方案，至少一个Y_i相同于蛋白质中天然存在的连续区段，而相同分子中的至少一个其他Y_i不同于在其基因组中编码靶蛋白质的生物体中的蛋白质中的区段。后面一种Yi一般是‘加强子’序列，即已知具有极高聚集趋势的序列。该序列可以改善聚集的动力学，或确保靶蛋白质的聚集在更低浓度发生/起始。此类序列可以是合成的，或可以源自另外的生物体/物种中存在的序列（即相同于或高度类似于该序列区段）。

如果考虑一种蛋白质的特异性靶向，则该至少一个在蛋白质中天然存在的4–15个连续氨基酸的区段应对基因组编码该蛋白质的生物体（或物种）中的所述蛋白质具有独特性（即，应是所述生物体/物种的蛋白质组中独特的），以确保确实地仅靶向生物体中的一种蛋白质。独特性一般仅在特定基因组（即，其中存在待下调的蛋白质的生物体的基因组）中是必需的。事实上，如果序列存在于不待施用干扰物的另一生物体中（或在该另外的生物体中干扰物不能达到其靶），这并不重要。这也适用于当靶向不同生物体（一般为微生物或病原性生物体）中的蛋白质并不重要的情况。

有时，特别当靶向病原体或治疗或稳定感染时，考虑可以靶向超过一种蛋白质。在这些情况下，蛋白质序列无需在生物体的基因组中是独特的。然而，它可以仍对于生物体或物种是独特的。这可以考虑用于如下情况：当本文描述的分子同时施用于超过一个不同物种（例如微生物的混合物），而仅在一个物种中需要下调蛋白质时（例如以靶向病原性物种，而不干扰非病原性或有益生物体。注意，这也例如适用于当将例如靶向抗微生物蛋白质的干扰物分子施用于人受试者时：在此类情况下，Y_i部分的序列不应相同于人蛋白质的序列，或至少不同于干扰物可以接触到的人蛋白质）。根据进一步特定实施方案，序列是对于蛋白质独特的并对于生物体/物种独特的。

代替物种，上述考虑也可应用于生物体的属、科、目或纲，但是序列保守性和发现独特序列的可能性随着分类学等级的增加而降低。

在其中n是至少二的实施方案中，存在的至少两个Y_i部分可以是相同的（即靶向相同蛋白质，本文有时称为‘串联重复肽’），可以是不同的但存在于相同蛋白质中（以不同方式靶向相同蛋白质，即‘biaggretopic’(双聚集表位)干扰物，其中靶向至少两个不同‘aggretopes’(聚集表位)或聚集区），可以是不同的且存在于不同蛋白质中（以靶向生物体中的一种以上蛋白质（即真正的双特异性干扰物），或靶向不同生物体的蛋白质（如果干扰物施用于超过一种（微）生物体或与超过一种（微）生物体接触）。注意，“施用于生物体”可以是间接施用。例如，在病原体的情况下，考虑将干扰物施用于宿主生物体（一般为受试者，植物或动物受试者），以靶向病原性生物体。因为在这些情况下干扰物分子将含有病原性生物体中存在的至少一种聚集序列、并且旨在聚集其中存在该序列的蛋白质，所以对于技术人员明确的是，这应解释为“将分子施用于病原性生物体”–在这点上，重要的是接触（达到靶）。

一般地，为了实现特异性靶向，考虑在Yi区和目的蛋白质中的序列区段之间的完全匹配。然而，在一些情况下，考虑可以使用不同但紧密相关的序列，即具有一个或两个置换的序列。为了维持特异性，考虑对于非保守置换，对于小于6个氨基酸的Yi区段，仅一个氨基酸差异是耐受的。对于至少6个氨基酸（特别是至少7个或至少8个氨基酸）的序列，可以置换一个或两个氨基酸。可替代地，在Yi和目的蛋白质中的聚集区段之间的序列同一性是至少70%、至少75%、特别是至少80%、至少85%、至少90%或甚至更高。在保守置换的情况下，在Yi和目的蛋白质中的聚集区段之间的序列相似性是至少70%、至少75%、特别是至少80%、至少85%、至少90%或甚至更高。

如技术人员应认识到的，制备（特别是非保守）置换可以导致改变的特异性（即，使得该区段相同于生物体中的另一种蛋白质、或干扰物可以接触到的另一种生物体中的一种蛋白质），因此如果改变的靶向是不期望的，则应当检查这是否发生。（在一些情况下，靶向超过一种蛋白质可能是期望的，还参见下文）。

保守置换是氨基酸由其侧链具有相似生物化学性质（例如是脂肪族，是芳香族，是带正电荷的，……）的其他氨基酸置换，并且是技术人员众所周知的。非保守置换是氨基酸由其侧链不具有相似生物化学性质的其他氨基酸置换（例如疏水性替换为极性残基）。保守置换一般导致不再相同但仍高度相似的序列。

引入置换的原因可以不同。根据特定实施方案，置换是用守门残基，特别是选自R、K、E、D、P、N、S、A、H、G、Q，更特别是选自R、K、E、D和P，最特别是选自R、K和P的残基进行的置换。这可以考虑用于改善可溶性或减少自聚集（通过‘破坏’疏水性Yi区的β-片层形成潜力）、或减少特异性同时维持聚集（这在实施例3中例示）。尽管此类置换一般而言降低特异性，但在一些实施方案中，这可以被考虑，以导致聚集诱导序列更容易被接近（通过‘打开’疏水区）。这特别适用于其中更欢迎聚集而特异性的实施方案（例如在抗微生物应用中）。

根据可替代实施方案，置换是保守置换。当考虑下调蛋白质家族、并且蛋白质之间共享保守但并不同的序列基序时，可以考虑这点。在此类情况下，这些紧密相关蛋白质的聚集可以使用共有序列基序来实现（即，相似但并不同的序列，其中‘相似的’用于序列比对的情形中）。然而，当序列匹配不是100%时，聚集可能较不有效。

考虑置换的另一个原因是增加序列的固有聚集倾向。例如，可以考虑将特定残基替换为具有高β-片层倾向或聚集潜力的残基。这不一定是保守置换。测定β-片层倾向或聚集潜力的方法是本领域众所周知的。例如，特定残基的β-片层倾向可以考虑Chou-Fasman参数（Chen等人，BMC Bioinformatics7（Suppl4）：S14，2006）进行测定。具有低于100的P（b-片层）得分的一个或多个残基可以替换为具有P（b-片层）>100得分的残基。Chou-Fasman方法中的高分β-片层残基是（以递减次序）：缬氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸。特别考虑用缬氨酸或异亮氨酸的置换，以增加β-片层形成潜力。当然，应始终检查特异性，并且此处再次，置换尤其可以考虑用于其中比特异性更欢迎聚集的应用。

如果Yi部分需要相同于蛋白质中存在的区段，则特异性聚集诱导序列可以在蛋白质序列中目视鉴定（使用上文的指导），或使用特异性算法以鉴定满足这些需要的序列区段。使用相同或其他方法或算法，可以检查序列是否同样在其他蛋白质中出现（或在其他生物体的基因组中编码）。

鉴定蛋白质中的此类序列的一种特别容易的方法是，通过首先使用β-聚集预测算法（优选考虑生物物理学参数），并且在上述序列限制的基础上选择最适当的序列。Tango和Zyggregator已作为此类算法的例子列出，但更多的算法已在本领域得到描述，包括但不限于下述文献描述的那些：

Bryan等人，PLoS Comput Biol.5（3）:e1000333，2009；Caflish，Curr Opin ChemBiol.10（5）:437-44，2006；Conchillo-Sole等人，BMC Bioinformatics8:65，2007；Galzitskaya等人，PLoS Comput Biol.29；2（12）:e177，2006；Goldschmidt等人，PNAS107（8）:3487-92，2010；Maurer-Stroh等人，Nat Methods7（3）:237-42，2010；Rojas Quijano等人，Biochemistry45（14）:4638-52，2006；Saiki等人，Biochem Biophys Res Commun343（4）:1262-71，2006；Sanchez de Groot等人，BMC Struct Biol5:18，2005；Tartaglia等人，Protein Sci.14（10）:2723-34，2005；Tartaglia等人，J Mol Biol.380（2）:425-36，2008；Thompson等人，PNAS103（11）:4074-8，2006；Trovato等人，Protein Eng Des Sel.20（10）:521-3，2007；Yoon和Welsh，Protein Sci.13（8）:2149-60，2004；Zibaee等人，ProteinSci.16（5）:906-18，2007。注意，这些中的许多主要涉及淀粉样蛋白聚集序列，而不仅仅用于无定形β-聚集。如先前解释的，两种聚集形式的序列空间重叠（Rousseau等人，CurrentOpinion in Structural Biology16:118–126，2006），并且可以考虑两种聚集形式，只要反应的动力学和条件有利于目的蛋白质的聚集即可。然而，典型地，此类算法也可以鉴定未达成本文定义的Yi序列限制的极性区段（例如酵母朊病毒蛋白质中存在的那些）。

X_2i-1和X_2i部分：守门残基

在本文描述的干扰物分子中，聚集诱导序列在两侧面上侧接具有低β-聚集潜力的1–4个特异性氨基酸（X_i部分）。这些有时被称为守门残基（Pedersen等人，J Mol Biol341：575–588，2004），并且在抑制干扰物分子自聚集（特别在与靶蛋白质接触前）中是必需的。

在蛋白质的天然状态中，聚集通常通过在聚集序列区段侧翼上天然存在的荷电残基以及例如脯氨酸和甘氨酸抑制或阻止。这些有效充当守门残基，即，所述残基不一定稳定天然状态，但通过例如立体或静电碰撞而阻断不想要的错折叠或聚集状态的形成。也已几次报道，在聚集倾向序列中荷电残基、脯氨酸或甘氨酸的引入减少聚集。脯氨酸和甘氨酸的聚集对抗性质主要源于它们的结构破坏性质。理想地，荷电残基在阻止聚集方面也是非常有效的，因为在自装配时生成的巨大斥力。有趣的是，在自然界中，精氨酸和赖氨酸在强聚集序列侧翼上优于谷氨酸和天冬氨酸（Rousseau等人，J Mol Biol355:1037–1047，2006）。关于该优先的原因可能是除了电荷外，精氨酸和赖氨酸还具有大得多的构象熵，使得将其固定在密堆的聚集体中代价非常高。

在WO2007071789申请中，陈述了此类守门者减少聚集倾向。为了优化干扰物与给定靶蛋白质的共聚集，在干扰物中包括的靶蛋白质的自结合区可以被突变，使得守门残基被替换为聚集促进残基。换言之，守门者的存在被视为是不期望的。

目前，令人惊讶地证实，对于构成Y_i部分的强β-聚集区，用守门者（即两个编号的X部分）侧接它们确实减少其自聚集倾向，但基本上不干扰其诱导全长蛋白质聚集的能力。一方面，令人惊讶的是，尽管高疏水性和固有聚集倾向，这些分子仍保持在溶解状态中；另一方面，在分子中提供的守门者的作用并不阻止（全长）蛋白质与分子的共聚集。该独特的特点组合使得本文提供的分子特别适合于实现诱导的蛋白质聚集。

这些守门残基特别选自R、K、E、D、P、N、S、H、G和Q残基。还可以使用丙氨酸残基，但因为其也可以存在于Yi部分中，所以特别考虑如本文使用的X部分不只由A残基组成。更特别地，考虑仅当X部分(moiety)的另一部分是选自R、K、P、D或E的至少一个残基时，使用A残基作为守门者。

注意，除了G和P外，这些都是极性残基。G和P残基是良好守门者，这是因为其具有特异性侧链结构（脯氨酸）或其缺乏特异性侧链结构（甘氨酸）。尽管S、H、N和Q是极性残基，但它们以低数目可以耐受在β-聚集区段中（参见上文）。类似的考虑适用于G残基。

根据特定实施方案，侧翼X部分中的残基是在这些侧翼部分之间的Y_i部分中不存在的残基。

在这些情况下，X部分一般是选自R、K、E、D、P和H的1–4个氨基酸。更特别地，它们是选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。甚至更特别地，它们选自R、D和P。注意，P保留在守门者的选项中，因为它是非常有效的β片层结构的破坏者。然而，根据特定实施方案，尤其当n是1时，P不考虑作为守门者。

通常，一个或两个氨基酸足以破坏β-片层，并且使分子保持在溶解状态中。较短的X部分在合成容易性和成本方面是有利的，同时在其‘守门’功能上，即在界定和/或呈递疏水性Y部分方面，是有效的。相应地，在一些特定实施方案中，每个X_2i-1和X_2i是1或2个氨基酸（其可以彼此独立地选择）。

类似地，在电荷上受限的肽可以促进与目的蛋白质的相互作用：在仍提供H键的可能性的同时，静电排斥的危险被减少。因此，根据可替代但非排他性实施方案，每个X_2i-1和X_2i具有不超过2的总电荷。可替代地，两个X部分中的氨基酸总数目是5或更少，特别是4或更少。可替代的实施方案提供，围绕疏水性Y区的两个X部分的总电荷小于5，特别是4或更少。该段落中的实施方案最特别考虑用于其中n是1的分子或其中n是2的分子。

因为特别考虑Yi部分不含荷电残基，所以当n是1时，分子的总电荷一般不高于5，并且当n是2时，不高于10。对于其中n是2的分子，特别考虑分子的总电荷是2–10，更特别是2-8，更特别是4-8，甚至更特别是2–6（例如3、4、5），4–6，例如4、5或6。特别考虑电荷在分子中或多或少平均分布，即所有X部分都具有相似电荷（换句话说：分子中含有的X部分之间的电荷差异特别地不超过一）。根据具体实施方案，分子不是中性的，即含有一些电荷。这是因为荷电部分一般将帮助获得特异性，即，帮助分子的Yi部分仅与几乎完全相同或完全相同的多肽区段相互作用。此外，电荷可以帮助阻止分子的自结合作用和过早聚集（即，无靶的共聚集）。因此，在具体实施方案中，至少一个–和高达每个–编号的X部分具有1或2的电荷。为了经济，在X部分中，X部分特别地主要或仅仅由相同荷电的残基组成。X_2i-1部分可以具有与相应X_2i部分不同符号的电荷。

根据特定实施方案，围绕Y_i区的X_2i-1和X_2i是相同的。根据进一步实施方案，分子中的每个X_2i-1相同于每个X_2i。根据再进一步的实施方案，分子中的所有X_2i-1和X_2i都是相同的。根据其他具体实施方案，至少一个且特别是所有X_2i-1的残基都镜像反映出相应X_2i中的残基序列次序。即，如果X_2i-1的守门残基是例如N-P（即，天冬酰胺在脯氨酸N端），则X_2i中的残基是P-N（天冬酰胺在脯氨酸C端）。

根据可替代实施方案，至少一个且特别是所有X_2i-1的电荷与其相应X_2i具有相同的符号。根据进一步具体实施方案，至少一个且特别是所有X_2i-1的电荷相同于相应X_2i的电荷。理想地，荷电残基更强烈地抵制通过自结合的聚集。根据其他实施方案，分子中的所有X部分的电荷是中性的或具有相同符号。这可以帮助阻止分子间的静电吸引。

根据一些非常具体的实施方案，侧接Yi区的至少一个X部分的至少部分也存在于目的蛋白质中。事实上，蛋白质中的疏水序列常侧接守门残基，以阻止聚集。根据其中至少一个Yi相同于蛋白质中天然存在的序列的具体实施方案，该分子X部分中侧接Y_i的至少一个守门者相同于蛋白质中存在的守门残基。在如下情况下，这特别如此：其中Y_i序列对应于蛋白质中的守门者之间的全序列，这使得就至少一个Yi区段和邻近该Y_i区段的至少一个X区段的至少部分而言，该分子的序列对应于该蛋白质的该序列。这也特别适用于其中天然侧接的守门者不是很强（即，该守门者是也可以成为Y_i区段的一部分的残基，例如N或S）的蛋白质。因此，分子的序列和目的蛋白质在比分子的Y_i区段长至少一个氨基酸的连续区上对应（即蛋白质中的聚集序列的至少一个侧接守门者被包括在分子中）。

根据可替代的特定实施方案，考虑守门者部分(moiety)促进或稳定Yi部分与其在蛋白质中的关连区的相互作用。这可以是其中蛋白质中侧接聚集区的残基（在N和/或C末端侧上）携带电荷的情况。为了减少通过相似电荷的排斥机会、并且因此使相互作用的机会达到最大，X_2i-1和/或X_2i守门者的电荷可以选择为与蛋白质中的侧接序列的电荷互补。用例子举例说明这点，酵母中的钙依赖磷酸酶蛋白质（参见实施例1.5）具有两个聚集诱导区，在该蛋白质序列中其侧接荷电残基。这两个蛋白质区如下：NKLRFAFNIY DIDRD（SEQ ID NO：100）,和GNGE LFIVM KMMV（SEQ IDNO：101）（显示的是，具有其N或C末端4或5个侧翼残基的两个聚集区（有下划线的））。NKLR（SEQ ID NO：102）具有两个带正电荷的氨基酸，而DIDRD（SEQ ID NO：103）的净电荷是负2（三个带负电荷的D残基，1个正电荷R残基）。因此，对于其中守门者部分具有互补电荷的实施方案，在FAFNIY（SEQ ID NO：104）的N端的X部分应是带负电荷的，而在C端侧的X部分应是带正电荷的。对于LFIVM序列（SEQID NO：105），则相反：在钙依赖磷酸酶蛋白质中该序列在其N端侧上侧接负电荷并在其羧基末端上侧接正电荷K残基。因此，具有互补守门者的分子具有在N末端上的正电荷和在另一个末端上的负电荷。在实施例1.5中，这是构建体6和7的情况。

如由DIDRD（SEQ ID NO：103）例子显而易见的，相反电荷可以存在于侧翼区中。为了确定净电荷，一般考虑不超过7个侧接序列的氨基酸，优选甚至更少，例如5、4或3。净电荷随后为该区段中的残基电荷的总和。与聚集诱导区段紧邻的残基常对实际电荷具有更重要的贡献。因此，例如，如果带正电荷的残基紧侧接聚集序列，而负电荷残基例如在四个氨基酸的再上游或下游，则该侧翼可以视为带正电荷的而不是中性的，因为来自紧邻残基的电荷效应将强得多。根据最特定的实施方案，仅考虑紧在聚集倾向序列侧翼的残基用于确定天然序列的电荷。

Z_i部分：接头

如上式中，本文描述的分子还含有接头部分Z_i。根据特定实施方案，分子仅含有内部接头且不含N或C末端接头（记住：本文使用的式（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n等价于式（Z_i-X_2i-1-Y_i-X_2i）_n，其中每个Z₂至Z_n是接头，并且Z₁独立地选自接头或无）。换言之，分子具有守门残基（即X部分）在其N和C两末端上。这对应于下式的分子：（X_2i-1-Y_i-X_2i）_n，其中n、i、X_2i-1和X_2i和Y_i如上定义，其中这些部分通过使用任选的接头部分而彼此融合。因为外部（N或C末端）接头可以用于例如将其他部分融合至分子，所以这也可以书写为Z₀-（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中X_2i-1和X_2i、Y_i、i和n如上定义，其中Z₀是任选的N末端接头部分，Z₁至Z_n-1是接头，并且Z_n是任选的C末端接头部分。

因此，在特定实施方案中，Z_n是无（或是零个连接单位的接头）。

接头部分的性质对于本发明并不重要，但一般不使用长的柔性接头。根据特定实施方案，每个Z_i独立地选自0–20个相同或不同单位的区段，其中单位是氨基酸、单糖、核苷酸或单体。不同单位可以是相同性质的不同单位（例如不同氨基酸、或一些共聚物）。它们还可以是不同性质的不同单位，例如具有氨基酸和核苷酸单位的接头，或包含两个或更多个不同单体种类的杂聚物（共聚物）。根据特定实施方案，除Z_n外的至少一个且特别是每个Z_i的长度是至少1个单位。根据其他特定实施方案，Z_n是0个单位。根据特定实施方案，除Z_n外的所有Z_i接头都是相同的。根据进一步实施方案，所有Z_i部分都是相同的。

氨基酸、单糖和核苷酸和单体具有与本领域相同的含义。注意，单体的具体例子包括天然单体的模拟物，例如非蛋白氨基酸或非天然存在的氨基酸（例如肉毒碱、GABA、以及L-DOPA、羟脯氨酸和硒代甲硫氨酸），肽核酸单体等。其他合适单体的例子包括但不限于环氧乙烷、氯乙烯、异戊二烯、乳酸、烯烃例如乙烯、丙烯、在聚合物中出现的酰胺（例如丙烯酰胺）、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯单体、乙烯乙酸乙烯酯、和其他能够形成聚合物的有机分子。

根据可替代实施方案，接头单位是化学接头，例如通过碳化二亚胺偶联产生的那些。合适的碳化二亚胺的例子包括但不限于1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）、N,N'-二异丙基碳化二亚胺（DIC）和二环己基碳化二亚胺（DCC）。另一种特别考虑的化学接头是4,7,10-三氧杂十三烷-琥珀酸（有时也称为4,7,10-三氧杂十三烷-13-琥珀酰胺酸）或Ttds。

根据具体实施方案，至少一个且特别是所有Zi是具有相同性质的0–10个单位，特别是具有相同性质的0–5个单位。如果接头是柔性的，则特别考虑使用短接头。短接头的使用阻止相同分子的两个Y_i区段在自身上回折，因为回折将使得它们更不易被目的蛋白质接近。此外，通过确保一个分子的不同Y_i区段不能彼此相互作用，可以增加分子的可溶性。根据特定实施方案，接头短至使得它们不允许Y_i区段以反向平行方式折叠。例如对于氨基酸，需要至少三个或四个氨基酸以实现完全转角，因此特别考虑不超过四个或不超过三个氨基酸的接头。这还取决于氨基酸的性质，因此特别考虑使用不具有特定结构倾向或转弯结构倾向的氨基酸，例如G、S和P。根据特定实施方案，除Z_n外的至少一个Zi部分且特别是所有Z_i部分是肽或多肽接头。特别考虑的此类接头的序列包括但不限于PPP、PP或GS。对于由氨基酸构成的Z_i部分，可以考虑一级结构（例如在接头的序列中包括许多氨基酸而无特定结构的倾向）以及二级或三级结构。例如，可以选择不形成特定二级结构、或形成（线性）α螺旋的氨基酸。或者，氨基酸可以经选择以使得它们不形成稳定的三级结构，因为这可能导致Y_i部分变得无法接近。氨基酸接头可以形成无规卷曲。另一个特别考虑的接头是聚乙二醇（PEG），即单体环氧乙烷基团的寡聚物或聚合物。PEG寡聚物常被缩写并同时指明单体单位的数目，例如PEG₂、PEG₃或(PEG)4。根据特定实施方案，至少一个Zi部分是PEG寡聚物(简言之PEG)。根据进一步特定实施方案，所有Zi部分都是PEG部分。根据再可替代的实施方案，除Z_n外的至少一个Zi部分且特别是所有Z_i部分是PEG接头。

接头优选很短以阻止相同分子的Y_i部分的反向平行相互作用。然而，注意，在许多情况下，即使接头的长度允许，也不利于反向平行β片层的形成。例如，当分子中Y_i具有与下一个Y_i（即Y_i+1）相同的序列并且该序列不对称时，将不形成β片层。对于此类分子，接头应足够短以阻止Y_i区段以平行方式的折叠–此类接头的长度取决于Y_i区段的长度和形成两个发夹转角所需的单位数（即允许Yi平行排列所需的最小长度）。值得注意的是，这适用于允许分子折叠的柔性接头。如果可以确保接头是刚性的并且一个分子的不同Y_i区不能彼此接触（即不能彼此相互作用），则接头的长度并不真正重要。在此类情况下，它可以超过20个单位，但典型地长度将由于实际原因而受限。

其中更长的接头优于其他接头的一个具体例子是，靶向至少两种不同蛋白质，特别是相同生物体中的两种不同蛋白质的那些情况（即Yi部分对应于超过一种蛋白质的聚集诱导区）。为了确保该分子可以（例如同时）与超过一种蛋白质相互作用，增加不同靶向Yi部分之间的距离可以是有利的，这样相互作用不会因空间位阻而被阻止。在这些情况下，Zi接头可以是0–100个相同或不同单位的区段，其中单位是氨基酸、单糖、核苷酸或单体；或0-90、0-80、0-70、0-60、0-50、0-40、0-30或0–20个单位。特别地，Zi接头的最小长度是至少1个单位、至少2个单位、至少3个单位、至少4个单位或至少5个单位。

当使用较长的接头时，它们优选不同于该至少一个Yi区衍生自的蛋白质的序列。根据非常特定的实施方案，超过20个单位的接头不是肽接头，即单位不是氨基酸。根据可替代实施方案，较长的接头可以是肽接头，是含有重复基序的肽接头（例如GS、GGS、PP接头或含有单、二或三氨基酸重复的其他接头）。特别地，接头基本上不含二级多肽结构，例如具有α-螺旋或β-片层的区段。多肽接头朝向多肽二级结构基序的任何倾向都必然限制由接头末端享有的空间自由度。

关于分子结构的一般解释

因为众多肽已在本领域中描述，所以可能具有落入本发明通式的肽结构的一些分子已在本领域中得到描述（用于不同目的）-特别是其中n是1的那些（尽管，就我们所知，情况不是这样）。因此，我们考虑针对分子（特别当n是1时）的产品权利要求的范围不同于可以应用这些分子的用途和方法的范围。相应地，对于n是1时的实施方案，考虑：更严格地选择X部分（例如仅选自R、K、E、D、P；或例如排除K，参照上文）；X部分更短（例如1或2个氨基酸）并且不存在仅为K残基的情况；Y部分更短（例如不长于13、11或10个氨基酸），选自不同长度范围（例如5–12个氨基酸、或5–10个氨基酸），或与其中n是至少二的实施方案相比，更严格地选择（例如特定残基如P、R、K、D、E的不存在，例如超过60%疏水性，……）。

特别考虑的分子是具有下述结构的那些：X₁-Y₁-X₂-Z₁（即n是1），其中X₁和X₂总共不超过5个氨基酸；Y₁是4–10个氨基酸的区段，并且Z₁是0个单位的区段；和X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂（即n是2），其中Z₁是接头并且Z₂是无。

对于其中n=1的实施方案，考虑的特定限制组合包括：

-X₁和X₂彼此相等，并且是选自R、K、E、D和P的1或2个氨基酸；和

-Y₁是6–10个连续氨基酸的区段，其中至少3个是疏水性的，其中不存在P、R、K、D、E或H残基，其中C、M、N、Q和W残基的总和不超过1，其中小于60%是除V外的小氨基酸（即选自A、C、G、S、P、N、T、D），其中不存在超过2个连续的相同氨基酸，其中非脂肪族残基不存在超过两次，并且其中第一个和最后一个残基是脂肪族或选自F、Y、W、A、M和T。

其中n=1的另一个特定组合是

-X₁和X₂是选自R、K、E、D和P的1或2个氨基酸；和

-Y₁是6–11个连续氨基酸的区段，其中至少75%是疏水性氨基酸，其中至少50%的氨基酸是脂肪族或F残基，其中不存在P、R、K、D、E或H残基，其中不存在超过一个C、M、N、Q、W、G、S、A或T残基，其中不存在超过3个Y或F残基，其中不存在两个连续的相同非脂肪族残基（即不存在2个连续的Y或F残基，或仅I、L和V可以是连续的相同残基），并且不存在超过2个连续的相同脂肪族残基，其中不存在两个连续的非芳香族极性残基（即选自S、N、T和Q），其中不存在超过50%的相同残基，其中第一个和/或最后一个残基是脂肪族或F残基，其中A和G残基的总和不超过2，其中A、G和S残基的总百分比不超过25%，其中C、M、N、Q和W残基的总百分比不超过25%，和其中除V外的小残基（即选自A、C、G、S、N、T）的总百分比不超过25%。

根据一些具体实施方案，Z₁不存在（即Z₁是零个单位）。根据其他实施方案，Z₁也是存在的，并且可以在N或C末端。

值得注意的是，尽管这些组合是特别考虑的且事实上描述良好工作的化合物的序列空间，但这些限制主要旨在确保本文请求保护的化合物和现有技术中描述的化合物之间不重叠。非常可能的是，这些限制太严格，或一些太严格而其他不够严格。因此，考虑这些标准中的任何单独一个均可以根据上文对于各单个结构部分描述的边界而进行改变，和/或一些标准可以被省略或替换为其他限制条件，和/或可以加入其他限制条件。

其他结构部分(moiety)

分子可以进一步包含（或可以进一步融合至）其他结构部分。对于所有部分，融合或接头的性质对于本发明并不重要，只要该部分和聚集物分子可以发挥其特定功能。根据特定实施方案，融合至分子的部分可以被切掉（例如通过使用具有蛋白酶识别位点的接头部分）。这样可以将该部分和分子的功能分开，对于较大部分，或对于其中所述部分在特定时间点后不再需要的实施方案（例如，标签可以在使用标签的分离步骤后被切掉），这可以是特别有意义的。

特别考虑，分子进一步包含可检测标记。可检测标记可以在N或C末端上或甚至内部融合至该分子（例如通过接头，或接头可以用作可检测标记）。可替代地，可检测标记可以指在分子的X-Y-Z部分中的一个或多个中使用一个或多个标记的氨基酸（例如荧光或放射性标记的氨基酸）。

注意，对于其中存在Z_n的实施方案，可检测标记可以融合至Z_n接头部分。（尽管该符号将需要标签加在C末端上，但也可以考虑N末端标签–这对应于（Z_i-X_2i-1-Y_i-X_2i）_n的等价符号，其中每个Z₂至Z_n是接头，并且Z₁是与标签融合的接头）。

然而，因为与可检测标记融合的接头的性质可以显著不同于分子中使用的接头（尤其是就长度限制而言），所以可优选提及这样标记的分子，该分子不存在Zn部分且可检测标记使用单独的接头融合至分子。事实上，用于将标签加入分子的接头可以是长且具有柔性的。然而，将可检测标记附着至分子的实际方法对于本发明并不重要，并且一般取决于使用的标记的性质和/或标记的目的（其可以决定所需接近性）。注意，原则上对于蛋白质性质的分子可以使用任何已知标记，只要该标记可以被检测。特别考虑的标记包括但不限于标签(tag)、荧光标记、酶底物、酶、量子点(quantum dot)、可以是（顺）磁性的纳米颗粒、放射性标记、光学标记等。

与其他结构部分一样，因为分子具有两个末端，所以可以考虑该分子在其N和C末端两者上融合另外的部分（例如标记）。这两个标记可以是相同的（获得更强的信号）或不同的（用于不同检测目的）。部分例如标记可以通过Z₀和/或Z_n接头或通过更长的接头融合。

根据特定实施方案，可检测标记不是GFP或生物素。根据其他特定实施方案，生物素或GFP可以是可检测标记。

根据其他特定实施方案，分子可以融合至其他部分，例如以延长其体内半衰期。除增加稳定性之外，此类部分还可以增加与之融合的分子的可溶性。尽管守门者（编号X的部分）的存在原则上足以阻止分子的过早聚集并且使其保持在溶解状态中，但增加可溶性（即阻止聚集）的部分的进一步添加可以使得分子更容易处理，并且特别改善稳定性和保存期限。此类部分的众所周知的例子是PEG（聚乙二醇）。特别考虑该部分，因为它可以用作接头以及增溶部分。其他例子包括肽和蛋白质或蛋白质结构域，或甚至整个蛋白质（例如GFP）。在这点上，应注意，如同PEG，一个部分可以具有不同的功能或效应。例如，flag标签（序列DYKDDDDK（SEQ ID NO：106））是可以用作标记的肽部分，但由于其电荷密度，它也将增强溶解。PEG化通常已经被证实可以增加生物药物的可溶性（例如Veronese和Mero，BioDrugs.2008；22（5）:315-29）。将肽、多肽、蛋白质或蛋白质结构域标签加入目的分子已在本领域中得到广泛描述。例子包括但不限于，衍生自突触核蛋白的肽（例如Park等人，Protein Eng.Des.Sel.2004；17:251-260）、SET（可溶性增强标签，Zhang等人，ProteinExpr Purif2004；36:207–216）、硫氧还蛋白（TRX）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、N-利用物质（NusA）、小遍在蛋白样改性剂（SUMO）、遍在蛋白（Ub）、二硫键C（DsbC）、十七千道尔顿蛋白质（Skp）、噬菌体T7蛋白质激酶片段（T7PK）、蛋白G的B1结构域、蛋白A的IgG ZZ重复结构域、和细菌免疫球蛋白结合结构域（Hutt等人，J Biol Chem.；287（7）:4462-9，2012）。标签的性质将取决于应用，如可以由技术人员决定的。例如，对于本文描述的分子的转基因表达，可以考虑将分子融合至较大的结构域，以阻止被细胞机制过早降解。其他应用可以考虑融合至较小的增溶标签（例如小于30个氨基酸、或小于20个氨基酸、或甚至小于10个氨基酸），以便不改变分子的性质太多。

除延长半衰期之外，分子还可以融合至改变其他或另外的药物代谢动力学和药效学性质的部分。例如，已知，与白蛋白（例如人血清白蛋白）、白蛋白结合结构域、或合成的白蛋白结合肽融合可以改善不同治疗性蛋白质的药物代谢动力学和药效学（Langenheim和Chen，Endocrinol.；203（3）:375-87，2009）。通常使用的另一个部分是抗体的可结晶片段区（Fc）。这些部分的性质对于本发明并不重要，并且可以通过本领域技术人员基于应用而决定。

根据特定实施方案，分子不融合至琼脂糖珠、乳胶珠、纤维素珠、磁珠、二氧化硅珠、聚丙烯酰胺珠、微球体、玻璃珠或任何固相载体（例如聚苯乙烯、塑料、硝酸纤维素膜、玻璃）、或NusA蛋白质。（然而，注意，这些融合是可以的，并且在具体实施方案中，它们也被考虑）。

还考虑与本文描述的分子组合的其他部分是靶向部分。例如，分子可以融合至例如对于给定靶具有特异性的抗体、肽或小分子，并且该分子在靶位点处开始聚集（在这种情况下，Y_i区（一个或多个）将具有与相同或不同靶蛋白质中存在的序列相同的序列，或该序列将是具有高聚集倾向的序列）。这类似于在WO2008148751中描述的策略。可以与本发明的分子组合的可能靶部分（在WO2008148751中也称为‘结合区’或‘结合结构域’）的一个广泛列表，可以参见WO2008148751中第3页（第26行起）和第4页（第34行止）：术语‘结合区’或‘结合结构域’一般指与靶蛋白质相互作用的分子。在某些情况下，结合结构域是化学化合物（例如对于至少一种靶蛋白质具有亲和力的小化合物），并且在某些其他情况下，结合结构域是多肽，在某些其他情况下，结合结构域是蛋白质结构域。蛋白质结合结构域是总体蛋白质结构的元件，其是自稳定的并且常独立于蛋白质链的其余部分而折叠。结合结构域的长度在约25个氨基酸到500个氨基酸和更多之间改变。许多结合结构域可以分类为折叠的，并且是可识别、可鉴定的3-D结构。一些折叠在许多不同蛋白质中是常见的，这使得它们被给予专门的名称。非限制性例子是罗斯曼（Rossman）折叠、TIM桶、犰狳重复、亮氨酸拉链、钙粘蛋白结构域、死亡效应结构域、免疫球蛋白样结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、pleckstrin同源结构域、src同源2结构域、BRCA1的BRCT结构域、G蛋白结合结构域、Eps15同源（EH）结构域和p53的蛋白质结合结构域。抗体是特异结合性蛋白质的天然原型，其特异性通过高变环区（所谓的互补决定区（CDR））介导。尽管一般而言抗体样支架已证明可以作为特异性结合者良好工作，但已经显而易见地，严格遵守展示CDR样环的该刚性支架范例，并非是强制性的。除抗体外，许多其他天然蛋白质可以介导在结构域之间的特异性高亲和力相互作用。免疫球蛋白的替代物已为设计新的结合（识别）分子提供了有吸引力的起点。如本发明中使用的，术语“支架”指可以携带改变的氨基酸或序列插入物的蛋白质构架，所述氨基酸或序列插入物赋予对特定靶蛋白质的结合。改造支架和设计文库是互相依赖的过程。为了获得特异性结合剂，必须生成支架的组合文库。这通常在DNA水平完成，其中使用简并密码子或三核苷酸，在合适氨基酸位置上随机化密码子。具有广泛多样起源和特征的大量不同非免疫球蛋白支架目前用于组合文库展示。其中一些在大小上与抗体的scFv（约30kDa）相当，而其中大多数小得多。基于重复蛋白质的模块支架在大小上依赖于重复单位数目而改变。例子的非限制性列表包括基于人第10个纤连蛋白III型结构域的结合剂，基于脂质运载蛋白的结合剂，基于SH3结构域的结合剂，基于knottin家族成员的结合剂、基于CTLA-4的结合剂、T细胞受体、新制癌菌素、碳水化合物结合模块4-2、tendamistat、kunitz结构域抑制剂、PDZ结构域、Src同源结构域（SH2）、蝎毒素、昆虫防御素A、植物同源域指蛋白质、细菌酶TEM-1β-内酰胺酶、金黄色葡萄球菌蛋白A的Ig结合结构域、大肠杆菌的大肠杆菌素E7免疫蛋白质、大肠杆菌的细胞色素b562、锚蛋白重复结构域。结合结构域还包括:对于给定靶蛋白质具有特异性的化合物、环状和线性肽结合剂、肽适体、多价avimer蛋白质或小模块免疫药物、对于受体或共受体具有特异性的配体、在双杂交分析中鉴定的蛋白质结合配偶体、基于生物素-抗生物素蛋白高亲和作用的特异性的结合结构域、基于环孢素-FK506结合蛋白质的特异性的结合结构域。还包括对于特定碳水化合物结构具有亲和力的凝集素。

值得注意的是，对于其中分子融合至靶向部分的实施方案，特别考虑至少一个但高达每个Yi部分是合成的序列，更特别地在该分子所施用至的生物体的蛋白质中不存在的序列。事实上，在此类情况下，可以考虑通过与靶向部分融合的干扰物分子的成核聚集而原位发生成核聚集（在到达靶蛋白质后）。

然而，注意，靶向部分不是必需的，因为分子自身能够通过特异性序列识别而发现其靶。因此，根据可替代实施方案，分子可以有效用作靶向部分并且进一步融合至其他部分例如药物、毒素或小分子。通过将分子靶向特定蛋白质（例如仅在特定细胞类型或细胞区室中存在的蛋白质），这些化合物可以被靶向特定细胞类型/区室。因此，例如，毒素可以选择性地被递送至癌细胞，或药物可以被递送至细胞质中。

根据另外其他实施方案，分子可以进一步包含介导细胞穿透（或细胞转运）的序列，即该分子通过重组或合成地结合细胞穿透序列而进一步修饰。干扰物分子（例如作为多肽）可以进一步融合至或化学偶联至促进融合物或化学偶联蛋白质转导到原核或真核细胞内的序列。细胞穿透肽（CPP）或蛋白质转导结构域（PTD）序列是本领域众所周知的，并且包括但不限于HIV TAT蛋白质、聚精氨酸序列、穿透素（penetratin）和pep-1。另外其他常用的细胞可透过肽（天然和人工肽）公开于例如Sawant和Torchilin，Mol Biosyst.6（4）:628-40，2010；Noguchi等人，Cell Transplant.19（6）:649-54，2010以及Lindgren和Langel，Methods Mol Biol.683:3-19，2011中。

关于CPP，典型的是其电荷，因此本文描述的一些荷电分子可以无需CPP而进入细胞。事实上，如实施例中所示的，可以靶向信号肽或细胞内区域，使得分子被细胞摄取，并且这无需与CPP融合而发生。

在其他部分融合至分子的情况下，在特定实施方案中考虑，这些部分可以从分子中去除。一般地，这将通过掺入特异性蛋白酶切割位点或等价方法来完成。这特别适用于其中所述部分是大蛋白质的情况：在此类情况下，可以在本文描述的任何方法中使用分子前（例如在分子的纯化过程中），切掉该部分。切割位点可以分开掺入或可以是外部Z_n接头（或如果该部分在N末端，或外部Z₁接头）的一个组成部分。根据非常具体的实施方案，部分可以是内部Zi接头的部分，或甚至可以是整个Zi接头。例如，具有n=2的分子可以具有下述结构：X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄，其中Z₁（部分或整体）是六组氨酸序列：这随后是接头和检测序列。尽管这是可能的，但在那些情况下，通常不插入切割位点，因为这将导致分子自身的切割。注意，根据其中该另外部分在内部融合的实施方案，仅非蛋白质性质（例如PEG）或具有有限长度（小于30、20或10个氨基酸，参照上文）的肽序列被考虑作为增溶部分。否则，蛋白质结构域可能干扰聚集的诱导。

根据具体实施方案，本文描述的分子的总长度不超过50个氨基酸。更特别地，该长度不超过40个氨基酸、30个氨基酸、25个氨基酸或甚至20个氨基酸。根据其中分子融合至其它部分的进一步具体实施方案，长度限制仅应用于总分子的（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n部分（并且因此例如不应用于标记）。因此，如果切割位点已插入分子中，则长度限制一般应用于切割后的长度。

对于完全蛋白质性质的分子，考虑它们可以作为核酸，例如作为包括编码至少一个本文描述的分子的序列的重组载体，提供。

分子的特定应用

根据进一步方面，本文描述的分子可以用于下调或抑制蛋白质的功能。一般地，这通过诱导该蛋白质的聚集来实现。根据这些实施方案，提供用于下调蛋白质功能的方法，其包括使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，在其中n是1的实施方案中，Y₁将是4–11个连续氨基酸的区段。根据这些实施方案，Z₁可以是无（即0个单位的区段）。根据可替代实施方案，Z₁是除氨基酸接头外的接头。根据另外其他可替代实施方案，Z₁可以是本文考虑的任何接头（即无进一步限制应用于Z₁）。

对于这些分子，适用与上文相同的考虑和限制。特别地，应注意，只要实现功能的下调，在存在于蛋白质中的Yi中可以耐受一个或两个置换，如较早描述的。然而，一般地，Y_i将是相同的。

分子可以跨越整个领域范围使用，包括白色生物技术（或工业生物技术）、红色或医学生物技术、绿色或农业生物技术、蓝色（或水生）生物技术。它们可以用于抑制蛋白质以及检测蛋白质，并且这在所有这些领域中适用。如可见的，其中分子施用于受试者的应用显示跨越领域的显著相似性，即在医学（动物受试者）和农业应用（植物受试者）两者中，均可以细分为感染和非感染应用。

关于干扰物的医学应用

对于本文描述的分子，存在两大医学应用领域，即感染性疾病和非感染性疾病。两个应用间的大差异是：在感染性疾病情形中，干扰物分子一般靶向引起感染的病原体的至少一种蛋白质，而它通常被施用给蛋白质组不是靶标的受试者（即Yi区段对应于病原体的蛋白质组中的蛋白质，但在具有该感染的受试者的蛋白质组中不存在）。然而，也考虑病原体的直接靶向（例如当治疗由外寄生物引起的感染时）。

在非感染性病症中，干扰物分子一般靶向在该干扰物施用至的受试者中存在的至少一种蛋白质。

非感染性疾病和感染性疾病中的相同考虑因素（施用于生物体和Yi区段在所述生物体中的蛋白质组中的存在）适用于干扰物在植物中的应用，但这些一般不视为医学应用。因此，虽然相似方法可以在植物上进行（参见下文），但本章节中描述的方法被视为医学方法，因为它们一般涉及动物受试者而不是植物受试者。

根据进一步特定实施方案，提供这些方法用于疾病情形中下调蛋白质，或用于作出诊断。这等于说，在这些实施方案中，提供具有下述结构的分子用作药物或诊断剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

其中如果n是1，则Y₁是4–11个连续氨基酸的区段（并且根据进一步特定实施方案，Z₁不是氨基酸接头）。

如本文使用的，方法和用途常是可互换的，即分子用作药物、或分子用于在特定疾病治疗中的用途，等价于包括使用该分子（例如与之接触）用于治疗疾病的方法。

根据特定实施方案，如果分子用作药物或诊断剂，则考虑它们作为被施用的外源分子而不是作为转基因使用。这同样适用于不用作药物的分子。根据可替代实施方案，分子可以作为转基因以及外源分子施用。

如果分子作为转基因（即作为编码该分子的核酸）施用，则不言而喻的，根据这些实施方案的干扰物分子完全具有多肽性质，因为它们需要能够被编码，即，干扰物分子中存在的所有编号的X、Y和Z部分都具有多肽性质。其中考虑转基因递送的医学应用包括但不限于基因治疗方法（例如使用慢病毒）或干细胞应用。

因此，根据这些实施方案，提供了编码具有下述结构的分子的核酸序列：

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

特别考虑，核酸序列编码具有本文描述的所有限制和变化（作必要修改后）的分子。因此，编码的多肽基本上如本文描述的，即，针对与该方面相容的干扰物分子提及的变化，也考虑为是适用于由核酸序列编码的多肽的变化。例如，规定X或Y部分的序列或长度的实施方案与核酸中编码是相容的，而其中Z部分具有非氨基酸性质的实施方案则不相容。

根据具体实施方案，编码的多肽序列是非天然存在的多肽。根据进一步特定实施方案，核酸序列是人工基因。因为核酸方面在利用转基因表达的应用中是最特别合适的，故特别考虑的实施方案是其中核酸序列（或人工基因）融合至另一结构部分，特别是增加基因产物的可溶性和/或稳定性的部分上的实施方案。事实上，由于产物的快速降解，肽的转基因表达有时可能是困难的。

应该注意，涉及本申请分子的所有方法和用途因此也包括其中该分子作为编码其的核酸序列提供并且该分子由该核酸序列表达的方法和用途。

该方面还提供的是，包含编码如本文描述的分子的核酸序列的重组载体。这些重组载体理想地合适作为媒介物，以携带目的核酸序列进入表达待下调的蛋白质的细胞，并且驱动核酸在所述细胞中表达。重组载体可以作为分离的实体（例如作为质粒）在细胞中维持，或可以整合到细胞的基因组内。重组载体包括例如质粒载体、二元载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体和病毒载体。因此，本文还涵盖，其中分子作为具有编码该分子的核酸序列的重组载体提供、并且该分子由重组载体中提供的该核酸序列表达的方法和用途。

相应地，本文提供细胞，其包含编码如本文描述的分子的核酸序列，或包含含有编码此干扰物分子的核酸序列的重组载体。细胞可以是原核或真核细胞。在后面一种情况下，它可以是酵母、藻类、植物或动物细胞（例如，昆虫、哺乳动物或人细胞）。因此，本文还涵盖，其中该分子作为具有编码该分子的核酸序列的细胞提供、并且该分子由细胞中提供的该核酸序列表达的方法和用途。这可以例如用于干细胞治疗中。

注意，转基因方法并不限于医学应用。根据非常特定的实施方案，提供在核酸中编码的干扰物分子而非直接以多肽形式提供干扰物分子，特别合适于在植物中使用，如下文讨论的。

相应地，本文提供植物、或植物细胞、或植物种子，其含有如本文描述的核酸序列、人工基因或重组载体。

在具体实施方案中，本发明提供了用于产生或制造药物或药物组合物的方法，所述药物或药物组合物包含至少一种干扰物分子，且进一步将所述至少一种干扰物分子与药学可接受的载体混合。即，提供用作药物的干扰物，或提供含有干扰物的药物组合物。

在优选实施方案中，干扰物分子是多肽（这意指存在的所有接头部分Z_i都具有多肽性质），并且可以通过化学合成或可替代地作为重组蛋白质制备。（注意，当适用时，用于医学用途的干扰物分子的特点也考虑用于非医学用途）。

“多肽”指其中单体是氨基酸且通过酰胺键连接在一起的聚合物，可替代地被称为肽。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-旋光异构体或D-旋光异构体。另外，也包括非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的并非基因编码的氨基酸也可以用于本发明中。在干扰物中使用的所有或部分氨基酸可以是D或L-异构体。此外，其他拟肽在本发明中也可以使用。特别可以参考Sillerud LO和Larson RS（2005）Curr ProteinPept Sci.6（2）:151-69中关于开发和使用拟肽作为蛋白质-蛋白质间相互作用的拮抗剂的综述，且该文献并入本文。此外，D-氨基酸可以加入肽序列中，以稳定转角特性（尤其在甘氨酸的情况下）。在另一种方法中，α、β、γ或δ转角模拟物（例如α、β、γ或δ二肽）可以用于模拟肽中的结构基序和转角特性，并且同时提供对抗蛋白酶解的稳定性和增强其他性质例如构象稳定性和可溶性。

重组干扰物可以使用合适的表达系统进行制造，所述表达系统包括细菌细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或转基因动物或植物。重组干扰物可以通过任何常规蛋白质或肽纯化程序纯化至接近于同质性、和/或与添加剂混合。在另外一个实施方案中，所述干扰物是化学修饰的多肽。化学合成允许通过设计而缀合其他小分子或掺入非天然氨基酸。在特定实施方案中，小分子与肽干扰物的缀合可以导致这些分子可以潜在地应用于正在发展的用于抗肿瘤治疗的靶向细胞毒素剂领域中。非天然氨基酸掺入肽内开辟了更大化学多样性的可能性，类似于用于开发高亲和力、高特异性分子识别的小分子医学化学方法。非天然氨基酸也可以通过造成肽不能被蛋白酶（例如血清或胃）识别而阻止肽干扰物的快速降解。在另外一个实施方案中，本发明的干扰物分子包含经修饰的氨基酸，例如D-氨基酸或化学修饰的氨基酸。在另外一个实施方案中，所述干扰物由天然氨基酸和非天然氨基酸的混合物组成。在另外一个实施方案中，肽的半衰期可以通过修饰得到延长，所述修饰例如糖基化（Haubner R.等人（2001）J.Nucl.Med.42，326-336）、与聚乙二醇缀合（PEG化，参见Kim TH等人（2002）Biomaterials23，2311-2317）、或改造肽以与血清白蛋白结合（参见Koehler MF等人（2002）Bioorg.Med.Chem.Lett.12，2883-2886）。包含干扰物分子的药物组合物的施用可以经口、吸入、经皮或肠胃外（包括静脉内、腹膜内、肌内、腔内、鞘内和皮下）施用。用于干扰物的特别优选的递送方法例子是经皮贴剂（Henry S等人（1998）J.Pharm.Sci.87，922-925）、离子电渗疗法（Suzuki Y等人（2002）J.Pharm.Sci.91，350-361）、超声波导入法(sonophoresis)（Boucaud A等人（2002）J.Control.Release81，113-119）、气溶胶（Duddu SP等人（2002）Pharm.Res.19，689-695）、传递体或脂质体（Guo J等人（2000）Drug Deliv.7,113-116）。干扰物可以单独施用或优选配制为药物组合物。（这意指，提供包括施用单独或配制为药物组合物的干扰物的方法）。

优选干扰物或其药学可接受的盐以单位剂量组合物的形式施用，所述单位剂量组合物例如单位剂量经口、肠胃外、经皮或吸入组合物。此类组合物通过混合进行制备，并且适当地适应性调整以用于经口、吸入、经皮或肠胃外施用，并且如此可以为片剂、胶囊、口服液体制剂、粉末、颗粒剂、锭剂、可重构粉末、可注射和可输注溶液或悬浮液或栓剂或气溶胶的形式。

因为提供分子用作药物或诊断剂、或用于治疗或诊断方法中，所以还考虑它们可以作为药品提供。相应地，提供包含如本文描述的分子的药物组合物。特别地，药物组合物包含具有下述结构的至少一种分子和药学可接受的载体：

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

在其中n是1的实施方案中，Y₁一般是4–11个连续氨基酸的区段，并且Z₁不是氨基酸接头（或可以甚至是无）。

最特别地，在药物组合物中，分子中的至少一个Y_i存在于组合物将施用于的受试者中待下调的蛋白质中。注意，这不意味着，这种蛋白质在该受试者的基因组中编码。事实上，对于患有感染的受试者，考虑施用靶向感染性生物体而不是受试者自身的蛋白质的分子。（再次，注意，类似考虑适用于待施用于植物受试者的组合物，即农业化学组合物。这些可以靶向植物蛋白质、或感染性生物体的蛋白质）。

本发明还涉及含有本发明的一种或多种干扰物的药物组合物。这些组合物可以通过施用于有此需要的患者，用于实现期望的药理学效应。为了本发明目的，患者是需要治疗特定状况或疾病的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括药物组合物，其包含药学可接受的载体和药学有效量的本发明的干扰物或其盐。药学可接受的载体优选是，在与活性成分的有效活性一致的浓度下对于患者相对无毒和无害的载体，这使得可归于载体的任何副作用不削弱活性成分的有益效果。药学有效量的干扰物优选是对治疗的特定状况产生结果或发挥影响的量。本发明的干扰物可以与本领域众所周知的药学可接受的载体一起施用，其中可以使用任何有效的常规剂量单位形式，包括立即、缓慢和定时释放制剂，经口、肠胃外、局部、经鼻、经眼、眼睛、舌下、经直肠、经阴道等。

对于经口施用，干扰物可以配制成固体或液体制剂，例如胶囊、丸剂、片剂、糖锭、锭剂、熔化物（melts）、粉末、溶液、悬浮液或乳液，并且可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的方法进行制备。固体单位剂型可以是胶囊——其可以为普通的硬或软壳明胶类型，含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂例如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。

在另一个实施方案中，本发明的干扰物可以用常规片剂基质例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉与下述组合以制片：粘合剂例如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；旨在于施用后帮助片剂崩解和溶解的崩解剂，例如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和瓜尔胶、黄蓍树胶、阿拉伯胶；旨在改善片剂制粒的流动和阻止片剂材料粘附至制片模和冲压机表面的润滑剂，例如滑石、硬脂酸或硬脂酸镁、钙或锌；旨在增强片剂的美学品质和使得其对于患者更可接受的染料、着色剂和调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃调味料。用于在经口液体剂型中使用的合适赋形剂包括磷酸二钙和稀释剂例如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，连同或不连同药学可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂的添加。多种其他材料可以作为包衣存在或另外修饰剂量单位的物理形式。例如片剂、丸剂或胶囊可以由紫胶、糖或两者包被。

可分散粉末和颗粒剂适合于制备水悬浮液。它们提供与分散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分（即至少一种干扰物）。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂通过上文已经提及的那些例示。还可以存在另外的赋形剂，例如上文描述的那些增甜剂、调味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以为水包油乳状液的形式。油相可以是植物油例如液体石蜡或植物油的混合物。合适的乳化剂可以是（1）天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍树胶，（2）天然存在的磷脂例如大豆和卵磷脂，（3）衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，（4）所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳状液也可以含有增甜剂和调味剂。

油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中进行配制，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以含有增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种增甜剂例如蔗糖或糖精。糖浆剂和酏剂可以用增甜剂进行配制，所述增甜剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇或蔗糖。此类制剂还可以含有缓和剂和防腐剂例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、以及调味剂和着色剂。本发明的干扰物还可以与药学载体一起、作为干扰物的可注射剂量、在优选地生理学可接受的稀释剂中、肠胃外施用（即皮下、静脉内、眼内、滑膜内、肌内或腹膜内），所述药学载体可以是无菌液体或液体的混合物，例如水、盐水、葡萄糖和有关糖的水溶液，醇例如乙醇、异丙醇或十六醇，二醇例如丙二醇或聚乙二醇，甘油缩酮例如2,2-二甲基-1,1–二氧戊环-4-甲醇，醚例如聚(乙二醇)400，油，脂肪酸，脂肪酸酯/或脂肪酸甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学可接受的表面活性剂例如皂或去污剂、悬浮剂例如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素、或乳化剂及其他药学辅助剂。

可以用于本发明的胃肠外制剂中的举例说明性油是石油、动物、植物或合成起源的油，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、异硬脂酸和肉豆蔻酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。合适的皂包括脂肪酸碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的去污剂包括阳离子去污剂例如二甲基二烷基卤化铵、烷基吡啶鎓卤化物和烷基胺乙酸盐；阴离子去污剂例如烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和甘油单酯硫酸盐，和磺基琥珀酸盐；非离子型去污剂例如脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚（氧乙烯-氧丙烯）、或者环氧乙烷或环氧丙烷共聚物；和两性去污剂例如烷基-β-氨基丙酸盐、和2-烷基咪唑啉季铵盐以及混合物。

本发明的肠胃外组合物一般含有在溶液中按重量计约0.5%-约25%的活性成分。还可以有利地使用防腐剂和缓冲剂。为了使在注射部位处的刺激降到最低或得到消除，此类组合物可以含有具有优选约12-约17的亲水亲油平衡（HLB）的非离子型表面活性剂。在此类制剂中的表面活性剂的量优选范围为按重量计约5%-约15%。表面活性剂可以是具有上述HLB的单一组分，或可以是具有所需HLB的两种或更多种组分的混合物。在肠胃外制剂中使用的举例说明性表面活性剂是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯、和环氧乙烷与疏水性基质（通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成）的高分子量加合物。

药物组合物可以以无菌可注射水悬浮液的形式。此类悬浮液可以根据已知方法进行配制，其中可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂，其可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，氧化烯与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物例如十七烷乙烯氧基鲸蜡醇，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。

无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以采用的稀释剂和溶剂是例如水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和等渗葡萄糖溶液。此外，无菌不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。为了该目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可以用于注射物的制备中。

本发明的组合物也可以以用于药物直肠施用的栓剂的形式施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述非刺激性赋形剂在常温是固体的，但在直肠温度是液体的，并且因此将在直肠中熔化以释放药物。此类材料是例如可可脂和聚乙二醇。

在本发明的方法中采用的另一种制剂采用经皮递送装置（“贴剂”）。此类经皮贴剂可以用于以控制量提供本发明的干扰物的连续或不连续输注。用于递送药剂的经皮贴剂的构建和使用是本领域众所周知的（参见例如US5,023,252）。此类贴剂可以构建用于药剂的连续、脉动或在需要时递送。用于肠胃外施用的控制释放制剂包括本领域已知的脂质体、聚合物微球体和聚合物凝胶制剂。可能期望或需要经由机械递送装置将药物组合物引入患者。用于递送药剂的机械递送装置的构建和使用是本领域众所周知的。关于例如将药物直接施用于脑的直接技术通常涉及将药物递送导管置于患者的脑室系统内，以绕过血脑屏障。用于将活性剂转运至机体的特定解剖区的一个此类可植入递送系统在US5,011,472中描述。

本发明的组合物，根据需要或期望，还可以含有其他常规药学可接受的配合成分，一般称为载体或稀释剂。可以利用用于制备合适剂型的此类组合物的常规程序。此类成分和程序包括在下述参考文献中描述的那些，所述参考文献各自引入本文作为参考：Powell，M.F.等人，"Compendium of Excipients for Parenteral Formulations"PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology1998，52（5），238-311；Strickley，R.G"ParenteralFormulations of Small Molecule Therapeutics Marketed in the United States（1999）-Part-1"PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology1999，53（6），324-349；和Nema，S.等人，"Excipients and Their Use in Injectable Products"PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology1997，51（4），166-171。

可以适当地用于配制组合物用于其预期施用途径的常用制药成分包括：

-酸化剂（例子包括但不限于乙酸、柠檬酸、延胡索酸、盐酸、硝酸）；碱化剂（例子包括但不限于氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺、trolamine）；吸附剂（例子包括但不限于粉状纤维素和活性炭）；气溶胶推进剂（例子包括但不限于二氧化碳、CCl₂F₂、F₂ClC-CClF₂和CClF₃）；空气驱逐剂（例子包括但不限于氮和氩）；抗真菌防腐剂（例子包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠）；抗微生物防腐剂（例子包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、十六烷基氯化吡啶、氯代丁醇、苯酚、苯乙基醇、硝酸苯汞和硫柳汞）；抗氧化剂（例子包括但不限于抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、单硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠）；粘合材料（例子包括但不限于嵌段聚合物、天然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、硅酮、聚硅氧烷和苯乙烯-丁二烯共聚物）；缓冲剂（例子包括但不限于偏磷酸钾、磷酸氢二钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和二水柠檬酸钠）；运载剂（例子包括但不限于阿拉伯胶糖浆、芳香糖浆、芳香酏剂、樱桃糖浆、可可糖浆、橙糖浆、糖浆剂、玉米油、矿物油、花生油、芝麻油、抑菌氯化钠注射液和抑菌注射用水）；螯合剂（例子包括但不限于依地酸二钠和依地酸）；着色剂（例子包括但不限于FD&C红编号3、FD&C红编号20、FD&C黄编号6、FD&C蓝编号2、D&C绿编号5、D&C橙编号5、D&C红编号8、焦糖和氧化铁红）；

-澄清剂（例子包括但不限于膨润土）；

-乳化剂（例子包括但不限于阿拉伯胶、聚西托醇(cetomacrogol)、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯50单硬脂酸酯）；

-包囊剂（例子包括但不限于明胶和邻苯二甲酸乙酸纤维素）；

-食用香料（例子包括但不限于茴香油、肉桂油、可可、薄荷醇、橙油、薄荷油和香草醛）；

-保湿剂（例子包括但不限于甘油、丙二醇和山梨糖醇）；

-研和剂（例子包括但不限于矿物油和丙三醇）；

-油（例子包括但不限于花生油(arachis oil)、矿物油、橄榄油、花生油(peanutoil)、芝麻油和植物油）；

-软膏基质（例子包括但不限于羊毛脂、亲水软膏、聚乙二醇软膏、矿脂、亲水矿脂、白色软膏、黄色软膏和玫瑰水软膏）；

-穿透促进剂（经皮递送）（例子包括但不限于单羟基或多羟基醇、单或多价醇、饱和或不饱和脂肪醇、饱和或不饱和脂肪酯、饱和或不饱和二羧酸、精油、磷脂酰衍生物、脑磷脂、萜烯、酰胺、醚、酮和尿素）

-增塑剂（例子包括但不限于邻苯二甲酸二乙酯和甘油）；

-溶剂（例子包括但不限于乙醇、玉米油、棉籽油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、纯净水、注射用水、无菌注射用水和无菌冲洗用水）；

-硬化剂（例子包括但不限于鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、微晶蜡、石蜡、硬脂醇、白蜡和黄蜡）；

-栓剂基质（例子包括但不限于可可脂和聚乙二醇（混合物）；

-表面活性剂（例子包括但不限于苯扎氯铵、壬苯醇醚10(nonoxynol10)、辛苯醇醚9(oxtoxynol)、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠和脱水山梨糖醇单棕榈酸酯）；

-悬浮剂（例子包括但不限于琼脂、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高岭土、甲基纤维素、黄蓍胶和硅酸镁铝(veegum)）；

-增甜剂（例子包括但不限于阿斯巴甜、葡萄糖、甘油、甘露醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖醇和蔗糖）；

-片剂抗粘着剂（例子包括但不限于硬脂酸镁和滑石）；

-片剂粘合剂（例子包括但不限于阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、非交联聚乙烯吡咯烷酮和预糊化淀粉）；

-片剂和胶囊稀释剂（例子包括但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、碳酸钠、磷酸钠、山梨糖醇和淀粉）；

-片剂包衣剂（例子包括但不限于液体葡萄糖、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素和紫胶）；

-片剂直接压片赋形剂（例子包括但不限于磷酸氢钙）；

-片剂崩解剂（例子包括但不限于海藻酸、羧甲基纤维素钙、微晶纤维素、波拉克林钾(polacrillin potassium)、交联聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠和淀粉）；

-片剂助流剂（例子包括但不限于胶体硅、玉米淀粉和滑石）；

-片剂润滑剂（例子包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌）；

-片剂/胶囊遮光剂（例子包括但不限于二氧化钛）；

-片剂抛光剂（例子包括但不限于巴西棕榈蜡（carnuba wax）和白蜡）；

-增稠剂（例子包括但不限于蜂蜡、鲸蜡醇和石蜡）；

-张度剂（例子包括但不限于葡萄糖和氯化钠）；

-增粘剂（例子包括但不限于海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠和黄蓍胶）；和

-湿润剂（例子包括但不限于十七烷乙烯氧基鲸蜡醇、卵磷脂、山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯硬脂酸酯）。

根据本发明的药物组合物的非限制性例子可以如下举例说明：

-无菌IV溶液：所需的本发明干扰物的5mg/mL溶液可以使用无菌可注射水进行制备，并且需要时调整pH。用无菌5%葡萄糖将溶液稀释至1-2mg/mL用于施用，并且作为IV输注剂经过约60分钟施用。

-用于IV施用的冻干粉末：无菌制剂可以用下述进行制备：（i）作为冻干粉末的100-1000mg所需的本发明干扰物，（ii）32-327mg/mL柠檬酸钠，和（iii）300-3000mg葡聚糖40。该制剂用无菌可注射盐水或葡萄糖5%复配至10-20mg/mL的浓度，其用盐水或葡萄糖5%进一步稀释至0.2-0.4mg/mL，并且IV推注或通过IV输注经过15–60分钟施用。

-肌内悬浮液：可以制备下述溶液或悬浮液，用于肌内注射：

50mg/mL所需的水不溶性（或水溶性）本发明干扰物

5mg/mL羧甲基纤维素钠

4mg/mL TWEEN80

9mg/mL氯化钠

9mg/mL苯甲醇

硬壳胶囊：通过填充标准两片式硬明胶胶囊制备大量单位胶囊，每个具有100mg粉末活性成分、150mg乳糖、50mg纤维素和6mg硬脂酸镁。

软明胶胶囊：制备在可消化油例如大豆油、棉籽油或橄榄油中的活性成分混合物，并且借助于容积泵注入熔化明胶内，以形成含有100mg活性成分的软明胶胶囊。将胶囊洗涤且干燥。活性成分可以溶解于聚乙二醇、丙三醇和山梨糖醇的混合物中，以制备与水混溶的医学混合物。

片剂：通过常规程序制备大量的片，使得剂量单位是100mg活性成分、0.2mg胶体二氧化硅、5mg硬脂酸镁、275mg微晶纤维素、11mg.淀粉和98.8mg乳糖。可以应用合适的含水和非含水包衣，以增加适口性、改善精致和稳定性或延迟吸收。

立即释放片剂/胶囊：这些是通过常规和新型过程制备的固体口服剂型。这些单位无需水而经口服用，用于药物的立即溶解和递送。将活性成分在含有成分例如糖、明胶、果胶和甜味剂的液体中混合。这些液体通过冷冻干燥和固态提取技术，固化成固体片剂或囊片。药物干扰物可以与粘弹性和热弹性糖和聚合物或泡腾组分一起压片，以产生预期无需水可以立即释放的多孔基质。

在特定实施方案中，干扰物在控制释放肠胃外制剂中配制。可以应用于施用干扰物的此类控制释放肠胃外递送系统的非限制性列表包括，基于油的注射剂、埋植剂、脂质体、纳米颗粒、PEG化、微球体和泵。在特定实施方案中，固体脂质纳米颗粒可以开发作为干扰物的载体系统。在另一个特定实施方案中，干扰物可以是装入微囊的。微球体是自由流动粉末，理想地直径小于约125μm，其可以悬浮于合适含水媒介物中，使用18或20-号针的常规注射器用于注射。用于此类使用的最有希望的聚合物是丙交酯/乙交酯共聚物、聚（原酸酯）和聚酐。聚（D,L-乙交酯共丙交酯）（PLGA）是生物可降解聚合物，其用酸或碱催化的反应水解，以形成天然代谢产物羟乙酸和乳酸。PLGA是FDA批准的。

如本文使用的术语‘施用’具有使目的蛋白质与分子接触的目的。注意，例如在感染性疾病的情况下，相对于其中的蛋白质应被聚集的生物体，施用可以针对不同的生物体。细胞内施用可以是通过载体介导的递送，例如通过脂质体载体或纳米颗粒或通过注射。在另外一个可替代实施方案中，聚集物分子可以通过介导细胞穿透（或细胞转运）的序列进入细胞。在后面一种情况下，聚集物分子通过重组或合成结合细胞穿透序列而进一步修饰。

联合治疗

在特定实施方案中，本发明的干扰物可以作为单一药学活性剂或与一种或多种其他药学活性剂组合施用，其中所述组合不引起无法接受的不利效应。本发明还涉及此类组合。例如，本发明的干扰物可以与已知抗微生物剂（例如抗真菌剂或抗生素）或其他适应症活性剂等、以及其混合物和组合一起组合。

本申请中，术语“治疗”照常规使用，例如受试者的管理或护理，用于对抗、减轻、减少、缓解、改善疾病或病症例如癌的状况等。治疗可以应用于感染性疾病以及非感染性病症。

剂量和施用：

基于已知标准实验室技术评估用于治疗感染性疾病（如实施例中所示，特别是真菌感染、细菌感染或病毒感染，特别是白色念珠菌感染、葡萄球菌属物种感染和流感病毒感染）或用于治疗非感染性疾病（例如癌症、AMD和炎症，如实施例中所示）的干扰物，通过标准毒性检测和通过标准药理学测定试验以确定对哺乳动物中上述状况的治疗，并通过将这些结果与用于治疗这些状况的已知药物的结果进行比较，可以容易地确定本发明干扰物用于治疗每种所需适应症的有效剂量。在这些状况之一的治疗中待施用的活性成分的量可以根据考虑因素而变化很大，所述考虑因素例如是采用的特定干扰物和剂量单位、施用方式、治疗期、治疗患者的年龄和性别、以及治疗状况的性质和程度。

待施用的活性成分的总量一般范围为0.001mg/kg-约200mg/kg体重/天，且优选约0.01mg/kg-约50mg/kg体重/天。临床上有用的给药方案将为每天给药一至三次到每四周给药一次。此外，其中患者持续一段时间不用药物给药的“药物假期”可能对药理学效应和耐受性之间的总体平衡是有利的。单位剂量可以含有约0.5mg-约1500mg活性成分，并且可以每天施用一次或多次或每天少于一次。用于通过注射（包括静脉内、肌内、皮下和肠胃外注射）和使用输注技术施用的平均日剂量，将优选是0.01-200mg/kg总体重。平均每日直肠给药方案优选是0.01-200mg/kg总体重。平均每日阴道给药方案优选是0.01-200mg/kg总体重。平均每日局部给药方案优选是每天一到四次之间施用的0.1-200mg。经皮浓度优选是维持0.01-200mg/kg的日剂量所需的浓度。平均每日吸入给药方案优选是0.01-100mg/kg总体重。优选地，用于吸入的组合物，以鼻烟或气溶胶或雾化器所用溶液的形式、或以用于吹入的超细粉末形式，单独或与惰性载体例如乳糖组合，呈现以用于施用给呼吸道。在此类情况下，活性干扰物的颗粒适当地具有小于50微米的直径，优选小于10微米，例如1–5微米，例如2–5微米。可替代地，可以使用包衣的纳米颗粒，具有30-500nm的粒度。有利的吸入剂量将在0.05-2mg的范围中，例如0.05-0.5mg、0.1-1mg或0.5-2mg。

对于技术人员显而易见的，用于每个患者的具体起始和持续给药方案将根据下述而改变：如通过主治医生确定的状况性质和严重性、采用的具体干扰物的活性、患者的年龄和一般状况、施用时间、施用途径、药物排泄率、药物组合等。本发明干扰物或其药学可接受的盐或酯或组合物的所需治疗模式和剂量数目可以通过本领域技术人员使用常规治疗试验进行确定。

在某些实施方案中，本发明的药物施用于哺乳动物纲，包括食肉目（例如犬和猫）、啮齿目（例如小鼠、豚鼠和大鼠）、兔形目（例如兔）和灵长目（例如人、黑猩猩和猴）。

作为常规实践，组合物通常伴随书面或印刷说明书用于相关医学治疗中。

本发明还包括同位素标记的干扰物，其相同于本文限定的那些，但将一个或多个原子替换为具有原子质量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子。可以掺入本发明的干扰物内的同位素例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如分别为²H、³H、¹³C、¹¹C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶CI。本发明的干扰物及所述干扰物的药学可接受的盐、或含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的干扰物在本发明的范围内。本发明的某些同位素标记的干扰物，例如放射性同位素例如³H和¹⁴C掺入其内的那些，可以用于药物和/或底物组织分布测定试验。由于其容易制备和可检测性，氚化即³H和碳-14即¹⁴C同位素是特别优选的。进一步地，由较重同位素例如氘即²H的置换可以提供因更大的代谢稳定性而引起的一定治疗优点，例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求，并且因此在一些情况下，可以是优选的。一般通过执行下文实施例中公开的程序，通过用可容易获得的同位素标记的试剂替代非同位素标记的试剂，可以制备同位素标记的本发明的式I干扰物。

如提及的，分子可以应用于治疗非感染性疾病和感染性疾病。根据第一实施方案，本发明的分子可以用于治疗与特定蛋白质的异常表达相关的（非感染）疾病（可替代地，用于制造药物以治疗（非感染）疾病），例如癌症、炎性疾病或免疫有关病症，所述特定蛋白质的异常表达为例如，特定蛋白质的过表达、或特定蛋白质的剪接变体或特定蛋白质的突变形式的（过）表达、膜锚定蛋白质的（过）表达、（突变型）跨膜蛋白质的（过）表达、分泌性蛋白（例如血液或血浆中存在的蛋白酶、抗体或细胞因子）的（过）表达、细胞外基质中的蛋白质（例如基质金属蛋白质或跨膜蛋白质（例如生长因子受体）的（过）表达。术语‘异常表达’指例如在癌症的情况下致癌生长因子的（过）表达，它还包括显性失活受体或突变型受体的表达、或血液中脱落受体的出现、或体液中细胞因子或生长因子的表达（或过表达）。在特定实施方案中，“异常表达”指不想要的翻译后修饰的蛋白质的存在、或不期望的非翻译后修饰的蛋白质的存在。翻译后修饰改变经修饰的氨基酸的理化性质，并且由此它们可能改变给定多肽区段的聚集趋势，这可用于特异性靶向具有最强的聚集趋势的形式。因此如果翻译后修饰显著降低β-聚集区的聚集趋势，则使用未经修饰的蛋白质将实现最有效的干扰。相反，对于增加β-聚集区的聚集趋势的翻译后修饰，则使用经修饰的蛋白质将获得最有效的干扰。基于单独疏水性，可以认为，修饰例如磷酸化和糖基化将降低聚集趋势，而脂质附着将增加聚集趋势。

在具体实施方案中，分子可以用于下调在疾病情形中需要被下调的（一种或多种）蛋白质。此类蛋白质一般是其过表达与疾病有关且优选是疾病病因的蛋白质（例如，VEGFR-2是其过表达与癌症和AMD在病因上关联的蛋白质，EGFR是其过表达与癌症在病因上关联的蛋白质，TNF是其过表达与炎症在病因上关联的蛋白质）。然而，它还可以是仅在疾病情形中表达、并且当细胞/组织/受试者健康时在待靶向的细胞/组织/受试者中正常不表达的蛋白质（例如PlGF是在成年组织中正常不表达的蛋白质，但它在肿瘤中表达）。待下调的蛋白质还可以是与疾病的病因性蛋白质在相同的信号传导途径中（一般为下游）的蛋白质（例如受体，当配体与疾病相关时），这样可以终止异常信号。

相应地，提供具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子用于在疾病的治疗、稳定或预防中使用，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与所述疾病相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

特别考虑的待治疗的疾病包括但不限于，癌症、AMD和炎性疾病。因此，提供具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子用于在癌症的治疗、稳定或预防中使用，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与所述癌症相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

类似地，提供具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子用于在年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗、稳定或预防中使用，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与AMD相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

同样地，提供具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子用于在炎性疾病的治疗、稳定或预防中使用，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与炎性疾病相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，在癌症或AMD中待下调的蛋白质是VEGFR-2。可替代地，在癌症中待下调的蛋白质是EGFR2。在炎性疾病中可以下调的具体蛋白质包括TNF-α和IL-1β。

如先前提及的，这等于说，提供在有需要的受试者中治疗、稳定或预防疾病（特别地，癌症、AMD或炎性疾病）的方法，其包括：给受试者施用具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与疾病（特别地，癌症、AMD或炎性疾病）相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

或者，以瑞士型(Swiss-type)形式，提供具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子在制造用于治疗、稳定或预防疾病（特别地，癌症、AMD或炎性疾病）的药物中的用途，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

本申请涵盖这三种等价表达形式，以符合不同国家的专利法要求。

受试者特别是动物，更特别是哺乳动物（例如猫、犬、兔、马、牛、猪、绵羊、山羊、美洲驼、小鼠、大鼠、……），最特别是人。也考虑其他受试者（参见定义）。

然而，注意，这些方法还可以应用于除哺乳动物外的生物体，特别是治疗植物中的疾病（参见下文）。

在特定实施方案中，干扰物分子针对生长因子或生长因子受体、或跨膜受体激酶（例如酪氨酸激酶受体）。非限制性例子的列表包括，PDGF-β蛋白质（并且特定干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的PDGF-β表达的病症例如睾丸癌和肺癌的受试者）、Erb-B蛋白质（并且特定干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的Erb-B表达的病症例如乳腺癌的受试者）、VEGF蛋白质（并且特定干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的VEGF表达的病症例如食道、结肠癌或病理性血管生成的受试者）、EGFR蛋白质（并且特定干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的EGFR表达的病症例如乳腺癌的受试者）、WNT-1蛋白质（并且特定干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的WNT-1表达的病症例如基底细胞癌的受试者）、Her2/Neu蛋白质（并且干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的Her2/Neu表达的病症例如乳腺癌的受试者）、αv-整联蛋白（并且干扰物可以用于治疗患有特征在于不想要的αv-整联蛋白的病症例如脑瘤或上皮起源的肿瘤的受试者）、Flt-1受体蛋白质（并且干扰物可以用于治疗患有特征在于不需要的Flt-1受体的病症例如癌症和类风湿性关节炎的受试者）。可以设计对于下述具有特异性的另外其他特定干扰物例子：整联蛋白的共配体例如VLA4、VCAM、ICAM，选择素或其共配体例如P-选择素、E-选择素（ELAM）、L-选择素、或P-选择素糖蛋白-（PSGL1），补体系统的组分例如C3、C5、C3aR、C5aR、C3转化酶、C5转化酶，趋化因子或其受体的功能例如TNF-α、IL-1α、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11或CCR3，离子通道的组分，G蛋白偶联受体的组分、或神经递质受体或其配体的功能。

根据另一个方面，特别考虑的医学应用是本文提供的分子作为药物用于感染性疾病中的用途。

因此，提供具有下述结构的分子用作抗病原（或抗感染）药物：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

根据特定实施方案，分子用作抗微生物剂。因此，提供具有下述结构的分子用作抗微生物剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

对于干扰物的用途，因此考虑用于治疗由动物和人细菌病原体引起的感染、用于动物和人真菌病原体、以及用于动物和人寄生病原体。动物和人病原体的非排他性列表在美国专利8,088,888的表1A（第8页起，第15页止）中找到。动物和人真菌病原体的非排他性列表在美国专利8,088,888的表1B（在第15页上开始，在第18页上结束）中找到。动物和人寄生病原体的非排他性列表在美国专利8,088,888的表1C（在第18页上开始，在第20页上结束）中找到。美国专利8,088,888的表1A、1B和1C在此整体引入作为参考。

根据另一个特定实施方案，分子用作抗病毒剂。因此，提供具有下述结构的分子用作抗病毒剂：（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

另一种等价表述方式是，提供这些分子在制造用于治疗病原体感染（或微生物或病毒感染）的药物中的用途，即瑞士型权利要求。

这还等于说，提供在有需要的受试者中预防或治疗病原体感染的方法，其包括：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是病原体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

或者，在抗微生物剂的情况下，这等于，提供治疗有需要的受试者中的微生物感染的方法，其包括：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

或者，在抗病毒剂的情况下，等于提供治疗有需要的受试者中的病毒感染的方法，其包括：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

这些方法的其它步骤可以包括评估（或测量）病原性（例如微生物、病毒）生物体的存在（例如监控病原性生物体的生长、繁殖或存活）。

如本文使用的“微生物生物体”可以指细菌例如革兰氏阳性菌（例如球菌例如葡萄球菌属物种、肠球菌属物种（Enterococcus sp.）、杆菌例如芽孢杆菌属物种（Bacillussp.））、革兰氏阴性菌（例如埃希氏杆菌属（Escherichia）物种、耶尔森氏菌属（Yersinia）物种）、螺旋体（Spirochaetes）（例如密螺旋体属（Treponema）物种例如苍白密螺旋体（Treponema pallidum）、钩端螺旋体属（Leptospira）物种、疏螺旋体属（Borrelia）物种例如伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi））、柔膜体（Mollicutes）（即无细胞壁的细菌，例如支原体属（Mycoplasma）物种）、抗酸细菌（例如分枝杆菌属（Mycobacterium）物种例如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosum）、诺卡尔菌属（Nocardia）物种）。“微生物生物体”还包含真菌（例如酵母和霉菌，例如念珠菌属物种、曲霉菌属（Aspergillus）物种、球孢子菌属（Coccidioides）物种、隐球酵母属（Cryptococcus）物种、组织胞浆菌属（Histoplasma）物种、肺孢菌属（Pneumocystis）物种、或发癣菌属（Trichophyton）物种）、原生动物（例如疟原虫属物种、内阿米巴属物种、贾第虫属物种、弓形虫属物种、隐孢子虫属物种、毛滴虫属物种、利什曼原虫属物种、锥虫属物种）和古细菌。根据特定实施方案，微生物生物体的蛋白质是选自细菌、真菌或原生动物的微生物生物体的蛋白质。更特别地，蛋白质是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌、柔膜体、原生动物或真菌的蛋白质。更特别地，它是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、分枝杆菌或真菌例如酵母和霉菌的蛋白质。

“病毒生物体”或“病毒”在本文中作为等价表述使用，是可以仅在生物体的活细胞内复制的小感染性物质。它们包括dsDNA病毒（例如腺病毒（Adenoviruses）、疱疹病毒（Herpesviruses）、痘病毒（Poxviruses））、ssDNA病毒（例如细小病毒（Parvoviruses））、dsRNA病毒（例如呼肠孤病毒（Reoviruses））、（+）ssRNA病毒（例如小核糖核酸病毒（Picornaviruses）、披膜病毒（Togaviruses））、（-）ssRNA病毒（例如正粘病毒（Orthomyxoviruses）、弹状病毒（Rhabdoviruses））、ssRNA-RT（逆转录）病毒，即生命周期中具有（+）有义RNA与DNA中间体的病毒（例如逆转录病毒（Retroviruses））、和dsDNA-RT病毒（例如嗜肝DNA病毒（Hepadnaviruses））。一类特定的病毒是细菌噬菌体（或简言之噬菌体）——感染细菌且注入其遗传物质（ssRNA、dsRNA、ssDNA或dsDNA）的病毒。噬菌体在海水中是特别丰富的，并且许多海洋细菌由噬菌体感染。细菌噬菌体可能在使用细菌的工业过程中（例如在食品例如酸奶酪、干酪等生产中）成为问题。

在涉及治疗非人动物中的病毒感染或抑制病毒感染力的方法中，动物病毒优选选自：小核糖核酸病毒例如牛肠道病毒、猪肠道病毒B、口蹄疫病毒、马鼻炎A病毒、牛鼻炎B病毒、ljungan病毒、马鼻炎B病毒、爱知病毒(aichi virus)、牛嵴病毒(kobuvirus)、猪捷申病毒(teschovirus)、猪萨佩罗病毒(sapelovirus)、猿猴萨佩罗病毒、禽萨佩罗病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸭甲型肝炎病毒、或猿猴肠病毒A；瘟病毒(pestivirus),例如边界病病毒(border disease virus)、牛病毒性腹泻、或古典猪瘟病毒(classical swine fevervirus)；动脉炎病毒，例如马动脉炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乳酸脱氢酶升高病毒、或猿猴出血热病毒；冠状病毒，例如牛冠状病毒、猪冠状病毒、猫冠状病毒或犬冠状病毒；副粘病毒例如亨德拉病毒(hendra virus)、尼帕病毒(nipah virus)、犬瘟热病毒(caninedistemper virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、新城疫病毒、和牛呼吸道合胞病毒；正粘病毒例如A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒；呼肠孤病毒，例如蓝舌病毒；猪环状病毒、疱疹病毒例如假性狂犬病病毒或牛疱疹病毒1型；asfarvirus，例如非洲猪瘟病毒；逆转录病毒例如猿猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、绵羊肺腺瘤逆转录病毒、或山羊关节炎脑炎病毒；黄病毒例如黄热病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、或牛病毒性腹泻；或弹状病毒例如狂犬病病毒。

在涉及治疗人中的病毒感染或抑制病毒感染力的方法中，人病毒优选选自腺病毒、星状病毒、嗜肝DNA病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、痘病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、杯状病毒、冠状病毒、线状病毒、黄病毒、正粘病毒、副粘病毒、小核糖核酸病毒、呼肠孤病毒、逆转录病毒、弹状病毒或披膜病毒。在优选实施方案中，腺病毒包括但不限于人腺病毒。在优选实施方案中，星状病毒包括但不限于哺乳动物星状病毒(mamastrovirus)。在优选实施方案中，嗜肝DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒。在优选实施方案中，疱疹病毒包括但不限于单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、蔷薇疹病毒（roseolovirus）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒。在优选实施方案中，乳多空病毒包括但不限于人乳头状瘤病毒和人多瘤病毒。在优选实施方案中，痘病毒包括但不限于天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒、猴痘病毒、痘疮病毒(smallpot virus)、假牛痘病毒、丘疹状口炎病毒、塔那痘病毒、亚巴猴瘤病毒和传染性软疣病毒。在优选实施方案中，沙粒病毒包括但不限于淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、拉沙病毒(lassa virus)、马丘波病毒(machupo virus)和胡宁病毒(junin virus)。在优选实施方案中，布尼亚病毒包括但不限于汉坦病毒、纳伊罗病毒、正布尼亚病毒和白蛉病毒。在优选实施方案中，杯状病毒包括但不限于vesivirus、norovirus例如诺瓦克病毒（Norwalk virus）、和Sapovirus。在优选实施方案中，冠状病毒包括但不限于人冠状病毒（严重急性呼吸综合症（SARS）的致病因子）。在优选实施方案中，线状病毒包括但不限于埃博拉病毒和马尔堡病毒(Marburg virus)。在优选实施方案中，黄病毒包括但不限于黄热病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、墨累山谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、圣路易斯脑炎病毒、苏联春夏脑炎病毒、鄂木斯克出血热病毒(omsk hemorrhagic fever virus)、牛病毒性腹泻病毒、科萨努尔森林病病毒（Kyasanus forest disease virus）和波瓦生脑炎病毒(Powassan encephalitis virus)。在优选实施方案中，正粘病毒包括但不限于A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒。在优选实施方案中，副粘病毒包括但不限于副流感病毒、腮腺炎病毒（腮腺炎）、麻疹病毒（麻疹）、肺病毒(pneumovirus)例如人呼吸道合胞病毒、和亚急性硬化性全脑炎病毒。在优选实施方案中，小核糖核酸病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒A、柯萨奇病毒B、甲型肝炎病毒、埃可病毒和肠病毒。在优选实施方案中，呼肠孤病毒包括但不限于科罗拉多蜱传热病毒和轮状病毒。在优选实施方案中，逆转录病毒包括但不限于慢病毒例如人免疫缺陷病毒和人嗜T细胞病毒（HTLV）。在优选实施方案中，弹状病毒包括但不限于丽沙病毒例如狂犬病病毒、水疱性口炎病毒和传染性造血器官坏死病。在优选实施方案中，披膜病毒包括但不限于甲病毒例如罗斯河病毒、奥尼翁-尼翁病毒、辛德毕斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和风疹病毒。

根据特定实施方案，病原性生物体的蛋白质是来自抗药病原体、株或变体的蛋白质。抗药性已知在几种病原体，特别是病毒和微生物，中出现。

抗药性的一个特定例子是抗生素抗性，因此，根据进一步特定实施方案，微生物生物体的蛋白质是来自抗生素抗性生物体、株或变体的蛋白质，或者是也出现在抗生素抗性生物体中的蛋白质。还参见实施例部分。因为本发明分子具有与已知抗生素完全不同的作用机制（即，它们聚集微生物生物体的靶蛋白质），所以考虑抗生素抗性生物体对这些分子不具有抗性。此外，因为蛋白质的大多数疏水区在蛋白质的保守部分中，所以考虑抗生素抗性（例如抗微生物剂抗性）针对这些分子比针对常规抗生素更慢发展。事实上，根据特定实施方案，本发明方法包括分子的延长施用而无MIC值的显著增加。因此，提供用于施用的方法，其中如本文描述的分子每天施用至少一次共至少十天，或每天至少一次共十四天。特别地，该治疗方案不伴随抗生素抗性的发展。因此，这些实施方案预计，MIC值经过该时间范围不增加超过四倍，或不加倍。最特别地，考虑在延长施用的过程中，干扰物分子对于特定微生物生物体的MIC值保持低于干扰物分子对于该特定微生物生物体的临床折点。

根据具体实施方案，分子可以用于杀死病原性（例如微生物）生物体，或方法导致病原性（例如微生物）生物体的杀死。根据再进一步具体实施方案，分子成功地快速杀死病原性（微生物）生物体，特别在一小时或更少时间内、或在30分钟或更少时间内。快速杀菌效应（或对微生物的快速杀死效应）不仅甚至在单一疗法中获得更佳的临床结果（Finch等人，Antimicrob Agents Chemother；46（6）:1746-54，2002），还可以缩短抗微生物疗法的持续时间和住院期的长度，以及促成减少的抗性发展。这已经例如通过快杀性的氟喹诺酮抗生素而被证实（Albertson等人，Int J Clin Pract.；64（3）:378-88，2010）。

根据可替代实施方案，使用分子的方法抑制病原性（例如微生物或病毒）生物体的生长和/或繁殖，而不杀死它。

根据特定实施方案，微生物生物体的蛋白质是必需蛋白质，即如果生物体耗尽该蛋白质，则它不能存活。根据其他（非排他性）特定实施方案，微生物生物体的蛋白质参与生物膜形成。如技术人员应意识到的，生物膜形成是充分表征的现象，并且参与生物膜形成的多种蛋白质已得到鉴定和/或表征。这些蛋白质在不同微生物物种中可以不同（或可以是同源的，但具有不同名称）。此类蛋白质的例子包括但不限于Hwp1，Als蛋白质家族（特别是在白色念珠菌中），由EPA基因家族编码的蛋白质，AWP1-4基因家族和PWP基因（特别是在光滑念珠菌（C.glabrata）中），耶尔森菌属中由hmsHFRS、gmhA、yrbH、waaAE-coaD、hmsT、hmsP、speA、speC、nghA、rcsA、rcsC、rcsDB、phoPQ基因编码的蛋白质（参见Zhou和Yang，ProteinCell2011的表1），葡萄球菌属中由icaADBC、icaR、sar、agr、rbf、sigma（B）基因编码的蛋白质。

根据进一步实施方案，提供治疗或预防生物膜形成的方法，其中微生物生物体的蛋白质参与生物膜形成。根据再进一步的实施方案，生物膜形成在物体，特别是可植入装置例如导管或支架上。

因此，根据这些实施方案，提供预防、抑制或逆转表面上的微生物生物膜生长的方法，其包括使该表面与具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子接触，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，微生物生物体的蛋白质是参与生物膜形成的蛋白质。预防、抑制或逆转在其上的生物膜形成的表面可以是生物的或非生物的表面。特别地，该表面可以在受试者的机体上或内，来自机体自身，或来自机体内的外源物体例如植入装置。

尽管主要考虑预防或治疗受试者中的微生物感染，但应注意，分子同样可以用作抗微生物剂以预防或治疗位于受试者机体外部的表面或物体上的（病原性）微生物体的存在。该应用主要旨在包被高价值的或无菌的材料，例如用于可植入装置的材料。相应地，提供预防、抑制或逆转可植入装置例如导管或支架的表面上的微生物生物膜生长的方法。

因此，经包被/涂布的装置也考虑在本发明的范围内。该装置的涂布(包被)可以直接通过将分子应用于装置来完成。可替代地，它们可以使用（交联）接头涂布到装置上。装置可以是完全涂布的（例如通过将装置浸入分子的溶液中），或可以仅涂布装置的部分。特别考虑，装置由针对微生物生物体中存在的蛋白质的分子涂布，所述蛋白质特别是参与生物膜形成的蛋白质。然而，还考虑，装置由针对其他蛋白质的分子（或由具有双特异性且通过不同Y_i部分靶向微生物生物体的一个蛋白质和另一种蛋白质的分子）涂布。例如，装置的植入常可以引起局部的不良免疫反应。这些可以通过用靶向针对涉及这些免疫反应中的蛋白质的分子（或用例如针对两种不同蛋白质的双特异性分子）涂布装置的至少部分而抵制。作为另一个例子，为了抵制（特别是形成生物膜的）真菌和细菌的共感染，装置的至少部分可以用靶向针对真菌蛋白质的分子涂布，而部分用靶向针对细菌蛋白质的分子涂布（或用具有针对真菌蛋白质和细菌蛋白质的（至少双）特异性的分子涂布）。

因此，提供至少部分由具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子涂布的装置（特别是可植入装置），其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

最特别地，至少一个Y_i是微生物生物体的蛋白质，特别是参与生物膜形成的蛋白质，中天然存在的区段。

筛选方法

根据进一步方面，提供在细胞系（包括但不限于人、哺乳动物、昆虫和植物细胞系）、病原体或微生物生物体中筛选新化合物的方法。这些方法，甚至在没有有关靶的先前知识的情况下，允许快速鉴定对所研究的细胞系或生物体的生长、繁殖或存活具有影响的化合物、或在所述细胞系或蛋白质中抑制蛋白质功能和/或聚集蛋白质的化合物。然而，因为通过聚集的下调是序列特异性的，所以通过工作化合物的序列可以实现靶的快速鉴定。因此，不仅可以使用这些筛选方法获得新化合物，还允许鉴定新药物靶。基于此原因，也可能特别有意义的是，使用建模疾病的细胞系（例如癌细胞系、或甚至直接从肿瘤中分离的细胞）。

此筛选方法包括步骤：

a）在至少一种蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，在所述区域中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、A、H、G和Q；更特别地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸，最特别地选自R、K和P；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的至少一种蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入步骤a）的蛋白质中；和

d）评估蛋白质的功能和/或聚集。

特别地，筛选方法将在细胞系统中或直接在病原体上执行。这些方法涉及步骤：

a）在细胞系、病原体或微生物生物体的至少一种蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，在所述区域中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的细胞系、病原体或微生物生物体的至少一种蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入在其基因组中编码步骤a）的蛋白质的细胞系、病原体或微生物生物体中；和

d）评估细胞系、病原体或微生物生物体的存活和/或生长或繁殖。

如上文提及的，需要时，该方法可以进一步包括，使（在步骤b中合成的）影响细胞系、病原体或微生物生物体的存活、生长和/或繁殖的分子的Yi序列与步骤a）中鉴定的蛋白质相关联的步骤，以鉴定所靶向的蛋白质。然而，该关联步骤不是必需的——对于抗病原化合物，比知晓所靶向的确切蛋白质，可能更重要的是分子成功地抑制病原体的存活、繁殖或生长。

因为对于病原性生物体（例如微生物或病毒生物体）主要考虑抑制靶生物体的存活、生长或繁殖，所以这些方法特别合适于筛选新抗病原（例如抗微生物或抗病毒）化合物。

因此，根据具体实施方案，提供筛选新抗病原化合物的方法。这些方法包括步骤：

a）在病原体的至少一种蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，在所述区域中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、A、H、G和Q；更特别地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸，最特别地选自R、D和P；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的病原性生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入在其基因组中编码步骤a）的蛋白质的病原性生物体中；和

d）评估病原性生物体的存活和/或生长或繁殖。

根据具体实施方案，提供筛选新抗微生物化合物的方法。这些方法包括步骤：

a）在至少一种微生物蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，在所述区域中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入在其基因组中编码步骤a）的蛋白质的微生物生物体中；和

d）评估微生物生物体的存活和/或生长或繁殖。

在评估存活中，可以测定MIC值。为了鉴定具有抗微生物活性的化合物，即将分子分类为命中物，MIC应特别低于100μg/ml，更特别低于50μg/ml、20μg/ml，或最特别低于10μg/ml（例如5μg/ml、2μg/ml或1μg/ml）。

尽管MIC值一般以μg/ml表达，但应注意，本发明化合物的分子量平均显著高于经典抗生素化合物的分子量。事实上，虽然抗生素一般具有在200-700道尔顿范围中的分子质量，但由于在至少X和Y部分中的氨基酸的存在，并且由于超过一个‘单位’可以存在于分子中（即n可以高于一），故本发明分子的分子量一般比1000道尔顿高（得多）。因此，相似的摩尔浓度将给出高得多的分子质量，并且因此高得多的MIC值。换言之，为了测定有效的抗微生物效应，可以有利的是，计算μg/ml值的摩尔当量（并且例如与其他抗生素的摩尔值比较）。

根据进一步具体实施方案，提供筛选新抗病毒化合物的方法。这些方法包括步骤：

a）在至少一种病毒蛋白质中鉴定4–16个连续氨基酸的至少一个区域，在所述区域中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基；

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a）中鉴定的病毒生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c）将步骤b）中制备的至少一种分子加入在其基因组中编码步骤a）的蛋白质的病毒生物体中；和

d）评估病毒生物体的存活和/或生长或繁殖。

一般地，对于病毒，存活可以通过评估对受感染细胞的影响（例如存活）间接测量。这种间接方法还可以应用于其他病原性生物体。然而，直接方法通常是优选的，因为它们是更定量的。对于病毒，可以测定病毒滴度。可替代地，可以设置微型复制子系统，其中仅存在特定病毒蛋白质，并且其中报道蛋白质指示对病毒繁殖或‘存活’的影响。

值得注意的是，尽管筛选方法在本文中描述为鉴定新抗病原化合物的方法，但技术人员易于理解，这些方法也可以用于鉴定针对非病原蛋白质的新化合物，以选择最有效的化合物。例如，被考虑通过下调蛋白质而治疗疾病的分子可以首先在具有合适读出的细胞或动物模型中筛选有效性（条件是，对应于该至少一个Y_i区段的区域的序列保守性足以允许在细胞或动物模型中和在化合物应施用于的生物体中使用该相同的化合物）。这可以用于例如含有不同β-聚集区的蛋白质，或以鉴定β-聚集区的最佳组合。

事实上，类似于筛选影响病原性生物体的生长、繁殖和/或存活（并且因此，可以用于治疗感染性疾病）的分子的方法，这些方法可以用于筛选可以在非感染性疾病中使用的分子。这些方法可以用于鉴定针对已知靶的最有效的化合物（例如通过在细胞系中筛选，所述细胞系具有与靶活性联系的报道分子、或依赖于靶的存在而存活），或鉴定新靶。后者对于其中细胞死亡可以被读出的应用是特别正确的，因为它们不依赖于报道分子测定试验。然而，这些方法同样可以用于在可获得报道分子测定试验的途径中鉴定新靶。

本文的筛选方法提供超过现有筛选方法的相当大的优点。一方面，它们不是随机筛选，并且因此更可能获得成功的化合物。另一方面，它们不要求可以得到靶蛋白质的3D结构用于有效筛选，因为靶向是完全基于序列的。鉴定新靶已知是抗微生物剂或抗生素的特定问题。

为了确保鉴定的化合物是有效的且无副作用，应测试化合物的毒性，特别对脊椎动物、最特别在哺乳动物系统中。另外，为了避免无关蛋白质（例如在鉴定新抗生素分子的情况下，非微生物蛋白质）的靶向，应测试交叉反应性。这在第一种情况下可以容易地通过下述完成：比较步骤a）中鉴定的序列与化合物（例如抗微生物或抗病毒化合物）施用于的生物体/物种的序列，例如通过序列比对程序例如BLAST进行。对于针对病原体的分子（待用于抗感染应用中），特别考虑，与分子中存在的病原性（例如微生物）蛋白质区段相同的该一个或多个Yi部分，在待施用分子的生物体/受试者（一般为哺乳动物，特别是人）的基因组中不编码。

在涵盖鉴定抗病原（例如抗微生物）化合物的新靶的方法的实施方案中，特别考虑，步骤a）中的病原性（例如微生物）蛋白质不是已知的药物（例如抗生素）靶。这使得鉴定的化合物在联合治疗中特别有用，因为其应对不同的靶标。此外，如果靶不是已知的药物（例如抗生素）靶，则仍未发展出药物（抗生素）抗性。

另一个特定优点是，可以执行筛选方法，而无针对特定蛋白质作为感兴趣靶的选择偏倚性。事实上，可以分析生物体（或细胞系）的整个蛋白质组，并且合适的序列可以用于本文描述的分子内，并且测试有效性。这导致获得新靶的高机会。此外，当进行此类分析时，特别对于抗病原应用，可以考虑步骤a）中鉴定的区域是在蛋白质组中出现超过一次的区域。更特别地，步骤a）中鉴定的4–16个连续氨基酸的该至少一个区域在病原性（例如微生物或病毒）生物体的超过一种蛋白质中出现。

事实上，在许多情况下，当面对感染时，期望靶向超过一种病原性生物体。例如在由微生物生物体的感染中，这是显而易见的，其中常使用广谱抗微生物剂。这样允许即使不了解感染性生物体的准确身份，也可对抗感染。在本发明方法中，还可以确保，在步骤a）中鉴定的4–16个连续氨基酸的至少一个区域在超过一种微生物生物体的蛋白质或至少一种蛋白质中出现。

最特别地，此处靶向的微生物生物体是病原性微生物生物体。为了确保不杀死有益的微生物生物体（例如在受试者的肠菌群中的有益微生物），可以检查在微生物生物体中鉴定的区段是否是对病原性生物体特异性的，并且在有益微生物中不出现。

分离、耗竭、检测和诊断

在另一个实施方案中，本发明提供了从样品中分离特定蛋白质的方法，其包括使所述样品与至少一种干扰物分子接触，并且从所述样品中分离所得到的共聚集的干扰物-蛋白质复合物。即，干扰物分子充当抓走靶蛋白质的结合剂。这可以在其中需要检测的所有领域中使用（例如在白色生物技术中以测量污染物的水平，在红色或绿色生物技术中以测量例如生物标记或代谢产物的水平等）。

在进一步的实施方案中，用于从样品中分离特定蛋白质的方法进一步包括从样品中分离所述至少一种蛋白质。从样品中分离至少一种蛋白质的一种应用是，从样品中去除（或耗竭）高富度的蛋白质。事实上，蛋白质靶回收和验证中的一个主要挑战是，如何特异性解剖复杂的蛋白质样品（例如血浆、尿、脑脊髓液）和测量痕量靶（即，非常低富度的靶）。一般地，丰富蛋白质的浓度通常比低富度蛋白质的浓度高6-10个数量级。因此，在某些情况下，必须去除高富度蛋白质，以检测和测量具有医学重要性的痕量蛋白质。因为白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白和触珠蛋白构成人血清中总蛋白质含量的约90%，所以十分需要快速耗竭这些不需要的丰富蛋白质和暴露较不丰富的低分子量蛋白质生物标记的诊断工具。几种方法已在本领域中使用：1）免疫球蛋白G（IgG）作为亲和试剂，以捕获且分离丰富蛋白质靶，2）卵黄免疫球蛋白（IgY）是从免疫接种的鸟的蛋黄中分离的IgG样抗体，3）预分级分离用于将蛋白质的混合物分离成不同级分，以去除原始混合物中的某些蛋白质，和4）蛋白A和蛋白G是对于IgG抗体具有特异性的细菌细胞壁蛋白质，因此蛋白A和G亲和树脂提供IgG的去除，和5）IgG-和IgY-微珠用于蛋白质检测。

在另一个具体实施方案中，用于分离至少一种蛋白质的方法进一步包括检测所述分子-蛋白质复合物中的至少一种蛋白质。可以通过例如电泳、柱层析、过滤、静电吸引、磁或顺磁吸引、质谱法等，分离干扰物分子-靶蛋白质复合物，以执行检测。

根据进一步方面，如权利要求中进一步定义的，干扰物分子用于检测中或用作诊断剂。因此，如权利要求中进一步定义的，干扰物分子可以用于诊断方法中。相应地，提供了用于检测和诊断的方法。

因此，提供检测样品中的蛋白质的方法，其包括步骤：

a）使怀疑含有蛋白质的样品与具有下述结构的分子接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

b）检测与蛋白质反应的分子的存在。

样品可以原样提供或可以进行预处理。在步骤b）中‘与蛋白质反应的分子’考虑正与蛋白质反应的分子（即实时检测）和已与蛋白质反应的分子两者。这些分子仍可以在与蛋白质的接触中或可以不再接触。这种检测还可以通过蛋白质完成，即检测与分子反应的蛋白质的存在。检测在两种情况下均可以是直接的（通过测量已反应的分子或蛋白质）或间接的（通过测量未反应的级分）。

根据特定实施方案，天然存在于待检测的蛋白质中的该至少一个Y_i对于所述样品中的所述蛋白质是独特的。因此，例如，在人来源的样品中，也出现在待检测的蛋白质中的该序列仅在人基因组中编码一次（或仅在人蛋白质组中出现一次），即在待检测的蛋白质（编码其的序列）中。尽管该独特性不一定是必需的——例如，当不同蛋白质具有相同序列且一起检测、它们仍可以例如基于大小进一步区分时——但特别考虑这点以促进检测。‘在所述样品中’的表述在确定蛋白质区段的独特性中是重要的：例如如果样品是预处理的，则与在复杂混合物中或在来自不同（微）生物体的样品中的检测，它可能含有较少的不同蛋白质。

应注意，本发明检测方法高度类似于已经确立的方法典型地基于抗体的检测方法。显著差异是特定分子的使用。事实上，应注意，在本文描述的检测方法中，如本文定义的分子发挥与抗体相似的作用。因此，在通常基于抗体的检测方法中，本文描述的分子可以替换至少一种抗体。例如，其中至少一个Y_i是待检测的蛋白质中天然存在的区段的分子可以替换检测试验中的一级抗体（并且可以是标记的‘一级干扰物’），其中Yi是用于检测的一级抗体中天然存在的区段的分子可以替换二级抗体。可替代地，二级干扰物分子可以针对融合至一级抗体的标签或标记，或可以针对与之融合的‘一级干扰物’或部分。

根据具体实施方案，用于检测的分子包含可检测标记。根据进一步具体实施方案，步骤b）中的检测是通过可检测标记的检测。

根据特定实施方案，该方法另外包括，在步骤b）中的检测前，分离与蛋白质反应的分子和未与蛋白质反应的分子。还可以相反进行：在检测前，分离与分子反应的蛋白质和未与分子反应的蛋白质。分离两者中的哪一个典型地依赖于实验的设置、和例如固定的是蛋白质还是分子。

步骤b）中的检测可以是直接或间接的，例如通过检测分子的未反应的级分。检测可以是定性（例如蛋白质存在或不存在）、半定量（例如存在较多还是较少的蛋白）或定量（例如存在多少蛋白质）。

根据特定实施方案，样品来自受试者，特别来自哺乳动物受试者，最特别来自人受试者。然而，原则上，可以检测含有聚集成核区的任何蛋白质，从而样品的来源可以来自任何生物体（例如植物、昆虫、病原体、哺乳动物）。样品甚至无需来自生物体，只要它含有蛋白质。例如，它可以是待在其中测量蛋白质（例如激素、雌激素）存在的流体（例如水、啤酒）样品，或它可以是食物或饲料样品。重要的是提及，对于来自生物体的样品，样品和待检测的蛋白质无需来自相同物种。例如，在检测病原体存在的情况下，考虑样品将取自受试者或植物，而待检测的蛋白质来自病原体（例如病毒或微生物）。

一般来说，诊断方法包括下述步骤：i）检查相（数据的收集，即在样品中的蛋白质生物标记的定性或定量检测），ii）所获得数据与标准值（例如来自非患病受试者的样品）的比较，iii）在所获得数据和参考数据之间的任何显著差异的发现（即通过比较数据），和iv）将差异归于特定临床表现（动物受试者）或状态（植物受试者）。注意，这些步骤还可以采取用于常规检测方法。在这种情况下，步骤iv）中获得的状态不是疾病状态，而是例如污染物的存在。

相应地，在具体实施方案中，在样品中检测的蛋白质的存在、不存在或量指示疾病状态（或健康）。此疾病状态可以例如是疾病的存在、疾病的不存在（即健康的发现）、疾病的进展（例如恶性、转移、对治疗的反应）。与疾病状态相关的蛋白质例如生物标记的例子在本领域有充分文献报道。因此，提供用于样品中检测蛋白质生物标记（即，指示疾病状态的蛋白质）的方法，其包括使所述样品与对于所述蛋白质生物标记具有特异性的至少一种干扰物接触，任选地从所述样品中分离所得到的共聚集的干扰物-蛋白质生物标记复合物，和检测所述干扰物-蛋白质生物标记。蛋白质生物标记越来越多地用于临床中，以预测疾病的发作、诊断疾病、监控疾病的进展、和提供关于其对治疗的应答性的预后（即，预测对治疗的反应、不利事件和药物相互作用、以及确定基线危险）。众所周知的用于人受试者的生物标记例子包括用于前列腺癌（早期检测）的前列腺特异性抗原（PSA）、用于胃肠癌的癌胚抗原、用于全身性炎症的C反应蛋白（CRP）、类风湿因子、用于类风湿性关节炎的抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP）、用于关节损伤的MMP-3、和用于阿尔茨海默氏病的淀粉样蛋白β抗体。蛋白质生物标记理论上优于mRNA标记，因为其增加的稳定性和更广泛范围的研究蛋白质的技术。在生物标记研究中激增的兴趣正在驱动现代医疗实践中新预测、诊断和预后产品的开发，并且生物标记还在新药开发和发展中起越来越重要的作用。蛋白质生物标记可以在体液（例如血清、尿、血液、唾液、泪、CSF、滑液、血液、乳头抽吸液、腹水、精液、汗液、肿瘤活检物（biopt））中鉴定。生物标记可以分成预测或预后种类。预后生物标记与结果例如存活、反应（例如对特定治疗）和复发的可能性相关。预测生物标记是在事件发生前存在的用于预测结果的生物标记。预测生物标记可以是阳性或阴性的。生物标记不仅可以用于诊断疾病，还可以用于患者选择或随访。随着研究继续，对于生物标记可以在疾病管理领域（例如癌症、心脏学、神经病学、代谢、自身免疫和炎性疾病）中发挥的作用，我们的理解已得到发展。

可以用本发明的干扰物分子和方法检测的蛋白质生物标记的非限制性列表包含，肺癌生物标记的诊断（如WO2005098445中所述）、头颈鳞状细胞癌的诊断（如WO2005034727）、腹主动脉瘤的诊断（如WO2009046267）、HTLV介导的疾病的诊断（如WO2004029575中）、乳腺导管癌的诊断（如WO2009039023中）、前列腺癌的诊断（如WO2004030511中）、阻塞性睡眠呼吸暂停的诊断（如WO2006020567中）、吉非替尼治疗的GBM患者的预后（如WO2010033993中）、肌萎缩侧索硬化的发作和/或进展的诊断（如WO2006060799中）、轻度认知损害和阿尔茨海默氏病的诊断（如WO2008014314中）、肝纤维化的诊断（如US20100323374中）、神经系统损伤的诊断（如EP2207033中）、骨骼肌损害的检测（如WO2007066129中）、阻塞性睡眠呼吸暂停的诊断（如WO2006020567中）、恶性乳腺癌的诊断（如WO20052463中）、泌尿学病症的诊断（如WO2010078403中）、发育毒性和胚胎毒性的体外测试（如WO2009146915中）、成胶质细胞瘤的预后和治疗结果（如WO2009102729中）、放射性损伤和暴露的评估（如WO2008140463中）、肝癌的检测（如US20050202485中）、鼻咽癌的检测（如US20050158745中）、卵巢癌的检测（如WO2003057014中）、在具有银屑病关节炎的患者中针对抗TNF-α抗体的临床应答的预测（如WO2011014349中）、用于鉴定口癌和牙周病的唾液生物标记的检测（如US20110021370中）、巴瑞特氏食道和食管腺癌的诊断（如WO2010115077中）、心房颤动和中风的诊断（如WO2010113185中）、同种异体移植排斥的预测（如WO2010093869中）、在具有强直性脊柱炎的患者中针对抗TNF抗体的临床应答的预测（如WO2010077722中）、间质性膀胱炎的诊断（如WO2010068747中）、败血症的诊断和预后（如US20100292131中）、异时性结肠直肠癌的预后（如US20090155842中）、用尼美舒利(nimesulide)治疗ALS的监控（如WO2004043444中）。

根据进一步具体实施方案，当检测生物标记蛋白质时（即分子中的至少一个Y_i是指示疾病状态的蛋白质中天然存在的区段），除了上文的步骤a）和b）外，这些方法还包括步骤c）——使样品中检测到的蛋白质的存在、不存在或量与受试者中的疾病状态关联。

等价地，提供具有下述结构的分子用于在所述疾病状态的诊断中使用:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

注意，相同方法可以用于植物中，以确定植物的疾病状态。

上述方法的一个具体实施方案是诊断感染的存在。根据该实施方案，指示疾病状态（即感染）的蛋白质是病原体（感染的原因，并且因此指示感染）的蛋白质。相应地，提供具有下述结构的分子用于所述病原体感染的诊断中使用:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是病原体中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

再次，这些诊断方法可以应用于受试者以及植物（或其中可能存在感染的其他生物体）。

然而，诊断不一定需要是疾病状态。如提及的，检测方法可以用于测定非源自受试者的样品中的蛋白质水平（如工业生物技术中一般遇到的），或它可以用于测定生物体的样品中的蛋白质（例如代谢产物）水平而无需这与疾病联系。这尤其适用于植物生物技术中，最特别地转基因植物。事实上，可以用于测量增加或降低的蛋白质水平，例如以估计哪些植物具有最高表达水平的有用蛋白质，或哪些植物具有更少表达的有害蛋白质或造成植物难吃的蛋白质，或哪些植物具有对胁迫条件的更佳应答。

因为本文考虑体外诊断，所以还提供包含如本文描述的至少一种分子和至少一种合适的缓冲液的试剂盒。此类试剂盒理想地针对所使用的具体检测方案而适应性调整。试剂盒可以含有本文描述的任何药物组合物或农业化学组合物。此外，试剂盒可以含有一种或多种装置，一般为用于检测蛋白质的装置，例如固相载体（例如板、微阵列、纳米颗粒、……），任选由本文描述的分子预涂布。试剂盒可以另外含有使用说明书。明显地，试剂盒无需限制于诊断或检测应用。然而，在提供用于治疗植物或动物受试者的试剂盒的情况下，试剂盒将任选含有用于施用目的的装置（例如注射器、具有喷雾嘴的容器）而不是实验室装置。

在现有技术中，测定蛋白质水平（或蛋白质生物标记）的多种不同方式是已知的，用于测定蛋白质水平的一种代表性和方便的方案是ELISA。在ELISA和基于ELISA的测定中，对于目的蛋白质（或蛋白质生物标记）特异性的一种或多种抗体可以固定到选择的固体表面上，优选显示出蛋白质亲和力的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。在洗涤以去除不完全吸附的材料后，测定板孔由非特异性“封闭”蛋白质包被，所述“封闭”蛋白质已知就测试样品而言是抗原中性的，例如牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白或奶粉溶液。这允许封闭在固定化表面上的非特异性吸附位点，从而减少通过抗原在表面上的非特异性结合而引起的本底。在洗涤以去除未结合的封闭蛋白质后，在有助于免疫复合物（抗原/抗体）形成的条件下，使固定化表面与待测试的样品接触。此类条件包括用稀释剂例如在磷酸盐缓冲盐水（PBS）/Tween或PBS/Triton-X100中的BSA或牛丙种球蛋白（BGG）稀释样品（其也趋向于帮助减少非特异性本底），允许样品在约25-27℃（尽管可以使用其他温度）温育约2-4小时。在温育后，洗涤抗血清接触的表面，以便去除未免疫复合的材料。示例性洗涤程序包括用溶液例如PBS/Tween、PBS/Triton-X100或硼酸盐缓冲液洗涤。免疫复合物形成的出现和量随后可以通过下述进行测定：对结合的免疫复合物实施第二抗体，所述第二抗体对于靶具有不同于第一抗体的特异性，并且检测第二抗体的结合。在某些实施方案中，第二抗体具有结合的酶，例如脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，其在与合适的生色底物一起温育后将生成有色沉淀物。例如，可以在促进免疫复合物形成出现的条件下（例如在室温在含PBS溶液例如PBS/Tween中温育2小时），采用脲酶或过氧化物酶缀合的抗人IgG一段时间。在与第二抗体的温育和洗涤以去除未结合的材料后，定量标记的量，例如在脲酶标记的情况下，通过与生色底物例如尿素和溴甲酚紫一起温育而定量，或在过氧化物酶标记的情况下，通过与2,2'-连氮基-二-（3-乙基-苯并噻唑啉）-6-磺酸（ABTS）和H₂O₂一起温育而定量。随后通过测量颜色生成程度，例如使用可见光谱分光光度计，实现定量。可替代地，先前形式可以通过首先使样品与测定平板结合而改变。随后，使一抗与测定平板一起温育，随后使用对一抗具有特异性的标记的第二抗体来检测结合的一抗。可替代地，可以采用非基于ELISA的方法用于测量样品中的一种或多种蛋白质生物标记的水平。代表性例子包括但不限于质谱法、蛋白质组学阵列、xMAP^TM微球体技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。根据本发明的方法，且在实施例部分中进一步例示的，将一抗替换为与蛋白质生物标记结合的特异性干扰物。在具体实施方案中，此干扰物用检测分子进行标记。

在具体实施方案中，可以在其上固定一种或多种特异性干扰物的固相载体可以由广泛多样的材料和以广泛多样的形状制备，例如微量滴定板、微珠、试条、树脂颗粒等。可以选择基底，以使信噪比达到最大，使本底结合降到最低，以及使得容易分离和成本。洗涤可以以对于使用的基底最合适的方式进行，例如通过从蓄液池中取出珠或试条，倒空或稀释蓄液池例如微量滴定板孔，或用洗涤溶液或溶剂洗涤珠、颗粒、层析柱或滤器。

在特定实施方案中，特定蛋白质生物标记的检测是定量的。在另一个特定实施方案中，特定蛋白质生物标记的检测是定性的。由此，当检测是定性的时，方法提供有关蛋白质生物标记是否存在于所测定的样品中的读出或评估例如评价。在另外其他实施方案中，方法提供有关蛋白质生物标记是否存在于所测定的样品中的定量检测，即估计或评估靶分析物的实际量或相对丰度。在此实施方案中，定量检测可以是绝对的，或如果该方法是检测样品中的两种或更多种不同蛋白质生物标记的方法，则可以是相对的。由此，当在定量样品中的蛋白质生物标记的情形下使用时，术语“定量”可以指绝对或相对定量。绝对定量可以通过如下来实现：包括已知浓度的一种或多种对照蛋白质生物标记，和将蛋白质生物标记的检测水平与已知对照蛋白质生物标记进行比照（例如通过产生标准曲线）。可替代地，相对定量可以通过如下实现：比较两种或更多种不同蛋白质生物标记之间的检测水平或量，以提供这两种或更多种不同蛋白质生物标记各自的相对定量，例如相对于彼此。

在某些实施方案中，评估对仅一种蛋白质生物标记的检测。在另外其他实施方案中，评估两种或更多种例如约3种或更多种、约10种或更多种、约15种或更多种蛋白质生物标记的表达。可以进行此评估的一种典型方法是使用蛋白质结合微阵列（参见下文）。

在此类实施方案中，通过提供，即生成，书面报告，可以提供预测、诊断或表征，所述书面报告包括技术人员的监控评估，即技术人员对特定疾病发作的预测、技术人员对受试者疾病的诊断、或技术人员对受试者疾病预后的表征。因此，主题方法可以进一步包括步骤——生成或输出提供监控评估结果的报告，所述报告可以以电子介质（例如在计算机监视器上电子展示）的形式，或以可触摸介质的形式（例如印刷在纸张或其他可触摸介质上的报告）提供。如本文描述的，“报告”是电子或可触摸文件，其包括提供与受试者监控评估及其结果有关的目的信息的报告元素。报告可以完全或部分地电子生成。报告可以进一步包括下述之一或多项：1）关于测试机构的信息；2）服务提供者信息；3）患者数据；4）样品数据；5）评估报告，可以包括多种信息，包括：a）采用的参考值和b）测试数据，其中测试数据可以包括例如蛋白质水平测定；6）其他特点。

报告可以包括关于测试机构的信息，所述信息与进行样品搜集和/或数据生成的医院、诊所或实验室有关。样品搜集可以包括从受试者获得流体样品例如血液、唾液、尿等、组织样品例如组织活检物等。数据生成可以包括针对在不同受试者中差异地表达或以不同水平存在的一种或多种生物标记，测量多肽生物标记浓度的水平。

在许多实施方案中，受试者属于哺乳动物纲，包括食肉目（例如犬和猫）、啮齿目（例如小鼠、豚鼠和大鼠）、兔形目（例如兔）和灵长目（例如人、黑猩猩和猴）。在某些实施方案中，动物或宿主即受试者（在本文中也称为患者）是人。

如本文先前解释的，最广泛使用的生物检测技术基于抗体的使用。抗体基于其形状和理化性质识别且结合其他分子。抗体高度适于在复杂的蛋白质混合物的存在下检测少量靶蛋白质。本发明显示，干扰物分子的使用是使用抗体（作为识别元件）特异性捕获靶蛋白质的替代物。事实上，干扰物分子可以用于典型地使用抗体的众多应用中。仅举几个例子，考虑在诊断、微量分析、法医学中和在病原体的特异性检测中应用。对于本发明的检测和分离应用，可能方便的是，将干扰物分子与载体（例如支持物）结合。支持物可以是平面例如塑料或硝酸纤维素或层析柱，但优选是珠例如微球体珠。关于可以用于结合干扰物分子目的的各种珠和微球体，一般讨论参见US6682940的第9和10页上的描述，并且该文献特别引入本文作为参考。在特定实施方案中，干扰物分子与碳水化合物类型的载体例如纤维素或琼脂糖结合。干扰物可以使用交联剂例如戊二醛与所述碳水化合物载体结合。在另一个特定实施方案中，载体可以是纤维素、玻璃或合成聚合物。在干扰物和载体之间的共价附着可以经由干扰物的氨基酸残基和干扰物上存在的叠氮化物、碳化二亚胺、异氰酸酯或其他化学衍生物而实现。

在另外一个特定实施方案中，载体是多孔硅烷化玻璃微珠。干扰物可以经由其肽胺基团（通过希夫反应，随后用硼氢化钠还原）与化学连接在二氧化硅原子上的醛基团（通过缩水甘油醚氧基丙基硅烷基团的高碘酸盐氧化而形成）（该偶联在Sportsman和Wilson（1980）Anal.Chem.52，2013-2018中描述），与载体共价键合。

在一个具体实施方案中，载体被与干扰物交联的蛋白质性质的薄膜包住（参见US4478946中与载体有关的权利要求1-50和实施例）。

在另一个具体实施方案中，支持物是荧光珠例如荧光乳胶颗粒。专利US4550017且尤其是其中的第4页，描述可以用于制造荧光珠的荧光化合物。

在另一个具体实施方案中，珠大小可变，并且还可以含有荧光染料或浸有荧光染料。由于珠的不同大小和染料，可以在单一反应中检测且定量多种蛋白质。关于开发此类珠的程序在US6159748中描述。

在另外一个特定实施方案中，在珠和干扰物之间经由聚（苏氨酸）、聚（丝氨酸）、葡聚糖或聚（乙二醇）偶联。US6399317的实施例6、7、8和9举例说明该偶联可以如何执行。

在另外一个特定实施方案中，支持物是磁珠。磁珠、磁珠和蛋白质试剂之间的偶联、及其用途在申请US6489092的第8页上描述。

根据进一步方面，支持物是微阵列。这些特别考虑用于蛋白质的多重检测。相应地，提供包含本文描述的分子的微阵列。即，提供包含具有下述结构的至少两种分子的微阵列:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5，并且i从1运行到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

根据特定实施方案，分子通过接头（例如如本文描述的Z₀部分）连接至微阵列。微阵列可以是阵列、芯片、珠、板、印迹等。

根据其他特定实施方案，该至少两种分子是至少两种不同分子。特别地，在该至少两种分子之间，分子中的至少一个Yi区不同。更特别地，第一分子的至少一个Yi区相同于蛋白质中的区段，而所述蛋白质与另外的在第二分子中的至少一个Yi区所对应的区段是不同的蛋白质。

在植物中的应用

本文描述的分子可以用于下调植物、植物细胞或植物种子中的蛋白质的功能。注意，此处同样，这可以应用于非感染性和感染性情形，即靶向植物蛋白质、或靶向在植物中或上的病原体的病原体蛋白质。相应地，提供用于下调植物或植物细胞或植物种子中的蛋白质的生物功能的方法，其包括使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物、植物细胞或植物种子中或上的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

该方法的更多步骤可以包括在蛋白质和该非天然存在的分子之间发生分子间β-聚集，从而下调蛋白质的生物功能。因为与动物受试者相反，植物受试者是固定的，所以它们特别易受外寄生物和病原体（即农害）感染。事实上，许多感染性物种不一定进入植物以发挥其致病作用，或不在感染的最初阶段进入植物（例如，还因为植物不具有消化系统但具有细胞壁，这使得病原体更难进入植物内）。因此，“在植物、植物细胞或植物种子上的蛋白质”一般指，在植物、植物细胞或植物种子上存在的另一种生物体的蛋白质。例子包括但不限于线虫、蚜虫、螨虫、毛虫、蛞蝓、霉菌等的蛋白质。注意，这些生物体可以存在于植物的任何部分上（例如线虫一般通过植物根感染，而蚜虫一般存在于植物的绿色部分上，例如茎杆和叶）。

因此，方法可以细分成下调植物中的植物蛋白质生物功能的方法（例如以获得特定性质例如增加的产率或胁迫耐受性，或在非感染性疾病情形中），和下调在植物中或上的农害生物体的蛋白质的生物功能的方法（如在感染性疾病的情况下）。

前面一种方法（提供用于下调植物或植物细胞或植物种子中的植物蛋白质的生物功能）包括步骤——使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物、植物细胞或植物种子的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

后面一种方法（用于下调植物或植物细胞或植物种子中的植物农害生物体的蛋白质的生物功能）包括使所述蛋白质与具有下述结构的分子接触:（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物、植物细胞或植物种子中或上的农害生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

如本文使用的术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和后代、和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根（包括块茎）、花、以及组织和器官，其中上述各自包含目的基因/核酸。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次其中上述各自包含目的基因/核酸。

在本发明的方法中特别有用的植物特别包括单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，选自：槭树属(Acer spp.)、狲猴桃属(Actinidia spp.)、秋葵属(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostis stolonifera)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、固沙草(Ammophila arenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、旱芹(Apium graveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatuavar.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turniprape)])、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属(Citrus spp.)、椰子属(Cocosspp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐属(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegusspp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、野胡萝卜(Daucus carota)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿树属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera))、龙爪稷(Eleusine coracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef)、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugeniaunifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragariaspp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或Soja max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersicon esculentum)、蕃茄(Lycopersiconlycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Mentha spp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属(Momordica spp)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、木犀榄属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、(例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryzalatifolia)、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passifloraedulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属(Pennisetum sp.)、鳄梨属(Perseaspp.)、欧芹(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属(Phaseolusspp.)、梯牧草(Phleum pratense)、刺葵属(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopisspp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属(Rubus spp.)、甘蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salix sp.)、接骨木属(Sambucusspp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属(Sesamum spp.)、白芥属(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、蒲桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、Triticum macha、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticummonococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vignaspp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、沼生菰(Zizaniapalustris)、枣属(Ziziphus spp.)，等等。

如本文使用的植物农害特别是农业、园艺、林业、园林和休闲设施中遇到的昆虫、蛛形类、蠕虫、真菌、病毒、细菌、线虫和软体动物。根据本发明的组合物可以针对通常敏感和抗性的物种和针对所有或一些发育阶段是活性的。这些植物农害包括：来自下述门的农害：节肢动物门（Arthropoda），特别来自蛛形纲(arachnids)，如粉螨属物种（Acarusspp.）、柑橘瘤瘿螨（Aceria sheldoni）、刺皮瘿螨属物种（Aculops spp.）、刺瘿螨属物种（Aculus spp.）、花蜱属（Amblyomma spp.）、山楂叶螨（Amphitetranychus viennensis）、锐缘蜱属物种（Argas spp.）、牛蜱属物种（Boophilus spp.）、短须螨属物种（Brevipalpusspp.）、苜蓿苔螨（Bryobia praetiosa）、刺尾蝎属物种（Centruroides spp.）、皮螨属物种（Chorioptes spp.）、鸡皮刺螨（Dermanyssus gallinae）、屋尘螨（Dermatophagoidespteronyssius）、粉尘螨（Dermatophagoides farinae）、革蜱属物种（Dermacentor spp.）、始叶螨属物种（Eotetran_ychus spp.）、梨上瘿螨（Epitrimerus pyri）、真叶螨属物种（Eutetranychus spp.）、瘿螨属物种（Eriophyes spp.）、赤足夜螨(Halotydeusdestructor)、半跗线螨属物种（Hemitarsonemus spp.）、璃眼蜱属物种（Hyalomma spp.）、硬蜱属物种（Ixodes spp.）、寇蛛属物种（Latrodectus spp.）、平甲蛛属物种（Loxoscelesspp.）、Metatetranychus spp.、Nuphersa spp.、小爪螨属物种（Oligonychus spp.）、纯缘蜱属物种（Ornithodorus spp.）、禽刺螨属物种（Ornithonyssus spp.）、全爪螨属物种（Panonychus spp.）、橘皱叶刺瘿螨（Phyllocoptruta oleivora）、侧多食跗线螨（Polyphagotarsonemus latus）、痒螨属物种（Psoroptes spp.）、扇头蜱属物种（Rhipicephalus spp.）、根螨属物种（Rhizoglyphus spp.）、疥螨属物种（Sarcoptesspp.）、中东金蝎（Scorpio maurus）、狭跗线螨属物种（Stenotarsonemus spp.）、跗线螨属物种（Tarsonemus spp.）、叶螨属物种（Tetranychus spp.）、Vaejovis spp.、Vasateslycopersici。

其他例子来自虱目(Anoplura)（虱毛目（Phthiraptera）），例如毛虱属物种（Damalinia spp.）、血虱属物种（Haematopinus spp.）、颚虱属物种（Linognathus spp.）、Pediculus spp.、阴虱（Ptirus pubis）、Trichodectes spp。

另外其他例子来自唇足纲（Chilopoda）例如地蜈蚣属物种（Geophilus spp.）、蚰蜒属物种（Scutigera spp）。

另外其他例子来自鞘翅目（Coleoptera）例如黄瓜条纹叶甲（Acalymmavittatum）、菜豆象（Acanthoscelides obtectus）、喙丽金龟属物种（Adoretus spp.）、杨毛臀萤叶甲（Agelastica alni）、锥尾叩甲属物种（Agriotes spp.）、黑菌虫（Alphitobiusdiaperinus）、马铃薯鳃金龟（Amphimallon solstitialis）、家具窃蠹（Anobiumpunctatum）、星天牛属物种（Anoplophora spp.）、花象属物种（Anthonomus spp.）、圆皮蠹属物种（Anthrenus spp.）、长喙小象属物种（Apion spp.）、甘蔗金龟属物种（Apogoniaspp.）、羽蛛属物种（Atomaria spp.）、毛皮蠹属物种（Attagenus spp.）、恶条豆象（Bruchidius obtectus）、豆象属物种（Bruchus spp.）、龟甲属物种（Cassida spp.）、菜豆莹叶甲（Cerotoma trifurcata）、象甲属物种（Ceutorrhynchus spp.）、凹胫跳甲属物种（Chaetocnema spp.）、Cleonus mendicus、宽胸叩头虫属物种（Conoderus spp.）、根颈象属物种（Cosmopolites spp.）、草地蛴螬（Costelytra zealandica）、叩甲属物种（Cteniceraspp.）、象鼻虫属物种（Curculio spp.）、杨干象（Cryptorhynchus lapathi）、细枝象属物种（Cylindrocopturus spp.）、皮蠹属物种（Dermestes spp.）、条叶甲属物种（Diabroticaspp.）、蛀野螟属物种（Dichocrocis spp.）、阿根廷兜虫属物种（Diloboderus spp.）、食植瓢虫属物种（Epilachna spp.）、毛跳甲属物种（Epitrix spp.）、Faustinus spp.、裸蛛甲（Gibbium psylloides）、菜螟（Hellula undalis）、黑异爪蔗金龟（Heteronychus arator）、寡节舍思金龟属物种（Heteronyx spp.）、Hylamorpha elegans、家天牛（Hylotrupesbajulus）、紫苜蓿叶象（Hypera postica）、咪小蠹属物种（Hypothenemus spp.）、甘蔗大褐齿爪鳃金龟（Lachnosterna consanguinea）、合爪负泥虫属物种（Lema spp.）、科罗拉多薯虫（Leptinotarsa decemlineata）、交嘴雀属物种（Leucoptera spp.）、稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）、筒喙象属（Lixus spp.）、Luperodes spp.、粉蠹属物种（Lyctus spp.）、美洲叶甲属物种（Megascelis spp.）、梳爪叩甲属物种（Melanotus spp.）、油菜露尾甲（Meligethes aeneus）、金龟属物种（Melolontha spp.）、Migdolus spp.、墨天牛属物种（Monochamus spp.）、Naupactus xanthographus、黄蛛甲（Niptus hololeucus）、犀角金龟（Oryctes rhinoceros）、锯谷盗（Oryzaephilus surinamensis）、Oryzaphagusoryzae、耳象属物种（Otiorrhynchus spp.）、小青花金龟（Oxycetonia jucunda）、辣根猿叶虫（Phaedon cochleariae）、鳃角金龟属物种（Phyllophaga spp.）、条跳甲属物种（Phyllotreta spp.）、日本金龟子（Popillia japonica）、象甲属物种（Premnotrypesspp.）、大谷蠹（Prostephanus truncatus）、蚤跳甲属物种（Psylliodes spp.）、蛛甲属物种（Ptinus spp.）、暗色瓢虫（Rhizobius ventralis）、谷蠹（Rhizopertha dominica）、米象属物种（Sitophilus spp.）、谷喙甲属物种（Sphenophorus spp.）、药材甲（Stegobiumpaniceum）、茎干象属物种（Sternechus spp.）、Symphyletes spp.、纤毛象属（Tanymecusspp.）、黄粉虫（Tenebrio molitor）、拟谷盗属物种（Tribolium spp.）、斑皮蠹属物种（Trogoderma spp.）、籽象属物种（Tychius spp.）、脊虎天牛属物种（Xylotrechus spp.）、距步甲属物种（Zabrus spp.）。

另外其他例子来自弹尾目（Collembola）例如棘跳虫（Onychiurus armatus）。

另外其他例子来自倍足目（Diplopoda）例如具斑马陆（Blaniulusguttulatus）。

另外其他例子来自双翅目（Diptera）例如伊蚊属物种（Aedes spp.）、潜蝇属物种（Agromyza spp.）、实蝇属物种（Anastrepha spp.）、按蚊属物种（Anopheles spp.）、波瘿蚊属物种（Asphondylia spp.）、果实蝇属物种（Bactrocera spp.）、花园毛蚊（Bibiohortulanus）、红头丽蝇（Calliphora erythrocephala）、地中海实蝇（Ceratitiscapitata）、摇蚊属物种（Chironomus spp.）、金蝇属物种（Chrysomyia spp.）、斑虻属物种（Chrysops spp.）、锥蝇属物种（Cochliomyia spp.）、花瘿蚊属物种（Contarinia spp.）、噬人瘤蝇（Cordylobia anthropophaga）、库蚊属物种（Culex spp.）、库蠓属物种（Culicoidesspp.）、脉毛蚊属物种（Culisetaspp.）、黄蝇属物种（Cuterebra spp.）、油榄实蝇（Dacusoleae）、瘿蚊属物种（Dasyneura spp.）、地种蝇属物种（Delia spp.）、人皮蝇（Dermatobiahominis）、果蝇属物种（Drosophila spp.）、稻象属物种（Echinocnemus spp.）、厕蝇属物种（Fannia spp.）、胃蝇属物种（Gasterophilus spp.）、舌蝇属物种（Glossina spp.）、麻虻属物种（Haematopota spp.）、毛眼水蝇属物种（Hydrellia spp.）、黑蝇属物种（Hylemyiaspp.）、虱蝇属物种（Hyppobosca spp.）、牛蝇属物种（Hypoderma spp.）、斑潜蝇属（Liriomyza spp.）、绿蝇属物种（Lucilia spp.）、罗蛉属物种（Lutzomia spp.）、曼蚊属物种（Mansonia spp.）、家蝇属物种（Musca spp.）、绿蝽属物种（Nezara spp.）、狂蝇属物种（Oestrus spp.）、瑞典麦秆蝇（Oscinella frit）、泉蝇属物种（Pegomyia spp.）、白蛉属物种（Phlebotomus spp.）、草种蝇属物种（Phorbia spp.）、黑花蝇属物种（Phormia spp.）、Prodiplosis spp.、胡萝卜蝇（Psila rosae）、绕实蝇属物种（Rhagoletis spp.）、麻蝇属物种（Sarcophaga spp.）、蚋属物种（Simulium spp.）、厩蝇属（Stomoxys spp.）、虻虫属物种（Tabanus spp.）、Tannia spp.、直斑蝇属物种（Tetanops spp.）、大蚊属物种（Tipulaspp）。

另外其他例子来自异翅目（Heteroptera）例如南瓜缘蝽（Anasa tristis）、拟丽蝽属物种（Antestiopsis spp.）、Boisea spp.、土长蝽属物种（Blissus spp.）、俊盲蝽属物种（Calocoris spp.）、斑腿微刺盲蝽（Campylomma livida）、异背长蝽属物种（Caveleriusspp.）、臭虫属物种（Cimex spp.）、Collaria spp.、绿淡盲蝽（Creontiades dilutus）、胡椒缘蝽（Dasynus piperis）、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽（Diconocoris hewetti）、棉红蝽属物种（Dysdercus spp.）、美洲蝽属物种（Euschistus spp.）、扁盾蝽属物种（Eurygaster spp.）、锤盲蝽属物种（Heliopeltis spp.）、Horcias nobilellus、稻缘蝽属物种（Leptocorisa spp.）、叶足缘蝽（Leptoglossus phyllopus）、盲蝽属物种（Lygusspp.）、蔗黑长蝽（Macropes excavatus）、盲蝽科（Miridae）、金光绿盲蝽（Monalonionatratum）、绿蝽属物种（Nezara spp.）、Oebalus spp.、蝽科（Pentomidae）、甜菜拟网蝽（Piesma quadrata）、璧蝽属物种（Piezodorus spp.）、杂盲蝽属物种（Psallus spp.）、Pseudacysta persea、红猎蝽属物种（Rhodnius spp.）、可可褐盲蝽（Sahlbergellasingularis）、Scaptocoris castanea、黑蝽属物种（Scotinophora spp.）、梨冠网蝽（Stephanitis nashi）、Tibraca spp.、锥蝽属物种（Triatoma spp）。

另外其他例子来自同翅目（Homoptera）例如无网长管蚜属物种（Acyrthosiponspp.）、Acrogonia spp.、Aeneolamia spp.、隆脉木虱属物种（Agonoscena spp.）、粉虱属物种（Aleurodes spp.）、甘蔗穴粉虱（Aleurolobus barodensis）、颈粉虱属物种（Aleurothrixus spp.）、杧果叶蝉属物种（Amrasca spp.）、Anuraphis cardui、肾圆盾蚧属物种（Aonidiella spp.）、Aphanostigma pin、蚜虫属物种（Aphis spp.）、葡萄叶蝉（Arboridia apicalis）、小圆盾蚧属物种（Aspidiella spp.）、圆蚧属物种（Aspidiotusspp.）、Atanus spp.、茄粗额蚜（Aulacorthum solani）、伯粉虱属物种（Bemisia spp.）、光管舌尾蚜（Brachycaudus helichrysii）、微管蚜属物种（Brachycolus spp.）、甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）、小褐稻虱（Calligypona marginata）、丽黄头大叶蝉（Carneocephala fulgida）、甘蔗绵蚜（Ceratovacuna lanigera）、沫蝉科（Cercopidae）、蜡蚧属物种（Ceroplastes spp.）、草莓毛管蚜（Chaetosiphon fragaefolii）、蔗黄雪盾蚧（Chionaspis tegalensis）、茶绿叶蝉（Chlorita onukii）、核桃黑斑蚜（Chromaphisjuglandicola）、柑桔褐圆蚧（Chrysomphalus ficus）、姆皮拉叶蝉（Cicadulina mbila）、Coccomytilus halli、蚧属物种（Coccus spp.）、茶鹿隐瘤额蚜（Cryptomyzus ribis）、黄翅叶蝉属物种（Dalbulus spp.）、裸粉虱属物种（Dialeurodes spp.）、Diaphorina spp.、盾蚧属物种（Diaspis spp.）、履硕蚧属物种（Drosicha spp.）、西圆尾蚜属物种（Dysaphisspp.）、灰粉蚧属物种（Dysmicoccus spp.）、小绿叶蝉属物种（Empoasca spp.）、绵蚜属物种（Eriosoma spp.）、斑叶蝉属物种（Erythroneura spp.）、双叶叶蝉（Euscelis bilobatus）、腺刺粉蚧属物种（Ferrisia spp.）、咖啡荒粉蚧（Geococcus coffeae）、蔗蝗属物种（Hieroglyphus spp.）、草翅叶蝉（Homalodisca coagulata）、桃大尾蚜（Hyalopterusarundinis）、吹绵蚧属物种（Icerya spp.）、片角叶蝉属物种（Idiocerus spp.）、扁喙叶蝉属物种（Idioscopus spp.）、灰飞虱（Laodelphax striatellus）、介壳虫属物种（Lecaniumspp.）、牡蛎蚧属物种（Lepidosaphes spp.）、萝卜蚜（Lipaphis erysimi）、长管蚜属物种（Macrosiphum spp.）、Mahanarva spp.、高梁蚜（Melanaphis sacchari）、Metcalfiellaspp.、麦无网长管蚜（Metopolophium dirhodum）、黑缘平翅斑蚜（Monellia costalis）、Monelliopsis pecanis、瘤蚜属物种（Myzus spp.）、莴苣蚜虫（Nasonovia ribisnigri）、黑尾叶蝉属物种（Nephotettix spp.）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）、Oncometopia spp.、Orthezia praelonga、杨梅粉虱（Parabemisia myricae）、Paratrioza spp.、片盾蚧属物种（Parlatoria spp.）、瘦绵虫牙属物种（Pemphigus spp.）、玉米花翅飞虱（Peregrinusmaidis）、绵粉蚧属物种（Phenacoccus spp.）、杨平翅棉蚜（Phloeomyzus passerinii）、忽布疣蚜（Phorodon humuli）、Phylloxera spp.、盾蚧（Pinnaspis aspidistrae）、动球菌属物种（Planococcus spp.）、梨形原绵蜡蚧（Protopulvinaria pyriformis）、桑白蚧（Pseudaulacaspis pentagona）、粉蚧属物种（Pseudococcus spp.）、木虱属物种（Psyllaspp.）、金小蜂属物种（Pteromalus spp.）、Pyrilla spp.、齿盾蚧属物种（Quadraspidiotusspp.）、Quesada gigas、平剌粉阶属物种（Rastrococcus spp.）、缢管蚜属物种（Rhopalosiphum spp.）、黑盔蚧属物种（Saissetia spp.）、Scaphoides titanus、麦二叉蚜（Schizaphis graminum）、刺盾蚧（Selenaspidus articulatus）、长唇基飞虱属物种（Sogata spp.）、白背飞虱（Sogatella furcifera）、稻飞虱属物种（Sogatodes spp.）、Stictocephala festina、Tenalaphara malayensis、胡桃黑蚜（Tinocalliscaryaefoliae）、广胸沫蝉属物种（Tomaspis spp.）、声蚜属物种（Toxoptera spp.）、粉虱属物种（Trialeurodes spp.）、尖翅木虱属物种（Trioza spp.）、小叶蝉属物种（Typhlocybaspp.）、矢尖蚧属物种（Unaspis spp.）、葡萄根瘤蚜（Viteus vitifolii）、斑叶蝉属物种（Zygina spp）。

另外其他例子来自膜翅目（Hymenoptera）例如顶切叶蚁属物种（Acromyrmexspp.）、残青叶蜂属物种（Athalia spp.）、切叶蚊属物种（Atta spp.）、松叶蜂属物种（Diprion spp.）、实叶蜂属物种（Hoplocampa spp.）、毛蚁属物种（Lasius spp.）、小黄家蚁（Monomorium pharaonis）、红火蚁（Solenopsis invicta）、酸臭蚁属物种（Tapinomaspp.）、虎头蜂属物种（Vespa spp）。

另外其他例子来自等足目（Isopoda）例如鼠妇（Armadillidium vulgare）、潮虫（Oniscus asellus）、鼠妇虫（Porcellio scaber）。

另外其他例子来自等翅目（Isoptera）例如家白蚁属物种（Coptotermes spp.）、Cornitermes cumulans、堆砂白蚁属物种（Cryptotermes spp.）、楹白蚁属物种（Incisitermes spp.）、甘蔗白蚁（Microtermes obesi）、土白蚁属物种（Odontotermesspp.）、散白蚁属物种（Reticulitermes spp）。

另外其他例子来自鳞翅目（Lepidoptera）例如桑剑纹夜蛾（Acronicta major）、褐带卷蛾属物种（Adoxophyes spp.）、白斑烦夜蛾（Aedia leucomelas）、地夜蛾属物种（Agrotis spp.）、Alabama spp.、脐橙螟蛾（Amyelois transitella）、条麦蛾属物种（Anarsia spp.）、干煞夜蛾属物种（Anticarsia spp.）、条小卷蛾属物种（Argyroplocespp.）、甘蓝夜蛾（Barathra brassicae）、籼弄蝶（Borbo cinnara）、棉潜蛾（Bucculatrixthurberiella）、松尺蠖（Bupalus piniarius）、干夜蛾属物种（Busseola spp.）、Cacoeciaspp.、茶细蛾（Caloptilia theivora）、Capua reticulana、苹果蠹蛾（Carpocapsapomonella）、桃蛀果蛾（Carposina niponensis）、Chematobia brumata、禾草螟属物种（Chilo spp.）、色卷蛾属物种（Choristoneura spp.）、葡萄果蠹蛾（Clysia ambiguella）、Cnaphalocerus spp.、云卷蛾属物种（Cnephasia spp.）、Conopomorpha spp.、米象属物种（Conotrachelus spp.）、Copitarsia spp.、小卷蛾属物种（Cydia spp.）、Dalacanoctuides、绢野螟属物种（Diaphania spp.）、小蔗螟（Diatraea saccharalis）、钻夜蛾属物种（Earias spp.）、Ecdytolopha aurantium、南美玉米苗斑螟（Elasmopalpuslignosellus）、非洲茎螟（Eldana Saccharina）、粉斑螟属物种（Ephestia spp.）、叶小卷蛾属物种（Epinotia spp.）、淡褐苹果蛾（Epiphyas postvittana）、荚斑螟属物种（Etiellaspp.）、棕卷蛾属物种（Eulia spp.）、女贞细卷蛾（Eupoecilia ambiguella）、毒蛾属物种（Euproctis spp.）、切根虫属物种（Euxoa spp.）、夜蛾属物种（Feltia spp.）、蜡螟（Galleria mellonella）、江蓠属物种（Gracillaria spp.）、小食心虫属物种（Grapholithaspp.）、蚀叶野螟属物种（Hedylepta spp.）、铃夜蛾属物种（Helicoverpa spp.）、实夜蛾属物种（Heliothis spp.）、拟衣蛾（Hofmannophila pseudospretella）、斑螟属物种（Homoeosoma spp.）、长卷蛾属物种（Homona spp.）、苹果巢蛾（Hyponomeuta padella）、柿举枝蛾（Kakivoria flavofasciata）、夜蛾属物种（Laphygma spp.）、Laspeyresiamolesta、茄黄斑螟蛾（Leucinodes orbonalis）、Leucoptera spp.、潜叶细蛾属物种（Lithocolletis spp.）、绿果冬夜蛾（Lithophane antennata）、花翅小卷蛾属物种（Lobesia spp.）、豆白隆切根虫（Loxagrotis albicosta）、毒蛾属物种（Lymantria spp.）、潜蛾属物种（Lyonetia spp.）、黄褐天幕毛虫（Malacosoma neustria）、豆荚野螟（Marucatestulalis）、甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）、毛胫夜蛾属物种（Mocis spp.）、粘虫（Mythimna separata）、水螟属物种（Nymphula spp.）、Oiketicus spp.、巫夜蛾属物种（Oria spp.）、瘤丛螟属物种（Orthaga spp.）、秆野螟属物种（Ostrinia spp.）、水稻负泥虫（Oulema oryzae）、小眼夜蛾（Panolis flammea）、稻弄蝶属物种（Parnara spp.）、红铃麦蛾属物种（Pectinophora spp.）、潜跳甲属物种（Perileucoptera spp.）、枸杞蛀果蛾属物种（Phthorimaea spp.）、柑橘潜叶蛾（Phyllocnistis citrella）、小潜细蛾属物种（Phyllonorycter spp.）、粉蝶属物种（Pieris spp.）、荷兰石竹小卷蛾（Platynotastultana）、印度谷斑螟（Plodia interpunctella）、金翅夜蛾属物种（Plusia spp.）、小菜蛾（plutella xylostella）、小白巢蛾属物种（Prays spp.）、斜纹夜蛾属物种（Prodeniaspp.）、烟草天蛾属物种（Protoparce spp.）、拟粘叶蛾属物种（Pseudaletia spp.）、大豆夜蛾（Pseudoplusia includens）、玉米螟（Pyrausta nubilalis）、Rachiplusia nu、稻褐边螟物种（Schoenobius spp.）、白禾螟属物种（Scirpophaga spp.）、黄地老虎（Scotiasegetum）、蛀茎夜蛾属物种（Sesamia spp.）、长须卷蛾属物种（Sparganothis spp.）、灰翅夜蛾属物种（Spodoptera spp.）、展足蛾属物种（Stathmopoda spp.）、花生卷叶麦蛾（Stomopteryx subsecivella）、透翅蛾属物种（Synanthedon spp.）、马铃薯块茎蛾（Teciasolanivora）、Thermesia gemmatalis、袋谷蛾（Tinea pellionella）、衣蛾（Tineolabisselliella）、卷蛾属物种（Tortrix spp.）、毛毡衣蛾（Trichophaga tapetzella）、粉夜蛾属物种（Trichoplusia spp.）、番茄斑潜蝇（Tuta Absoluta）、灰蝶属物种（Viracholaspp）。

另外其他例子来自直翅目（Orthoptera）例如家蟋蟀（Acheta domesticus）、东方蜚蠊（Blatta orientalis）、德国小蠊（Blattella germanica）、Dichroplus spp.、蝼蛄属物种（Gryllotalpa spp.）、马德拉蜚蠊（Leucophaea maderae）、飞蝗属物种（Locustaspp）、黑蝗属物种（Melanoplus spp.）、大蠊属物种（Periplaneta spp.）、人蚤（Pulexirritans）、沙漠蝗（Schistocerca gregaria）和长须带蠊（Supella longipalpa）。

另外其他例子来自蚤目（Siphonaptera）例如角叶蚤属物种（Ceratophyllusspp.）、栉头蚤属物种（Ctenocephalides spp.）、穿皮潜蚤（Tunga penetrans）、印度鼠蚤（Xenopsylla cheopis）。

另外其他例子来自综合目（Symphyla）例如么蚰属物种（Scutigerella spp）。

另外其他例子来自缨翅目（Thysanoptera）例如放牧蓟马（Anaphothripsobscurus）、稻蓟马（Baliothrips biformis）、葡萄德蓟马（Drepanothris reuteri）、Enneothrips flavens、花蓟马属物种（Frankliniella spp.）、阳蓟马属物种（Heliothripsspp.）、温室蓟马（Hercinothrips femoralis）、腹钩蓟马（Rhipiphorothripscruentatus）、硬蓟马属物种（Scirtothrips spp.）、Taeniothrips cardamoni、蓟马属物种（Thrips spp）。

另外其他例子来自衣鱼目（Zygentoma）（=缨尾亚目（Thysanura））例如衣鱼（Lepisma saccharina）、斑衣鱼（Thermobia domestica）。

在另一个实施方案中，软体动物门（Mollusca）特别是来自双壳纲（Bivalvia），例如饰贝属物种（Dreissena spp.）的农害也是重要的植物农害。

在另一个实施方案中，腹足纲（Gastropoda）的农害是重要的植物农害，例如Anionspp.、双脐螺属物种（Biomphalaria spp.）、泡螺属物种（Bulinus spp.）、灰蛞蝓属物种、土蜗螺属物种（Galba spp.）、椎实螺属物种（Lymnaea spp.）、钉螺属物种（Oncomelaniaspp.）、福寿螺属物种、琥珀螺属物种。

在另外一个实施方案中，来自线虫门（Nematoda）的植物农害是重要的植物农害，即植物寄生性线虫，意指对植物引起损害的植物寄生性线虫。植物线虫涵盖植物寄生性线虫和在土壤中生活的线虫。植物寄生性线虫包括但不限于外寄生物例如剑线虫属物种（Xiphinema spp.）、长针线虫属物种（Longidorus spp.）、和毛刺线虫属物种（Trichodorusspp.）；半寄生物例如半穿刺线虫属物种（Tylenchulus spp.）；迁移性内寄生物例如根腐线虫属物种（Pratylenchus spp.）、穿孔线虫属物种（Radopholus spp.）、和盾线虫属物种（Scutellonerna.spp.）；固著性寄生物例如异皮线虫属物种（Heterodera spp.）、球异皮线虫属物种（Globodera spp.）、和根结栈虫属物种（Meloidogyne spp.），以及茎和叶外寄生物例如茎线虫属物种（Ditylenchus spp.）、滑刃线虫属物种（Aphelenchoides spp.）、和潜根线虫属物种（Hirshmaniella spp）。此外，有害的根寄生性土壤线虫是异皮线虫属或球异皮线虫属的胞囊形成线虫，和/或根结栈虫属的根结线虫。这些属的有害物种是例如南方根结线虫（Meloidogyne incognata）、大豆异皮线虫（Heterodera glycines）（大豆胞囊线虫）、马铃薯白线虫（Globodera pallida）和马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis）（马铃薯胞囊线虫）。作为植物农害具有重要性的另外其他重要的属包括肾形线虫属物种（Rotylenchulus spp.）、拟毛刺线虫属物种（Paratriclodorus spp.）、穿刺短体线虫（Pratylenchus penetrans）、Radolophus simuli、鳞球茎茎线虫（Ditylenchus dispaci）、四川柑桔根线虫（Tylenchulus semipenetrans）、剑线虫属物种、伞滑刃线虫物种（Bursaphelenchus spp.）等，特别是滑刃线虫属物种、伞滑刃线虫物种、茎线虫属物种、球异皮线虫属物种、异皮线虫属物种、长针线虫属物种、根结栈虫属物种、根腐线虫属物种、香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）、毛刺线虫属物种、四川柑桔根线虫、剑线虫属物种。

在另外一个实施方案中，植物农害是病毒，并且本发明的方法涉及治疗植物中的病毒感染或抑制病毒感染力，植物病毒选自苜蓿花叶病毒(alfamovirus)、青葱病毒(allexivirus)、α隐病毒(alphacryptovirus)、禽腮腺炎病毒(anulavirus)、苹果锈果类病毒(apscaviroid)、金病毒(aureusvirus)、燕麦病毒(avenavirus)、aysunviroid、杆状DNA病毒(badnavirus)、菜豆金色花叶病毒(begomovirus)、甜菜坏死黄脉病毒(benyvirus)、β隐病毒(betacryptovirus)、β弯曲病毒科(betaflexiviridae)、雀麦花叶病毒(bromovirus)、大麦黄花叶病毒(bymovirus)、毛状病毒(capillovirus)、香石竹潜隐病毒(carlavirus)、香石竹斑驳病毒(carmovirus)、花椰菜花叶病毒(caulimovirus)、木薯脉花叶病毒(cavemovirus)、樱桃锉叶病毒(cheravirus)、黄化丝状病毒(closterovirus)、椰子死亡类病毒(cocadviroid)、锦紫苏类病毒(coleviroid)、豇豆花叶病毒(comovirus)、线性病毒(crinivirus)、黄瓜花叶病毒(cucumovirus)、曲顶病毒(curtovirus)、质型弹状病毒(cytorhabdovirus)、香石竹病毒(dianthovirus)、豌豆耳突花叶病毒属(enamovirus)、伞形植物病毒(umbravirus)和B型卫星病毒(B-type satellitevirus)、蚕豆病毒(fabavirus)、裴济病毒(fijivirus)、真菌传杆状病毒(furovirus)、大麦病毒(hordeivirus)、啤酒花矮化类病毒(hostuviroid)、悬钩子病病毒(idaeovirus)、等轴不稳环斑病毒(ilarvirus)、番薯属病毒(ipomovirus)、黄矮病毒(luteovirus)、玉米褪绿斑驳病毒(machlomovirus)、橙桑花叶病毒(macluravirus)、玉米雷亚朵非纳病毒(marafivirus)、玉米线条病毒(mastrevirus)、纳米病毒(nanovirus)、坏死病毒(necrovirus)、线虫传多面体病毒(nepovirus)、核型弹状病毒(nucleorhabdovirus)、油橄榄病毒(oleavirus)、柑橘鳞皮病毒(ophiovirus)、矮缩病毒(oryzavirus)、黍花叶病毒(panicovirus)、花生丛簇病毒(pecluvirus)、牵牛花叶脉透明样病毒(petuvirus)、植物呼肠病毒(phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒(polerovirus)、马铃薯帚顶病毒(pomovirus)、马铃薯纺锤形块茎类病毒(pospiviroid)、马铃薯X病毒(potexvirus)、马铃薯Y病毒(potyvirus)、呼肠孤病毒(reovirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、黑麦草花叶病毒(rymovirus)、温州蜜柑矮缩病毒(sadwavirus)、SbCMV样病毒、伴生病毒(sequivirus)、南方菜豆花叶病毒(sobemovirus)、纤细病毒(tenuivirus)、TNsatV样卫星病毒、烟草花叶病毒、番茄伪曲顶病毒(topocuvirus)、番茄斑萎病毒(tospovirus)、苹果退绿叶斑病毒(trichovirus)、小麦属病毒(tritimovirus)、东格鲁病毒(tungrovirus)、芜菁黄花叶病毒(tymovirus)、伞形植物病毒(umbravirus)、叶脉曲张病毒(varicosavirus)、葡萄病毒(vitivirus)或矮化病毒(waikavirus)。

在另外一个实施方案中，植物农害可以是植物病原性真菌。此类植物真菌包括但不限于选自下述属的那些：链格孢属（Alternaria）；壳二孢属（Ascochyta）；葡萄孢属（Botrytis）；尾孢属（Cercospora）；刺盘孢属（Colletotrichum）；色二孢属（Diplodia）；白粉菌属（Erysiphe）；镰刀菌属（Fusarium）；小球腔菌属（Leptosphaeria）；顶囊壳属（Gaeumanomyces）；长蠕孢属（Helminthosporium）；壳球孢属（Macrophomina）；丛赤壳属（Nectria）；霜霉属（Peronospora）；茎点霉属（Phoma）；瘤梗孢属（Phymatotrichum）；疫霉属；单轴霉属（Plasmopara）；叉丝单囊壳属（Podosphaera）；柄锈菌属；Puthium；核腔菌属（Pyrenophora）；梨孢属（Pyricularia）；腐霉属（Pythium）；丝核菌属（Rhizoctonia）；小核菌属（Scerotium）；核盘菌属（Sclerotinia）；壳针孢属（Septoria）；根串珠霉属（Thielaviopsis）；钩丝壳属（Uncinula）；黑星菌属（Venturia）；和轮枝孢属（Verticillium）。可以用本发明的干扰物处理的植物真菌感染的具体例子包括在谷类中的禾白粉菌（Erysiphe graminis），葫芦中的二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）和单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)，苹果中的白叉丝单囊壳（Podosphaeraleucotricha），葡萄藤中的葡萄钩丝壳（Uncinula necator），谷类中的柄锈菌属物种，棉花、马铃薯、稻和草坪中的丝核菌属物种，谷类和甘蔗中的黑粉菌属物种（Ustilago sp.），苹果中的苹果黑星菌（Venturia inaequalis）（痂），谷类中的长蠕孢属物种（Helminthosporium sp.），小麦中的颖枯壳针孢（Septoria nodorum），小麦中的小麦壳针孢（Septoria tritici），大麦上的黑麦喙孢（Rhynchosporium secalis），草莓、番茄和葡萄中的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）（灰霉），落花生中的落花生尾孢（Cercospora arachidicola），烟草中的烟草霜霉菌（Peronospora tabacina），或多种作物中的其他霜霉，小麦和大麦中的Pseudocercosporella herpotrichoides，大麦中的大麦网斑病菌（Pyrenophera teres），稻中的稻梨孢（Pyricularia oryzae），马铃薯和番茄中的致病疫霉（Phytophthorainfestans），多种作物中的镰刀菌属物种（例如尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和轮枝孢属物种，葡萄中的葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola），水果和蔬菜中的链格孢属物种，黄瓜中的古巴假霜霉（Pseudoperonospora cubensis），香蕉中的斐济球腔菌（Mycosphaerella fijiensis），鹰嘴豆中的壳二孢属物种，卡诺拉上的小球腔菌属物种，和多种作物中的刺盘孢属物种（Colleotrichum sp.）。

在另外一个特定实施方案中，植物农害是植物病原性细菌，包括但不限于燕麦嗜酸菌燕麦亚种（Acidovorax avenae subsp.avenae）（引起稻的细菌褐条病）、燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种（Acidovorax avenae subsp.cattleyae）（引起洋兰的细菌性褐斑病）、魔芋嗜酸菌（Acidovorax konjaci Konnyaku）（引起细菌性叶枯病）、发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）（引起甜瓜的毛状根）、根瘤土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）（引起冠婴病）、须芒草伯克霍尔德氏菌（Burkholderia andropogonis）（引起康乃馨的细菌性斑点）、石竹伯克霍尔德氏菌（Burkholderia caryophylli）（引起康乃馨的细菌性青枯病）、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）（引起兰花的细菌性褐斑病）、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌唐菖蒲致病型（Burkholderia gladioli pv.gladioli）（引起唐菖蒲的颈腐病）、荚壳伯克霍尔德氏菌（Burkholderia glumae）（引起稻的细菌性谷粒腐烂病）、植物伯克霍尔德氏菌（Burkholderia plantarii）（引起稻的细菌性苗立枯病）、密执安棒状杆菌密执安亚种（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）（引起番茄的细菌性溃疡病）、密执安棒状杆菌坏腐亚种（Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus）（引起马铃薯的环腐病）、梭菌属物种（Clostridium spp.）（引起马铃薯的软腐病）、蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens）（引起洋葱的细菌性溃疡病）、解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）（引起梨的火烧病）、菠萝欧文氏菌（Erwiniaananas）（引起稻的细菌性内颖褐变病）、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种（Erwiniacarotovora subsp.atroseptica）（引起马铃薯的黑腿病）、胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）（引起蔬菜的细菌性软腐病）、菊欧文氏菌（Erwinia chrysanthemi）（引起芋头的细菌性苗立枯病）、菊欧文氏菌玉米致病变种（Erwinia chrysanthemi pv.zeae）（引起稻的细菌性基腐病）、草生欧文氏菌鸡血藤致病变种（Erwinia herbicola pv.millettiae）（引起紫藤的冠婴）、菊苣假单胞菌（Pseudomonascichorii）（引起菊的细菌性斑点）、皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugate Pith）（引起番茄的枯斑）、褐鞘假单胞菌（Pseudomonas fuscovaginae）（引起稻鞘的褐腐病）、边缘假单胞菌边缘致病变种（Pseudomonas marginalis pv.marginalis）（引起卷心菜的软腐病）、红苍白假单胞菌（Pseudomonas rubrisubalbicans）（引起甘蔗的斑驳条纹）、丁香假单胞菌甜菜致病变种（Pseudomonas syringae pv.aptata）（引起甜菜的细菌性枯萎病）、丁香假单胞菌绛红致病变种（Pseudomonas syringae pv.atropurpurea）（引起黑麦草的晕枯病）、丁香假单胞菌栗致病变种（Pseudomonas syringae pv.castaneae）（引起栗子的细菌性溃疡病）、丁香假单胞菌大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.glycinea）（引起大豆的细菌性枯萎病）、丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）（引起黄瓜的细菌性斑点）、丁香假单胞菌斑生致病变种（Pseudomonas syringae pv.maculicola）（引起卷心菜的细菌性黑斑病）、丁香假单胞菌桑致病变种（Pseudomonas syringae pv.mori）（引起桑树的细菌性枯萎病）、丁香假单胞菌李死致病变种（Pseudomonas syringaepv.morsprunorum）（引起李子的细菌性溃疡病）、丁香假单胞菌稻致病变种（Pseudomonassyringae pv.oryzae）（引起稻的晕枯病）、丁香假单胞菌菜豆致病变种（Pseudomonassyringae pv.phaseolicola）（引起菜豆的晕枯病）、丁香假单胞菌豌豆致病变种（Pseudomonas syringae pv.pisi）（引起豌豆的细菌性枯萎病）、丁香假单胞菌芝麻致病变种（Pseudomonas syringae pv.sesame）（引起芝麻的细菌性斑点）、丁香假单胞菌条纹致病变种（Pseudomonas syringae pv.striafaciens）（引起燕麦的细菌性条纹枯萎病）、丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）（引起小红珠中的细菌性褐斑病）、丁香假单胞菌烟草致病变种（Pseudomonas syringae pv.tabaci）（引起烟草的野火病）、丁香假单胞菌茶致病变种（Pseudomonas syringae pv.theae）（引起茶的细菌性枝枯病）、丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）（引起番茄的细菌性叶斑病）、绿黄假单胞菌（Pseudomonas viridiflava）（引起菜豆的细菌性褐斑病）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）（引起细菌性青枯病）、拉氏拉氏杆菌（Rathayibacterrathayi）（引起果树草的细菌性穗枯病）、疥疮链霉菌（Streptomyces scabies）（引起马铃薯的疮痂病）、番薯链霉菌（Streptomyces ipomoea）（引起番薯的土壤中腐烂）、白纹黄单胞菌（Xanthomonas albilineans）（引起甘蔗的白色条纹）、野油菜黄单胞菌谷物致病变种（Xanthomonas campestris pv.cerealis）（引起黑麦的细菌性条纹）、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）（引起黑腐病）、野油菜黄单胞菌柑橘致病变种（Xanthomonas campestris pv.citri）（引起柑橘的溃疡病）、野油菜黄单胞菌黄瓜致病变种（Xanthomonas campestris pv.cucurbitae）（引起黄瓜的细菌性褐斑病）、野油菜黄单胞菌大豆致病变种（Xanthomonas campestris pv.glycines）（引起大豆的细菌性斑疹病）、野油菜黄单胞菌紫罗兰致病变种（Xanthomonas campestris pv.incanae）（引起母株黑腐病）、野油菜黄单胞菌锦葵致病变种（Xanthomonas campestris pv.malvacearum）（引起棉花的角斑病）、野油菜黄单胞菌芒果致病变种（Xanthomonas campestrispv.Mangiferaeindicae）（引起芒果的细菌性溃疡病）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris pv.mellea）（引起烟草的威斯康辛州细菌性叶斑病）、野油菜黄单胞菌黑斑致病变种（Xanthomonas campestris pv.nigromaculans）（引起牛蒡的细菌性斑点）、野油菜黄单孢菌菜豆致病变种（Xanthomonas campestris pv.phaseoli）（引起菜豆的细菌性斑疹病）、野油菜黄单胞菌豌豆致病变种（Xanthomonas campestris pv.pisi）（引起菜豆的细菌性茎腐病）、野油菜黄单胞菌桃李致病变种（Xanthomonas campestris pv.pruni）（引起桃的细菌性穿孔病）、野油菜黄单胞菌萝卜致病变种（Xanthomonas campestris pv.raphani）（引起日本萝卜的细菌性斑点）、野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种（Xanthomonas campestrispv.ricini）（引起蓖麻的细菌性斑点）、野油菜黄单胞菌栖茶致病变种（Xanthomonascampestris pv.theicola）（引起茶的溃疡病）、野油菜黄单胞菌半透明致病变种（Xanthomonas campestris pv.translucens）（引起果树草的细菌性枯萎病）、野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种（Xanthomonas campestris pv.vesicatoria）（引起番茄的细菌性斑点）、野油菜黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）（引起稻的细菌性叶枯病）。

虽然分子可以就此施用，但在植物中，特别考虑使用转基因方法。在这些情况下，方法利用编码具有下述结构的分子的非天然存在的核酸序列：

（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；并且其中

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50%是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个和优选至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个，优选无，P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是植物、植物细胞或植物种子的蛋白质中（或植物病原体的蛋白质中）天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

上文方法可以重新表述为，用于下调植物或植物细胞或植物种子中的植物蛋白质的生物功能（或用于下调植物或植物细胞或植物种子中的农害生物体的蛋白质的生物功能）的方法，其包括用（即至少一种）非天然存在的编码具有上文所述结构的分子的核酸序列转化所述植物、植物细胞或植物种子。

可替代地，方法可以重新表述为，用于下调植物或植物细胞或植物种子中的植物蛋白质的生物功能（或用于下调植物或植物细胞或植物种子中的农害生物体的蛋白质的生物功能）的方法，其包括在所述植物、植物细胞或植物种子中表达非天然存在的编码具有上述结构的分子的核酸序列。

根据具体实施方案，所编码的多肽序列是非天然存在的多肽。根据进一步特定实施方案，核酸序列是人工基因。人工基因一般包含下述可操作地连接的DNA元件：a）植物可表达启动子，b）编码上述分子的核酸（特别是DNA）序列，和c）包含在所述植物的细胞中起作用的转录终止和多腺苷酸化信号的3'末端区。

因为核酸方面最特别适合于利用转基因表达的应用中，特别考虑的实施方案是其中核酸序列（或人工基因）融合至另一个部分，特别是增加基因产物的可溶性和/或稳定性的部分。事实上，由于产物的快速降解，肽的转基因表达有时可以是困难的。因此，人工基因包含下述可操作地连接的DNA元件：a）植物可表达启动子，b）编码融合至增强干扰物分子的可溶性（防止聚集）的部分的干扰物分子的核酸，和c）包含在所述植物的细胞中起作用的转录终止和多腺苷酸化信号的3'末端区。

在该方面还提供，包含编码如本文描述的分子的该核酸序列的重组载体。这些重组载体理想地适合作为媒介物以携带目的核酸序列进入表达待下调的蛋白质的细胞，并且驱动核酸在所述细胞中表达。重组载体可以作为分开的实体在细胞中维持（例如作为质粒），或可以整合到细胞的基因组内。

最特别地，分子是由重组载体上存在的核苷酸序列编码的多肽，并且在引入植物细胞、植物种子或植物内之后，在所述植物细胞、植物种子或植物中产生所述多肽。在这些情况下，在蛋白质和非天然存在的分子之间的接触通过在所述植物或植物细胞中表达所述非天然存在的分子来实现。蛋白质的生物功能因而通过干扰物分子的表达而得到下调。

相应地，本文提供植物、或植物细胞、或植物种子，其含有如本文描述的核酸序列、人工基因或重组载体。本文还考虑含有此类序列的植物原生质体。

在本发明中，“植物可表达启动子”包含调节元件，其介导编码序列区段在植物细胞中的表达。对于在植物中的表达，核酸分子必须可操作地连接至合适的启动子或包含合适的启动子，所述启动子在正确的时间点和以所需空间表达模式表达基因。对于功能上等价的启动子的鉴定，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过下述进行分析：使启动子与报道基因可操作地连接，并且测定报道基因在植物的多个组织中的表达水平和模式。合适的众所周知的报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶促活性进行测定。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子（例如在本发明的方法中使用的启动子）相比较。可替代地，启动子强度可以通过定量mRNA水平或通过比较在本发明的方法中使用的核酸的mRNA水平与持家基因例如18S rRNA的mRNA水平而进行测定，其中可以使用本领域已知的方法，例如RNA印迹与放射自显影图的光密度测量分析、定量实时PCR或RT-PCR（Heid等人，1996GenomeMethods6：986-994）。一般地，“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”意指每细胞约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物，至约1/500,0000个转录物的水平。相反地，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或以每细胞约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1000个转录物表达。一般地，“中等强度启动子”意指驱动编码序列以低于强启动子的水平表达的启动子，特别地该水平在所有情况下低于在35S CaMV启动子的控制下获得的表达水平。

如本文使用的术语“可操作地连接”指在启动子序列和目的基因之间的功能连接，使得启动子序列能够起始目的基因的转录。

“组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中，在大部分但不一定是所有的生长发育期中和在大多数环境条件下具有转录活性的启动子。“遍在”启动子在生物体的基本上所有组织或细胞中具有活性。发育调节的启动子在某些发育阶段中或在经历发育变化的植物部分中具有活性。诱导型启动子具有响应化学品（关于综述参见Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48:89-108）、环境或物理刺激而诱导或增加的转录起始，或可以是“胁迫诱导型的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或“病原体诱导型的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织例如叶、根、种子组织等中起始转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是占优势地在植物根中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。仅能够在某些细胞中起始转录的启动子在本文中被称为“细胞特异性的”。种子特异性启动子占优势地在种子组织中，但不一定唯一地在种子组织中（在渗漏表达的情况下），具有转录活性。种子特异性启动子可以在种子发育过程中和/或在发芽过程中是活跃的。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉/胚特异性的。种子特异性启动子的例子在Qing Qu和Takaiwa（Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004）中给出，所述参考文献的公开内容完全地引入本文作为参考。如本文定义的绿色组织特异性启动子是占优势地在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，但仍允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。

术语“终止子”包含这样的控制序列，其是在转录单位结束处的DNA序列，其发出对初级转录物进行3'加工和多腺苷酸化和转录终止的信号。终止子可以衍生自天然基因，多种其他植物基因，或T-DNA。待添加的终止子可以衍生自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或可替代地衍生自另一种植物基因，或较不优选地衍生自任何其他真核生物基因。

“可选择标记”、“可选择标记基因”或“报告基因”包括赋予细胞表型的任何基因，该基因在细胞中的表达有利于鉴定和/或选择被本发明的核酸构建体转染或转化了的细胞。这些标记基因通过各种不同的原理使得能够鉴定核酸分子的成功转移。适宜的标记可以选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的代谢性状或允许可视选择。可选择标记基因的实例包括赋予抗生素抗性的基因（例如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt，或赋予例如对博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素抗性的基因）、赋予除草剂抗性的基因（例如提供抗Basta抗性的bar；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或赋予例如对咪唑啉酮、膦丝菌素或磺酰脲抗性的基因）、或者提供代谢性状的基因（如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或导致木糖利用的木糖异构酶，或抗营养标记如对2-脱氧葡萄糖的抗性）。可视标记基因的表达导致形成颜色（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS，或β-半乳糖苷酶及其有色底物，例如X-Gal）、发光（如萤光素/萤光素酶系统）或荧光（绿色荧光蛋白GFP及其衍生物）。这里仅仅是列出了一小部分可用的标记。技术人员对这类标记极为熟悉。优选根据不同生物体和选择方法来使用不同的标记。

已知，取决于所用的表达载体和所用的转染技术，当核酸向植物细胞进行稳定或瞬时整合时，仅少数细胞能摄入外来DNA，并将其整合入基因组（如果期望的话）。为鉴定并选择这些整合体，通常将编码可选择标记(如上文所述的那些)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。这些标记能够例如在如下突变体中使用，在所述突变体中所述基因例如通过常规方法缺失而没有功能。此外，编码可选择标记的核酸分子与编码本发明多肽或用于本发明方法的序列可以在同一个载体中引入宿主细胞，或者在分开的载体中引入。已由所引入的核酸稳定转染的细胞可以例如通过选择(例如，整合有可选择标记的细胞存活而其他细胞死去)予以鉴定。

由于一旦成功引入核酸后，将不再需要或不期望转基因宿主细胞中存在标记基因，特别是抗生素和除草剂抗性基因，所以根据本发明引入核酸的方法有利地采用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法是称为共转化的方法。共转化法采用两个载体同时进行转化，一个载体携带根据本发明的核酸，而第二个携带标记基因。很大比例的转化体将接收或者对于植物而言(高达40%或以上的转化体)含有两个载体。对于农杆菌转化，转化体通常只接收载体的一部分，即被T-DNA侧翼包围的序列，其通常是表达盒。随后可通过杂交（cross）从转化植物中除去标记基因。在另一种方法中，利用整合进转座子的标记基因与期望的核酸一起进行转化(称为Ac/Ds技术)。转化体可与转座酶来源杂交，或者用赋予转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定转化转化体。在有些情况下(约10%)，一旦成功进行了转化，转座子将跳离宿主细胞基因组并丢失。在另一些情况下，转座子跳至不同的位置。在这些情况下，必须通过杂交，消除标记基因。研发了可以或便于检测此类事件的微生物学技术。另一有利的方法有赖于称为重组系统的方法，其优势在于可以免除杂交消除步骤。最著名的这类系统称为Cre/lox系统。Cre1为重组酶，且切除位于loxP序列之间的序列。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦成功进行了转化，将因Cre1重组酶的表达而得以切除。其他重组系统有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB系统(Tribble等,J.Biol.Chem.,275,2000:22255-22267;Velmurugan等,J.Cell Biol.,149,2000:553-566)。根据本发明的核酸序列可以位点特异性地整合进植物基因组。

出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”，就例如，核酸序列，含有所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体而言。

为了本发明目的，转基因植物因此应理解为表示：本发明方法中所用的核酸(例如人工基因)不存在于或起源于所述植物的基因组，或者其存在于所述植物的基因组中、但不位于其在所述植物的基因组中的天然位置上，该核酸可以为同源或异源表达。不过，正如所提到的那样，转基因也表示：当在植物基因组中，根据本发明的核酸或本发明方法中所用的核酸位于其天然位置上时，所述序列已相对于天然序列被修饰，和/或该天然序列的调控序列已被修饰。转基因优选指：根据本发明的核酸在基因组中于非天然的座位上表达，即同源表达，或者发生核酸的异源表达。优选的转基因植物在文中述及。

术语“表达”或“基因表达”是指一种或多种特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别指一种或多种基因或遗传构建体转录为结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，后者随后翻译或不翻译为蛋白质。该过程包括DNA的转录、以及所产生mRNA产物的加工。

如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”表示超出原始野生型表达水平的任何形式的表达。为了本发明的目的，原始野生型表达水平也可以是零，即，无表达或无法测量到的表达。

增加基因或基因产物表达的方法在本领域有充分的记载，这包括，例如由适当的启动子(见前述)驱动的过表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入非异源形式多核苷酸的适当位置(一般是上游)，从而上调目的多肽编码核酸的表达。如果期望多肽表达，通常期望在多核苷酸编码区的3’末端纳入多聚腺苷酸化区域。多聚腺苷酸化区域可以源自天然基因、多种其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’末端序列可以源自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因、或可选地源自其他植物基因、或次优选地源自任何其它真核基因。

也可以在5’非翻译区(UTR)或部分编码区的编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。已显示，在植物和动物表达构建体的转录单位中纳入可剪接内含子可以在mRNA和蛋白质水平使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8:4395-4405;Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)。通常这类内含子被放置在转录单位5’末端附近时，其增强基因表达的作用最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6以及Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。一般信息请参见The MaizeHandbook,第116章,Freeling和Walbot编辑,Springer,N.Y.(1994)。

本文述及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移进宿主细胞，不考虑转移所用的方法。可以使用本发明的遗传构建体转化能够通过器官发生或者胚胎发生随后进行克隆繁殖的植物组织，并从其再生整个植物。具体选择的组织将因可得的和最适于待转化的具体物种的克隆繁殖系统而变。示例性的组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子、愈伤组织、既有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)，以及诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可将多核苷酸瞬时或稳定地导入宿主细胞，其可保持非整合状态例如作为质粒。可选择地，可将其整合入宿主基因组。然后以本领域技术人员已知的方法将所得的转化的植物细胞用于再生转化的植物。

外来基因转移进入植物基因组中称为转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，可使用几种转化方法中的任一方法将目的基因导入适宜的祖先细胞。可以利用转化方法以及由植物组织或植物细胞再生植物的方法来进行瞬时或稳定转化。转化方法包括脂质体的使用、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、DNA至植物的直接注射、基因枪轰击（particle gun bombardment）、使用病毒或花粉的转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens,F.A.等人,(1982)Nature296,72-74;Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol8:363-373)、原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol3,1099-1102)、至植物材料内的显微注射(Crossway A等人,(1986)Mol.GenGenet202:179-185);DNA或RNA包被的微粒轰击(Klein TM等人,(1987)Nature327:70)；使用（非整合型）病毒的感染等。优选通过农杆菌介导的转化产生转基因植物，包括转基因作物植物。一种有利的转化法是植物原位(in planta)转化。为此，可以例如使农杆菌作用于植物种子，或用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，证明使转化了的农杆菌悬液作用于完整植株或至少花原基尤为有利。随后培养植物，直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent,Plant J.(1998)16,735–743)。农杆菌介导的稻转化方法包括众所周知的稻转化方法，例如在任一如下文献中描述的方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta,199:612-617,1996);Chan等(Plant Mol.Biol.22(3)491-506,1993),Hiei等(Plant J.6(2):271-282,1994)，其公开的内容在此并入本文作为参考就如同陈述了其全部内容那样。至于玉米转化，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol.14(6):745-50,1996)或Frame等(Plant Physiol.129(1):13-22,2002)中所述，其公开的内容全部地并入本文作为参考。作为举例说明，所述方法还由B.Jenes等,Techniques for Gene Transfer,在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press(1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)中进一步描述。优选将待表达的核酸或构建体克隆到载体中，所述载体适用于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如pBin19(Bevan等,Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后以已知的方式利用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，例如用作模式植物的植物，像拟南芥(Arabidopsis thaliana)、或者作物植物，例如作为举例的烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸没擦伤的叶子或切碎的叶子，然后在合适的培养基中培养之。通过根癌农杆菌的植物转化例如已由Hfgen和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16,9877描述，或者尤其是可从F.F.White,Vectors for GeneTransfer in HigherPlants在Transgenic Plants,卷1,Engineering and Utilization,编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press,1993,第15-38页获知。

除了转化体细胞（其随后必须再生为完整植株）以外，还可以转化植物分生组织的细胞，特别是可以发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子循着天然植物的发育而产生转基因植物。因此，例如，可以用农杆菌处理拟南芥的种子，并从发育的植物收获种子，其中一定比例经转化因而是转基因的[Feldman,KA和Marks MD(1987).Mol GenGenet208:274-289;Feldmann K(1992).在C Koncz,N-H Chua和J Shell编辑Methods inArabidopsis Research.Word Scientific,Singapore,第274-289页]。可选的方法基于花序的反复去除以及莲座叶丛中心切割部位与转化农杆菌一起进行的孵育，由此在随后的时间点同样能够获得转化的种子(Chang(1994).Plant J.5:551-558;Katavic(1994).MolGen Genet,245:363-370)。然而，一种特别有效的方法是真空渗入法，及其改良方法如“花器浸蘸法”(floral dip)。对于拟南芥的真空渗入，用农杆菌悬液在减压下处理完整植株[Bechthold,N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci,316:1194-1199]，而对于“花器浸蘸法”，将发育中的花组织与表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂孵育[Clough,SJ和Bent,AF(1998).The Plant J.16,735-743]。在两种情况下均收获一定比例的转基因种子，且可通过在上述选择性条件下培养而将这些种子与非转基因种子区分开来。另外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在多数作物中为母系遗传，从而降低或消除了转基因通过花粉传播的风险。叶绿体基因组的转化通常通过Klaus等,2004[Nature Biotechnology22(2),225-229]中系统性展示的方法实现。简言之，将待转化的序列与可选择的标记基因一起克隆到同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导转基因位点特异性整合到质体基因组中。质体转化已在许多不同的植物物种中描述，且综述由Bock(2001)Transgenicplastids in basic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日;312(3):425-38或Maliga,P(2003)Progress towards commercialization of plastidtransformation technology.Trends Biotechnol.21,20-28给出。最近报道了形式为不含标记的质体转化体的其他生物技术方法，所述转化体可以利用瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等,2004,Nature Biotechnology22(2),225-229)。

遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者Hfgen和Willmitzer的出版物。

通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子，酌情在消毒之后，种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。可选地，针对转化的植物筛选可选择标记如上文所述标记的存在。

DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析(DNA印迹)，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。可选的或额外地，可用Northern和/或Western分析(蛋白质印迹)监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的砧木嫁接到非转化的接穗上)。

选择合适的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或不含目的基因的相应植物。对照植物通常与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子(nullizygote)。无效合子是由于分离而丢掉转基因的个体。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且指植物部分，包括种子和种子部分。

术语“表达盒”指用于在任何细胞中组成性或诱导性地在体外或体内表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统，其中所述细胞除了植物细胞外还包括原核、酵母、真菌、昆虫或哺乳动物细胞。该术语包括线性和环状表达系统。该术语包括所有载体。盒可以保持为附加体形式、或整合到宿主细胞基因组内。表达盒可以具有自复制的能力或不具有该能力（即仅在细胞中驱动瞬时表达）。该术语包括仅含有转录重组核酸所需的最少元件的重组表达盒。

根据可替代实施方案，本发明分子就此施用于植物，而不作为转基因。因为植物不具有消化系统，所以术语施用在此处还特别考虑该分子的局部应用（在植物上而不是在植物中提供分子）、或间接施用途径（例如在土壤中提供分子，使得它们可以通过植物的根吸收）。尽管这种施用途径特别适合于应对植物感染，但它也可以应用于下调植物蛋白质。

分子可以就此作为农业化学品提供。然而，一般地，用于在植物中使用的分子（或编码其的核酸）可以连同农艺学可接受的载体（而不是药学可接受的载体）一起作为组合物提供。“农艺学可接受的载体”意指，固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质，其可以安全地用于干扰物分子向植物、植物种子、植物细胞或植物原生质体的局部或全身施用中。与农艺学可接受的载体组合的、本文描述的用于在植物中应用的分子也被称为农业化学制剂或农业化学组合物。如本文使用的“农业化学制剂”意指，用于农业或园艺用途的组合物，包含活性成分（即至少如本文描述的分子），任选地连同促进农业化学品的最佳分散、喷雾、叶湿润、分布、保留和/或摄取的一种或多种添加剂。作为非限制性例子，此类添加剂是稀释剂、溶剂、助剂、表面活性剂、湿润剂、铺展剂、油、粘着剂、穿透剂、缓冲剂、酸化剂、去泡剂或漂移控制剂。如本文使用的“农业化学品”不仅包括现成使用的化合物或化合物制剂，还包括失活形式的前体——其可以通过外部因素活化。作为非限制性例子，前体可以通过pH改变而活化，通过昆虫损害后的植物伤口、通过真菌攻击引起的酶促作用、或通过温度变化或湿度变化而引起。如本文使用的，农业化学品不仅包括适于和/或旨在用于在大田作物（农业）中使用的试剂（例如农药、生长调节剂、营养素/肥料、排斥剂、落叶剂等），还包括意欲用于在温室作物（园艺学/花卉园艺学）中使用的试剂（例如农药、生长调节剂、营养素/肥料、排斥剂、落叶剂等），和甚至适于和/或预期用于非作物用途的试剂，例如在私人园林中使用、家庭用途（例如用于家庭用途的除草剂或杀虫剂）、或通过农害控制操作者使用（例如杂草控制等）。优选地，所述农业化学品或农业化学品的组合选自除草剂（例如具有针对杂草蛋白质的Yi区的分子）、杀虫剂（例如具有针对昆虫蛋白质的Yi区的分子）、杀真菌剂（例如具有针对霉菌蛋白质的Yi区的分子）、杀线虫剂（例如具有针对线虫蛋白质的Yi区的分子）、杀生物剂（例如具有针对病原体蛋白质的Yi区的分子）、或植物生长调节化合物（例如具有针对待施用该分子的植物的蛋白质的Yi区的分子）。另外的活性成分（其并非如本文描述的分子）特别选自除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀生物剂、肥料、微量营养素或植物生长调节化合物。

特别地，本发明的此类农业化学组合物可以包含微胶囊、微球体、纳米胶囊、纳米球、脂质体或囊泡等，其中一种或多种农业化学品被适当地封装、包围、嵌入、掺入或以其它方式包含在内；和一种或多种靶向试剂，其各自包含用于结合一种或多种抗原的一个或多个结合结构域，其中所述抗原存在于植物或植物部分（例如植物的叶、茎、花、果实、球茎或块茎）上的一个或多个结合位点处或中、或形成所述结合位点。具有与之结合、偶联或附着或连接的一种或多种靶向试剂的该载体可以溶解、乳化、悬浮或分散或以另外方式包括在合适的液体介质（例如水或另一种含水、有机或油性介质）内，以便提供（浓缩）溶液、悬浮液、分散体或乳状液，其可以贮存，且（需要时在进一步稀释后），例如通过喷射、倾倒、滴、刷、滴涂或任何其他合适的技术，应用于植物、一个或多个植物部分（例如叶、茎、根、果实、球果、花、球茎或块茎）、或植物周围环境（例如生长植物的土壤）。因此，组合物可以经由一个或多个结合结构域，优选以靶向方式，结合在结合位点处或上（或结合存在于所述结合位点上或中或形成所述结合位点的一种或多种抗原，所述结合位点例如毛状体、气孔、表皮、皮孔、刺、针或蜡质层），其中所述结合结构域构成包含在组合物中的靶向试剂的部分。由此，农业化学品以可以提供所需农业化学品的方式，从载体中释放（例如由于载体的降解、或通过微胶囊、微球体、纳米胶囊、纳米球、脂质体或囊泡等的壁的被动转运）。作为使用载体的替代方案，农业化学品或农业化学品的组合也可以以（小）颗粒的形式提供，所述颗粒被给予合适的包衣或(外)层，该包衣或层与所述靶向试剂偶联或可以与所述靶向试剂结合，并且也可以起到稳定或改善颗粒的物理完整性或稳定性的作用。作为另一个替代方案，农业化学品或农业化学品的组合可以适当地与赋形剂或粘合剂混合，所述赋形剂或粘合剂与靶向试剂偶联或可以与之结合，并且再次也可以起到稳定或改善颗粒的物理完整性或稳定性的作用。此类涂布的或复合的颗粒优选以浆、湿饼或自由流动粉末、片、胶囊或液体浓缩物（例如乳状液、悬浮液、分散体）的形式。

应当理解，尽管特定实施方案、具体构型以及材料和/或分子已在本文中针对根据本发明的细胞和方法进行了讨论，但可以作出形式和细节的多种变化或修饰，而不背离本发明的范围和精神。提供下述实施例以更好地举例说明特定实施方案，并且它们不应视为限制本申请。本申请仅受权利要求限制。

实施例

在下述实施例中，突出显示干扰物技术的不同应用。本发明分子在治疗感染性疾病中的有用性在分别涉及抗真菌、抗细菌和抗病毒应用的实施例1至3中举例说明。实施例1详述可以如何处理或防止生物膜生长，并且还显示在酵母中对胁迫抗性的下调。实施例2证实可以有效杀死多种细菌物种，包括抗生素抗性物种，同时对于哺乳动物细胞是无毒的。此外，实施例2证实肽的体内施用以治疗感染的可行性。实施例3表征针对不同流感病毒蛋白质的干扰物分子的鉴定。

实施例4举例说明了，本发明分子可以用于检测蛋白质（范围从细菌到人蛋白质）的不同方式、以及这可以如何通过检测复杂样品中的生物标记而应用于疾病诊断。

实施例5通过显示涉及癌症和AMD的两种众所周知的受体酪氨酸激酶的特异性聚集，详述了用于非感染性疾病的应用。还证实了，可以使用本文描述的干扰物分子调节免疫功能的概念。

最后，实施例6显示，本发明分子还可以应用于实现植物中的蛋白质的下调。

1.抗真菌应用

1.1前言

白色念珠菌构成人正常菌群的部分，并且它在健康个体的粘膜表面上生长。在易感宿主中，这种真菌生物体可以引起粘膜和血原性散布的疾病。对于白色念珠菌，为了在宿主中维持和诱导疾病，它必须能够粘附至生物的和非生物的表面，侵入宿主细胞，且获得铁。白色念珠菌的菌丝特异性表面蛋白质Als3是凝集素样序列（Als）蛋白质家族的成员，并且在所有这些过程中都是重要的（Hoyer LL等人（1998）Curr.Genet.33（6）：451-9）和Liu Y等人（2011）Eukaryotic Cell.10（2）:168-73。充当粘附素，Als3介导与上皮细胞、内皮细胞和细胞外基质蛋白质的附着。它还在人造装置(prosthetic)表面上的生物膜形成中起重要作用。Als3是两种已知的白色念珠菌侵袭素之一。它与宿主细胞受体例如E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白结合，并且从而诱导宿主细胞内吞生物体。Als3还与宿主细胞铁蛋白结合且使得白色念珠菌可以利用该蛋白质作为铁源。由于其多重功能及其在体内的高表达水平，Als3视为是有希望的对抗念珠菌感染的靶。在本实施例中，我们应用本发明的产品和方法以特异性靶向Als3蛋白质。

1.2特异性Als3干扰物的细胞内表达

使用β-聚集预测算法TANGO，将衍生自Als3（在SEQ ID NO：2中描述）的序列LQQYTLLLIYLSVATAK（SEQ ID NO：1）鉴定为具有高聚集形成潜力的序列。对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸2-18的这17个氨基酸残基（SEQ ID NO：1）用作细胞内干扰物构建体中的诱饵序列。QQ和K作为天然守门残基（X1和X2部分）起作用，YTLLLIYLSVATA（SEQ ID NO：107）是本例中的Y1区。将编码SEQ ID NO：1的DNA序列克隆到白色念珠菌表达载体pPCK1-GFP（Barelle等人，（2004）Yeast21（4）：333-40）中，与白色念珠菌优化的GFP（绿色荧光蛋白）基因和多接头序列在读框内，进一步遗传偶联编码聚集加强子和HA-标签的DNA序列。该所谓的加强子序列（RKLLFNL（SEQ ID NO：68））是具有高聚集倾向的人工序列。序列RKLLFNL（SEQID NO：68）显示DnaK结合，并且是衍生自σ因子32的经适应性修改的序列（野生型序列是RKLFFNL（SEQ ID NO：69））（参见McCarty J.等人（1996）J.Mol.Bio.256，829-837）。整个融合构建体的表达在PCK1启动子的控制下。PCK1基因被葡萄糖阻遏，并且通过糖原异生碳源例如酸或琥珀酸盐而编码PEP羧化激酶（Leuker等人（1997）Gene192：235-240）。

SEQ ID NO：2：白色念珠菌的Als3的氨基酸序列

1mlqqytllli ylsvatakti tgvfnsfnsl twsnaatyny kgpgtptwna vlgwsldgts 61aspgdtftln mpcvfkftts qtsvdltahg vkyatcqfqa geefmtfstl tctvsntltp121sikalgtvtl plafnvggtg ssvdledskc ftagtntvtf ndggkkisin vdfersnvdp181kgyltdsrvi pslnkvstlf vapqcangyt sgtmgfanty gdvqidcsni hvgitkglnd241wnypvssesf sytktcssng ifityknvpa gyrpfvdayi satdvnsyti syaneytcag301gywqrapftl rwtgyrnsda gsngivivat trtvtdstta vttlpfdpnr dktktieilk361piptttitts yvgvttsyst ktapigetat vivdipyhtt ttvtskwtgt itsttthtnp421tdsidtvivq vpspnptvtt teywsqsfat tttitgppgn tdtvlirepp nhtvttteyw481sesytttstf tappggtdsv iikeppnptv ttteywsesy tttttvtapp ggtdtviire541ppnhtvttte ywsqsytttt tviappggtd sviireppnp tvttteywsq syattttita601ppgetdtvli reppnhtvtt teywsqsyat tttitappge tdtvlirepp nhtvttteyw661sqsytttttv iappggtdsv iikeppnptv ttteywsqsy attttitapp getdtvlire721ppnhtvttte ywsqsyattt titappgetd tvlireppnh tvttteywsq sfattttvta781ppggtdtvii reppnhtvtt teywsqsfat tttvtappgg tdtvlirepp nptvttteyw841sqpytttttv iappggtdtv iiydtmssse issfsrphyt nht

包含表达盒的质粒在RPS10座位处线性化，之后转化白色念珠菌CAI4菌株（Fonzi和Irwin（1993）Genetics134：717-728）。生成转化体且通过PCR分析证实为包含该表达盒。三个独立转化体AFA16a、AFA16b和AFA16c（表达GFP+加强子+诱饵序列）用于后续实验中。作为阴性对照，使用包含相同质粒但缺乏特异性诱饵序列的重组体。这导致对照菌株AFA15a（表达GFP+加强子）。为了鉴定诱饵肽的定位，使用GFP的表达。所有菌株都在阻遏条件下生长过夜。接下来，将细胞转移至补充有4%D-葡萄糖的YNB培养基，pH6.5（启动子阻遏条件）或补充有酪蛋白氨基酸的相同培养基（启动子诱导条件）。在1小时、2小时、3小时和5小时后，经由GFP荧光测定，跟踪干扰物构建体的表达。在阻遏条件下，无法检测到GFP荧光（数据未显示）。

白色念珠菌AFA15a展示存在细胞内弥漫的GFP信号，而非在细胞区室内的明确定位。然而，包含干扰物构建体的重组白色念珠菌菌株展示了点状定位，指示在细胞溶质内的抗Als3蛋白质聚集体。在诱导后2小时该现象已出现并且在以后时间点内扩增。随着时间过去，点的量以1–3个/细胞的范围增加。以后时间点指示相同比例的病灶，类似于在5小时后获得的（数据未显示）。这说明，短干扰诱饵序列的存在可以导致诱导的聚集。

1.2.1体外生物膜形成

因为已知Als3对于粘附和生物膜形成是重要的，所以还在体外生物膜实验中使用了重组菌株。起始的假设是，表达干扰物构建体的白色念珠菌菌株与白色念珠菌ALS3缺失突变体在粘附和生物膜形成中具有相似的表型。表达干扰物的重组菌株就其在硅氧烷正方形盘上形成体外生物膜的能力进行测试。在具有琥珀酸盐或4%D-葡萄糖作为碳源的YNB，pH6.5中生长后，获得成熟生物膜（48小时）。随后通过荧光显微镜检查评估了生物膜结构。观察到，白色念珠菌AFA15a在48小时内增殖，导致跨越整个硅氧烷表面的强附着和成熟生物膜结构，不依赖于在诱导还是在阻遏条件中生长。重要的是，白色念珠菌SC5314（如通过Gillum等人（1984）Mol Gen Genet198:179-182提及的，野生型白色念珠菌）形成了与AFA15a等价的成熟生物膜（数据未显示）。另一方面，Als3干扰物构建体的表达诱导导致了强烈减少的粘附和生物膜形成，其特征在于无任何附着细胞的黑色区域。此未发育的生物膜形成类似于通过纯合Als3突变体白色念珠菌als3Δ/als3Δ产生的。当在YNB，4%D-葡萄糖中生长时，所有三个独立转化体都能够形成类似于AFA15a的成熟生物膜。除了荧光显微镜检查外，生物膜还通过菌落形成单位（CFU）进行定量。数据呈现于图3中。

生物膜的定量与得自GFP荧光显微镜检查的观察结果明确一致。如预期的，对照菌株（白色念珠菌SC5314和AFA15a）在两种生长条件下均产生成熟生物膜。相比之下，与野生型菌株相比较，表达白色念珠菌Als3干扰物的重组体明显未能形成生物膜（p<0.001）（观察到几乎80%抑制），而在阻遏条件下生长时，它们获得其功能且产生与对照菌株相似的生物膜（几乎100%生物膜形成）。这些结果支持下述事实：Als3的诱导的蛋白质聚集导致了其功能丧失，并且表达干扰物的重组体具有与白色念珠菌als3Δ/als3Δ菌株相似的表型。

1.2.2人上皮细胞的粘附和侵入

除了在粘附中具有作用外，Als3也涉及对人上皮和内皮细胞的侵入。因此，在下一个步骤中，我们研究了重组白色念珠菌菌株粘附和侵入人上皮细胞的能力，白色念珠菌对照菌株（SC5314和AFA15a）和表达干扰物的重组菌株（AFA16a、AFA16b和AFA16c）在诱导/阻遏条件下生长过夜。白色念珠菌als3Δ/als3Δ用作对照。念珠菌与上皮细胞的接触在1小时后评估，而侵入在3小时后监控。粘附和侵入的真菌细胞的百分比显示于图4A和B中。

表达Als3干扰物构建体的白色念珠菌菌株（A）粘附和（B）侵入上皮细胞系TR-146的能力。菌株在补充有琥珀酸盐的YNB，pH6.5（白色条）中或在YNB，pH6.5,4%D-葡萄糖（黑色条）中温育过夜。两个测定都在含有NaHCO₃、D-葡萄糖、丙酮酸钠和谷氨酰胺、不含FCS的DMEM中执行。粘附执行1小时，而侵入执行3小时，两者都在37℃、5%CO₂下。粘附的念珠菌细胞用calcofluor white染色，并且粘附细胞的百分比计算为分布在盖玻片的整个表面上的一百个区域上的附着念珠菌细胞的平均值。侵入的白色念珠菌细胞的百分比通过将内在化的细胞的数目除以粘附细胞的总数目而确定。在每个盖玻片上计数至少100个真菌细胞。白色念珠菌SC5314用作对照菌株（100%），并且白色念珠菌als3Δ/als3Δ用作阴性对照。与对照比较，表达干扰物构建体的菌株在与上皮细胞的粘附/侵入上的显著差异确定为p<0.001（*）。标准差由两次独立实验进行计算。

Als3特异性干扰物在白色念珠菌中的诱导导致了在40%-50%范围中的与上皮细胞的减少粘附，如图4A中所示。该差异是统计上显著的（p<0.001）。惊人的是，重组菌株AFA16a与als3Δ/als3Δ以相同的低水平粘附（参见图3A）。如预期的，在阻遏条件下生长的重组体（即不产生Als3蛋白质干扰物）表现类似于对照菌株。菌株AFA15a显示与白色念珠菌SC5314相当的粘附能力，与使用的条件无关。接下来，当在诱导条件下生长时，携带Als3干扰物构建体的重组体显示了在侵入上的约40%减少，而在阻遏条件下生长时，它们获得了其功能（参见图4B）。如预期的，白色念珠菌als3Δ/als3Δ未能侵入上皮细胞（p<0.001）。

在本实施例中，我们证实，重组方法证明是一个可靠系统，其可以进一步用于研究特定目的蛋白质的靶向蛋白质聚集。

1.3Als3干扰物肽对白色念珠菌的外部应用减少粘附和生物膜形成

因为Als3蛋白质位于细胞壁中，所以我们通过将Als3特异性干扰物外部应用于念珠菌细胞，研究了诱导特异性Als3聚集的可能性。除了在重组表达盒中使用的序列外（YTLLLIYLSV（SEQ ID NO：70）），TANGO算法还揭示在Als3中具有强聚集倾向的另外氨基酸序列。因此，九肽NGIVIVATT（SEQ ID NO：71）和肽TWLCGLITLLSLF（SEQ ID NO：72）也被预期具有高聚集潜力（50%-99%聚集倾向）。设计，合成且测试了这些TANGO序列的几个衍生物。表1描述使用的23种不同肽。

通过参考本申请中提出的通式，澄清分子的设计：E1和E2是其中n=1的分子。对于E1，X₁和X₂各自是精氨酸残基，Y₁是Als3蛋白质中存在的9个残基的区段，并且Z₁不存在。注意，这可以等价于说，X₁是RNG，X2是R，并且Y₁是Als3蛋白质中存在的连续七肽序列。然而，因为NG是Als3序列中的邻近残基（参见SEQ ID NO：2），并且该九肽满足Y_i区段的要求，所以前面一种表述法是优选的。对于E2，X₁是R，并且X₂是K，Y₁是Als3蛋白质中存在的16个残基的区段，并且Z₁不存在。

F9是其中n=2的分子。X₁是RK，并且X₂是G，Y₁是合成序列，Z1是S，X₃和X₄各自是精氨酸残基，Y₂是Als3蛋白质中存在的9个残基的区段，并且Z₂不存在（即该分子的第二个部分与E1相同）。注意，在该分子中，X₁和Y₁一起形成衍生自具有高聚集倾向的σ因子32（参见McCarty J.等人（1996）J.Mol.Bio.256，829-837）的人工序列。

接下来的20种肽都具有其中n=2的相似设计，所有X部分都是单个残基，Y₁和Y₂均是Als3蛋白质中出现的序列，Z₁是GS接头，并且Z₂不存在。表1：测试的23种干扰物肽的序列。所有序列都由TANGO设计。

标签	肽的序列	测试的浓度
			E2	RNGIVIVATTR(SEQIDNO:7)	50μM;10μM;2.5μM
E2	RLQQYTLLLIYLSVATAK(SEQIDNO:8)	5OμM;lOμM;2.5μM
			F9	RKLLFNLGSRNGIVIVAttR(SEQIDNO:9)	5OμM;1OμM;2.5μM
P_1	RNGIVIVATRGSRNGIVIVATR(SEQIDNO:10)	5OμM;1OμM;2.5μM
			p_2	RVIQHSTWLRGSRVIQHSTWLR(SEQIDNO:11)	5OμM;1OμM;2.5μM
p_3	RLITLLSLFRGSRLITLLSLFR(SEQIDNO:12)	5OμM;1OμM;2.5μM
			p_4	RQYTLLLIYRGSRQYTLLLIYR(SEQIDNO:13)	5OμM;lOμM;2.5μM
p_5	KNGIVIVATKGSKNGIVIVATK(SE4IDNO:14)	50μM;10μM;2.5μM
			p_6	KVIQHSTWLKGSKVIQHSTWLK(SEQIDNO:IS)	5OμM;lOμM;2.5μM
p_7	KLITLLSLFKGSKLITLLSLFK(SEQIDNO:16)	5OμM;lOμM;2.5μM
			p_8	KQYTLLLIYKGSKQYTLLLIYK(SEQIDNO:17)	5OμM;lOμM;2.5μM
p_9	DNGIVIVATDGSDNGIVIVATD(SEQIDNO:1B)	5OμM;1OμM;2.5μM
			p_10	DVIQHSTWLDGSDVIQHSTWLD(SEQIDNO:19)	5OμM;lOμM;2.5μM
p_n	DLITLLSLFDGSDLITLLSLFD(SEQIDNO:20)	50μM;10μM;2.5μM
			p_12	DQYTLLLlYD6SDQYTLLLIYD(SEQIDNO:21)	5OμM;1OμM;2.5μM
p_13	ENGIVIVATEGSENGIVIVATE(SEQIDNO:22)	5OμM;1OμM;2.5μM
			p_14	EVIQH5TWLEGSEVIQHSTWLE(SE4IDNO:23)	5OμM;1OμM;2.5μM
p_15	ELITLLSLFEGSELITLLSLFE(SEQIDNO:24)	5OμM;lOμM;2.5μM
			p_16	EQYTLLLIYEGSEQYTLLLIYE(SEQIDNO:25)	5OμM;lOμM;2.5μM

p_17	PNGIVIVATPGSPNGIVIVATP(SEQIDNO:26)	5OμM;1OμM;2.5μM
			p_18	PVIQHSTWLPGSPVIQHSTWLP(SEQIDNO:27)	50μM;10μM;2.5μM
p_19	PLITLLSLFPGSPLITLLSLFP(SEQIDNO:25)	50μM;10μM;2.5μM
			p_20	PQYTLLLIYPGSPQYTLLLYP(SEQIDNO:29)	50μM;1OμM;2.5μM

在所有肽以三个不同浓度（250μM、50μM和10μM）施用后，基于在96孔聚苯乙烯板上的白色念珠菌SC5314粘附测定试验，进行最佳Als3候选干扰物的最初筛选和选择。基于该粘附测定试验获得的结果，我们还测试了肽对成熟生物膜形成的影响。大多数最佳候选干扰物肽的最终选择基于如下结果进行，所述结果显示由测试的肽的最低浓度（10μM或2.5μM）引起了粘附和成熟生物膜形成的减少。三种合适的干扰物肽的例子显示于图5A和5B中。

在测试的23种不同肽干扰物中，肽F9显示了在体外对抗成熟生物膜形成的最佳活性，即使当使用极低浓度时（p<0.001）（参见图5）。基于图5中所示的数据，选择肽F9（RKLLFNLGSRNGIVIVATTR（SEQ IDNO：9））用于进一步实验。肽F9的主要聚集子序列是具有高聚集潜力的NGIVIVATT（SEQ ID NO：71）。除肽F9之外，当使用较高浓度（250μM和50μM）时，肽E1（RNGIVIVATTR（SEQ ID NO：7））也表现了在体外对抗成熟生物膜形成的显著活性。

1.3.1在粘附和生物膜形成上确定干扰物F9的最佳浓度

初始结果（参见图5）显示，当在最初筛选条件下（250μM、50μM、10μM）使用时，干扰物肽F9具有体外对抗成熟白色念珠菌生物膜的有希望的活性。在下一个步骤中，还测试了更低浓度的肽F9（50μM、10μM和2.5μM）。首先，我们阐明了肽F9在粘附期中的影响（在37℃，90分钟）。随后，我们通过将培养基更换为新鲜的RPMI1640-MOPS，在不存在肽的情况下48小时，测试了该肽对进一步的生物膜发育的影响。两个测定都在96孔聚苯乙烯板中执行，并且通过XTT还原测定试验（参见材料与方法部分）进行定量。结果显示于图6A和B中。

如图6A中所示，即使最低浓度（2.5μM），干扰物肽F9也已急剧地降低了念珠菌细胞的粘附性质（p<0.001）。并且更高浓度的干扰物肽F9（50μM和10μM）几乎完全除去了念珠菌的附着。白色念珠菌als3Δ/als3Δ用作对照。令人惊讶地发现，ALS3敲除菌株仍表现了比F9干扰物肽处理的野生型细胞更佳的粘附性质。不限制于可能机制，一种似乎合理的解释可能是，干扰物肽F9不仅引起Als3的β-聚集，还另外引起白色念珠菌的同源Als1和Als5蛋白质的β-聚集。

如前在图5B中所示，肽F9在包括粘附的整个白色念珠菌生物膜发育过程中（即在48小时的过程中）的连续施用，导致了成熟生物膜形成的强烈减少。然而，此处如在图6B中描述的，显示白色念珠菌细胞仅在粘附期中用肽F9处理。允许成熟生物膜在不含肽的新鲜RPMI1640-MOPS中形成。重要的是，类似于白色念珠菌als3Δ/als3Δ菌株，肽干扰物F9降低了念珠菌细胞形成生物膜的能力。测试的较高浓度（50μM）引起了几乎90%生物膜抑制，而较低浓度（10μM和2.5μM）引起了生物膜形成的40%到50%的减少（p<0.001）。我们得出结论，干扰物肽F9能够有效干扰两种不同实验条件的白色念珠菌生物膜形成。

在下一个步骤中，我们还研究了干扰物肽F9在体内白色念珠菌生物膜发育过程中的潜在抑制作用。我们使用在大鼠中的体内皮下白色念珠菌生物膜模型（即在聚氨基甲酸酯三腔导管片内形成的体内生物膜），见材料与方法部分中的进一步描述。在实验条件下仅测试了一个浓度的肽F9（即50μM）。该肽在念珠菌与基底最初附着的过程中（90分钟，37℃）离体施用。其后，洗涤导管并且植入大鼠皮下。在植入后六天研究生物膜，并且通过CFUs定量。这些分析的结果显示于图7中。

从肽处理的导管获得的平均每个导管段的CFUs±SD（2.25±1.08log₁₀CFU/导管段）显著不同于从对照的导管获得的念珠菌细胞的量（3.69±0.42log₁₀CFU/导管段）（p<0.001）。重要的是，在20个肽处理的导管中四个（20%）含有小于2.0log₁₀CFU/导管段，这是临床实践中用于确定念珠菌感染的阈值（Mermel等人（2001）Clin.Infect.Dis.32:1249-1272。白色念珠菌als3Δ/als3Δ表现出了与未经处理的野生型细胞相似的生物膜能力（3.30±0.55log₁₀CFU/导管段），但白色念珠菌als1Δ/als1Δals3Δ/als3Δ显著地未能在体内皮下生物膜模型中形成生物膜，如通过低CFU值证实的（1.46±1.24log₁₀CFU/导管段）（p<0.001）。肽F9的有力活性可能来自肽在粘附期过程中的作用。因此，我们还测试了在白色念珠菌于聚氨基甲酸酯基底上粘附的过程中肽F9的活性（图8）。

与对照（3.06±0.39log₁₀CFU/导管段）相比较，用肽F9处理念珠菌细胞显著降低了与聚氨基甲酸酯装置的附着（2.18±0.12log₁₀CFU/导管段）（p<0.001）。这些结果与在聚苯乙烯上的念珠菌粘附过程中获得的数据一致。这提示，Als3的蛋白质聚集出现在生物膜发育的早期过程中。如预期的，与野生型菌株相比较，白色念珠菌als3Δ/als3Δ和白色念珠菌als1Δ/als1Δals3Δ/als3Δ显示在聚氨基甲酸酯上显著更少的粘附能力（p<0.001）。

1.3.2干扰物F9对于白色念珠菌的特异性

对于体外生物膜形成抑制，研究与远源念珠菌属物种，即光滑念珠菌ATCC2001相比较，干扰物肽F9对于白色念珠菌的特异性。F9肽（NGIVIVATT（SEQ ID NO：71））的β-聚集序列不存在于光滑念珠菌中-光滑念珠菌中最紧密相关的序列是NGVVIVAAT（SEQ ID NO：73）。光滑念珠菌显示在体外在聚苯乙烯和聚氨基甲酸酯上形成有效的生物膜。我们测试了F9针对光滑念珠菌在体外在96孔聚苯乙烯板上的粘附和生物膜形成的影响。生物膜通过XTT还原测定试验进行定量，并且结果指出肽F9不干扰光滑念珠菌的粘附和生物膜发育。这些数据支持，肽F9对抗粘附和成熟生物膜发育的效率是序列依赖性和高度特异性的。

1.3.3干扰物肽F9的应用还降低白色念珠菌粘附和侵入上皮细胞的能力

如本文前文讨论的，白色念珠菌Als3还在上皮和内皮细胞的粘附和侵入中起作用。我们证实（在实施例1.2.2中），表达Als3特异性干扰物的重组菌株在干扰物诱导条件下显著降低了粘附和侵入上皮细胞的能力。此处，我们研究干扰物肽F9的外部应用对白色念珠菌SC5314粘附和侵入上皮细胞的影响。为此，在粘附（1小时）或侵入（3小时）过程中，在肽F9的存在下，念珠菌细胞与人细胞（上皮细胞系TR-146）一起温育。通过使用表面荧光计数，确定粘附的和内在化的细胞的量。结果展示于图9中。

如预期的，白色念珠菌als3Δ/als3Δ显示显著减少（60%）的粘附和侵入上皮细胞的能力（p<0.001）。肽F9对白色念珠菌SC5314粘附和侵入的影响显示是浓度依赖性的（图9）。与对照（不含肽）相比较，最高浓度（50μM）使念珠菌粘附降低40%。较低浓度（10μM和2.5μM）分别引起约20%-15%的影响。除粘附外，我们还测定肽F9对侵入的影响。较高浓度（50μM）的肽F9使侵入降低34%，而中等浓度（10μM）使侵入减少15%。最低浓度（2.5μM）对侵入不具有任何作用（100%）。虽然粘附明显地受F9添加影响，但对侵入的作用较不明显。不束缚于特定理论，已知侵入可以通过不同和另外的机制发生，其中一些可能较不依赖于Als3。

1.3.4F9肽干扰物对于Als3的特异性

在先前所述中，我们已证实，肽F9对白色念珠菌粘附至生物材料（硅氧烷正方形盘、聚苯乙烯和聚氨基甲酸酯）、以及在体外和体内生物膜形成过程中、以及对上皮细胞的粘附和侵入，可以造成显著影响。尽管这些结果指向Als3被靶向的事实，但Als3是否被特异性靶向仍有待证实。为了证实特异性，我们决定在与可得的Als3特异性抗体的竞争中，通过荧光显微镜检，在肽F9施用后检查白色念珠菌细胞表面上Als3的存在。Als3主要在菌丝细胞上表达，并且因此首先诱导菌丝形成20分钟。将不同浓度的肽F9（50μM、10μM和2.5μM）施用于菌丝细胞45分钟。随后将细胞洗涤且在ALS3抗血清的存在下在30℃温育60分钟，并且用缀合至AlexaFluor488的二级抗兔IgG复染色。用1%DMSO处理的念珠菌细胞用作对照。使用滤波器组，用表面荧光，显现染色的细胞，以检测Alexa Fluor488。发现干扰物肽处理的念珠菌细胞能够以浓度依赖性方式与抗ALS3抗体结合进行有效的竞争。因此，与对照（不含肽，仅加入1%DMSO）相比较，用最高浓度（50μM）的肽F9处理的念珠菌细胞表现了ALS3抗血清结合的约50%减少。此外，中等浓度（10μM）也降低了念珠菌细胞结合Als3抗体的能力。这些数据还通过在荧光激活细胞分选（FACS）方法中测定干扰物肽处理的白色念珠菌SC5314细胞结合抗ALS3抗体的能力，进行定量。与荧光显微镜检相比较，这种方法允许我们检测来自仅10000个念珠菌细胞的荧光信号。FACS数据明确支持得自显微镜检图像的观察结果。用肽F9（50μM）处理的白色念珠菌菌丝细胞展示与对照相比较显著减少量的荧光信号（54%）（p<0.001）。此外，中等浓度（10μM）也引起ALS3抗血清结合的惊人减少（45%），而最低浓度（2.5μM）也引起10%减少。因此，数据显示肽F9特异性靶向Als3，并且诱导其聚集，导致在菌丝细胞上显著降低量的Als3，这通过以F9浓度依赖性方式减少的抗ALS3抗体结合进行了表征。

1.4干扰物涂布的医学装置阻止白色念珠菌生物膜形成

白色念珠菌常在受生物膜感染的导管中被诊断。念珠菌属物种可以在广泛多样的医学装置上形成生物膜，所述医学装置从尿和血管导管到牙科、臀、膝和语音假体和甚至起搏器。可以被念珠菌感染的植入生物材料的该广泛范围反映了粘附至许多类型的基底的能力，包括塑料材料例如硅氧烷、聚苯乙烯和聚氨基甲酸酯。这些医学装置的感染常导致其功能的丧失，并且可能构成全身感染的来源。因为白色念珠菌生物膜通常对常见抗真菌疗法是极端抵抗的，所以受感染装置通常需要被去除。抗性机制并未充分确定，但药物对真菌细胞的接近受到限制是一种可能解释。在先前实施例中，我们已显示，一种可替代方法是干扰白色念珠菌与基底（例如硅氧烷（实施例1.2.1）、聚苯乙烯（实施例1.3.2）和聚氨基甲酸酯（实施例1.3.2）的粘附，即代替对抗成熟生物膜，阻止生物膜形成。在我们的目前方法中，我们正在制备与F9肽干扰物共价连接的导管材料。用于将肽共价连接至固相载体的方法在本领域中有描述。这些干扰物偶联的导管的性能依照材料与方法部分1.6.7.2在如实施例1.3.2中所述的体内大鼠模型中进行评估。

1.5使用转基因分子下调钙依赖磷酸酶

在白色念珠菌中，Hsp90是涉及病原性和抗真菌剂抗性的一种必需的、高度保守的伴侣蛋白。丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶——钙依赖磷酸酶（CNB1）——是Hsp90的靶，并且cnb1的纯合缺失突变体对胁迫敏感。因此，决定使用本文分子靶向钙依赖磷酸酶蛋白质。

Cnb1聚集诱导分子的设计

钙依赖磷酸酶的调节亚基的TANGO分析揭示两个易于聚集的区域。预测的蛋白质序列FAFNIY（SEQ ID NO：104）和LFIVM（SEQ ID NO：105）显示分别为40%和96%的β-聚集倾向。这两个短序列用于设计几种不同的构建体，以使用转基因方法下调CNB1。构建体具有下述结构：

启动子–yEGFP–HA标签（序列YPYDVPDYA（SEQ ID NO：108））–氨基酸接头（序列MAQW（SEQ ID NO：109））–具有结构（X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i）_n的分子，其中n=5和

X₁=QN

Y₁=STLIVL（SEQ ID NO：110）

X₂=Q

Z₁=0

X₃=N

Y₂=STVIF（SEQ ID NO：111）

X₄=E

Z₂=Q

X₅=N

Y₃=STVIF（SEQ ID NO：111）

X₆=EQN

Z₃=KPAGAAKPGAAG（SEQ ID NO：112）

X₇、Y₄、X₈、Z₄、X₉、Y₅、X₁₀根据表2中所示的变化；并且Z₅是无。

表2.用于下调钙依赖磷酸酶的构建体结构

连续书写，例如1号构建体编码的序列因此看起来如下：

启动子-yEGFP-YPYDVPDYAMAQWQNSTLIVQNSTVIFEQNSTVIFEQNKPAGAAKPGAAGRFAFNIYRGSRLFIVMR(SEQ ID NO:113

在这些构建体中使用的分子基本上含有两类聚集诱导区：Y1、Y2和Y3充当加强聚集的合成（即在念珠菌中不存在/不是CNB1的部分）序列，而Y4和Y5是确保特异性的在CNB1蛋白质中鉴定的两个易于聚集区。

转化体的性质

携带这些构建体的转化体的最初表征通过体内测试对于多类胁迫（cnb1Δ突变体敏感的胁迫）的抗性来完成。将构建体置于PCK1启动子的控制下，所述PCK1启动子在含葡萄糖培养基（合成葡萄糖（SD）培养基）中被阻遏，并且在糖原异生条件（合成酪蛋白氨基酸（SCAA）培养基）中被诱导。如图10中所示，转化体事实上对培养基中的SDS存在更敏感，并且这仅在聚集物蛋白质被诱导时。当不存在胁迫时，未观察到对生长的影响，说明观察到的表型不是由于与构建体表达相关的非特异性或毒性效应所引起。

四个不同转化体不同，并且仅在X8和X9守门者和Z4接头的性质（和电荷）上不同。然而，它们都具有钙依赖磷酸酶下调所典型的相同表型。因此，在该实验设置中，守门者的电荷和接头的性质仅具有次级重要性 –不管这些变异如何，该系统足够强壮以实现靶蛋白质的下调。

因为四个构建体都以相同次序共享相同CNB1聚集诱导区（即FAFNIY（SEQ ID NO：104）和LFIVM（SEQ ID NO：105）），这也是这些区域在钙依赖磷酸酶蛋白质中出现的相同N至C末端次序，故决定测试这些聚集决定区的次序是否是重要的。

这已通过制备其中仅交换Y4和Y5区的构建体进行评估，如表3中所示。

表3.用于下调钙依赖磷酸酶的构建体的结构，具有交换的聚集区。

转化体5–8也使用相同测定试验就其对SDS的敏感性进行测试。所有转化体表现都类似于构建体1–4的，即表型类似野生型酵母在启动子阻遏条件下的表型，并且类似纯合cnb1缺失突变体在启动子诱导条件下的表型。这允许我们得出结论，至少在该实验设置中，聚集诱导区的次序对于实现特异性下调并不至关重要，并且无需与这些区域在靶蛋白质中出现的次序相同。

为了检查两个区域是否都促成特异性聚集，还测试其中Y4和Y5相同的构建体（并且因此对应于LFIVM（SEQ ID NO：105）或FAFNIY（SEQ ID NO：104））。这些转化体显示相同表型（即任一区域单独的存在足以实现钙依赖磷酸酶下调），但程度较低（即未在测试的所有转化体中观察到该表型，这可能是由于诱导特异性聚集需要较高的阈值表达水平）。因此，可以证明，将同一蛋白质中的两个不同聚集诱导区组合以靶向该蛋白质是有利的。

1.6抗真菌应用的材料与方法

1.6.1.动物和免疫抑制

用于体内实验的动物是200g无特定病原体的雌性Sprague Dawley大鼠（Janvier，法国）。所有动物都给予标准和无限制的饮食，并且在整个实验程序前和过程中在其饮用水中用1mg/L地塞米松（Organon，荷兰）进行免疫抑制高达24小时。将四环素（1g/L）或氨苄青霉素（0.5g/L）加入该水中，以使细菌感染降到最低。所有动物实验依照实验室动物保护和健康的欧洲条例进行维持，并且由Katholieke Universiteit Leuven的动物伦理委员会批准。

1.6.2.具有聚集目的蛋白质Als3的高倾向性的基于肽的治疗剂

通过JPT Peptide Technologies GmbH（Berlin，德国）合成白色念珠菌特异性肽基治疗剂，其具有引起Als3p交叉β-聚集的高倾向性。高度纯化的肽（>90%，纯度通过HPLC检测）以冻干形式递送，并且在使用前维持在-20℃。在超纯水（Invitrogen）中于50%DMSO中制备每种肽的贮存液至终浓度10mM–20mM。三个不同浓度（50μM、10μM和2.5μM）的阳性肽F9在每一个测试中进行测试。包括肽的实验在低粘附塑料材料（Bioplastics，荷兰）中执行，以降低自聚集。

1.6.3.酵母培养条件

除非另有说明，一般而言，酵母细胞在含有1%（w/v）酵母提取物、2%（w/v）细菌用蛋白胨和2%（w/v）D-葡萄糖的丰富YP培养基（YPD）中在30℃连续振荡下培养过夜。在体外和体内白色念珠菌生物膜实验前，细胞在固体YPD培养基（含有1.5%（w/v）琼脂）上在37℃生长过夜。携带聚集物构建体的菌株在具有氨基酸和硫酸铵的酵母氮源（YNB），pH6.5（Difco，USA）中生长，所述YNB补充有琥珀酸盐、酪蛋白氨基酸（启动子诱导条件）或补充有4%D-葡萄糖（启动子阻遏条件）。为了研究聚集物肽对真菌生长的潜在作用，细胞分别在50μM浓度的每种肽的存在下在30℃温育。在对照样品中DMSO终浓度不超过1%。每小时收集样品，并且使用分光光度计（BioPhotometer，Eppendorf）在600nm测量细胞密度。

1.6.4.酵母至菌丝的转变

念珠菌细胞在YPD培养基中生长过夜，洗涤两次并且在无菌水中在30℃进一步温育另外2小时（饥饿期）。接下来，将细胞浓度调整至1x10⁶细胞/ml，并且细胞在含/不含肽（50μM）的含有10%胎牛血清（FBS）（F7524，Sigma，USA）的YP培养基或RPMI1640-MOPS，pH7.0中温育。培养物在37℃温育1.5小时–2小时。通过光学显微镜检（Axiostar plus，CarlZeiss，德国）在放大率40x下确定真菌丝与出芽酵母比较的比例。

1.6.5.最小抑制浓度（MIC）的测定

根据NCCLS M27-A3（2008）测定浮游生物细胞对于抗真菌剂的最小抑制浓度（MIC）。简言之，白色念珠菌菌株在30℃在YPD平板上生长过夜。念珠菌细胞悬液（1-5x10⁶细胞/ml）在RPMI1640-MOPS培养基中制备。将细胞进一步稀释1:50，并且向96孔聚苯乙烯板的每个孔，应用来自此悬浮液的100μl念珠菌细胞。随后，加入100μl含有不同浓度的待测抗真菌剂。对照孔包括其中仅加入RPMI1640-MOPS的念珠菌细胞。允许细胞生长两天，并且通过使用分光光度计（Spectra max Plus384）在490nm处测量细胞的光密度（OD）来确定抗真菌剂的有效性。数据测定为MIC₅₀和MIC₉₅，其分别代表抑制真菌生长50%或95%的药物最小抑制浓度。

1.6.6.最小杀真菌活性（MFC）的测定

如由Cantón等人（2009）Antimicrob Agents Chemother.Jul；53（7）:3108-11所述的测定最小杀真菌活性（MFC）。仅对于阿尼芬净（anidulafungin）确定了MFC，因为这是在我们的研究中具有抗真菌活性的唯一药物。简言之，将用不同浓度的抗真菌药物预处理的100μl念珠菌细胞悬液铺在YPD平板上，并且在37℃进一步温育24小时。MFC测定为99%生长抑制的结果。

1.6.7.白色念珠菌生物膜模型

1.6.7.1体外白色念珠菌生物膜系统

体外白色念珠菌生物膜在三个不同类型的生物材料上进行研究，即平底96孔聚苯乙烯板（Greiner Bio-One，德国）、硅氧烷（CS Hyde，USA）和聚氨基甲酸酯三腔静脉内导管（2.4mm直径）（Arrow International Reading，USA）。在生物膜建立前，将硅氧烷切成小方片（1cm x1cm），并且将聚氨基甲酸酯切成1cm片。硅氧烷或聚氨基甲酸酯装置在99%FBS（F7524，Sigma）中在37℃温育过夜。将细胞洗涤且重悬浮于1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）,pH7.4中。在RPMI1640-MOPS培养基、琥珀酸盐，pH6.5中或在YNB培养基、4%D-葡萄糖中制备1x10⁷细胞/ml或5x10⁴细胞/ml的念珠菌悬浮液。总地，将1ml细胞悬液加入置于24孔板中的硅氧烷盘或聚氨基甲酸酯导管，并且将100μl细胞悬液接种到96孔聚苯乙烯板内。细胞与基质的附着通过在37℃在静止条件下温育90分钟（粘附期）实现。其后，通过用1x PBS进行两轮洗涤步骤，去除未附着的念珠菌细胞，并且在37℃在新鲜培养基中浸没48小时至144小时（成熟生物膜）。这之后，将生物膜用1x PBS洗涤两次且定量。

1.6.7.2体内皮下白色念珠菌生物膜系统

在新皮下模型中体内白色念珠菌生物膜发育的实验时间线在方案1中举例说明。

方案1：动物白色念珠菌生物膜模型的实验时间线。在新皮下模型中体内白色念珠菌生物膜发育的实验时间线。

白色念珠菌细胞在37℃在YPD平板上生长过夜，并且在1x PBS中洗涤并重悬浮。念珠菌细胞悬液（5x10⁴细胞/ml）通过计数在RPMI1640-MOPS培养基中制备。将切成1cm区段的聚氨基甲酸酯三腔静脉内导管（2.4mm直径）（Arrow International Reading，USA）在FBS中在37℃温育过夜。血清涂布的导管在37℃在1ml念珠菌细胞悬液中温育90分钟（粘附期）。在粘附期后，将导管用1x PBS洗涤两次,如所述的,植入大鼠皮下（Van Wijngaerden等人（1999）J Antimicrob Chemoth44:669-674）。通过恩氟烷气体（Alyrane^TM，Pharmacia）的短吸入期,实施麻醉。大鼠在植入程序过程中通过恩氟烷（20%）和氧（80%）的气体混合物保持熟睡。将大鼠后背下方剃毛且用于醇70%中氯己定0.5%消毒。纵向作出10mm切口，并且小心解剖下皮层以产生3个皮下通道。植入高达十个导管段。将切口用手术缝合器（Precise^TM，USA）闭合，并且用于70%醇中的氯己定0.5%消毒。生物膜形成48小时和144小时。对于导管移出，通过CO₂吸入使大鼠安乐死。将皮肤消毒且从皮下组织下取出导管段，用1x PBS洗涤两次，并且定量或显现。同样地，表征促进Als3p聚集的肽在体内念珠菌生物膜发育过程中的影响。在粘附期过程中（90分钟，37℃），在50μM浓度的阳性肽F9和阴性肽F9_negat、p13和p20的存在下，使血清涂布的聚氨基甲酸酯段与念珠菌细胞（5x10⁴细胞/ml）一起温育。其后，通过两轮洗涤步骤去除非粘附细胞。如上所述将导管皮下植入免疫抑制的大鼠的背侧。在植入后六天后，通过CFU计数研究生物膜。

1.6.8.生物膜定量法

1.6.8.1XTT还原测定试验

使用XTT还原测定试验，研究在体外生物膜内念珠菌细胞的代谢活性。这种方法基于分光光度计在490nm处测量特定底物——XTT（2,3-二（2-甲氧基-4-硝基-5-磺基-苯基）-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺）（Sigma，USA）——的比色变化，所述底物通过代谢活性细胞的线粒体脱氢酶还原为XTT甲簪。XTT（Sigma，USA）工作溶液在无菌1x PBS中制备，其终浓度为1mg/ml。在使用前，将甲萘醌以1μM的终浓度加入XTT溶液中。将该溶液涡旋且将100μl应用于含有生物膜的每个孔内，并且在37℃暗温育3-5小时。通过分光光度计（Spectra maxPlus384）在490nm处测量比色变化的强度。不含念珠菌细胞的XTT-甲萘醌溶液用作空白对照。

1.6.8.2真菌生物膜生物质的定量

通过菌落形成单位（CFU）测定体外和体内移出的导管的导管腔内形成的真菌生物膜生物质的量。简言之，体外基质和来自体内的导管的生物膜在水浴超声仪（Branson2210）中以40000Hz超声处理10分钟，并且在1x PBS中进一步涡旋30秒。将原始样品和1:10稀释物在YPD平板上始终一式两份地铺平板。在37℃两天后计数CFUs。

1.6.9.通过显微镜检观察念珠菌生物膜

1.6.9.1荧光显微镜检

在荧光显微镜检前，将具有附着的生物膜的体外和体内导管纵向切开，并且在具有50μg/ml calcofluor white（Sigma，USA）的1x PBS缓冲液中温育20分钟。用ZeissAxioplan2荧光显微镜,观察这些装置。使用Axiovision3.0软件（Carl Zeiss，Thornwood，NY）通过Zeiss Axiocam HRm摄影机获得图像。

1.6.9.2扫描电子显微镜检

在显微镜检前，将导管（纵向切开的）于0,1M二甲基胂酸钠缓冲液（pH7.4）中在3%戊二醛中固定。将导管从固定液中取出并且干燥过夜。将封固的样品用金溅射涂布，并且在XL30ESEM FEG扫描电子显微镜（Philips）中观察。

1.6.9.3共聚焦扫描激光显微镜检

将纵向切开且固定的导管与50μg/ml伴刀豆球蛋白A（伴刀豆球蛋白A，AlexaFluor488缀合物，Invitrogen）一起在37℃下温育一小时。获得共聚焦图像且用LSM510/ConfoCor2系统（Carl Zeiss，Jena，德国）分析。氩激光器（6A，调整至50%的声光可调谐滤波器）提供488nm的激发光（用于伴刀豆球蛋白A-Alexa488荧光）。激发光通过二向色镜（HFT488）反射且通过Plan-NeoFluar20x NA0.5物镜聚焦。荧光发射光经过505-nm长通滤波器和1个艾里单位(airy unit)的针孔。之前，评估了生物膜厚度，首先，捕获成熟生物膜的3维（3-D）照片。跨整个生物膜结构，制备了约200个切片。随后，从其中荧光信号增益强度超过其最大值一半的区域的外缘直到其中荧光信号不再能测定的区域，估计生物膜厚度。

1.6.10.绿色荧光蛋白（GFP）荧光显微镜检

细胞无经固定而直接使用，使用Zeiss Axioplan2荧光显微镜观察。GFP用UV光源和长通GFP滤波器显现。通过Quantix电荷耦合器件摄影机，使用Axiovision3.0软件（CarlZeiss，Thornwood，NY）获得图像。

1.6.11.白色念珠菌als3Δ/als3Δ芽管对兔ALS3抗血清的吸收

冻干形式的ALS3抗体在500μl无菌水中重构。由白色念珠菌als3Δ/als3Δ芽管吸收该抗血清，之后将之用于荧光显微镜检和FACS。使三个含有1x10⁶细胞/ml的烧瓶在具有L-谷氨酰胺和HEPES的RPMI1640培养基（PAA，奥地利）中在37℃萌芽90分钟。将芽管分到微量离心管内，与ALS3抗血清混合，并且在冰上伴随轻轻振荡温育1小时。其后，将细胞离心并且将上清液转移至含有新鲜白色念珠菌als3Δ/als3Δ芽管的另一个烧瓶。该程序总共重复三次。将ALS3抗血清等分成较小体积（20μl）并且贮存于-80℃。通过荧光显微镜检（LeicaDFC350FX，Mannheim，德国）证实抗体的特异性。

1.6.12.上皮细胞的生长和分化

最初，颊粘膜鳞状细胞癌衍生的上皮细胞系TR-146得自Cancer ResearchTechnology，London。TR-146细胞能够形成分层的细胞层，显示与正常人颊粘膜相比较的许多相似性（Rupniak等人，（1985）J Natl Cancer Inst75:621-35。TR-146细胞照常规在达尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中生长（4–20代），所述DMEM含有NaHCO₃、D-葡萄糖、丙酮酸钠和稳定谷氨酰胺与10%胎牛血清（FCS）（Sigma，USA），不含抗生素或抗真菌剂。细胞在37℃在5%CO₂中维持在加湿的温箱中。对于粘附和侵入实验，将1x10⁵TR-146细胞种植到先前置于24孔板中的12mm直径玻璃盖玻片上。

1.6.13.粘附测定试验

白色念珠菌菌株在液体YPD、琥珀酸盐，pH6.5中或在YNB（4%D-葡萄糖）中在30℃在振荡温箱中生长过夜。念珠菌细胞用1x PBS洗涤三次，并且确定为在DMEM中1x10⁵细胞/ml的终浓度，所述DMEM含有NaHCO₃、D-葡萄糖、丙酮酸钠和稳定谷氨酰胺、不含FCS。TR-146在12mm玻璃载玻片上生长，并且用念珠菌细胞接种。就念珠菌对上皮细胞的粘附，测试了不同浓度的阳性肽F9（50μM、10μM和2.5μM）和阴性肽F9_negat、13和20（50μM）。粘附测定试验在37℃、5%CO₂中进行1小时。在粘附后，将细胞用1x PBS洗涤三次，以去除非粘附细胞，且随后用4%多聚甲醛在室温固定30分钟。在用1x PBS充分冲洗后，将细胞在水中于0.5%Triton X-100中透化处理5分钟，并且随后用calcofluor white（稀释度1:100）染色15分钟，并且在30℃、180rpm下用水进一步洗涤三次共10分钟。将盖玻片倒置封固在显微镜载玻片上，并且使用滤波器组在表面荧光下定量，以检测calcofluor white（用于DAPI的滤波器）（LeicaDFC350FX，Mannheim，德国）。粘附细胞的百分比计算为散布在盖玻片的整个表面上的一百个区域上的附着念珠菌细胞的平均值。

1.6.14.侵入测定试验

如先前6.2.15中所述，TR-146细胞系单层由念珠菌细胞感染。在单层与念珠菌细胞在37℃、5%CO₂下3小时温育期后，抽吸出在上皮细胞上方的培养基，并且将单层用1x PBS冲洗三次，以去除未与上皮细胞结合的真菌细胞。接下来，将上皮细胞用4%Histofix（Roth）在37℃固定20分钟。保持粘附至表面的所有真菌细胞用兔抗白色念珠菌多克隆抗体（AcrisAntibodies，德国）（稀释度1:2000）染色1小时，并且用缀合至Alexa Fluor488的二级抗兔IgG（Invitrogen）（稀释度1:5000）复染色。在用1x PBS充分冲洗后，将细胞于水中在0.5%Triton X-100中透化处理5分钟。进一步地，位于上皮细胞内的真菌细胞的粘附和侵入部分用calcofluor white（稀释度1:100）染色15分钟，并且在30℃、180rpm下用水洗涤三次共10分钟。将盖玻片倒置封固在玻璃载玻片上，并且使用滤波器组用表面荧光显现染色的细胞，以检测calcofluor white（用于DAPI的滤波器）和Alexa Fluor488（Leica DFC350FX，Mannheim，德国）。侵入性白色念珠菌细胞的百分比通过将内在化的细胞的数目除以粘附细胞的总数目而确定。在每个盖玻片上计数至少100个真菌细胞。

1.6.15.通过荧光显微镜检和通过荧光激活细胞分选（FACS）检测白色念珠菌ALS3 抗体结合

收集白色念珠菌细胞的过夜培养物并且用1x PBS洗涤三次。在具有L-谷氨酰胺和HEPES的RPMI1640培养基（PAA，奥地利）中制备念珠菌细胞（2.5x10⁶细胞/ml），所述培养基含/不含肽F9（50μM、10μM和2.5μM）或阴性肽F9_negat、13和20（50μM）。在12mm玻璃载玻片或玻璃培养皿（5cm）上在37℃、5%CO₂下进行念珠菌粘附和菌丝诱导45、60或90分钟。非粘附细胞用1x PBS洗涤，并且立即用4%Histofix（Roth）在37℃固定20分钟。在用1x PBS充分冲洗后，将细胞在0.5%Triton X-100中透化处理5分钟，洗涤且在1%牛血清白蛋白（BSA）中在RT下温育20分钟。进一步地，粘附细胞在ALS3抗血清（稀释度1:500）的存在下在30℃温育60分钟，并且用缀合至Alexa Fluor488的二级抗兔IgG（Invitrogen）（稀释度1:2000）复染色。在最后洗涤步骤后，将盖玻片倒置封固在玻璃载玻片上，并且使用滤波器组用表面荧光显现染色的细胞，以检测Alexa Fluor488（Leica DFC350FX，Mannheim，德国）。最后，使用细胞刮棒使细胞从盖玻片上脱离，并且重悬浮于0.5ml1x PBS中。使用LSRII流式细胞仪（BectonDickinson，http://www.bd.com）测量菌丝的荧光强度。收集每种菌株10,000个细胞的荧光数据。

1.6.16.原生质球的分离和聚丙烯酰胺凝胶的考马斯染色

念珠菌细胞（1x10⁷细胞/ml）在肽F9、F9_negat、13和20（50μM）的存在下在37℃在YPD培养基中温育。在添加肽后5分钟、30分钟和60分钟收集细胞，以4500rpm在室温下离心5分钟。将沉淀用一等体积的不含酶解酶的消化缓冲液（2M山梨糖醇、1M KH2PO4、pH7.5、0.5MEDTA）洗涤两次，称重且进一步溶解在含有10mg酶解酶20T（MPBiomedicals、USA）的消化缓冲液（5ml缓冲液/1g细胞）中。反应补充有10μlβ-巯基乙醇/1ml消化缓冲液。细胞在37℃下温育30分钟–45分钟。在小体积的0.5%SDS中确定原生质球相对于完整细胞，并且在显微镜下观察。完整细胞不受0.5%SDS的存在影响，而原生质球仅留下“菌蜕”。原生质球通过在2000rpm、RT下离心2分钟收集，并且用1.2M冷山梨糖醇洗涤两次。重要的是，用于分离原生质球的所有溶液都含有蛋白酶抑制剂混合物（完全无EDTA，Roche）。最后，将原生质球溶解于补充有4%β-巯基乙醇的NuPAGELDS样品缓冲液（Invitrogen）中，在65℃煮沸5分钟。在装载到凝胶上之前，将样品短暂离心。在120V恒压下在NuPAGEMES SDS运行缓冲液（Invitrogen）中经由SDS-PAGE （NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶，Invitrogen）分离蛋白质。在电泳后，将凝胶转移至塑料托盘，并且蛋白质在30%（v/v）甲醇和10%（v/v）乙酸中于0.25%考马斯亮蓝中伴随轻轻振荡而染色过夜。将凝胶在30%（v/v）甲醇和10%乙酸中脱色，直至蛋白质条带变得明确可见。

1.6.17.统计分析

对于统计分析，使用斯氏t-检验(student t-test)。当p<0.001时，结果视为统计上显著的。用曼-怀二氏检验（Mann-Whitney test,Analyse-it Software）分析抗真菌处理的统计显著性。

所有实验一式两份地重复至少三次。每个体外白色念珠菌粘附或生物膜测定试验一式三份地重复五次。体内白色念珠菌生物膜重复四次，始终包括两只动物/菌株。在白色念珠菌生物膜敏感性测定过程中，每个浓度的药物一式四份地测试。包括TR-146上皮细胞的所有实验程序在五个分开的场合中一式两份地执行。FACS分析和ALS3抗体结合的测定重复五次。

2.抗细菌应用

2.1前言

抗生素抗性出现是不可避免的进化过程。迄今约90%引起严重感染的细菌对大多数可用抗生素是抗性的。大多数新抗生素是先前化合物的衍生物或属于众所周知种类的化合物。因此，需要具有新作用机制的抗细菌剂。

在本实施例中，我们已基于在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌（MRSA菌株）的可公开获得基因组的靶蛋白质中存在的易于聚集序列，设计了干扰物肽文库。这些基因组基于这些细菌菌株的临床关联性进行选择；尤其在医院获得性疾病的情形下。在本实施例中，我们已证实，设计的干扰物具有针对广泛范围的革兰氏阳性菌（包括甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素抗性肠球菌（VRE））以及革兰氏阴性菌的强体外和体内抗细菌活性。我们的结果有说服力地显示，聚集可以充当成功的抗微生物策略。这是用于治疗医源性疾病的重要突破，尤其是鉴于兴起的多药耐受和泛耐药菌株。

2.2干扰物肽文库的初步筛选，最小抑制浓度（MIC）的测定

基于由表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的基因组编码的多种蛋白质中存在的易于聚集区的出现率，设计总共50种不同干扰物肽。由于这些干扰物肽的设计，可能这些区域中的一些也存在于其他（远源）细菌物种的蛋白质中。在筛选努力中，遵循两步骤程序：1）所有肽以较高浓度（75-300μg/ml）初始筛选，随后2）对于在步骤1）中显示活性的所选化合物组以较低浓度（<75μg/ml）筛选。使用取自新鲜的过夜TSA-绵羊血平板的单菌落，在振荡温箱中在37℃和160rpm下在50ml BHI中生长细菌。培养物生长至约1x10⁸细胞/ml的密度，并且随后在CAMHB（McFarland0.5）中稀释至5x10⁵细胞/ml。每个孔含有100μl（50μl含有肽的MHB加上50μl接种物）。最终细胞密度是1x10⁵-5x10⁵/ml。在添加细胞悬液后，使平板在37℃下温育18–24小时。在振荡平板5秒后，使用Perkin Elmer分光光度计（1420MultilabelCounter Vicotr3）测量每个孔在590nm处的光密度（OD₅₉₀）。MIC值作为完全抑制孔中的细菌生长所需的最小浓度读出。其中未观察到生长的每个孔也在TSA-绵羊血琼脂平板上铺平板，在37℃温育过夜，并且目视检查。

这产生了对葡萄球菌和其他细菌物种具有高活性的几种分子（参见表4）。除了该表中所示的主要设计以具有针对金黄色葡萄球菌活性的化合物外，值得一提的、设计为具有针对表皮葡萄球菌活性的两种分子是C29（序列：RLFNFLKRGSRLFNFLKR（SEQ ID NO：32），即相同于表4中的Hit11）和C30（RILLGLIRRGSRILLGLIRR（SEQ ID NO：115））。

表4：针对金黄色葡萄球菌设计的肽的体外效力的总结。显示的结果是以微尺度形式合成的肽。

2.2.1.抗细菌化合物的谱

在表4中，显示了六种不同干扰物肽的MIC活性（以μg/ml表示），所述干扰物肽已在第一次初始筛选后选择。这些分子的结构对应于本申请中的式，其中n是2，X₁是1个氨基酸（Hit50、Hit1、Hit11、Hit57A、Hit50A）或2个氨基酸（Hit14），Y₁是5个（Hit11）或6个氨基酸（其他），X₂是两个氨基酸，Z₁是二氨基酸接头，X₃是1个氨基酸，Y₂是5个（Hit11和Hit57A）或6个氨基酸，X₄是两个氨基酸，并且Z₂不存在。注意，Y1和Y2可以是相同或不同的。值得注意的是，在具有5个氨基酸的序列的Y部分中，侧翼K残基也存在于金黄色葡萄球菌蛋白质中，因此这些序列在6个氨基酸而不是5个上是相同的。

这些干扰物肽最初设计为特异性靶向金黄色葡萄球菌MRSA菌株。由于在其他革兰氏阳性菌的基因组中存在相同的易于聚集序列（即TANGO序列），也存在干扰物肽针对其他细菌物种的活性。肽干扰物Hit1显示为广谱干扰物。Hit14看起来对于它所设计针对的细菌菌株（即金黄色葡萄球菌MRSA）更特异。Hit11尽管针对两个葡萄球菌属物种均是有效的，但针对表皮葡萄球菌的活性最大，这与Y区的确切序列更常见于表皮葡萄球菌基因组中的事实一致。MIC值（或最小抑制浓度）是在接种后抑制细菌的可见生长的最小抗细菌剂浓度。最小杀细菌浓度（MBC）视为在24小时内阻止接种物生长且使接种物减少99.90%的最低肽浓度。MBCs通过将每个孔的内容物在血琼脂平板上铺平板用于存活性检查而确定。另外，孔的内容物也用作接种物用于新微孔板（其中不添加肽），并且对浊度的进行性变化观察了另外24小时。MBCs值或者与MIC值相同或者比MIC值高两倍，这提示这些肽是杀细菌剂。

在下一个步骤中，经过重复筛选维持高活性（低MIC）的肽以高度纯化、按比例扩大的形式重新订购，且在几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌上进行了进一步测试。表5描述化合物30（C30）对于多个细菌物种的MIC值。如表5中可见，化合物30不仅针对在其基因组中编码聚集诱导序列（所述序列用于设计化合物30）的表皮葡萄球菌非常有效，还针对其他临床上有意义的病原体有效，例如甲氧西林抗性（MRSA）金黄色葡萄球菌和万古霉素抗性肠球菌（VRE）、医源性病原体粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、一组食物传播的病原体：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）。非常有希望地看到，针对抗生素抗性菌株的活性与针对抗生素敏感菌株的活性一样高。这指示，这些抗微生物化合物的全新作用机制。因为抗生素抗性是医院中的主要问题，所以完全不同的分子在临床应用中提供更大前景。

我们近期发现，如表4中所示的一些化合物，C30也针对棒状杆菌属（Corynebacterium）细菌有效（表5中未显示）。因为棒状杆菌的细胞壁组成模拟分枝杆菌（Mycobacteriae）的细胞壁组成，鉴于新的抗结核肽设计，针对棒状杆菌的活性是有前途的。结核分枝杆菌的细胞壁结构值得特别关注，因为它在原核生物中是独特的，并且它是该细菌毒力的主要决定因素。该细胞壁复合物含有肽聚糖，但另外它由复杂脂质组成。超过60%的分枝杆菌细胞壁是脂质。MTB细胞壁的脂质级分由三个主要组分组成：分枝菌酸、索状因子和D蜡。分枝杆菌细胞壁的低渗透性与其罕见结构目前已知是该抗性的主要因素。因此，亲水试剂缓慢跨越细胞壁，这是因为分枝杆菌的孔蛋白在允许溶质渗透上效率不佳并且以低浓度存在。亲脂试剂推测会通过脂质双层被减速，所述脂质双层具有不寻常的低流动性和异常的厚度。

C30对于革兰氏阴性菌的较高MIC值可能反映如下事实——C30的结构是串联干扰物肽（即具有两个相同聚集诱导区段（2个相同Y部分）的肽）。近期证据已显示，单干扰物肽也可以对革兰氏阴性菌展示低的MIC值。不将本发明限于特定作用机制，这可能指向下述事实：革兰氏阴性菌在其细菌细胞壁中具有较小孔，与单干扰物肽相比较，所述较小孔将限制串联干扰物的进入。然而，也注意，存在含有聚集诱导区段的几种蛋白质，这些组的蛋白质在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中是不同的。因此，可能一种或多种不同靶蛋白质在革兰氏阳性菌中聚集而在革兰氏阴性菌中不聚集。

结果浮游生物细菌：

化合物30的MIC值

表5：化合物30（C30）针对广泛范围的革兰氏阳性和革兰氏阴性物种的MIC值。此外，该表还包括7个MRSA菌株和7个VRE菌株。MIC值的读出在生长18小时后进行。

2.2.2.纯度和修饰对肽活性的影响

我们已观察到当以高度纯化形式合成时干扰物肽活性的显著（高达5倍）改善。该改善活性的结果显示于表6中。重要的是，该活性改善不增加针对哺乳动物细胞的毒性（数据未显示）。

此外，我们已发现，由加上生物素标签的干扰物肽与未加上标签的干扰物肽具有一样的活性。后者意味着可以使用不同检测方法。

表6：针对金黄色葡萄球菌MRSA设计的具有>95%纯度（HPLC-220nm-C18线性梯度）的肽对抗不同细菌的体外最小抑制浓度（MIC）的总结。

该表中未显示Hit24。Hit24的序列（即RRLFNFLKRGSRLFNFLKR（SEQ ID NO：74））是Hit11（参见表4）的修饰序列，其中Hit24在前面具有加倍守门者。尽管未针对所有细菌对它进行测试，但它具有针对金黄色葡萄球菌ATCC29213（MIC值12.5μg/ml）、表皮葡萄球菌ATCC12228（MIC1.5μg/ml）和革兰氏阴性菌阴沟肠杆菌（E.cloacae）（25μg/ml）的相当大的活性。

除生物素化之外，还测试了几种其他的干扰物修饰。这些基于C30并且包括C30的D-氨基酸形式。

测试的另一种修饰是肽C30的PEG化。测试PEG在肽C30的不同位置的共价附着。它在内部（即作为Zi接头部分）和作为N末端部分使用。PEG引入的目的主要是提供在体内更佳的化合物稳定性以及更佳的可溶性。

已合成基于C30序列（SEQ ID NO：115）的下述化合物：

P2170：Ac-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-CONH2，乙酰化和酰胺化形式的C30。

P2175：NH2-RILLGLIRR（Peg）₂RILLGLIRR-CONH2，酰胺化形式的C30，其中在聚集区之间的Z₁接头由两个PEG单位（即通过醚键连接的两个环氧乙烷单位）代替GS氨基酸序列组成。

P2151：NH2-RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH，正常C30但使用不同化学肽合成而制备。

P2153：NH2-（Peg）₂RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH，在N末端上融合两个PEG单位的C30。这还可以表述为具有由两个PEG单位组成的另外Z₀部分的C30。

P2154：NH2-Peg3RILLGLIRRGSRILLGLIRR-OH，在N末端上融合三个PEG单位的C30。这还可以表述为具有由三个PEG单位组成的另外Z₀部分的C30。

DAA：D-氨基酸形式的C30，其中所有氨基酸都是D氨基酸。

这些肽与用于最初筛选相同的方式测试。使用微量肉汤稀释法，用在CAMHB（根据EMEA指导）中两倍系列稀释物，筛选肽活性，浓度范围为0.3μg/ml-200μg/ml。

结果显示于表7中。对于P2170和P2175，测试对应于在肽合成过程中获得的两个峰的两个级分。这些分别表示为P1和P2。

表7：经修饰的C30肽对于选择的细菌菌株的MIC值。

如由该表可见的，所有经修饰的肽都保持可与未经修饰的C30相当的抗细菌活性。因此，修饰例如D-氨基酸和PEG化对此处给出的这些分子的活性没有负面作用。特别鼓舞人心的是，MIC值（和因此的抗细菌活性）不受PEG化影响。

2.2.3非聚集对照肽

为了验证聚集物的设计原理，我们已构建对照肽，此处称为‘乱序’肽。这些肽由与原始聚集物相同的氨基酸组成（并且因此具有相同电荷），但次序是被打乱的，这样它们不再符合本文给出的设计原则。这些肽不导致细菌生长或存活的抑制。

2.2.4.靶向一种以上细菌蛋白质

如提及的，第一筛选基于鉴定由表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的基因组编码的蛋白质中存在的易于聚集区。一个非常有希望的化合物C30含有在这些基因组中于一种以上蛋白质中存在的聚集诱导序列，所以提出假设——这可以用于设计新化合物。因此，在下一个步骤中，我们设计了在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的细菌细胞中可获得一种以上的预测靶的干扰物肽（即，含有在这些细菌之任一编码的一种以上蛋白质中存在的β-聚集序列）。该所谓的‘mtop’干扰物肽筛选显示了极高命中率，说明抗细菌干扰物肽的设计可以基于在细菌细胞内可得的多个靶进行（即，含有特定TANGO区的靶蛋白质越多，用干扰物获得杀菌效应的可能性越高）。这是合乎逻辑的，因为靶向的蛋白质越多，通过抑制其中的一种或多种而抑制必需功能的机会越高。表8显示，基于在细菌中遇到一种以上靶蛋白质而设计的双特异性干扰物肽的MIC活性。重要的是提及，表5中使用的干扰物以微尺度形式合成；意味着，对于高纯度的干扰物肽，我们可以预期干扰物活性的相当大改善。

表5中列出的分子对应于本申请中描述的式，其中n是2，X₁和X₄是两个氨基酸，Y₁和Y₂是6个氨基酸，X₂和X₃是1个氨基酸，Z₁是二氨基酸接头，并且Z₂不存在。

表8：几种多靶干扰物肽的MIC值

2.3干扰物分子的抗微生物杀菌动力学

获得时间-杀菌曲线，以研究杀细菌活性的动力学。以化合物的MIC和两倍MIC值，针对表皮葡萄球菌菌株ATCC12228和金黄色葡萄球菌ATCC，测试了化合物C30、Hit50和C29（关于序列参见上文）。显示，均以等于其MIC值的浓度，化合物30在5分钟内使活菌计数降低100%，而Hit50在相同温育期后使活菌计数减少～3log单位（参见图11）。所有肽都显示浓度依赖性活性，因为将浓度加到两倍MIC值导致更快速的杀死。例如，对于C29，以最小抑制浓度，使CFU/ml数降低一倍所需的时间是60分钟，而对于2xMIC仅10分钟。这是重要效应，因为具有更快速杀细菌效应的抗生素一般被认为是更有效的、并且针对此化合物的抗性发展更慢。

2.4针对抗细菌干扰物的细菌抗性发展的监控

通过反复传代和MIC测定，评估金黄色葡萄球菌临床菌株MRSA204发展针对干扰物C30的抗性的能力。在一半MIC的C30存在下生长一天的金黄色葡萄球菌细胞在这天后用于相同化合物的MIC测定试验中。以这种方式，使细菌细胞连续暴露于一半MIC值的单个化合物（即C30），同时传代15天。可以证实，连续暴露于干扰物肽C30仅导致了抗性发展的微小趋势，因为需要在一半起始MIC上十次传代以将该MIC提升两倍。在MIC升高2倍前需要在亚MIC上九次传代，然而，该抗性随着时间过去未成功维持，在12次传代后，MIC回到其原始值。参见图15。用上文列出的其他肽获得了相似结果。当经过更长时间段（31天代替15天）监控抗性时，未观察到在MIC值中的进一步增加（参见下文）。

相比之下，利福平的MIC经过相同时间段获得显著增加（经过15天，多达512倍）——利福平是已知抗性十分容易通过自发性染色体点突变而出现的试剂。类似于测试的肽，万古霉素在这些条件下的MIC仅增加两倍；万古霉素一般被视为在排除物种间的水平遗传转移的条件下不太可能出现针对其的自发抗性发展的抗生素。值得一提的是，这些化合物靶向埋在蛋白质内部的疏水区。据认为，这些区域一般是十分保守的，并且不易于突变，因为这会引起错折叠的（无功能的）蛋白质。不束缚于特定机制，这可能贡献于所观察到的慢抗性发展。

因为抗性发展是随机过程，所以我们已重复先前实验，其中使用相同肉汤微量稀释法（始终4次一式两份重复）），并且还加入常见抗生素如氨苄青霉素和庆大霉素。可以看到，C30和C29显示比氨苄青霉素慢得多的抗性发作，并且MIC值增加相当大地小于庆大霉素和氨苄青霉素的（图12）。注意，因为庆大霉素的初始MIC值低于这些化合物的，所以倍数增加甚至比图中所示的显著得多。

第二个系列的实验为，用MRSA菌株326接种补充有限定浓度的肽C30的2ml BHI肉汤。每天，如先前所述测试MIC。在培养基中的肽浓度根据来自前一天的MIC进行调整，使得生长培养基支持抗性的选择。31天，这被重复3次。C30的MIC显示与先前实验过程中相似的波动，并且从未增加超过4倍。在实验最后一天时，MIC是12,5μg/ml。相比之下，氨苄青霉素处理的细胞的MIC水平高度波动，增加高达7倍（在实验结束时的MIC=100μg/ml）。在过夜温育过程中增加氨苄青霉素浓度导致了抗性菌的选择和MIC水平的进一步增加，而C30浓度的增加不加速抗性发展。结果显示于图13中。

有意义的是，从培养中撤出C30引起MIC水平的50%减少或者不对菌株敏感性具有任何影响。

2.5由抗细菌干扰物引起的膜透性

用膜不透性DNA-结合染料Sytox Green（Invitrogen）研究肽干扰物对活微生物细胞的细胞膜的作用。膜透化允许染料进入，其可以通过荧光的增加而监控。Sytox Green核酸染剂用于实时监控细菌膜透性（以25μg/ml的恒定干扰物肽浓度（参见图18）和以不同的肽浓度（参见图19），以15分钟的恒定时间）。我们观察到，在前5分钟内Sytox Green结合的急剧增加，这在该时间点后稳定，在5分钟后仅具有微小的进一步增加。该进一步微小增加可能归因于两亲性干扰物肽在细菌脂质双层内的快速插入，这诱导脂质堆叠中的局部缺陷和引起进一步增强的渗透性。与非常有效地裂解葡萄球菌的溶菌对照剂（溶葡萄球菌素）相比较，对于用抗菌干扰物处理的细菌，Sytox Green信号稍微较低。图11显示，用化合物30以3μg/ml（这近似其MIC值）处理的金黄色葡萄球菌的杀菌曲线能够非常快速地破坏这些细菌（因为杀菌是浓度依赖性的）；因此如果膜裂解是作用机制，则将预期发生Sytox Green结合的同等快速的升高。然而，情况不是这样。为了支持膜裂解不是细胞死亡的主因的假设，我们已进行了蛋白质组学方法以验证参与主要肽-靶相互作用的细胞内靶，以及用电子显微镜检分析以显示完整细胞。

在下一个步骤中，我们研究了肽干扰物C30的膜电位（MP）变化。为此，使用BacLight试剂盒（Invitrogen）。图20显示在仅5分钟后，在用化合物C30处理的细菌细胞中存在红色荧光的显著减少，展示相等的红色与绿色比，这指示MP的完全去极化。相比之下，溶菌对照（溶葡萄球菌素）显示慢得多的膜去极化。C30处理的细胞的点状图模式非常类似于去极化对照。当合并这些数据时，我们可以推定，在C30处理5分钟后，存在MP的部分坍塌，导致Sytox Green核酸染剂的流入，这在一定程度上指示膜透化。通过这些干扰物引起的去极化显示是时间依赖性而不是浓度依赖性的（数据未显示）。这些结果进一步证明抗菌干扰物的快速杀菌作用机制。

2.6在细菌中聚集体的检测

聚集体用两种不同的淀粉样蛋白诊断染料（硫代黄素-T和刚果红）在抗菌干扰物处理的细菌中显现。硫代黄素-T荧光已描述为β-聚集结构的延长片层构象的特异性标记物。当这种染料与淀粉样蛋白纤丝结合时，相对于游离染料，Th-T荧光有大的增强。Th-T用于细菌测定试验中，以研究肽干扰物是否在细菌细胞内诱导聚集。作为对照，我们使用肽干扰物单独在生理水中的两倍稀释物，以确保外部自聚集的干扰物肽不给出假信号。我们明确观察到，在用干扰物肽处理的细菌细胞中Th-T染料结合的显著浓度依赖性增加（参见图21），说明在用干扰物肽处理的细菌细胞中存在更多β-片层结构。此外，我们还显示，刚果红（CR）与聚集的β结构结合（参见图22），并且该结合诱导CR最大光吸收从490nm到540nm的特征性迁移。本实验验证了Th-T浓度依赖性结合实验，独立地证实在肽处理过程中β-结构形成的增加。

2.7在细菌中通过干扰物诱导的形态变化

扫描电子显微镜检（SEM）和透射电子显微镜检（TEM）用于检查由干扰物肽诱导的细菌中的超微结构变化。葡萄球菌和芽孢杆菌两者用于比较。可以观察到，在用抗菌干扰物C30处理5分钟后，蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都展示了平滑和完整的表面，在其包膜中未显示明显的凹陷、洞和孔。然而，在约20分钟后，芽孢杆菌表面在处理后开始起皱和收缩，这在葡萄球菌中不明显——可能是由于其小的圆形尺寸。在两个细菌物种中，细胞内容物均开始释放，在芽孢杆菌中在处理20分钟后已开始（参见图23，右图，下），在金黄色葡萄球菌中长达1小时后开始（参见图24）。在健康细胞分裂过程中，蜡状芽孢杆菌形成与母细胞不分离的极长链。然而，记录到，在用肽C30处理的蜡状芽孢杆菌细菌细胞群体中，这些长链较不常见，说明受阻的细胞分裂。相似结论可以由下述事实得出：与未经处理的健康细菌细胞相比较，明显更少的经处理的葡萄球菌含有分裂隔。最后，我们可以得出结论，SEM数据描述快速裂解的缺乏。此外，已知化合物30需要短至5-10分钟杀死葡萄球菌，我们预期非常快速的细菌细胞破裂，这明显地并非事实（甚至在用抗菌干扰物处理一小时后）。为了进一步支持我们的假设，我们还察看C30处理的葡萄球菌的超薄切片。这些处理的细胞的透射电子显微镜检也证实裂解的缺乏，尽管存在细胞质的明显收缩（参见图25和26）。另外，在核酸区域中存在电子密度的增加，提示其发生浓缩。DNA浓缩是细胞凋亡反应的晚期阶段之一。该细胞凋亡性细胞死亡可以得到我们的二维凝胶分析支持，这揭示参与自溶活性的MarR家族转录调节物表达的3倍增加。用化合物30处理的金黄色葡萄球菌的超薄切片的透射电子显微镜检分析显示了膜结构（参见图25中的箭头），其先前被描述为间体。

免疫电子显微镜检分析

使用透射电子显微镜检，研究免疫标记的聚集物的定位。为了该目的，肽30用5(6)羧基荧光素在其N末端上标记（FITC标签）。

指数生长期的细菌用加上FITC标签的肽（2xMICs值）处理30分钟，随后用两倍浓度的固定剂（于0.1M P-缓冲液，pH=7.4中4%多聚甲醛+0.4%戊二醛）固定10分钟和单个浓度的固定剂（上文的一半）固定1小时。在几个洗涤步骤（P-缓冲液和P-缓冲液/甘氨酸）后，将沉淀悬浮于12%明胶/p-缓冲液中，在冰上温育，切成小方块，并且设置为在2.3M蔗糖中温育过夜。将样品固定在样品支架上，在液氮中冷冻，并且用金刚石刀在-100℃用ultracut S/FCScryoultyramicrotome（Leica）切片。将超薄解冻切片置于Formavar-碳涂布的铜载网（400网目）上，使切片漂浮在甘氨酸-PBS的小滴上，六次，每次10分钟。载网随后在10mM PBS缓冲液中洗涤5分钟，用PBS/BSA（0.1%）阻断，并且在抗FITC山羊一级抗体（Abcam）（在PBS缓冲液中1:1000稀释）的小滴中温育30分钟，在PBS缓冲液中洗涤5次，与在PBS缓冲液中1:50稀释的兔抗山羊蛋白A-金缀合物（5nm；BBInternational EM Rag5）一起温育30分钟。随后将切片在PBS中洗涤6次共5分钟，并且在ddH₂O中洗涤3次。将载网用乙酸双氧铀-甲基纤维素（1%）在冰上染色5分钟，小心干燥且使用JEOLJEM2100透射电子显微镜观察（在80kV的加速电压下操作）。在不同对照程序中未检测到抗体的主要非特异性结合，本底标记是微小的问题，并且大多数时间与在蛋白A-金温育后不充分的洗涤步骤联系，这已得到优化。

在暴露30分钟后，FITC-C30肽占优势地存在于细菌细胞质中，以聚集体的形式簇在一起（图27，红色箭头）。因为未观察到非特异性结合，所以免疫金标记的颗粒代表肽的存在。这些结果证实肽的细胞内活性。此外，用肽处理的细胞具有明显扰乱的分裂过程。当与未经处理的葡萄球菌相比较时，肽处理的细胞的分裂是不对称的；分裂隔也厚得多且丧失其边缘。有意义的是，聚集体簇仅在细胞的一个部分中可见，这提示针对聚集体遗传的进化压力——先前在大肠杆菌中描述的过程（Rokney，A.，M.Shagan等人（2009）."E.coliTransports Aggregated Proteins to the Poles by a Specific and Energy-Dependent Process."Journal of Molecular Biology392（3）：589-601；Lindner，A.B.，R.Madden等人（2008）."Asymmetric segregation of protein aggregates isassociated with cellular aging and rejuvenation."Proceedings of the NationalAcademy of Sciences105（8）：3076-3081.）

经处理的细菌的形态分析和膜渗透性研究看起来暗示干扰物肽将其自身插入细菌胞质膜内，导致快速膜去极化及其完整性的丧失。不束缚于特定机制，这看起来不是其杀菌作用模式，而是“副作用”。干扰物肽仅对在其基因组中编码也存在于干扰物分子中的β-聚集区的细菌是活性的。干扰物能够诱导其靶聚集，导致细胞死亡。因此，提出假设：细胞内靶聚集和膜效应的组合导致细菌的快速细胞死亡。

2.8抗细菌干扰物对哺乳动物细胞的毒性

2.8.1溶血测定试验

为了区分选择性抗微生物活性与对真核细胞的非选择性裂解活性，我们使用人红细胞测量最有活性的干扰物肽的裂解能力。如图14中所示，化合物：C29、Hit57A、Hit50和Hit24在临床有关浓度未显示出显著的溶血活性，而肽C30和Hit1具有范围在25μg/ml-50μg/ml之间的HD₅₀s（导致50%红细胞被裂解的浓度）。去污剂Tween用作阳性对照，引起RBCs的100%裂解。可以证实，干扰物肽在其MIC值时未显示主要溶血（参照表4），并且一些干扰物肽甚至在高达100μg/ml的浓度下也是非溶血性的。

2.8.2对哺乳动物细胞的Alamar蓝测定试验和乳酸脱氢酶（LDH）释放测定试验

当与干扰物肽Hit50相比较时，用不同浓度的抗微生物干扰物肽C30处理的人胚肾（HEK293T）细胞导致更高水平的LDH释放。观察到细胞外LDH的浓度依赖性增加，指示这些肽引起质膜完整性的一些丧失。图16显示，当以50μg/ml或更高使用时，肽干扰物C30引起高于50%的LDH释放，而肽干扰物hit50在相同浓度时仅引起5%LDH释放（参见表4）。

Alamar蓝测定试验允许实时监控在肽的存在下细胞生长恢复的总百分比。对于大多数肽干扰物（在高达100μg/ml的浓度时），我们发现80-100%的哺乳动物细胞显示在3-24小时内的总生长恢复。图17显示，对于两种不同的肽干扰物，人胚肾细胞（HEK293T细胞系）上的Alamar蓝细胞毒性。尽管由高浓度的C30引起LDH释放，但可以看出对于低于100μg/ml的浓度，哺乳动物细胞的存活力并未显著受这种化合物的施用影响。数据指示抗菌肽干扰物对于细菌的特异性，仅对哺乳动物细胞具有微小影响。

2.8.3侵入测定试验

在该测定中，HCT116细胞单层（人结肠肿瘤细胞系）在微孔板底部培养。第二天，加入新鲜的金黄色葡萄球菌ATCC27853细菌（约10⁶CFU/ml），并且包括阴性未感染对照。在感染90分钟后，加入肽的不同稀释物，并且将培养物温育另一小时。作为阳性对照，使用庆大霉素（考虑到其具有良好的细胞内活性）。每个孔用预温的生理水洗涤以除去任何胞外菌，随后为1%Triton处理以从哺乳动物细胞中释放所有截留的细菌。将孔的内容物系列稀释，并且在TSA琼脂平板上铺平板用于CFU计数。该测定的结果显示于图28中。

值得注意的是，肽浓度可以进一步降低到低至12.5μg/ml，同时维持相似的抗细菌活性。这对于避免可能随着肽的高浓度而出现的有毒副作用是有利的。不管怎样，这些结果都显示，聚集物肽在与杀细菌效应有关的浓度下是被哺乳动物细胞耐受的，并且可以靶向存在于培养的人结肠肿瘤（HCT-116）细胞中的金黄色葡萄球菌（即，它们由细胞吸收且显示杀细菌效应）。

2.9靶向蛋白质的蛋白质组学分析

聚集技术基于下述假定：具有高聚集倾向（例如通过TANGO得分评估的）且衍生自靶蛋白质的短氨基酸区段可以诱导该蛋白质的聚集。该假设已通过不溶性级分的鸟枪法蛋白质组学分析加以证实。如果我们假定我们的聚集物肽通过与其靶的特异性相互作用而工作并且引起其聚集，则预期靶进入不溶性级分。为此，我们已决定将裂解产物分成2个级分：不溶性和可溶性的，并且比较这些与未经处理的细胞的级分。假定存在于经处理的（TC30）和未经处理的（NT）不溶性级分中的蛋白质呈现非特异性天然不溶性蛋白质的本底。另外，我们已检查经处理的和未经处理的细菌的可溶性级分，并且如预期的，目的蛋白质仅存在于未经处理的级分中。这意味着，使用下述标准用于靶搜索：

1）潜在聚集靶是这样的蛋白质，其得自C30处理的细胞的不溶性级分中的蛋白质减去未经处理的细胞的不溶性级分中的蛋白质；

2）C30处理的细胞的不溶性级分中的蛋白质减去C30处理的细胞的可溶性级分中的蛋白质，只有当在不溶性NT级分中不存在并且存在于可溶性NT级分中、且仅当它在其氨基酸序列内含有tango序列或其部分时，才是潜在靶。

通过SOSPA（锯短鸟枪（sawn-off shotgun）蛋白质组学分析）法，可以证实每个聚集物各自的靶蛋白质。由此，我们迄今已证实在两个不同细菌菌株中化合物30的靶：金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌。两个经处理的物种的不溶性级分都含有在芯片上(in silico)预测的蛋白质：即遗传感受态的负调节物ClpC/mecB，其事实上在其FASTA序列（Uniprot登记号：Q63HB8）内含有该Tango区段。如预期的，C30的靶蛋白质在肽处理后从可溶性转变为不溶性级分。

另外，我们已印迹了不同级分且使用这些印迹和特异性识别肽进行靶检测。再次，我们证实，在C30处理的蜡状芽孢杆菌的不溶性级分中存在靶蛋白质ClpC/MecB（90kDa）（图29）。

这些结果一起证明我们的假设：聚集物具有与细菌膜相互作用的能力（界面活性），它们穿透细菌的细胞质，并且如果靶具有可接近的tango区，则聚集物与之结合，使其聚集并且因此播种进一步的反应级联。如参考文献中已提及的，聚集体引起脂质重排和膜渗透化。广泛电子显微镜检查分析证明，聚集物自细胞内部而非自外部作用于膜。我们得出结论，聚集物作用于细胞质靶蛋白质并且在后期阶段中作用于膜自身，导致快速细胞死亡。

通过SOSPA获得的数据还可以使用二维凝胶电泳加以证实（数据未显示）。

2.10抗细菌干扰物的血清稳定性和在血清中的检测

为了评估在血清的存在下的干扰物活性，在含有50%胎牛血清的培养基中确定（如上所述）几种抗菌肽干扰物对于金黄色葡萄球菌的MIC值。如预期的，表9显示MIC值在血清的存在下略微更高，但重要的是，干扰物肽保留其抗微生物活性，指示抗菌干扰物肽的可能体内用途。

表9：在有和没有50%血清存在下几种抗菌干扰物的MIC值

肽干扰物名称	MIC	在50%FBS存在下MIC
			C30	6μg/ml	50μg/ml
Hit1	3μg/ml	25μg/ml
			Hit50	25μg/ml	100μg/ml
Hit57A	50μg/ml	100μg/ml

为了检测血清中的肽，使用斑点印迹测定。肽还在PBS中稀释，印迹且用作定量指导。从100μg/ml开始，遵循肽的2倍稀释，将斑点点在硝酸纤维素膜上。

因为肽是生物素标记的，所以链霉抗生物素蛋白-HRP用于探测。存在线性应答，提示这种方法成功地用于在300μg/ml-6μg/ml的范围中的血清检测（图30）。关于肽检测的更多信息，参见实施例4。

2.11在大鼠和小鼠中抗细菌干扰物的体内毒性的初步评估

为了评估抗菌肽干扰物在体内的毒性，称重约±350克的八只无菌fisher雄性和雌性大鼠用溶于缓冲液A：组氨酸-乙酸盐（pH6.5）和缓冲液B磷酸盐缓冲液（pH6.5）中的肽干扰物C30注射。两只大鼠用1.5mg/kg的浓度注射，并且两只用3mg/kg的浓度注射。这些为注射到尾静脉内的单次不重复注射。经过几天观察大鼠，但死亡率和任何其他副作用都不是明显可见的。

进一步地，三组6周龄的雌性Swiss小鼠用渐增的C30剂量经过1周注射。将C30溶解于生理水中，并且给予1次注射/天。在前3天中，给予尾静脉中的注射（150μl/注射），并且在剩下2天过程中，给予IP注射（300μl/注射）。初剂量从3mg/kg开始，并且每天逐渐增加剂量。对照组接受相同体积的盐水。对于IV注射，所分析的最高剂量是50mg/kg，对于IP注射是100mg/kg。IV注射的小鼠未显示死亡的体征和任何其他可见副作用。然而，IP注射的小鼠在100mg/kg的最高剂量后发展皮下损伤肿块，暗示肽溶液太浓且形成了不溶性聚集体。对经处理的和对照小鼠的器官实施进一步的组织学分析。在给予所有5次注射后，通过眶后穿刺获得血液且分析。在血液中未发现异常。

2.12化合物C30的体内功效

动物：

称重21-24g的六周龄、无特定病原体、NIH Swiss雌性小鼠（Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN）用于所有分析。所有实验程序都由当地动物实验伦理委员会批准。

金黄色葡萄球菌MRSA326菌株的嗜中性粒细胞减少小鼠大腿模型

在实验感染前4天（150mg/kg体重）和1天（100mg/kg）腹膜内注射环磷酰胺（Sigma），致使小鼠出现嗜中性粒细胞减少。先前研究已显示，该方案在该模型中导致5天的嗜中性粒细胞减少。新鲜接种的金黄色葡萄球菌MRSA326的肉汤培养物在Mueller-Hinton肉汤（MHB）中生长过夜。在PBS内1:4,000稀释后，接种物的细菌计数为10⁶-2×10⁶CFU/ml之间。临接种前，将小鼠用约4%异氟烷短暂麻醉。将细菌悬液（0.05ml）肌内注射到每条大腿内（约5x10⁴CFU）。在细菌接种后2小时，通过i.v.（静脉内）或i.p.（腹膜内）途径开始处理。在该研究中使用3只动物/组的四个组：

·组A仅接受缓冲液，并且在注射后4小时处死，

·组B已用15mg/kg C30（总体积150ul）i.v.处理，并且在注射后4小时处死，

·组C在感染后2小时和4小时后接受30mg/kg的2次i.p.注射，并且在注射后6小时处死。

·组D用15mg/kg万古霉素i.v注射，并且在注射后4小时处死。

在处理后的多个时间点，三只动物的组通过CO₂窒息人为处死。将大腿肌块匀浆化且在冰冷的PBS中十进制稀释，并且将五个连续稀释物的10μl等分试样在血琼脂上铺平板（每个大腿匀浆物，3个独立稀释重复）。在37℃过夜温育后，对于每只大腿，计数CFU并且表示为log₁₀CFU/大腿。

如图31中所示，当以15mg/kg的推注i.v.剂量注射时，化合物C30显示使初始接种物的扩增减少6.9Log₁₀CFU/ml。相比之下，相同剂量的万古霉素使生长减少8.7Log₁₀CFU/ml。腹膜内加倍剂量的C30未显示对大腿中的CFU减少具有快速作用（考虑到施用途径，这事实上是预期的）。需要该递送途径的更多时间依赖性评估。实验还缺乏在感染后6小时后处死的对照动物组。然而，考虑到细菌在未经处理的小鼠中在接种4小时内扩增了4.7Log₁₀CFU/ml（1.7倍），可以主张，在感染后6小时后，CFU的量应进一步对数增加。为此，仍不应摒弃i.p.递送。

3.抗病毒应用

由季节性流感引起的疾病负担、2009年大范围流行的H1N1爆发和药物（金刚烷和神经氨酸酶抑制剂）抗性流感病毒的增加传播，证实存在对如下新药的医学需要，所述新药可以抑制许多类型或变体的流感病毒、并且较不易受季节性病毒变异性影响。目前，Roche的Tamiflu和GSK的Relenza是在流感治疗中最常开的处方药物。两种药物都靶向神经氨酸酶蛋白质。循环流感病毒快速发展针对Tamiflu的抗性，并且仅存在非常有限数目的在临床开发下的抗流感药物。

因此，决定设计针对流感蛋白质的保守区的干扰物，以确保广谱靶特异性。重要的是，干扰物技术的作用机制从根本上不同于针对感染性疾病的疫苗和所有其他目前使用的抗病毒干预策略，即它靶向蛋白质折叠的基本过程，并且因此对于病毒适应性而言代表一种全新的分子干预和选择压力。此外，它允许鉴定迄今未接受抑制的新病毒靶。此外，考虑到抗病毒干扰物显示高稳定性行为，干扰物通过鼻内或气管内喷雾剂或气雾剂的递送可以用于感染部位的局部施用，并且因此可以揭示出与目前处方药物相比干扰物的另外优点。

对于干扰物的设计，特别关注病毒聚合酶亚单位（PA、PB1、PB2）和核蛋白（NP）。这些蛋白质在很大程度上是保守的，并且后面一种病毒蛋白质近期被鉴定为小分子化合物的靶，所述小分子化合物通过触发NP聚集而发挥其抗病毒效应，但存在天然抵抗这种实验药物的流感病毒（Kao等人，Nat Biotechnol.2010；28（6）:600-5）。总之，对于目前可用抗病毒剂的渐增流感病毒抗性，靶向这些保守蛋白质的干扰物将提供一个回答。

在初步实验中评估了针对不同A型流感病毒蛋白质的36种肽。Madin Darby犬肾（MDCK）细胞生长至汇合，并且在37℃在无血清培养基中与干扰物一起预温育1小时。细胞随后用NIBRG-14（H5N1株）或PR8（H1N1株）病毒感染16小时。选择对于每一种所选蛋白质最有希望的肽用于进一步评估。这些肽显示于表10中。

表10.选择用于进一步评估的抗病毒干扰物的序列

在序列之前的O和Z分别指光学标记和接头。O代表5（6）-羧基荧光素。使用的接头是N-（3-{2-[2-（3-氨基-丙氧基）-乙氧基]-乙氧基}-丙基）-琥珀酰胺酸]，有时也称为4,7,10-三氧杂十三烷-13-琥珀(酰胺)酸或Ttds。分子的结构因此对应于下式：

标记–Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4，即n=2，标记和Z1如上定义，所有4个X部分都等于单个R残基，Z2是GS接头，Y1=Y2并且等于该表的最后一列中列出的序列，除了干扰物1，其中Y部分是LIQLIVS（SEQ ID NO：124）。对于该聚集区，N末端守门残基等于蛋白质中的侧翼残基。所有聚集区都对它们靶向的A型流感蛋白质具有独特性。

作为后续实验，MDCK细胞在24孔形式中生长成汇合单层。将干扰物（200mg）溶解于45微升DMSO中，以获得2mM贮存液。将7微升干扰物贮存液加入400微升PBS中，以获得35mM溶液。将细胞用无血清培养基洗涤，这之后加入250微升新鲜无血清培养基和100微升干扰物。将干扰物稀释，使得它们以1或10μM的浓度应用于细胞。随后，将细胞在37℃和5%CO₂下温育4小时。在与干扰物肽的4小时预温育后，使细胞与10噬斑形成单位（pfu）的PR8病毒一起温育。去除接种物且加入含胰蛋白酶培养基。在0、8、12、16、24和36小时获得样品用于病毒滴定。作为阳性对照，细胞用1μM或10nM Tamiflu处理。一式两份实验的结果显示于图32中。

如由该图可见的，在10μM时，所有肽都抑制病毒复制。在1μM时，干扰物1和4仍重现性地抑制病毒复制，而干扰物2和3的效应较不强。然而，注意，Tamiflu在一个设置中完全不抑制病毒复制。

我们还使用更敏感的A型流感微型复制子测定试验，以评估候选干扰物的潜力。该系统要求功能性PA、PB1、PB2和NP蛋白质的存在。作为报道分子，使用反义萤火虫萤光素酶构建体，其连同PB1、PB2、PA和NP的表达质粒一起转染到哺乳动物细胞内。使用海肾萤光素酶报道分子，进行转染的标准化。对照实验证实，当所有4个组分都存在时，萤火虫萤光素酶微型复制子产生萤光素酶活性，但当其中之一缺失时或当共转染编码小鼠Mx1蛋白质的表达载体时则不产生，所述小鼠Mx1蛋白质通过抑制受流感病毒感染的细胞的细胞核中病毒mRNA的合成，对流感病毒赋予选择压力（图33）。

使用该系统作为读出，我们可以证实干扰物构建体的抗病毒活性。还测试这些干扰物具有不同守门者（R或D）和/或不同Z₂接头部分（GS、PP或PS）的变异、以及具有其他聚集序列的干扰物（参见图34）。这些构建体的序列显示于表11中。

表11.针对病毒蛋白质的更多干扰物的序列

O和Z是如上表10中规定的相同标记和接头。

经由对照，还测试了针对不参与微型复制子测定试验的内部病毒蛋白质（M1和NS1）设计的干扰物，并且这些事实上未显示萤光素酶活性的减少（图35）。这些无关干扰物的设计相同于针对聚合酶蛋白质和针对NP的4种干扰物的设计，其具有守门者和Z2接头（即内部接头，此处式为Z1-X1-Y1-X2-Z2-X3-Y2-X4），如该图中所示。针对基质蛋白质1和非结构蛋白质1的肽的聚集序列和肽序列也显示于表11中。

因此，可以设计针对流感病毒的各种聚合酶蛋白质以及针对核蛋白的干扰物肽。这些干扰物成功降低流感RNA复制，这是一种特异的依赖于靶下调的效应，因为针对无关靶的干扰物不导致下调。

4.检测和诊断

4.1用特异性干扰物检测β-半乳糖苷酶（β-gal）

4.1.1特异性干扰物肽设计和合成

使用Tango算法，鉴定待检测的靶（即β-半乳糖苷酶）的聚集成核区段，所述Tango算法为基于三个理化参数（即低净电荷、高疏水性和β-片层倾向）用于预测蛋白质中的β-聚集倾向区的一种统计力学算法。随后就本申请中所述的Y_i部分的要求，检查这些区段，以确保这些序列具有高聚集倾向。Tango比较给定氨基酸序列相对于一组相似序列形成各种二级结构元件的倾向，且指定与其形成β-片层聚集体的能力成比例的得分（0-100）。总得分<5的序列区段视为具有低聚集倾向，并且>50的那些是强聚集的。根据β-gal蛋白质序列（在SEQ ID NO：3中描述，不含M起始残基），选择具有总tango得分>50的两个氨基酸序列区段，即SEQ ID NO：3中的残基7-12（LAVVLQ（SEQ ID NO：75，Tango1）和SEQ ID NO：3中的残基453-460（VIIWSLGN（SEQ ID NO：76），Tango2），并且通过固相合成，合成了包含与一个或多个守门残基（Arg、Lys、Asp、Glu和Pro）侧接的野生型序列的一系列高纯度（>95%）肽。选择包含SEQ ID NO：3中显示总Tango得分<5的残基106-113的序列区段作为阴性对照，以确定该区段如通过Tango算法预测的具有弱聚集倾向。另外，合成包含VIIWSLGN（SEQ ID NO：76）（Tango2-区）的三个突变干扰物。6种干扰物肽（包含鉴定的Tango-区、包含阴性对照序列、或包含变体（或突变的）Tango2-区）的序列在表12中描述。将这6种肽的C末端乙酰化且在N末端上用生物素或聚组氨酸（His）₆标签进行标记，分别用于蛋白质印迹（WB）检测和体外筛选（参见实施例2）。

SEQ ID NO：3，β-半乳糖苷酶的氨基酸序列。鉴定的Tango区以粗体描述

1 TM ITDSLAV VLQRRDW EN P GVTQLNRLAA HPPFASWRNS EEARTDRPSQQLRSLNGEWR60 FAWFPAPEAV PESWLECDLP DADTVVVPSN WQMGYDAPI YTNVTYPITVNPPFVPAENP120 TGCYSLTFNI DESWLQEGQT RIIFDGVNSA FHLWCNGRWV GYGQDSRLPSEFDLSAFLRA

180 GENRLAVMVL RWSDGSYLED QDMWRMSGIF RDVSLLHKPT TQISDFQVTTLFNDDFSRAV240 LEAEVQMYGE LRDELRVTVS LWQGETQVAS GTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPE300 LWSAEIPNLY RAVVELHTAD GTLIEAEACD VGFREVRIEN GLLLLNGKPLLIRGVNRHEH360 HPLHGQVMDE QTMVQDILLM KQNNFNAVRC SHYPNPLWY TLCDRYGLYVVDEANIETHG420 MVPMNRLTDD PRWLPAMSER VTRMVQRDRN HPSVIIWSLG NESGHGANHDALYRWIKSVD480 PSRPVQYEGG GADTTATDII CPMYARVDED QPFPAVPKWS IKKWLSLPGEMRPLILCEYA540 HAMGNSLGGF AKYWQAFRQY PRLQGGFVWD WVDQSLIKYD ENGNPWSAYGGDFGDTPNDR600 QFCMNGLVFA DRTPHPALTE AKHQQQYFQF RLSGRTIEVT SEYLFRHSDNEFLHWMVALD660 GKPLASGEVP LDVGPQGKQL IELPELPQPE SAGQLWLTVR VVQPNATAWSEAGHISAWQQ720 WRLAENLSVT LPSASHAIPQ LTTSGTDFCI ELGNKRWQFN RQSGFLSQMWIGDEKQLLTP780LRDQFTRAPL DNDIGVSEAT RIDPNAWVER WKAAGHYQAE AALLQCTADTLADAVLITTA840 HAWQHQGKTL FISRKTYRID GHGEMVINVD VAVASDTPHP ARIGLTCQLAQVSERVNWLG900 LGPQENYPDR LTAACFDRWD LPLSDMYTPY VFPSENGLRC GTRELNYGPHQWRGDFQFNI960 SRYSQQQLME TSHRHLLHAE EGTWLNIDGF HMGIGGDDSW SPSVSAEFQLSAGRYHYQLV1020 WCQK

表12：用于在大肠杆菌BL21完全细胞裂解物中检测β-Gal的6种不同干扰物肽的列表

干扰物肽	干扰物序列#	野生型序列^&
			Tango1	b～RLAVVLQR(SEQ ID NO:44)	DSLAVVLQRR(SEQ ID NO:50)
Tango2	b～RVIIWSLGNR(SEQ ID NO:45)	PSVIIWSLGNES(SEQ ID NO:51)
			脱靶	b～RPITVNPPFR(SEQ IDNO:46)	TYPITVNPPFVP(SEQ ID NO:52)
Tango2Mut_1	b～RVPIWSLGNR(SEQ ID NO:47)	PSVIIWSLGNES(SEQ ID NO:51)

干扰物肤干扰物序列#	野生型序列^&
		Tango2Mut_2b～RVIPWSLGNR(SEQIDNO:48)	PSVIIWSLGNES(SEQIDNO:51)
Tango2Mut_3b～RVIPESLGNR(SEQIDNO:49)	PSVIIWSLGNES(SEQIDNO:51)

#如本文使用的注释b～指示该肽在N末端上是生物素化的，并且与接头融合。

^&显示具有其天然侧翼残基的野生型序列。

如下述实施例的描述中使用的，干扰物的名称在列1中描述，序列在列2中描述。在这些干扰物分子中，n是1，X₁和X₂是R残基，Y₁是靶蛋白质的6（‘Tango1’）或8（‘Tango2’）个残基的区段，Z₁是N末端氨基酸接头APAA（SEQ ID NO：77），并且分子融合至可检测标记–在此情况下生物素（b）。对于进一步实验，也已使用其他接头例如Ttds和PEG、以及不同标记例如HA-标签(YPYDVPDYA(SEQ ID NO：108))、Flag-标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO：106))、和His-标签(聚组氨酸)——显示了代表实验。突变型肽包含相对于靶蛋白质β-gal的序列具有1或2个非保守置换的Y1区。

通过使用干扰物的该通用蛋白质检测方法（其在下文被称为PepBlot）的示意性图显示在图36中。

4.1.2.经由蛋白质印迹和使用特异于β-半乳糖苷酶的干扰物经由PepBlot分析，检测β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶首先在大肠杆菌中表达。为此，在LB培养基中在37℃培养具有表达构建体pBad_βgal_WT（pBad载体得自Invitrogen）的大肠杆菌BL21细胞。当培养物达到OD_600nm～0.6时，细胞用0.2%阿拉伯糖诱导且允许在37℃生长过夜。平行地，生长不表达β-Gal的感受态BL21细胞用于对照和滴定实验。

0.4ml表达β-Gal的BL21细胞悬液（OD_600nm～1.2）（在诱导条件下生长）以5000 g在室温下离心10分钟。弃去上清液并且将0.8 ml含有蛋白酶抑制剂的细菌蛋白质提取试剂（B-PER，Thermo scientific）加入细菌团块中，并且涡旋混合30秒，以便裂解细胞。向21μl完全BL21细胞裂解产物中加入5μl5x SDS样品上样缓冲液（Fermentas），并且在99℃下加热3分钟。将这种混合物（26μl/孔）装载到10孔NuPage4-12%Bis-Tris凝胶中，并且在变性条件下分离蛋白质。随后将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并且用在磷酸盐缓冲盐水、0.05%Tween20，pH7.4（PBS-T）中的1%BSA在4℃封闭过夜。切下膜的每个泳道，并且分别与兔抗β-Gal抗体、生物素化的Tango1、生物素化的Tango2、或生物素化的脱靶肽、或生物素化的Tango2突变肽一起温育。

用抗β-Gal抗体进行的β-Gal蛋白质印迹（WB）检测遵循如下的程序。切下膜的第一个泳道，并且在轻轻搅动下与兔多克隆抗β-Gal抗体（1:1000稀释度）一起在PBS-T中温育1小时。随后用PBS-T进行3x 10分钟洗涤。在最后一次洗涤后，使膜与缀合至辣根过氧化物酶（HRP，1:5000稀释度）的山羊多克隆抗兔抗体一起在PBS-T中温育1小时。随后，用PBS-T洗涤膜的该泳道3x 10分钟，并且最后在去离子水中洗10分钟。使膜的该泳道暴露于化学发光HRP底物试剂（SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate，ThermoFisher Scientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现靶蛋白质（参见图37，泳道1）。

用生物素化的干扰物肽进行的β-gal PepBlot检测的程序（即类似于蛋白质印迹的方案，但使用干扰物代替抗体作为检测试剂）如下。在100%DMSO中制备每个生物素化肽（Tango1，Tango2、脱靶和tango2的突变体（参见表12））各自的贮存液（10μM）。肽贮存液在10mM MES缓冲液、100mM海藻糖、0.02%Tween20，pH5.5中稀释（1/40），以获得250nM的肽终浓度。将新鲜制备的肽溶液立即加入膜试条中，并且在室温下轻轻搅动。在1小时后，倾析肽溶液并且将膜试条用10mM MES缓冲液、0.05%Tween20，pH5.5洗涤4x10分钟。随后，使膜试条与缀合至HRP的生物素亲和试剂（1:100,000稀释度）链霉抗生物素蛋白（SRP）一起在PBS-T中在室温下温育1小时。随后用PBS-T进行3x10分钟洗涤，并且最后在去离子水中洗10分钟。使膜试条暴露于化学发光HRP底物试剂（SuperSignal West Femto Maximum SensitivitySubstrate，Thermo Fisher Scientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现靶蛋白质。

4.1.2.1使用的不同干扰物的选择性

在图37中，比较了使用兔多克隆抗β-Gal抗体对完全细菌细胞裂解产物中的β-Gal的WB检测以及使用具有三种不同干扰物的PepBlot的检测：Tango1肽（b～RLAVVLQR（SEQ IDNO:44））和Tango2肽（b～RVIIWSLGNR（SEQ ID NO：45））和脱靶肽（b～RPITVNPPFR（SEQ IDNO：46））。此处再次，生物素用作标记，并且APAA（SEQ ID NO：77）用作氨基酸接头。观察到（参见图37）Tango1和Tango2干扰物以高特异性与β-Gal结合。尽管Tango1肽预测显示与β-Gal聚集的最强倾向，但它显示出比Tango2干扰物肽弱的结合（参见泳道2）。不束缚于特定作用机制，一个解释是，Tango1肽的确较不有效地与β-gal的N末端相互作用，这是因为在β-gal于膜试条上的固定化状态中该N末端较不可得。该非限制性解释进一步受下述事实支持：与Tango2肽相比较，在体外相同干扰物肽（即Tango1肽）对游离β-gal的添加导致更快速的聚集动力学（参见下文）。图37明确显示，Tango2肽展示与β-Gal的强亲和力，与用β-gal的特异性抗体的检测具有相当的信号（比较泳道1和泳道3）。尽管脱靶肽干扰物由疏水性氨基酸构成，但一个以上β-片层破坏者P残基在序列中心的存在有效地破坏β-聚集。在泳道4中在位置～20kDa处的条带不是肽交叉反应性的效应，而是由于在生物素不存在（或低可得性）的情况下链霉抗生物素蛋白（SRP）的非特异性结合。在下述章节中描述的实验主要基于Tango2序列。

4.1.2.2干扰物探针的结合特异性

为了评估Tango2干扰物肽与β-Gal的相互作用的特异性，使用另外肽进行了检测实验。首先，我们用非聚集性但疏水性的β-Gal肽（P₁₀₆ITVNPPF₁₁₃）探测β-Gal，并且未发现相应探测肽b～RPITVNPPFR（SEQ ID NO：46）与β-Gal的相互作用（参见上文，图37，泳道4）。其次，我们采用四种探测肽，其序列对应于使用TANGO在无关细菌和人蛋白质中鉴定的聚集区。这使用衍生自下述的生物素标记的肽完成：人细胞周期蛋白依赖性激酶4抑制剂B（序列b～FLDTLVVLHRA（SEQ ID NO：175））、人前列腺特异性抗原（PSA，序列b～RQWVLTAAR（SEQ IDNO：85））、和脯氨酸脱氢酶（PD，b～RFFIALSR（SEQ ID NO：176））及ClpB ATP酶（b～RILLGLIR（SEQ ID NO：177））——两者都得自表皮葡萄球菌。后面三种探针的设计对应于这样的分子，其中n=1，X₁=X₂=一个Arg残基，在两者之间具有Y₁序列。在第一种探针中，FLD和RA是对应于Y₁的TLVVLH（SEQ ID NO：178）部分的天然侧翼序列。在这些侧翼序列中，D对应于X₁守门者，R对应于X₂守门者。

所有这些肽都未能导致对应于β-Gal的条带的特异性染色(数据未显示)，证明聚集倾向对于特异性相互作用是必要但非充分的。最后，为了测试高评分Tango区是否耐受由其他残基的置换而维持其性质，生成了突变体。在第一种情况下，将“I”残基替换为β-片层破坏者“P”残基，并且生成具有“I”至“P”变化的2个不同突变体肽(关于该特异性序列，参见表12)。此外，将“IW”替换为“PE”的双重突变体肽的效应被用于研究带电荷守门残基对β-聚集倾向的影响。预期聚集通过引入排斥电荷而被抑制。在图38中举例说明的两个单点突变肽(b～RVPIWSLGNR(SEQ ID NO：47)和b～RVIPWSLGNR(SEQ ID NO：48))的PepBlot分析显示，这些突变肽仍与β-Gal有效结合。然而，明确的是，通过引入置换，观察到脱靶结合。这并非不合逻辑，因为该保留的短聚集诱导区段对于大肠杆菌中的β-Gal蛋白质不是独特性的。此外，荷电残基的另外引入导致相互作用的几乎完全丧失。这证实，以单点突变体的形式探针结合的高序列特异性足以抑制结合特异性，而聚集倾向的抑制足以废除结合——尽管80%的序列同一性。这些数据证实我们的假设：聚集倾向和序列匹配是肽介导的相互作用的特异性的先决条件，并且与近期研究(Sabate，R.等人J.Mol.Biol.404：337-352，2010)一致，所述近期研究显示，打乱或逆转形式的胰岛淀粉样蛋白多肽不与彼此或野生型序列杂交成种，证实超过仅仅序列组成的位置依赖性。

4.1.2.3干扰物的结合动力学

为了研究Tango2肽干扰物与完全BL21细胞裂解产物中的β-Gal的结合动力学(即在干扰物和靶之间的接触时间)，使肽与膜一起温育30秒到1小时。膜以选择的时间间隔从温育缓冲液中取出，并且进一步如上所述加工。

图39举例说明，自完全细菌BL21细胞裂解产物的β-Gal检测可以在与肽的短时帧(低至30秒)温育中实现。

4.1.2.4基于干扰物使用的PepBlot检测方法的灵敏度

测定基于干扰物肽的PepBlot检测的灵敏度。为此，将浓度0.1pmol(11.6ng)-10pmol(1160ng)的β-Gal掺到非诱导BL21细胞的完全裂解产物(OD_600nm～0.6)中。向21μl完全BL21细胞裂解产物中加入5μl5x SDS上样缓冲液(Fermentas)，并且在99℃下加热3分钟。将26μl含有不同浓度β-Gal的混合物装载到10孔NuPage4-12%Bis-Tris凝胶中，并且在变性条件下分离蛋白质。随后将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并且用在PBS-T中的1%BSA在4℃封闭过夜。进一步与干扰物的温育和处理如本文先前描述的。图40显示该实验的结果。根据数据，显而易见的是可以检测亚皮摩尔量的β-Gal(少至58ng)(参见图40A的泳道2中的β-Gal检测)，其与抗体的检测限相当。此外，获得的信号也与抗β-Gal抗体检测的相当(图41)。

4.1.2.5PepBlot检测的特异性

为了测定守门残基对PepBlot检测的特异性的影响，我们生成具有核心Tango序列“VIIWSLGN”(SEQ ID NO：76)的针对靶蛋白质β-gal的干扰物肽。为此，生成3种干扰物肽：1)无守门残基，具有经由GSGS氨基酸接头在C末端中连接至Flag-标签(DYKDDDDK(SEQ ID NO：106))的序列VIIWSLGN(SEQ ID NO：76)(VIIWSLGNGSGSDYKDDDDK(SEQ ID NO：179))。2)由天然守门残基侧接的Tango序列(RDRNHPSVIIWSLGNESGHG(SEQ ID NO：180))。3)互补荷电守门残基，其中残基‘D’和‘R’被放置以与极性‘S’和‘E’残基互补(DVIIWSLGNR(SEQ ID NO：181))。前两种肽证实WO2007/071789中提供的干扰物肽的定义，而第三种肽是根据本文提供的结构定义的干扰物分子。表13中列出的所有肽都是加倍生物素化的(在N末端和C末端两者上)，并且通过Ttds-接头连接至干扰物肽。

表13：在竞争PepBlot平台中用于研究守门者对β-Gal检测特异性的影响的3种不同干扰物肽的列表。

^&干扰物肽在C末端(由～b指示)和N末端(b～)上均由Ttds接头连接至生物素。注意，Tango序列在每种肽中加有下划线。

我们测试肽在竞争PepBlot平台中与β-gal选择性结合的性能，其中在一个泳道中采取7%临床血清而在另一个泳道中为完全大肠杆菌裂解产物中的β-Gal。在100%DMSO中制备每种生物素化肽各自的贮存液(10μM)。肽贮存液在10mM MES缓冲液、100mM海藻糖、0.05%Tween20，pH5.5中稀释(1/400)，以获得25nM的肽终浓度。新鲜制备的肽溶液被立即加入膜试条中，并且在室温下轻轻搅动。在15分钟后，倾析肽溶液并且将膜试条用10mM MES缓冲液、0.05%Tween20，pH5.5洗涤3x10分钟，并且进一步如本文以前描述的加工。

图42显示，守门残基对基于干扰物肽的PepBlot检测的特异性的影响。所有三种肽都与β-gal结合，但最佳探针是具有互补荷电守门者的干扰物肽。这种肽显示与其他两种肽相比较与β-gal的强相互作用，并且不与血清中的蛋白质交叉反应。电荷互补性连同Tango序列的β-片层倾向促成有利的分子间结合，其看起来是高度特异性的。另一方面，如由临床血清中的非特异性条带而证实，具有天然侧翼的肽展示低特异性。这些数据提示，守门者不一定是干扰物肽与靶蛋白质相互作用所必需的——如同在WO2007/071789中所证实的。然而，检测可以通过设计具有互补侧翼残基的肽而进行细调，以实现高特异性，所述互补侧翼残基可以包括极性氨基酸例如R、D、E、K、H和β-片层破坏者P。

4.2.用表面等离振子共振研究的干扰物-靶相互作用

在该体外实验中，借助于表面等离振子共振(SPR)测量不同干扰物肽与β-gal结合的亲和力。SPR实验在25℃下使用配备CM5传感器芯片的BiacoreT100(GE Healthcare.)执行。偶联试剂(N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和乙醇胺-HCl)购自GE Healthcare。BSA和β-gal分别购自Sigma-Aldrich和RocheDiagnostics。肽在JPT，GmbH合成，并且具有>95%纯度。蛋白质BSA和β-Gal分别通过标准胺偶联化学以10μl分钟^-1的流速固定在CM5传感器芯片上的参考和样品通道中。羧甲基葡聚糖表面通过注射1:1的EDC和NHS进行7分钟活化。蛋白质在10mM乙酸钠缓冲液，pH4.5中稀释至0.2mg ml^-1的终浓度，并且以短脉冲注射到活化的表面上，直至固定化水平对于BSA和β-Gal分别达到4000RU或8000RU。剩余反应基团用1M乙醇胺，pH8封闭。在偶联完成后，表面用50mMNaOH和8M尿素的短脉冲再生，以去除非共价附着的蛋白质。在再生后的固定化水平在参考和样品通道中均一般在3500RU-4000RU之间。通过在25℃将加上六组氨酸标签的肽注射到参考(BSA)和样品(β-Gal)表面上，研究几种干扰物(关于干扰物的序列，参见表14)结合β-Gal的亲和力：Tango区1、Tango区2、脱靶、Tango区2突变体、和Tango区2肽的串联重复。以1_μM的浓度溶解于运行缓冲液(10mM磷酸钠，pH6.8，150mM NaCl、3mM EDTA和0.015%Tween20)中的肽以30μl分钟^-1的流速注射60秒，并且随后允许解离600秒。注射在相同表面上以及在独立固定的表面上重复。表面在每个循环之间通过下述的30秒脉冲再生：i)50mMNaOH，和ii)8M尿素，并且允许在下一个循环前稳定400秒。

表14：在SPR分析和体外聚集动力学中使用的不同干扰物肽的序列。

#肽在N末端中由另外的氨基酸‘APAA’（SEQ ID NO：77）接头连接至His-标签。

^&显示具有其天然侧翼残基的野生型序列。

在25℃下研究β-gal和Tango2肽（HHHHHHAPAARVIIWSLGNR（SEQ ID NO：54））的共聚集动力学。将溶解于运行缓冲液中的肽以一系列浓度（0–4μM，具有一个内部重复）以30μl分钟^-1的流速注射到参考（BSA）和样品（β-Gal）表面上60秒，并且随后允许解离600秒。浓度系列在相同表面上（三次）以及在独立固定的表面上重复。表面在每个循环之间通过下述的30秒脉冲再生：i）50mM NaOH，和ii）8M尿素，并且允许在下一个循环前稳定400秒。

所有传感图都是扣除双参考的（Myszka，D.G.等人J.Mol.Recognit.12：279-284，1999），其中i）扣除在参考表面上观察到的应答，和ii）扣除对于缓冲液注射观察到的应答，后者为了去除系统假象。数据总体拟合至三态模型，其中使用Biacore T100软件，假定：在溶液中的肽和在芯片上的蛋白质之间的最初相遇后，在相同结合位点在成长的β-片层上变得可得前，为两步重排。

得自SPR分析的数据汇编显示于图43-46中。

β-Gal蛋白质通过胺偶联固定在传感器芯片上，其可能阻碍在N末端附近的Tango区1（残基7-12）的可接近性。可能在SPR中观察到的Tango肽1与β-Gal的弱结合亲和力是由于加在固定状态的蛋白质上与肽相互作用的限制性。然而，在体外Tango1肽显示出与Tango2相当的与溶液中的游离β-Gal的较高亲和力，这与Tango算法预测一致。

传感图显示于图45中，其中作为分析物（Tango2肽）浓度的函数描述仪器应答单位（RU）的变化。1:1化学计量学计算的RU_max是～80RU，然而，我们的数据超过该值，并且即使在更高浓度和延长接触时间（>10分钟）下也未实现稳定。这是因为在肽与β-Gal结合后，产生新结合位点，允许在传感器芯片表面上聚集体生长。为了建模聚集体生长，发现简单的1态或2态动力学是不足够的。动力学数据使用涉及3-态模型的多级方法，最佳表示。根据该模型，肽可逆地对接至靶，随后为构象转变，其锁定在接受后续肽的位置中，后续肽与第一个肽结合且封闭该结合位点。该模型先前已报道，用于描述在SPR芯片上淀粉样蛋白纤丝的延长。对于该3-步机制，计算的k_a和k_d是：k_a1=2.744E+4，k_a2=0.02359，k_a3=0.005491，并且k_d1=0.4123，k_d2=0.02509，k_d3=0.002654。由于模型的复杂性，我们不能计算平衡结合常数K_a和平衡解离常数K_d。如果串联重复肽（n=2并且两个Y部分是相同的）用作分析物，则动力学变得甚至更复杂（参见图46）。在该分子中，所有X部分都是单个R残基，并且Z1接头是GSGSAPAA（SEQ ID NO：90）（参照表14）。

4.3体外聚集动力学的测定

基于在室温下由聚集体颗粒的生长引起340nm处光密度（OD）的表观变化，通过光散射，监控Tango1肽、Tango2肽和Tango2肽的串联重复在体外与β-Gal的共聚集。通过在20mM磷酸钠缓冲液，pH6.8中加入等摩尔浓度（10μM）的Tango1肽、Tango2肽、或Tango2肽的串联重复和β-Gal，随后在50rpm下轻轻搅拌样品，起始干扰物-β-Gal共聚集。干扰物的序列在表14中描述。

为了表征聚集体的大小，在时间零时和在与Tango1肽、Tango2肽、或Tango2肽的串联重复共温育2小时后，使用动态光散射（DLS），DynaPro DLS（Wyatt Technology Europe，德国），测量β-Gal的流体力学半径（RH）。

图47显示，与Tango2肽相比较，具有更高得分的Tango1肽在体外显示出与溶液中的游离β-Gal更快速的共聚集动力学。当Tango2肽的串联重复加入β-Gal时，观察到快速的共聚集动力学，并且与单个Tango2肽相比较，在2小时后形成的聚集体的尺寸更大（图48）。

为了评估单个Tango2肽起始β-Gal共聚集的限制，在20mM磷酸盐缓冲液pH6.8中制备具有1:0、1:0.2、1:0.5和1:1的β-Gal与肽摩尔比的一系列样品。β-Gal的浓度保持恒定在10μM，而肽量是2μM、5μM和10μM。干扰物-β-Gal共聚集通过在50rpm下轻轻搅拌样品而起始。

光散射和DLS实验显示，亚化学计量浓度的肽足以诱导β-Gal的聚集（参见图49）。由此形成的可见聚集体在8M尿素或6M GdHCl中不可溶。

4.4.β-gal酶功能敲除

为了研究Tango2肽干扰物对β-Gal的酶功能的作用，在与这种肽温育前和后测定催化活性。使用底物荧光素-二-β-D-半乳糖吡喃糖苷（FDG）执行酶功能读出，所述FDG是非荧光的、但通过β-Gal的酶促切割后荧光被释放，其强度与催化活性成比例。图50显示渐增浓度的Tango2肽干扰物对β-半乳糖苷酶的酶促活性的影响。明显地，等摩尔浓度的酶和干扰物导致酶促活性的完全抑制（或换言之，通过完全共聚集导致功能敲除）。

4.5.分离的β-gal-Tango2肽干扰物共聚集体的结构

在共温育2小时后分离不溶性β-gal-Tango2肽干扰物共聚集体。将分离的聚集体用20mM磷酸钠缓冲液，pH6.8反复洗涤，直至上清液显示在280nm处可忽略不计的吸光度，并且悬浮于缓冲液中用于结构表征，其中使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱学、圆二色性（CD）和电子显微镜（EM）。

天然β-gal的FTIR光谱显示在1638cm^-1处的酰胺I峰（富β-片层的二级结构元件所特征性的），其在与Tango2肽干扰物共聚集后由于分子间β-片层形成而迁移至1628cm^-1（图51）。天然β-gal溶液的CD光谱展示α+β结构种类的特点，而具有～218nm负峰的共聚集体悬浮液光谱提示天然蛋白质结构的完全丧失和转变为聚集的β-片层（图52）。最后，分离的β-gal-Tango2肽干扰物共聚集体的EM说明形成的聚集体在性质上是无定形的（并且因此不是生淀粉样的）（图53）。

4.6.干扰物的诊断应用：在血清中的三种不同蛋白质生物标记的检测

在下述实施例中，我们证实干扰物用于诊断应用的用途的可行性。为此，选择三种医学相关生物标记作为例子用于在人血清中检测：1）前列腺特异性抗原（PSA），关于其的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中描述，2）C反应蛋白（CRP），关于其的氨基酸序列在SEQ ID NO：5中描述，和3）β-2-微球蛋白（β-2M），关于其的氨基酸序列在SEQ ID NO：6中描述。显示不含其信号肽的序列。注意，用于设计特异性干扰物的Tango区在各氨基酸序列中有下划线。生物标记特异性干扰物的序列在表15中描述。

SEQ ID NO：4：前列腺特异性抗原（PSA）的氨基酸序列

IVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSCSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP

SEQ ID NO：5：C反应蛋白（CRP）的氨基酸序列

QTDMSRKAFVFPKESDTSYVSLKAPLTKPLKAFrUCLHFYTELSSTRGYSIFSYATKRQDNEILIFWSKDIGYSFrUGGSElLFEVPEVTVAPVHICTSWESASGIVEFWVDGKPRVRKSLKKGYTVGAEASIILGQEQDSFGGNFEGSQSLVGDIGNVN

MWDFVLSPDEINTIYLGGPFSPNVLNWRALKYEVQGEVFTKPQLWP

SEQ ID NO：6：β-2-微球蛋白（β-2M）的氨基酸序列

IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRM表15：用于血清中三种不同蛋白质生物标记的PepBlot检测的特异性干扰物序列的列表。串联重复PSA肽通过Ttds-APAA（SEQ ID NO：77）接头连接至生物素。

^&显示具有其天然侧翼残基的野生型序列。

用于检测蛋白质生物标记的膜如下制备。向21μl5%人血清（Lonza）中加入50pmol靶蛋白质生物标记（分别为1.55ng PSA、1.25ng CRP和0.6ngβ-2M），并且将这与含和不含DTT（Fermentas）的5μl5x SDS上样缓冲液混合，并且在82℃下加热3分钟。将26μl含有PSA或CRP或β-2M的这种混合物装载到10孔NuPage4-12%Bis-Tris凝胶中，并且在变性或非变性条件下分离蛋白质。随后将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并且用在PBS-T中的1%BSA在4℃封闭过夜。

4.6.1掺在人血清中的PSA的PepBlot和WB检测

在100%DMSO中制备PSA特异性生物素化肽（关于序列，参见表15）的贮存液（10μM）。肽贮存液在25mM MES缓冲液、100mM海藻糖、0.02%Tween20，pH5.0中稀释（1/40），因此获得250nM的肽终浓度。将新鲜制备的肽溶液立即加入膜试条中，并且在室温下轻轻搅动。在1小时后，倾析肽溶液并且将膜用25mM MES缓冲液、0.05%Tween20，pH5.0洗涤4x10分钟。随后，使膜与生物素亲和试剂（1:100,000稀释度）SRP–HRP缀合物一起在PBS-T中在室温下温育1小时。这随后为用PBS-T的3x10分钟洗涤，并且最后在去离子水中冲洗10分钟。对于掺在人血清中的PSA的WB检测，使膜与对于PSA的c末端肽具有特异性的（1:5000）兔单克隆抗PSA抗体（EP1588Y，Abcam）一起温育。这随后为用（1:30,000）缀合至HRP的山羊多克隆抗兔抗体染色。使膜暴露于化学发光HRP底物试剂（SuperSignal West Femto Maximum SensitivitySubstrate，Thermo Fisher Scientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现靶蛋白质。

图54显示，在PSA的干扰物肽b～RQWVLTAAR（SEQ ID NO：85）检测（小图A）和抗体检测（小图B）之间的比较。PSA的WB检测已显示，依赖凝胶运行条件，展示多个条带。在非还原变性条件下，观察到两个条带，并且在还原条件下（未显示）由于内部切割而出现多个片段（Wang，T.J.等人，Tumor Biol.20：79–85，1999）。

4.6.2掺在人血清中的CRP的PepBlot和WB检测

在100%DMSO中制备生物素化肽的贮存液（10μM）。肽贮存液在25mM MES缓冲液、100mM海藻糖、0.02%Tween20，pH5.0中稀释（1/40），因此获得250nM的肽终浓度。将新鲜制备的肽溶液立即加入膜试条中，并且在室温下轻轻搅动。在60分钟后，倾析肽溶液并且将膜用25mM MES缓冲液、0.05%Tween20，pH5.0洗涤4x10分钟。随后，使膜与生物素亲和试剂（1:30,000稀释度）——缀合至HRP的Neutravidin——一起在PBS-T中在室温下温育1小时。这随后为用PBS-T的3x10分钟洗涤，并且最后在去离子水中冲洗10分钟。掺在人血清中的CRP的WB检测通过如下进行：温育（1:2000）兔单克隆抗CRP抗体（Abcam）1小时。随后用缀合至HRP的山羊（1:30,000）多克隆抗兔抗体染色。使膜暴露于化学发光HRP底物试剂（SuperSignalWest Femto Maximum Sensitivity Substrate，Thermo Fisher Scientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现靶蛋白质。印迹显示于图55中。

4.6.3掺在人血清中的β-2M的PepBlot和WB检测

在100%DMSO中制备对于β-2M特异性的生物素化肽干扰物（关于序列参见表15）的贮存液（10μM）。肽贮存液在25mM MES缓冲液、100mM海藻糖、0.02%Tween20，pH5.0中稀释（1/40），以获得250nM的肽干扰物终浓度。将新鲜制备的肽干扰物溶液立即加入膜试条中，并且在室温下轻轻搅动。在30分钟后，倾析肽干扰物溶液并且将膜用25mM MES缓冲液、0.05%Tween20，pH5.0洗涤4x10分钟。随后，使膜与生物素亲和试剂（1:100,000稀释度）SRP–HRP缀合物一起在PBS-T中在室温下温育1小时。这随后为用PBS-T的3x10分钟洗涤，并且最后在去离子水中冲洗10分钟。

为了通过WB检测掺在人血清中的β-2M，使膜与（1:5000）兔单克隆抗β-2M抗体（Abcam）一起温育1小时，并且用（1:30,000）缀合至HRP的山羊抗兔二级抗体染色。随后使膜试条暴露于化学发光HRP底物试剂（SuperSignal West Femto Maximum SensitivitySubstrate，Thermo Fisher Scientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现靶蛋白质。该分析的结果显示于图56中。

4.6.4在非掺料的复杂人样品中检测CRP和PSA

为了探究本方法是否还可以应用于在临床情形中的定量检测，以检测天然分泌或渗漏的蛋白质，使用与大肠杆菌裂解物具有不同的起源、组成和复杂性的蛋白质组，我们设计了测定试验，以在相关复杂样品中检测人蛋白质生物标记，即人血清中的CRP和精浆中的PSA。CRP是广泛使用的炎症生物标记，这使得我们得到丰富来源的临床血清样品，关于这些样品，可获得基于独立的免疫比浊法测定试验的CRP测定结果。

对于血清中的CRP检测，选择对于CRP独特的探测肽b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）。使用含有低（1μg ml^-1）和高（317μg ml^-1）CRP的两个患者的临床样品，执行血清中的CRP检测。将血清样品在MilliQ水中稀释至7%，并且与5x SDS上样缓冲液混合，在82℃加热5分钟。变性蛋白质在4-12%Bis-Tris凝胶上电泳，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，并且用在磷酸盐缓冲盐水，pH7.4和0.05%tween20（PBS-T）中的1%BSA封闭。使膜在25℃下与在10mM MES缓冲液pH5.1、100mM海藻糖、0.05%Tween20和2.5%DMSO中配制的250nM b～RILIFWSR（SEQ ID NO：86）肽一起搅拌1小时。在用10mM MES缓冲液pH5.1、0.05%Tween20冲洗后，将膜用SRP-HRP缀合物染色，并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现。

使用兔单克隆抗CRP抗体（1:2000）在轻轻搅拌下实现CRP的免疫印迹检测。在1小时后，将膜用PBS-T冲洗，用缀合至HRP的山羊多克隆抗兔抗体（Promega）染色1小时，并且随后暴露于化学发光试剂（SuperSignal West femto最大敏感性底物，Thermo FisherScientific），并且使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像系统显现蛋白质。结果显示于图57中。

我们随后继续评估我们的探测肽检测临床血清样品中的CRP的诊断效用。根据标准方案加工20名患者的血样（Universiteit Ziekenhuis，Leuven），分离血清，以采用免疫比浊法测定试验和PepBlot、用标准实验室诊断学分析CRP。通过基于免疫比浊法的方法使用偶联至单克隆小鼠抗CRP抗体的乳胶颗粒，测量CRP的浓度。该测试在Hitachi/RocheModular P系统（Roche Diagnostic）上执行。

显示于图58中的20个临床样品的PepBlot分析揭示，对应于CRP分子量的充分确定条带的特异性染色。这些条带强度的定量与在相同样品上独立执行的标准临床免疫比浊法测定的数据良好媲美。

接下来，我们设计用于检测PSA的PepBlot测定，所述PSA是蛋白酶的组织激肽释放酶家族成员，其在前列腺中合成，分泌在精液中并且用作前列腺癌的生物标记。我们合成肽，靶向通过Tango预测的序列W₁₄QVLVAS₂₀和序列Q₃₄WVLTAA₄₀（参照表15）。

收集来自男性志愿者的精液，并且允许在室温液化。在2小时后，将精液以10,000xg离心15分钟，以从精细胞中分离精浆。使用描述用于血清电泳的方案，10%精浆样品使用变性凝胶电泳在非还原条件下分级分离，随后转移至PVDF膜并且封闭。膜的泳道在25℃下分别与250nM肽b～RWQVLASD（SEQ ID NO：88）或肽b～RQWVLTAAR（SEQ ID NO：85）或250pM串联重复肽b～RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR（SEQ ID NO：89）一起搅拌1小时，其中所述肽配制在10mM MES缓冲液pH5.1，100mM海藻糖、0.05%Tween20和2.5%DMSO中。将膜在10mM MES缓冲液pH5.1、0.05%tween20中冲洗，并且用HRP缀合的SRP染色并且用ECL系统显现。平行地，在精浆中的PSA的WB检测通过使膜与对于PSA的c末端肽特异性的（1:5000）兔单克隆抗PSA抗体（EP1588Y，Abcam）一起温育来执行。这随后为用缀合至HRP的山羊多克隆抗兔抗体染色，并且使用ECL系统显现。

如图59A中可见的，肽（b～RWQVLASD（SEQ ID NO：88）和b～RQWVLTAAR（SEQ ID NO：85））在约30kDa表观分子量处的蛋白质条带上累积，所述蛋白质条带通过对于PSA的C末端序列特异性的单克隆抗体得以鉴定。两种肽都可以检测PSA至与抗体相当的水平。注意，选择WQVLAS肽的D守门者，以提供与蛋白质序列中的侧翼残基互补的电荷。有意义的是，强条带信号可以使用足够低浓度（250pM）的串联重复（n=2，并且两个Y部分是相同的）干扰物肽b～RQWVLTAARGSGSAPAARQWVLTAAR（SEQ ID NO：89）作为探针来实现（图59B）。在该分子中，所有X部分都是单个R残基，并且Z1接头是GSGSAPAA（SEQ ID NO：90）。该结果说明，生物标记检测可以使用重复聚集序列（即其中n至少为2，并且其中至少两个Yi彼此相同并与蛋白质中的区域相同）得到加强，并且探针可以进一步在溶液中稀释。作为进一步证实，我们通过胰蛋白酶消化和质谱法分析进行N末端测序，其证实PSA为该条带的主要组分。

4.6.5在人血清中检测细胞因子白细胞介素1-β（IL1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）

将各5μg细胞因子白细胞介素1-β（IL1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）分别掺到5%人血清中，并且通过电泳使用4-12%Bis-Tris凝胶分离，转移至PVDF膜，并且用在PBS-T中的1%BSA封闭。作为对照，与该血清样品相邻的一个泳道含有单独的5μg IL1β或5μg TNFα。

使用肽（b～RQQVVFSMSFVQD（SEQ ID NO：184）和b～KQQVVFSMSFVQD（SEQ ID NO：185））检测IL1β。在DMSO中分别制备肽的10μM贮存液，并且在配制缓冲液（10mM MES、100mM海藻糖、0.05%Tween20，pH7.4）中稀释。使膜在25℃下与肽制剂一起轻轻搅拌1小时。在10mMMES、0.05%Tween20，pH7.4缓冲液中四次冲洗后，将膜用缀合至HRP的生物素亲和试剂SRP染色。该PepBlot检测的结果呈现于图60中。

对于TNFα检测，10μM肽（b～RGLYLIYSQVLFP（SEQ ID NO：186），b～RGLYLIYSQVLFH（SEQ ID NO：187））分别在配制缓冲液（10mM MES、100mM海藻糖、0.05%Tween20，pH6.5）中稀释，并且在25℃下与膜一起轻轻搅拌1小时。在10mM MES、0.05%Tween20，pH6.5缓冲液中四次冲洗后，将膜用缀合至HRP的生物素亲和试剂SRP染色。使用干扰物肽的TNFα检测的PepBlot数据显示于图61中。

4.7使用ELISA的蛋白质定量检测

为了探究本技术在更多的诊断技术中的应用，我们在定量平台如ELISA中并入选择性蛋白质标记的靶向聚集。在这种方法中，在微量滴定板中在复合培养基中研究肽探针检测目的蛋白质标记的选择性和灵敏度。首先，我们滴定了非诱导的大肠杆菌裂解产物中的β-gal，并且在96孔微量滴定板上捕获全细胞裂解产物。捕获的蛋白质随后用针对β-Gal生成的串联重复肽b～RVIIWSLGNRGSGSAPAARVIIWSLGNR（SEQ ID NO：91）探测。（串联重复意指n=2，并且两个Y部分是相同的（此处VIIWSLGN（SEQ ID NO：76））。在该分子中，所有X部分都是单个R残基，并且Z1接头是GSGSAPAA（SEQ ID NO：90））。SRP缀合的HRP充当二级试剂，并且信号通过比浊测定在450nm处检测。我们的结果显示与全细胞裂解产物中的β-Gal浓度良好关联，如图62中所示。（注意，该数据类似于实施例2中所示的斑点印迹测定中的ClpC蛋白质检测（图30））。

4.8使用ForteBio Octet传感器的蛋白质定量检测

作为可替代方法，尝试无标记测定试验设置，其中使用Bio-LayerInterferometry（BLI）技术（Octet，ForteBio），其中针对β-Gal和CRP生成的串联重复探测肽被固定在传感器探针上。溶解于含有0.015%Tween 20和3mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水pH6.8中的重组蛋白质生物标记（β-gal和CRP）被滴定到微孔板内，并且随后使用Octet仪器（ForteBio）直接读出与靶肽的相互作用。传感器的高灵敏度意味着，可以检测皮摩尔浓度的分析物。这些结果（对于β-Gal和CRP分别显示于图63和64中）说明，基于肽的测定试验具有在临床诊断学中实施生物标记（包括人生物标记）的定量检测的潜力，其可以容易地并入现有技术平台内。

4.9用于检测蛋白质的肽微阵列

类似于在实施例4.8中干扰物在传感器探针上的涂布，初始实验显示，本文描述的干扰物肽可以共价固定到纤维素膜上，并且用于蛋白质检测（基于PepSpot^TM平台（JPT，GmbH）的测定。这允许同时检测多种蛋白质（超过50种探针一起使用；数据未显示）。

为了评估这些肽是否还可以用于其他微阵列形式中，执行初步试验，以通过使用PepStar^TM肽微阵列（JPT、GmbH），设计在玻璃载玻片上的肽微阵列。针对十种不同靶，设计了肽；这些肽包括Hit1、Hit57（参见实施例2），针对β-Gal、p53、p16、CS（柠檬酸合酶）、CRP、PSA、SEGN（Secretagogin）和A2MG（α-2-巨球蛋白）的肽。将肽合成，且用5个不同针大小：62.5μm、165μm、265μm、335μm和400μm，点（500μmol）在玻璃载玻片上。在阵列中包括一式三份的生物素点（62.5μm）以及每种针大小，作为标记。

测试肽的不同变异：由天然守门残基侧接的肽（即含有Yi部分的短蛋白质片段），在两个侧面上侧接Arg守门者的Yi部分（即n=1，X₁=X₂=R），和具有带Arg守门者的串联重复的肽（即n=2，所有X部分都等于R，Y₁=Y₂）。此外，使用两个不同接头长度，将‘单’肽–仅具有一个Y部分的那些肽–连接至玻璃载玻片。每个玻璃载玻片具有肽的3个重复。

所有肽概述在表16中。对于天然侧翼肽，短接头由序列GS组成（随后为一个或两个残基和之后的Yi部分）。长接头是GSPGSPGS（SEQ ID NO：188）。对于单干扰物肽，短接头由序列GSA组成（随后为一个R残基，第一个守门者），并且长接头是GSPGSPGSA（SEQ ID NO：189）。对于串联重复肽，GA或GAS用作接头。

在温育前将含有317μg ml^-1CRP的患者血清样品在PBS-T中稀释至10%。将300μl10%血清吸取到载玻片上，随后用玻璃片（glass slip）覆盖且在37℃下温育1小时。将载玻片在PBS-T中洗涤3x10分钟，并且与1:1000稀释的兔单克隆抗CRP抗体（Abcam）一起温育1小时，随后与由DyLight488标记的1:1000山羊抗兔抗体（Thermo）温育。为了显现生物素标记，包括另外步骤，其中使载玻片与缀合至DyLight594的SRP一起温育。使用GenePix4400（Molecular devices）扫描仪，在488nm和594nm通道，扫描载玻片。

表16.用于检测人血清中的CRP的点在肽微阵列上的肽列表。

关于具有长接头的‘R’侧接肽和‘R’侧接串联肽的结果显示于图65中。

即使这仅是初步实验并且它需要进一步优化，但结果是鼓舞人心的。如预期的，针对最低浓度的CRP的结果是不能作出结论的（数据未显示）。然而，对于较高浓度的CRP，相对显示最高信噪比的肽是CRP单干扰物肽和CRP串联重复肽。此外，这些也是每个微阵列载玻片各自的最高信号，并且两个信号都具有超过2.5的信噪比。

使用天然序列看起来不导致有效的CRP检测。不束缚于特定机制，这可能至少部分是由于下述导致：侧接CRP聚集部分的天然序列含有相反电荷（N末端的负E残基，C末端的正K残基）。在此情况下，可能更佳的是，在守门者中提供电荷互补，以避免相同电荷的排斥和通过相反电荷吸引（换言之，以避免肽由于电荷将它们推向相反方向而不能适当地对齐）。

认为进一步优化（例如其他接头、守门残基的变异、配制、载玻片的预处理、动力学、温度和其他方案变量）将获得甚至更佳的结果，指示干扰物肽可以用于微阵列形式中，以检测复杂样品例如临床血清中的多重分析物。

5.非感染性医学应用

5.1生长激素受体的靶向聚集

5.1.1前言

受体酪氨酸激酶（RTK）超家族是癌症药物开发的关键靶（Zhang等人，Nat RevCancer2009；9（1）:28）。目前抗癌治疗主要靶向激酶，例如表皮生长因子受体成员，其通常也同样具有抗血管生成效应。然而，鉴定对于这些分子各自具有特异性的抑制剂，通常仍是一个让人望而却步的任务。

因此，我们旨在使用本文描述的分子靶向RTKs。通过筛选设计为特异性诱导聚集的一组肽，鉴定针对EGFR和VEGFR2的几种新型肽，其能够抑制通过这些受体的功能性信号传导。

血管内皮生长因子（VEGF）是尤其在血管生成中涉及的重要信号传导蛋白质。存在VEGF受体的三个主要亚型，编号1、2和3。在这些中，VEGFR-2（也称为KDR或Flk-1）看起来介导大多数已知的针对VEGF的细胞应答。在VEGF与VEGFR-2结合后活化的途径之一是ERK途径，导致Erk1/2的磷酸化。考虑到血管生成在癌症中的重要性，不同VEGFR-2抑制剂目前就其作为抗癌药物的潜力正在进行测试（例如Guo等人，Biochim Biophys Acta.2010；1806（1）:108-21；Subramanian等人，Clin Lung Cancer.2010；11（5）:311-9；ramucirumab：Spratlin，Curr Oncol Rep.2011；13（2）:97-102；vandetanib：Morabito等人，Drugs Today（Barc）.2010；46（9）:683-98）。此外，抗VEGFR2化合物也显示有希望通过阻遏脉络膜新生血管化而治疗年龄相关性黄斑变性（Miao等人，Biochem Biophys Res Commun.2006；345（1）:438-45；Takahashi等人，Curr Eye Res.2008；33（11）:1002-10；Chappelow和Kaiser，Drugs.2008；68（8）:1029-36）。

表皮生长因子受体（EGFR）是ErbB家族的受体酪氨酸激酶。ErbB家族的四个成员已得到鉴定：EGFR（亦称ErbB1、HER1）、EGFR2（ErbB2或HER2）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4）。EGFR信号传导通过配体与细胞外配体结合结构域的结合而起始。蛋白质与配体的结合诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化，并且导致细胞增殖。在该基因中的突变与肺癌相关，并且该基因的扩增或过表达已显示在某些侵袭类型的乳腺癌的发病机理和进展中起重要作用。近年来，它已进化成为重要的生物标记和用于该疾病的治疗靶。例如，EGFR2是单克隆抗体曲妥珠单抗（作为赫赛汀销售）的靶。

针对这些受体的聚集肽如本文已详细描述的进行设计。它们由两个核心聚集序列（Yi部分得自蛋白质序列的聚集核）组成，侧面为D或R守门残基（编号的X部分）。在大多数情况下，Y_i部分是相同的（‘串联重复’肽），但在一些情况下，Y_i部分对应于受体中的两个不同聚集结构域。对于其中n=2的这些分子，Z₁部分是富含脯氨酸的接头，其确保两个核心结构域都可用于聚集。

5.1.2用干扰物肽的VEGFR2靶向

基于鼠VEGFR2蛋白质中（在信号肽、胞外区、跨膜区或胞质区中）的易于聚集区的出现，设计不同干扰物肽。为了测试肽干扰配体结合后VEGFR发信号的能力，执行下述测定。首先，mVEGFR2经由FuGENE转染在HEK293细胞中过表达。HEK293细胞缺乏内源VEGFR2。使细胞生长一天并且随后在溶于DMSO中的10或20μM肽（或载体对照）的存在下饥饿过夜。接下来，将细胞用25ng/ml VEGF在饥饿/肽培养基中刺激5分钟，并且通过研究ERK1/2磷酸化和总ERK1/2水平，分析经由MAP激酶磷酸化级联的下游信号传导。这通过使用蛋白质印迹或更定量的ELISA进行评估。

设计一系列肽，并且通过JPT GmbH以纳摩尔规模合成。肽靶向小鼠VEGFR2中的几个聚集区。肽的确切序列显示于表17中。将每种肽以5mM的浓度溶解于DMSO中，并且在使用后，保持在-20℃冷冻。

表17.靶向小鼠VEGFR2的肽序列。

测试首先用以微量规模合成的肽执行，其获得在处理后显著（即超过75%）减少ERK1/2磷酸化的两种肽（3次独立实验的结果，数据未显示）。重复显示对ERK磷酸化的最大影响的这些肽被重新订购为高纯度肽且在相同测定试验中再测试。为了比较不同扩大方案，肽得自两个来源：JPT GmbH，Berlin和Professor Kris Gevaert实验室（UniversityGent）。这些高纯度肽中2种的结果显示于图66中。

每种肽生产证明是同样有效的。肽B8具有序列DLAVALWFDPPDLAVALWFD（SEQ IDNO：241），肽B12具有序列DMISYAGMDPPDMISYAGMD（SEQ ID NO：249）。这些分子的结构对应于在本申请中描述的式，其中n是二，X₁至X₄是1个氨基酸（即D），Y₁是7个氨基酸，并且相同于Y₂，Z₁是二氨基酸接头（即PP），并且Z₂不存在。B8的Y部分（LAVALWF（SEQ ID NO：278））对应于VEGFR2的预测信号肽的序列的一部分，B12的Y部分（MISYAGM（SEQ ID NO：279））与VEGFR2的细胞外序列的一部分相同。注意，这两个7氨基酸序列均是在小鼠基因组中独特编码的，即7个连续氨基酸的这些区段仅在mVEGFR2中且不在其他小鼠蛋白质中出现。不束缚于特定机制，因为B8肽靶向信号肽，所以最可能抑制发生在VEGFR2蛋白质翻译后（即在信号肽被切割前），指示该肽被细胞内在化。

如图66A中所示，两种肽都几乎完全消除ERK1/2磷酸化，而不干扰总ERK1/2水平。这种效应已用5μM肽观察到。如果相对于存在的总ERK，对磷酸化的ERK的比率作图，则可以看出添加干扰物分子几乎完全消除配体诱导的VEGFR-2信号传导：该比率在未刺激细胞的范围中，并且比用相同量的VEGF但不用干扰物肽刺激的那些细胞低得多（图66B）。

为了评估所鉴定的肽的特异性，基于B8或B12肽的序列，设计一组肽，其含有另外突变——在核心聚集区中具有脯氨酸残基。使用这些‘灭活’肽，未显示ERK1/2的磷酸化的显著减少（数据未显示）。

作为下一个步骤，为了测试VEGFR2肽的特异性，我们测试了其针对EGFR家族的交叉反应性。因此，将HeLa细胞用肽B8和B12处理，并且随后用EGF（25ng/ml）刺激。在该设置中，B8和B12不抑制ERK1/2磷酸化，因为EGFR2和VEGFR2使用几乎相同的信号级联，这说明这些肽（i）对于VEGFR2是特异性的，和（ii）不直接影响一般的细胞活性或ERK1/2级联（图67）。

为了更好地了解肽抑制的细胞机制，执行初步实验，其中细胞用抗VEGFR2抗体染色，以跟踪细胞定位。如图68中可见的，在对照处理的细胞中，VEGFR2主要存在于HEK293细胞的细胞膜上。然而，在细胞用10μM肽B8过夜处理后，VEGFR2分子不再存在于细胞表面上，而是存在于极为可能含有聚集的VEGFR2的细胞内小泡中。

因此，如这些实验显示的，干扰物肽可以用于特异性靶向且抑制单个蛋白质的功能（在这点上，注意，B8的LAVALWF（SEQ ID NO：278）序列不在人基因组中编码（并且因此不存在于HEK293细胞中），并且B12的MISYAGM（SEQ ID NO：279）序列对于人中的VEGFR2是独特的（但通常在HEK293细胞中不表达））。考虑到VEGFR-2在癌症和AMD 病理学中已经确立的作用和集中于VEGFR-2抑制的临床试验，在这些疾病的治疗中，肽（如本文描述的那些）具有高潜力。因为用于B12肽的（小鼠）序列也存在于人VEGFR-2中，所以预期这种肽将显示交叉反应性，并且可以用于人治疗。

5.1.2.1在脉络膜新生血管化（CNV）模型中的VEGFR2抑制

脉络膜新生血管化（CNV）是年龄相关性黄斑变性（AMD）末期的严重病理后果之一。几条证据线表明在AMD患者的视网膜中增加水平的VEGF信号传导，并且VEGFR2的抑制已证实可以抑制CNV模型中的新生血管化。为了测试针对VEGFR2的干扰物肽是否可以在体内抑制VEGFR2功能，在新生血管化鼠模型（即激光诱导的CNV）中评估了这些肽。该模型先前已得到描述（Lambert等人，FASEB Journal；15:1021-1027，2001）。

简言之，实验设置如下：

在第1天时在C57/Bl6小鼠的右眼中施用3个激光烧伤。在第1天和第3天时，1μlDMSO（阴性对照）、B8-FITC或B12-FITC（用异硫氰酸荧光素标记的干扰物肽）或DC101（抗VEGFR-2mAb，Fischer等人，Cell，131：463–475，2007）。干扰物肽作为在DMSO中的5mM溶液提供，在注射前进行超声处理。在第5天时，眼用TRITC-葡聚糖灌流，将小鼠人道处死且解剖，随后进行视网膜铺片。获得照片且测定在损伤总面积上的血管%。结果显示于图69中。

如由该图可见的，在用干扰物处理后存在新生血管化的明显降低。该效应不如DC101的大，但DC101是十分成熟表征的抗体，而该肽仍未优化。该实验可以历经14天时程重复，可以使用重复的施用——因为这允许更佳地区分实际新生血管化和炎症应答。

5.1.3用干扰物肽的EGFR2靶向

EGFR2肽设计为靶向人EGFR2受体。因此，对于这些测定，最初使用HeLa细胞，因为这些细胞内源表达EGFR1和EGFR2。在用EGF（25ng/ml）刺激后，也诱导ERK1/2的磷酸化，这使得可以使用如针对VEGFR2描述的相同测定试验。

关于EGFR2，设计一系列肽且通过JPT以纳摩尔规模合成，各靶向人EGFR2（ErbB2或HER2）中的几个聚集区带。肽的确切序列显示于表18中。将每种肽以5mM的浓度溶解于DMSO中，并且在使用后，保持在-20℃下冷冻。

表18.靶向人EGFR2的肽序列

对于EGFR2，执行与VEGFR2相似的筛选。然而，代替使用耗时的蛋白质印迹方法，使用ELISA方案，其可以检测磷酸-和总ERK1/2。鉴定显著且重现地减少EGF信号传导的3种肽：RWGLLLALRPPR WGLLLALR(SEQ ID NO：93)(命名为A5，靶向信号肽)、RTGYLYISRPPRTGYLYISR(SEQ ID NO：94)(命名为A11，靶向细胞外结构域)和RIISA VVGRPPRI ISAVVGR(SEQ ID NO：95)(命名为A12，靶向跨膜结构域)。结果显示于图70中。

抑制效应是显著的，尽管抑制是不完全的。这可能是由于HeLa细胞中如下其他EGFRs的表达所致(Masui等人，Cancer Res.1984；44(3):1002-7)，所述其他EGFRs也通过ERK磷酸化发信号但不被本发明肽靶向。

5.2抗炎应用

核因子（NF）-κB途径在免疫中具有重要作用，并且不合适的NF-κB途径活性已与许多自身免疫和炎性疾病联系。多种机制通常确保NF-κB途径活化的正确终止。在该情形下，细胞内遍在蛋白编辑蛋白质A20（也称为肿瘤坏死因子α-诱导蛋白质3或TNFAIP3）是响应多种刺激而负反馈调节NF-κB信号传导中的关键参与者。

为了估计干扰物在调节免疫应答中的潜力，决定使用干扰物肽抑制涉及NF-κB途径的蛋白质（例如A20）。

因为A20调节肿瘤坏死因子（TNF）诱导的细胞凋亡，并且近期遗传研究证实在人A20基因座中的几种突变与免疫病理学例如克罗恩氏病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和1型糖尿病之间明显相关（Vereecke等人，Trends Immunol.；30（8）:383-9，2009），所以选择该蛋白质，用于调节NF-κB途径的原理的第一个证据。

为此，测定响应TNF-α的A20诱导的动力学。将A549细胞（腺癌人肺泡基底上皮细胞系）用1000IU/ml人TNF刺激。在刺激后0、1、3、6和8小时，使用ELISA就IL-8的存在、和使用生物测定试验就IL-6的存在，检查上清液（IL-8和IL-6表达是在TNF刺激后NF-κB诱导的应答）。同时，将细胞裂解且使用蛋白质印迹在裂解产物中检测A20。

基于7TD1细胞的增殖反应，测定IL-6（Beyaert，Schulze-Osthoff，Van Roy和Fiers，Cytokine1991）。简言之，将A549细胞用TNF处理所示时间，获得上清液且用于处理7TD1细胞，所述7TD1细胞依赖IL-6进行增殖。作为标准，使用已知数量的重组IL-6；通过比较增殖，可以外推IL-6的数量。

结果显示于图71中。

IL-8的诱导在刺激后6小时达到峰值，在该时间IL-6也明显被诱导。因此，为了测试A20干扰物对A20表达和NF-κB信号传导的活性，使A549细胞与20μM A20干扰物（溶解于DMSO中，在无血清培养中稀释以仅含2%DMSO）一起预温育20小时。在用1000IU/ml TNF刺激6小时后，执行相同的IL-8ELISA、IL-6生物测定试验和A20WB。

所有测试的肽都具有相同通式X1-Y-X2-Z1-X3-Y2-X4（即n=2，不具有外部接头），其中X部分是单个R残基。肽显示于表19中。

表19.A20干扰物的序列。

ELISA测定试验（2次独立实验）的结果显示于图72中。如由该图可见的，几乎所有干扰物都成功地显著增加了TNF刺激后的IL-8水平——NF-κB信号传导活性的量度。因为A20是细胞质蛋白质，所以干扰物肽需要进入细胞以能够抑制该途径。当测试其中X部分都是单个D残基的相同干扰物时，获得类似但较不显著的结果（未显示）。蛋白质印迹显示A20蛋白质水平的降低，但这较难以定量且需要进一步优化（数据未显示）。代表性IL-6生物测定试验的结果显示于图73中，并且这些非常类似于用IL-8测定试验获得的结果。

这些结果显示影响通过NF-κB途径调节的免疫应答的可行性。在下一个步骤中，针对TNF设计的肽将用于评估TNF诱导的信号的抑制。将测试的干扰物肽的例子是RGLYLIYSQVLFDPPRGLYLIYSQVLFD（SEQ ID NO：317）、RGLYLIYSQVLFRPPRGLYLIYSQVLFR（SEQID NO：318）、RGLYLIYSQVLFPPPRGLYLIYSQVLFP（SEQ ID NO：319）和RGLYLIYSQVLFHPPRGLYLIYSQVLFH（SEQ ID NO：320）。

6.在植物中的应用

6.1前言

为了在植物中(in planta)测试该蛋白质干扰技术，已选择油菜素类固醇（BR）信号传导途径的细胞溶质参与者。BR是类固醇激素，影响参与器官生长和植物发育的许多细胞过程，包括维管分化、衰老、雄性能育性、开花、光形态发生作用、对生物和非生物胁迫的耐受性（Bajguz和Hayat（2009）Plant Physiol.Biochem47（1）：1-8）。它们还作用于作物植物的农艺学有利性状，如分蘖数、叶大小和叶角度（Morinake Y等人（2006）PlantPhysiol141（3）：924-31。例如，甾醇C-22羟化酶（控制BR激素水平的酶）的组织特异性表达可以增强稻中的籽粒灌浆（Wu CY等人（2008）Plant Cell20（8）：2130-45）。

在拟南芥(Arabidopsis)中，BR通过质膜富亮氨酸重复（LRR）受体样激酶（RLK）油菜素类固醇不敏感型1（BRI1）感知，其在BR结合后被活化，并且与BRI1相关受体激酶1（BAK1）结合，诱导后续转磷酸事件，通过所述事件，完全活化的BRI1可以进一步磷酸化BR-信号传导激酶（BSKs）。随后，磷酸化的BSKs从受体复合物中释放，并且与BRI1阻遏物1（BSU1）磷酸酶结合，推测增强其活性。活化的BSU1通过使磷酸-酪氨酸残基脱磷酸化，抑制油菜素类固醇不敏感型2（BIN2）和属于糖原合酶激酶-3（GSK3）家族的其他激酶。未磷酸化的BIN2允许活性未磷酸化的BRASSINAZOLE抗性1（BZR1）和BZR2/bri1-EMS-阻遏物1（BZR2/BES1）转录因子在细胞核中的累积。活性BZR1和BZR2/BES1与基因组DNA结合，以调节BR-靶基因表达，从而调节植物的生长和发育。

在该途径中，在BR负调节物BIN2中已鉴定到良好的推定靶，如我们预期的，通过使用蛋白质干扰技术干扰它将导致农艺学有意义的表型改变。为此，蛋白质聚集敲除效率，与通过评分生长参数（叶形状和植物高度）而观察到的表型变化关联。这些参数对作物产量具有重要的农学影响，因为已显示在稻中敲除油菜素类固醇信号传导突变体在密集种植条件下具有更高产量。

在本研究中，解决两个主要生物学问题；首先是否可以显现和评估植物中的β-聚集现象，和随后聚集诱饵对特定目的蛋白质的靶向是否可实现（通过证明其功能敲除）。

6.2.BIN2干扰物表达构建体的设计

GSK3样激酶BIN2被选择为合适的植物靶，由于其细胞溶质和细胞核定位可以允许被表达的聚集肽（即干扰物肽）靶向。我们用TANGO算法在BIN2一级氨基酸序列中鉴定了两个短氨基酸区段（参见图74a）。该算法预测这两个β-聚集倾向氨基酸序列具有高于50%的聚集倾向。这些干扰物肽（在此也称为诱饵）覆盖来自44-55aa（诱饵44）和来自249–257_aa（诱饵249）的激酶结构域中的BIN2区。由于实验原因，我们决定将研究集中于诱饵249。为了诱导BIN2聚集，在植物二元表达载体中工程化构建几个构建体，其中诱饵249在C末端上融合至eGFP荧光蛋白质。这些诱饵249表达构建体已改造为具有和不具有带正电荷的氨基酸（在此称为守门者）；包含守门者的构建体命名“诱饵249R”，并且不含这些守门者的构建体命名为“诱饵249”。制备后面一种构建体，以评估守门残基在增强表达的诱饵的细胞溶质定位中的作用。此外，已知加强聚集过程的合成序列（在此称为加强子）已通过接头序列插入诱饵和eGFP之间（具体序列在图74b中描述）。因此，“诱饵249R”构建体对应于融合至其它部分的干扰物分子，其中n=1，即具有式X₁-Y₁-X₂-Z₁。X₁和X₂都是R，Y₁是序列QLVEIIKVL（SEQ ID NO：321），Z₁是具有序列KPAGAAKPGAAG（SEQ ID NO：112）的氨基酸接头，并且该其它部分是聚集加强子序列和用于检测的GFP部分。

为了评估聚集肽的哪些生物化学特点在实现聚集体形成和特异性靶向中是更佳的，还已进一步构建诱饵249的不同变体。已生成表达诱饵249的两种构建体，其中诱饵249的侧翼为在BIN2蛋白质中天然侧接诱饵序列的5-7aa，以单拷贝（命名为诱饵249NF）或串联重复（命名为诱饵249NF_Tand）插入。在该第二组载体中，不插入聚集的加强子（参见图74c）。在这些情况下，天然侧翼残基的一部分充当守门者。因此，诱饵249NF对应于其中n=1的干扰物分子，即具有式X₁-Y₁-X₂-Z₁，其中X₁是D（侧翼ENAVD（SEQ ID NO：322）序列的最后一个氨基酸），X₂是G（侧翼GTPTREE（SEQ ID NO：323）序列的第一个氨基酸），Y₁是序列QLVEIIKVL（SEQ ID NO：321），Z₁是具有序列AGSPKGAPAAKGSGA（SEQ ID NO：324）的氨基酸接头，并且该分子通过Z₁接头融合至用于检测的GFP部分。诱饵249NF_Tand由2个单位的诱饵249NF构建（即n=2，或X₁-Y₁-X₂-Z₁-X₃-Y₂-X₄-Z₂，其中X₁=X₃，X₂=X₄，Y₁=Y₂，Z₁=Z₂，并且通过Z₂接头融合至GFP部分）。

6.3.在本氏烟草叶中通过瞬时表达而显现诱饵249聚集

最初已在瞬时表达系统中用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查了不同诱饵在植物中诱导聚集体形成的能力，其中在本氏烟草叶中经由根瘤土壤杆菌介导的浸润而过表达诱饵。观察到，在诱饵249载体中守门者的不存在强烈诱导了不溶性包含体的形成而不是细胞溶质表达（如图75a中证明的）。相反，诱饵249R诱导非常强烈的细胞溶质核周聚集，如通过比较该效应与游离GFP定位模式所清楚证实的（参见图75b,e）。检测到的信号比诱饵249更均一，并且未鉴定到包含体，说明守门残基的重要性。在本研究中使用的第二组构建体显示在两个形式中均明显存在核周聚集体，其中表达串联重复形式的诱饵的构建体（诱饵249NF_Tand）是最强的聚集构建体，如用CLSM观察到的（参见图75c,d）。在这些构建体中，看起来向诱饵序列添加的额外侧翼氨基酸（包括守门者）在实现细胞溶质聚集中起重要作用。

6.4.诱饵259在本氏烟草细胞中与BIN2靶蛋白质共定位且物理相互作用

已执行BIN2和诱饵249在本氏烟草叶中的瞬时共定位测定试验，以快速指示诱饵针对其靶的靶向和共聚集趋势。为此，将叶用根瘤土壤杆菌菌株共注射，所述菌株表达如在CLSM水平观察到的诱饵249最强聚集形式，即融合至RFP荧光蛋白质的诱饵249NF_Tand，和融合至eGFP的BIN2蛋白质。诱导诱饵249NF_Tand表达24小时，之后进行荧光显微镜检查评估。在注射后4-5天，叶的CLSM分析显示，在诱饵和靶之间的明显共定位，这通过重叠表达模式和计算的共定位Mander’s系数（具有高于0.8的值）而证明。也在荧光显微镜检中评估了共定位细胞溶质聚集体的形成（参见图76）。

在下一个步骤中，在CLSM证实诱饵-GFP蛋白质与BIN2靶之间的共定位和蛋白质聚集后，它们在瞬时表达系统中的稳定物理相互作用也通过共免疫沉淀（co-IP）实验进行评估。为了规避特异性BIN2抗体的缺乏，靶蛋白质在N末端上融合至血凝素（HA）免疫学标签。本氏烟草叶随后用由不同诱饵249-GFP表达载体转化的土壤杆菌菌株和在35S启动子的控制下表达BIN2-HA的土壤杆菌菌株共注射。测试带和不带守门者（和聚集加强子）的诱饵249以及单个和串联重复的诱饵249（无加强子）。通过抗GFP琼脂糖偶联珠拉下GFP标签的诱饵，执行co-IP实验，并且用抗HA单克隆抗体进行后续蛋白质印迹检测。使用不同的阴性对照：i）为了测试GFP与珠的非特异性结合，将游离GFP编码载体与BIN2HA共注射；ii）为了测试合成的加强子与珠的非特异性结合，已构建仅编码加强子和融合至GFP的接头序列的载体且与BIN2-HA共注射；iii）为了测试BIN2蛋白质或HA标签与珠的非特异性结合，单独注射BIN2-HA构建体；和iv）野生型植物提取物也已用作另外的阴性对照。Co-IP实验表明测试的任何形式的诱饵249与BIN2的阳性相互作用，从而强烈证实诱饵和靶可以经由特异性生物化学相互作用的形成，即交叉-β-片层介导的聚集（参见图77），而相互作用。该结果证实在共定位测定试验中观察到的结果，从而为想法——在体内系统中发生两个配偶体之间的物理相互作用——产生证据。

6.5.评估拟南芥转基因植物中的蛋白质聚集效率

在几种加GFP标签的诱饵249表达构建体的转化后，还在拟南芥转基因植物中监控聚集效率。

诱导的聚集子复合物通过在每个纯合株系中在CLSM显微镜上成像GFP荧光蛋白质，进行评估。

观察到，35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP表达系显示最强的亚细胞GFP表达模式，具有在不同幼苗组织（子叶、叶柄、下胚轴和根）中的明显核周聚集（参见图78a-d，e-h）。

相比之下，对于包含35S::诱饵249-GFP构建体的拟南芥植物，守门者的不存在损害了在拟南芥细胞中的任何细胞溶质定位聚集体的表达，导致细胞中报道蛋白质的较弱表达和圆形不溶体的形成，这同样在瞬时转化的烟草叶中观察到。与串联诱饵相比，35S::诱饵249NF-GFP表达模式较弱（参见图79a-h）。由于上述原因，构建体35S::诱饵249-GFP和35S::诱饵249NF-GFP未考虑用于进一步的功能分析。

为了在亚细胞水平研究在拟南芥细胞中35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP的定位模式，对稳定表达这些构建体的播种后（D.A.S.）8天的幼苗执行透射电子显微镜检（TEM）。选择用于进一步分析的这些株系的细胞溶质诱饵-GFP定位模式已通过免疫金标记实验加以证实。在该方法中，用抗GFP抗体标记35S::诱饵249R-GFP株系的下胚轴和根细胞，导致了诱饵的特异性亚细胞定位——主要在属于根伸长区的细胞的细胞溶质中。聚集蛋白质看起来被安排为纤丝结构和簇生凝聚物的形式，指示聚集体可以在细胞中获得不同形状（图80a-c）。高尔基体叠层无金颗粒（参见图80c），其看起来反而在膜样结构（即ER）中更丰富（图80b）。游离细胞溶质诱饵249RGFP蛋白质的存在也很少发现。对于35S::诱饵249NF_Tand-GFP，在子叶中的栅栏细胞和根伸长区细胞中注意到大量细胞溶质和核周定位，并且未检测到异常的聚集物复合物形状（图80d-e）。

通过非变性-PAGE电泳和用抗GFP单克隆抗体进行后续蛋白质印迹分析，聚集物蛋白质水平的生物化学验证已对每个拟南芥转化株系进行评估（参见图81a）。

在与抗GFP抗体免疫沉淀（IP）后，聚集体的生物化学性质已通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱学进一步分析。FT-IR光谱明确显示在1616和1680λ值处的两个吸光度峰，指示，除了其不同的亚细胞定位模式外，在35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249-GFP系中高含量的β-片层聚集体（参见图81b）。对于株系35S::诱饵249NF-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP，检测到1616和1680吸收值的较轻微增加，指示在免疫沉淀材料中含有β-片层，尽管程度低于先前分析的株系（图81c）。

6.5.1转基因拟南芥植物的表型

纯合诱饵249表达系随后在体外和土壤中就表型的出现进一步分析，所述表型显示发生BIN2的敲低。在体外垂直生长8天的35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP转基因幼苗具有比未经转化的系Col-0更长的根和下胚轴；该观察也通过用ImageJ软件定量加以证实（图82a）。实施的统计学评估指示，在Col-0和转基因系之间的统计显著性。在土壤中生长的一月龄的转基因植物也导致了比Col-0更大的个体（图82a）。35S::诱饵249-GFP和35S::诱饵249NF-GFP转基因幼苗在体外和土壤条件下均未显示与Col-0的任何表型差异，不包括在进一步分析中。

在下一个步骤中，为了提供进一步证据证明BIN2功能受其特异性聚集的影响，35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF-GFP株系就针对油菜素类固醇生物合成抑制剂brassinazole（BRZ）的抗性进行检查。作为阳性对照，使用BIN2中的三重突变敲除及其两个紧密同源物（atsk22和atsk23）（Vert G和Chory J（2006）Nature441（7089）：96-100）。我们预期，如果BIN2的功能受影响，则将导致植物至少部分抵抗brassinazole（请注意，三重突变体（Vert G和Chory J（2006）Nature441（7089）：96-100）对brassinazole是抗性的）。我们事实上证实，转基因系显示对抑制剂brassinazole的部分抗性，如就下胚轴长度而言定量的（参见图82b）。

6.5.2转基因拟南芥植物中的基因表达变化

在对BRs相关DWF4和CPD基因表达的定量实时PCR（qRT-PCR）分析中，我们证实在两个聚集物株系中降低的DWF4表达水平。在CPD基因表达的情况下，仅对于35S:诱饵249NF_Tand:GFP观察到效应，指示反馈抑制以及因此活化的BRs信号传导（参见图83a）。相应地，对来自NAC家族的BR响应转录因子的相对表达水平的分析显示对于35S:诱饵249NF_Tand:GFP构建体的轻微增加的表达（参见图83a）。

除了BR相关基因外，还监控在转基因拟南芥系中35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP表达在伴侣蛋白表达诱导中的效应。有意义的是，两个聚集物株系，但特别是表达串联重复的诱饵249（35S::诱饵249NF_Tand-GFP）的转基因植物，显示HSP70、HSP90-1、HSP101、HSC70-1、HSC70-2和HSC70-3基因的更高（诱导）表达水平（参见图83b）。

6.5.3转基因拟南芥植物的形态评估

此外，进行转基因株系在透射电子显微镜检查（TEM）水平的形态评估，以监控聚集物构建体在亚细胞水平的可能细胞毒性效应。使用这种方法，在35S::诱饵249R-GFP系的不同组织中未能观察到细胞和亚细胞细胞器的大小和形状的异常改变（参见图84）。偶而地，在转基因系的叶绿体中发现更大量的质体小球。后一现象通常指示胁迫，在本情况下，所述胁迫也可能由在尼龙网目上的体外生长条件引起。TEM评估也对表达不含聚集加强子的串联重复诱饵249的纯合系执行。

为了评估靶蛋白质和诱饵在稳定转化的拟南芥系中的共定位，我们旨在显现在35S::BIN2-GFP与强烈表达的聚集物变体诱饵249NF_Tand之间的共定位，所述诱饵融合至tagRFP荧光蛋白质、在诱导型启动子下表达（pMDC::诱饵249NF_Tand-RFP）。为此，用雌二醇可诱导的pMDC::诱饵249NF_Tand-RFP构建体，超转化最佳的35S::BIN2-GFP表达系。在诱饵249NF_Tand诱导24小时后，对初级转化体执行共定位测定，且随后在CLSM下分析。8D.A.S.转化幼苗的共聚焦分析显示诱饵和靶之间的明显重叠的定位模式（参见图85）。观察到的共定位的强度也用专门软件（ImageJ MBF）定量，所述软件对于处理的所有照片释放接近于1的Mander’s系数，意味着发生在诱饵和靶蛋白质之间的高共定位。

关于形态变化，有意义的是，初步实验显示诱饵249串联构建体的表达援救了bri1-5突变体的表型。BIN2表达的减少预期援救bri1-5突变体表型（Li和Nam，Science295:1299-1301，2002）。

6.6用于植物实施例的材料与方法

6.6.1.在植物相容性Gateway载体中克隆诱饵259聚集物

通过使用TANGO预测工具（http://tango.switchlab.org/），最初选择了靶向BIN2蛋白质中的两个不同诱饵区（44-55aa：RVVGTGSFGIVFK（SEQ ID NO：325）；249-257aa：QLVEIIKVL（SEQ ID NO：321））的两种聚集物肽。对于BIN2区249-257aa，设计带（诱饵249R：RQLVEIIKVLR（SEQ ID NO：326））和不带（诱饵249：QLVEIIKVL（SEQ ID NO：321））侧翼守门者的聚集物构建体，所述守门者为带正电荷的精氨酸残基。

各诱饵序列通过PCR在C末端上融合至合成的聚集加强子序列（QWQNSTLIVLQNSTVIFEQNSTVIFEQN（SEQ ID NO：327）），引入柔性接头序列KPAGAAKPGAAG（SEQ ID NO：112）。

通过使用原理——检查哪些诱饵氨基酸修饰可以导致更佳的BIN2蛋白质靶向，随后生成表达诱饵249的两种其他载体。通过添加BIN2中天然侧接249-257aa区的5-7aa（诱饵249NF：ENAVDQLVEIIKVLGTPTREE（SEQ ID NO：328））以及对应于BIN2蛋白质序列开始的6个氨基酸（MADDKE（SEQ ID NO：329）），修饰诱饵249。柔性接头序列已变成AGSPKGAPAAKGSGA（SEQ ID NO：324），并且去除加强子序列。在一个构建体中，诱饵已以串联重复插入（诱饵249NF_Tand：ENAVDQLVEIIKVLGTPTREEENAVDQLVEIIKVLGTPTREE（SEQ IDNO：330））。所得到的DNA序列通过Gateway克隆在pDONR221入门载体(entry vector)中。在序列证实后，将插入片段转移至pK7WG2,0（Karimi等人2007）目的载体(destination vector)，以生成含有35S启动子和在C末端上融合至eGFP荧光标签的异源序列的植物二元载体。诱饵249NF_Tand也克隆到含有雌二醇诱导型启动子（Curtis和Grossniklaus2003）的Gateway pMDC-m13GW载体中，并且已插入在C末端上融合至tagRFP荧光蛋白质的异源序列（pMDC::诱饵249NF_Tand-tagRFP）。35S::BIN2-HA载体已通过使用pKWG2,0目的载体进行构建，以生成含有35S启动子和异源序列的植物二元载体，所述异源序列通过同源重组在C末端上融合至HA荧光标签。

6.6.2.植物材料和生长条件

本氏烟草植物直接在土壤中在16L/8D光周期下在21℃生长45天且在开花前浸润。

拟南芥（Heyhn.）（哥伦比亚生态型，Col-0）幼苗在4℃下层化处理2天，并且在方板中在含有1%蔗糖和0.8%琼脂pH5.9的垂直半强度Murashige&Skoog（MS）培养基（Duchefa）上在22℃在16小时/8小时光-暗周期中发芽，其中通过冷-白荧光管（Spectralux Plus36W/840；Radium）供应80-100mE m^-2s^-1光强度（除了指出之外）。在体外生长幼苗21天，转移至生长室中的土壤——具有相似的光和温度条件。下述突变体系用于该研究中：bin2-3/atsk22/atsk23三重突变体（Vert和Chory2006）。在该研究中使用的先前描述的转基因系是：pBIN2::BIN2-GFP和35S::BIN2-GFP（Vert和Chory，2006）。brassinazole（BRZ）购自TCIEUROPE N.V.（比利时），24-epibrassinolide（BL）购自Fuji Chemical Industries（日本）。pMDC::诱饵249NF_Tand-RFP的表达通过添加或浸入20μM雌二醇（Sigma）24小时而诱导。

6.6.3.植物转化

为了生成稳定的拟南芥转基因植物，工程化的构建体在根瘤土壤杆菌C58C1菌株中转化。随后将经转化的细菌菌株的悬浮液用于浸渍拟南芥Col-0野生型花芽。使经转化的花的种子在抗生素抗性培养基上发芽，选择原代转化体。通过下一代的3:1分离分析，进一步分离纯合转基因系。

对于农杆菌浸润（agroinfiltrations），本氏烟草叶用根瘤土壤杆菌菌株C58C1（pCH32）注射，所述菌株用载体35S::诱饵249R-GFP、35S::诱饵249-GFP、35S::诱饵249NF-GFP、35S::诱饵249NF_Tand-GFP、pMDC:诱饵249NF_Tand-RFP连同35S::P19转化，所述35S::P19编码衍生自番茄丛矮病毒（Tomato Bushy Stunt Virus）的沉默抑制蛋白质p19（Voinnet等人2003）。

遵循有微小改动的先前公开的方案（English等人1996），用不含针的注射器，用这些菌株共浸润本氏烟草叶的远轴侧。简言之，使细菌在28℃下在含有10mM2-（N-吗啉代）乙磺酸pH5.5和20μM乙酰丁香酮的YEB培养基中生长过夜。在光密度（O.D.）0.8时，使细菌形成沉淀，重悬浮于10mM MES、10mM MgCl₂、100μM乙酰丁香酮中，且在浸润前在室温下保持3小时。

6.6.4.成像和图像分析

幼苗在激光扫描共聚集显微镜（Olympus FluoView1000）上成像，其中使用20X或60X水浸透镜，NA1.2。图像分析用Olympus FluoViewFV10-ASW软件完成。对于共定位实验，用ImageJ MBF软件完成Mander’s重叠系数计算。

6.6.5.用于电子显微镜检的组织固定和免疫学标记

对于形态研究，将35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP播种后（D.A.S.）8天幼苗的子叶、下胚轴和根的片段（1-2mm²）浸没在3%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液中，并且于0.1M二甲基胂酸钠缓冲液pH7.2中在1%OsO₄与1.5%K₃Fe（CN）₆中后固定。将样品通过梯度乙醇系列脱水，包括在50%乙醇步骤时用2%乙酸双氧铀的本体染色，随后在Spurr’s树脂中包埋。使用超薄切片机（Leica EM UC6）制备超薄切片，并且在Leica EMAC20中在20℃在乙酸双氧铀中后染色40分钟以及在铅染剂中在20℃后染色10分钟。载网用在80kV操作的JEM1010透射电子显微镜显现（JEOL，Tokyo，日本）。

对于免疫细胞化学检测，将35S::诱饵249R-GFP和35S::诱饵249NF_Tand-GFP8D.A.S.幼苗的子叶、下胚轴和根的片段（1-2mm²）浸没在0.1M二甲基胂酸钠缓冲液，pH7.2中于2.5%多聚甲醛和0.3%戊二醛的固定液中。将样品通过梯度乙醇系列脱水，并且在LR-white hard级别（London Resin）中在4℃下经过3天逐步浸润，随后包埋在囊中。聚合作用通过在4℃UV照射24小时，随后在60℃16小时完成。使用超薄切片机（Leica EM UC6）切金干涉色(gold interference colour)的超薄切片，并且收集在formvar涂布的铜槽网格上。免疫标记的所有步骤都在湿室中在室温下执行。网格在25μl封闭溶液（5%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）中颠倒漂浮30分钟，随后使用溶于PBS中的1%BSA，洗涤5次，每次5分钟。在1:50稀释（溶于PBS中的1%BSA）的一级抗体抗GFP抗体（AbCam）中温育60分钟，随后使用溶于PBS中的0.1%BSA洗涤5次，每次5分钟。使网格与PAG10nm1:60稀释度（溶于PBS中的1%BSA）（CellBiology，Utrecht University，荷兰）一起温育，并且使用溶于PBS中的0.1%BSA、PBS和双蒸水洗涤2次，每次5分钟。切片在Leica EM AC20中在20℃在乙酸双氧铀中后染色40分钟，并且在柠檬酸铅中在20℃下后染色10分钟。网格用在80kV操作的JEM1010透射电子显微镜显现（Jeol Ltd.，Tokyo，日本）。

6.6.6.电泳和蛋白质印迹

从拟南芥8D.A.S.幼苗或将本氏烟草农杆菌浸润的叶的片段中提取总可溶蛋白质（TSP），在研钵中磨碎，且用冰冷的0.01M磷酸盐缓冲盐水（PBS；10mM Na₂HPO₄、10mMNaH₂PO₄、150mM NaCl，pH7.2）冲洗，加入蛋白酶抑制剂（Complete无EDTA，Roche，德国）。匀浆物随后以20,000x g在4℃下离心20’。用Bradford测定（Micro Assay试剂盒，Bio-RadLaboratories Inc.，Hercules，CA，U.S.A.）就蛋白质含量定量上清液。

共免疫沉淀实验已通过使用琼脂糖偶联的抗GFP珠（Chromotek）根据制造商说明书执行。

全蛋白质提取物或IP产物通过SDS-PAGE（Biorad）或BN-PAGE（NativePAGEsystem，Invitrogen）遵循产品手册进行分级分离。对于SDS-PAGE，约60μg TSP在95℃下在1%SDS和0.1M DTT的存在下变性10分钟，并且随后通过10%、12%或15%（w/v）SDS-PAGE凝胶在TGS运行缓冲液（25mM Tris、192mM甘氨酸和0.1%SDS）中分级分离。在免疫印迹前，膜用溶于PBS中的5%（w/v）去脂乳在4℃下封闭过夜。

对于BN-PAGE，在装载到3-12%Novex Bis-Tris梯度凝胶上之前，向蛋白质提取物加入20%甘油和5mM考马斯G-250。电泳在含有50mMBisTris和50mM Tricine（加上溶于阴极缓冲液中的0.004%考马斯G-250）的运行缓冲液中在固定电压（100V）下在21℃下执行120分钟。将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，并且用考马斯G-250染色，以显示分子量标记（NativeMark，Invitrogen）。在用8%乙酸固定20分钟后，使聚偏氟乙烯膜风干，并且用100%甲醇脱色。在免疫印迹前，膜用溶于TBS中的4%BSA在4℃下封闭过夜。

为了在膜上检测加HA标签的BIN2或加GFP标签的诱饵249、诱饵249R、诱饵249NF，诱饵249NF_Tand，已分别将一级抗体（大鼠抗HA，Roche；小鼠抗GFP，Living Colors）在含有0.1%Tween-20（PBS-T）和3%（w/v）去脂乳的PBS中稀释至1:1,000或1:5,000，并且在RT下温育1小时。在用PBS-T四次冲洗后，膜用辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗大鼠IgG（GE-Healthcare）或绵羊抗小鼠IgG（GE-Healthcare）染色，并且用电化学发光系统显现。

6.6.7.qRT-PCR

从在0.5MS培养基中如所示处理的整个8D.A.S.幼苗中提取RNA，并且根据供应商的说明书使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取RNA，并且在NanoDropND-100分光光度计上定量。用iScript逆转录酶（Biorad）由1μg总RNA制备聚（dT）cDNA。PCR在384孔反应平板上执行，所述平板加热至95℃10分钟，随后为在95℃变性10秒和分别在60℃和72℃下退火和延伸15秒的45个循环。靶定量用表20中列出的特异性引物对进行。所有PCRs都以三个技术重复进行，并且每个样品使用至少两个生物学重复。对于伴侣蛋白表达分析，Taqman引物三联体购自Integrated DNATechnologies（IDT）。使用Applied Biosystems Fast RealtimePCR混合物在Biorad iQ5机器中执行qRT-PCR，检测Fam荧光团。相对表达水平针对CDKA和EF表达水平标准化。

表20：用于qRT-PCR分析的引物

引物	SEQ ID NO	序列
			DWF4FOR	331	GTGATCTCAGCCGTACATTTGGA
DWF4REV	332	CACGTCGAAAAACTACCACTTCCT
			CPDFOR	333	GAATGGAGTGATTACAAGTC
CPDREV	334	GTGAACACATTAGAAGGGCCTG
			NACFOR	335	CTCATTTGCCAATCCTGTATC
NACREV	336	GCACTGAGATGCGACATCTTG
			HSP70FOR	337	TGACTCTTATCCGCTTGAACAG
HSP70REV	338	TCCTACGTTGCTTTCACTGAC
			HSP90-1FOR	339	GTGGTTCCTTCACTGTCACTAG
HSP90-1REV	340	TTCACCAATCTTTGAGTCTCC
			HSP101FOR	341	TGAAAGGAAGAGGATGCAGC
H5P101REV	342	TGTATTTCATCGTGAGAGGCTG
			HSC70-1FOR	343	GCTATTCTCAGCGGTGAAGG
HSC70-1REV	344	TTCTCGTCTTGGATGGTGTTC
			HSC70-2FOR	345	GAAACAGAACCACTCCCTCG
HSC70-2REV	346	CCAATCAACCTCTTTGCATCG
			HSC70-3FOR	347	AACAGAACCACACCGTCTTAC
HSC70-3REV	348	ACCAATCAACCTCTTCGCATC
			CDKAFOR	349	ATTGCGTATTGCCACTCTCATAGG
CDKAREV	350	TCCTGACAGGGATACCGAATGC
			EFFOR	351	CTGGAGGTTTTGAGGCTGGTAT
EFREV	352	CCAAGGCTGAAAGCAAGAAGA

6.6.8.FT-IR光谱学

傅里叶变换红外光谱学已在配备BioATR II室的Tensor37FT-IR分光光度计（Bruker）上，如先前报道的（Xu等人）实施。简言之，检测器用液氮冷却，并且Bio-ATR II室通过干燥空气的连续流动而吹扫，以使可能干扰结果的水蒸气降到最低。在每次测量前和后，将ATR室的晶体用乙醇和水洗涤。相对于由缓冲液覆盖的晶体组成的本底，进行样品测量。

Claims

1.一种下述结构的分子：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、H、G和Q；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

其中如果n是1，则

-X₁和X₂是选自R、K、E、D和P的1或2个氨基酸；和

-Y₁是6–11个连续氨基酸的区段，

-其中至少75％是疏水性氨基酸，

-其中至少50％的氨基酸是脂肪族或F残基，

-其中不存在P、R、K、D、E或H残基，

-其中不存在超过一个C、M、N、Q、W、G、S、A或T残基，

-其中不存在超过3个Y或F残基，

-其中不存在两个连续的相同非脂肪族残基，

-其中不存在超过2个连续的相同脂肪族残基，

-其中不存在两个连续的非芳香族极性残基，

-其中不存在超过50％的相同残基，

-其中第一个和/或最后一个残基是脂肪族或F残基，

-其中A和G残基的总和不超过2，

-其中A、G和S残基的总百分比不超过25％，

-其中C、M、N、Q和W残基的总百分比不超过25％，和

-其中选自A、C、G、S、N、T的除V外的小残基的总百分比不超过25％。

2.权利要求1的分子，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

3.权利要求1的分子，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、D和P的1–4个氨基酸。

4.权利要求1的分子，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且无P、R、K、D或E残基。

5.权利要求1的分子，其中每个X_2i-1和X_2i各是1或2个氨基酸。

6.权利要求1－5任一项的分子，其中至少一个Y_i是4–13个氨基酸的区段。

7.权利要求6的分子，其中至少一个Y_i是5-9个氨基酸的区段。

8.权利要求6的分子，其中至少一个Y_i是6或7个氨基酸的区段。

9.权利要求1－5任一项的分子，其中所有Y_i是4–13个氨基酸的区段。

10.权利要求9的分子，其中所有Y_i是5-9个氨基酸的区段。

11.权利要求9的分子，其中所有Y_i是6或7个氨基酸的区段。

12.权利要求1–5中任一项的分子，其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段。

13.权利要求12的分子，其中所述蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的至少一个区段，在基因组编码所述蛋白质的生物体中，对于所述蛋白质是独特的。

14.权利要求12的分子，其中所述蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的至少一个区段存在于基因组编码所述蛋白质的生物体的一种以上蛋白质中、和/或存在于一种以上生物体的蛋白质中。

15.权利要求12的分子，其中在所述蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的至少一个区段中，如果所述区段的长度是至少6个氨基酸，则一个或两个氨基酸已被置换，并且如果长度小于6个氨基酸，则一个氨基酸已被置换。

16.权利要求15的分子，其中置换已用选自R、D、E、K和P的残基完成。

17.权利要求12的分子，其中至少两个Y_i是蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段。

18.权利要求12的分子，其中每一个Y_i是蛋白质中天然存在的4–16个连续氨基酸的区段。

19.权利要求17的分子，其中所述至少两个Y_i在相同蛋白质中出现。

20.权利要求17的分子，其中所述至少两个Y_i是相同的。

21.权利要求17的分子，其中所述至少两个Y_i衍生自不同蛋白质。

22.权利要求1–5中任一项的分子，其中至少一个Y_i的总电荷不高于1。

23.权利要求1–5中任一项的分子，其中每个Y_i的总电荷不高于1。

24.权利要求22的分子，其中至少一个Y_i中的荷电残基数目不高于1。

25.权利要求22的分子，其中每个Y_i中的荷电残基数目不高于1。

26.权利要求1–5中任一项的分子，其中每个Z_i独立地选自0–20个相同或不同单位的区段，其中单位是氨基酸、单糖、核苷酸或单体。

27.权利要求1–5中任一项的分子，其中至少一个Z_i为相同性质的0–10个单位。

28.权利要求27的分子，其中至少一个Z_i为相同性质的0–5个单位。

29.权利要求1–5中任一项的分子，其中所有Z_i为相同性质的0–10个单位。

30.权利要求1–5中任一项的分子，其中所有Z_i为相同性质的0–5个单位。

31.权利要求1–5中任一项的分子，其中Z_n是0个单位。

32.权利要求1–5中任一项的分子，其中至少一个除Z_n外的Z_i是选自下述的接头：肽或多肽接头、PEG接头、和Ttds接头。

33.权利要求32的分子，其中所述肽或多肽接头具有选自PPP、PP或GS的序列。

34.权利要求1–5中任一项的分子，其中除Z_n外的所有Z_i是选自下述的接头：肽或多肽接头、PEG接头、和Ttds接头。

35.权利要求34的分子，其中所述肽或多肽接头具有选自PPP、PP或GS的序列。

36.权利要求1–5中任一项的分子，其中所述总长度不超过60个氨基酸。

37.权利要求1–5中任一项的分子，其中n是1。

38.权利要求1–5中任一项的分子，其中n是1，Y₁是6–10个氨基酸的区段，并且Z₁是0个单位的区段。

39.权利要求1–5中任一项的分子，其中n是2，Z₁是接头，并且Z₂是无。

40.权利要求1–5中任一项的分子，其进一步包含可检测标记。

41.权利要求1–5中任一项的分子，其进一步包含增加所述分子的可溶性的部分。

42.权利要求41的分子，其中所述增加可溶性的部分选自PEG、肽或蛋白质结构域。

43.权利要求40的分子，其中所述标记或增加可溶性的部分经由接头融合至所述分子。

44.权利要求40的分子，其中所述标记或增加可溶性的部分过Z_i接头融合至所述分子。

45.一种编码根据权利要求1–5中任一项的分子的核酸分子。

46.权利要求45的核酸分子，其为人工基因。

47.一种重组载体，其包含根据权利要求45的核酸分子。

48.一种细胞，其包含根据权利要求45的核酸分子或根据权利要求47的载体。

49.根据权利要求48的细胞，其是植物细胞。

50.一种药物组合物，其包含下述结构的至少一种分子和药学可接受的载体：

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

51.权利要求50的药物组合物，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

52.权利要求50的药物组合物，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

53.权利要求50的药物组合物，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

54.一种用于下调蛋白质的生物功能的非治疗和非诊断方法，其包括使所述蛋白质与下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

其中如果n是1，则Y₁是4–11个连续氨基酸的区段，并且Z₁不是氨基酸接头。

55.权利要求54的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

56.权利要求54的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

57.权利要求54的方法，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

58.一种下述结构的分子用于制备药盒的用途：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

其中如果n是1，则Y₁是4–11个连续氨基酸的区段。

59.权利要求58的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

60.权利要求58的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

61.权利要求58的用途，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

62.权利要求58的用途，用于制备治疗癌症的药盒。

63.权利要求58的用途，用于制备治疗AMD的药盒。

64.权利要求58的用途，用于制备治疗炎性疾病的药盒。

65.下述结构的分子在制备在有需要的受试者中治疗或预防癌症的药物中的用途：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个X_2i-1和X_2i独立地选自1–4个连续氨基酸，所述氨基酸选自：R、K、E、D、P、N、S、A、H、G和Q；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是其表达或过表达与所述癌症相关的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

66.权利要求65的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

67.权利要求65的用途，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

68.下述结构的分子在制备抗病原化合物药盒中的用途：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是病原性生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

69.权利要求68的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

70.权利要求68的用途，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

71.下述结构的分子在制备在有需要的受试者中治疗或预防病原性感染的药物中的用途：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

72.权利要求71的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

73.权利要求71的用途，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

74.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原体是病毒生物体。

75.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原体是选自革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、和真菌的微生物生物体。

76.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原体是选自酵母和霉菌的微生物生物体。

77.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原体是选自分枝杆菌的微生物生物体。

78.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原性生物体是抗药性株或变体。

79.权利要求68-73任一项的用途，其杀死所述病原性生物体。

80.权利要求68-73任一项的用途，其抑制所述病原性生物体的生长和/或繁殖，而不杀死它。

81.权利要求68-73任一项的用途，其中所述病原性生物体的蛋白质是必需蛋白质。

82.权利要求71–73中任一项的用途，以处理或防止生物膜形成，其中所述病原性生物体的蛋白质参与生物膜形成。

83.权利要求82的用途，其中所述生物膜形成在可植入装置上。

84.权利要求82的用途，其中所述生物膜形成在导管或支架上。

85.一种防止、抑制或逆转表面上微生物生物膜生长的非治疗和非诊断方法，其包括使该表面与结构(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n的分子接触，其中：

n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是微生物生物体的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

86.权利要求85的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

87.权利要求85的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

88.权利要求85的方法，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

89.权利要求85的方法，其中所述表面是可植入装置的表面。

90.权利要求89的方法，其中所述表面是导管或支架的表面。

91.一种至少部分地被结构(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n的分子涂布的可植入装置，其中：

n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

92.权利要求91的可植入装置，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

93.权利要求91的可植入装置，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、D和P的1–4个氨基酸。

94.权利要求91的可植入装置，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

95.一种筛选新抑制性化合物和/或检测化合物的方法，其包括步骤：

a)在至少一种蛋白质中鉴定至少一个具有4–16个连续氨基酸的区域，所述区域中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基；

b)合成下述结构的分子:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是步骤a)中鉴定的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

c)使步骤b)中制备的分子与步骤a)的蛋白质接触；和

d)评估所述蛋白质的功能和/或聚集。

96.权利要求95的方法，其中在步骤a)中，如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T。

97.权利要求95的方法，其中在步骤a)中，无P、R、K、D或E残基。

98.权利要求95的方法，其中在步骤b)中，每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

99.权利要求95的方法，其中在步骤b)中，如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T。

100.权利要求95的方法，其中在步骤b)中，无P、R、K、D或E残基。

101.一种鉴定抑制性化合物的新靶的方法，其包括权利要求95的方法，其中所述步骤a)中的蛋白质不是已知的抑制性化合物的靶。

102.权利要求95-100任一项的方法，以筛选新抗病原化合物，其中所述至少一种蛋白质是病原性生物体的蛋白质，且步骤d)中评估所述蛋白质的功能和/或聚集通过评估所述病原性生物体的存活、繁殖和/或生长来完成。

103.一种鉴定新抗病原化合物的方法，其包括权利要求102的方法，其中所述步骤a)中鉴定的4–16个连续氨基酸的至少一个区域在病原性生物体的一种以上蛋白质中出现。

104.一种鉴定新抗病原化合物的方法，其包括权利要求95-101和103中任一项的方法，其中所述4–16个连续氨基酸的至少一个区域在一种以上病原性生物体的至少一种蛋白质中出现。

105.一种检测样品中的蛋白质的方法，其包括步骤：

a)使怀疑含有蛋白质的样品与下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是待检测的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无；

b)检测与所述蛋白质反应的分子的存在。

106.权利要求105的方法，其中在步骤a)中，每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

107.权利要求105的方法，其中在步骤a)中，每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

108.权利要求105-107任一项的方法，其中在所述待检测的蛋白质中天然存在的至少一个Y_i在所述样品中对于所述蛋白质是独特的。

109.权利要求105-107任一项的方法，其中所述分子包含可检测标记。

110.权利要求109的方法，其中所述步骤b)中的检测是通过所述可检测标记的检测。

111.权利要求105-107中任一项的方法，其进一步包括，在步骤b)中的检测前，分离与所述蛋白质反应的分子和未与所述蛋白质反应的分子，或分离与所述分子反应的蛋白质和未与所述分子反应的蛋白质。

112.权利要求105-107中任一项的方法，其中检测是直接或间接的。

113.权利要求105-107中任一项的方法，其中检测与所述蛋白质反应的分子的存在通过检测所述蛋白质而进行。

114.权利要求105-107中任一项的方法，其中检测是定性、半定量或定量。

115.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述样品来自受试者。

116.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述样品来自动物或植物受试者。

117.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述样品来自哺乳动物受试者。

118.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述样品来自人受试者。

119.权利要求105-107中任一项的方法，其中所述样品不来自生物体。

120.权利要求105-107中任一项的方法，其中在所述样品中检测到的蛋白质的存在、不存在或量指示疾病状态。

121.权利要求120的方法，其中所述蛋白质选自CRP、PSA、IL-1β和TNF-α。

122.权利要求105-107中任一项的方法，其进一步包括步骤c)：使所述样品中检测到的蛋白质的存在、不存在或量与状态关联。

123.权利要求120的方法，其进一步包括步骤c)使所述样品中检测的蛋白质的存在、不存在或量与受试者中的疾病状态关联。

124.一种下述结构的分子在制备用于疾病状态诊断的诊断试剂中的用途:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个残基，并且其中至少一个Y_i是指示所述疾病状态的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

125.权利要求124的用途，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

126.权利要求124的用途，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

127.一种用于下调植物中的蛋白质的生物功能的方法，其包括使所述蛋白质与下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物中的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

128.一种用于下调植物细胞中的蛋白质的生物功能的方法，其包括使所述蛋白质与下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物细胞中的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

129.一种用于下调植物种子中的蛋白质的生物功能的方法，其包括使所述蛋白质与下述结构的分子接触:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少一个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中存在不超过1个P、R、K、D或E残基，并且其中至少一个Y_i是所述植物种子中的蛋白质中天然存在的区段；和

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

130.权利要求127-129任一项的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

131.权利要求127-129任一项的方法，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

132.权利要求127-129任一项的方法，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

133.根据权利要求127-132任一项的方法，其中所述分子是由重组载体上存在的核苷酸序列编码的多肽，其中，所述核酸序列，在引入所述植物细胞中后，在所述植物细胞中产生所述多肽。

134.根据权利要求127-132任一项的方法，其中所述分子是由重组载体上存在的核苷酸序列编码的多肽，其中，所述核酸序列，在引入所述植物种子中后，在所述植物种子中产生所述多肽。

135.根据权利要求127-132任一项的方法，其中所述分子是由重组载体上存在的核苷酸序列编码的多肽，其中，所述核酸序列，在引入所述植物中后，在所述植物中产生所述多肽。

136.一种试剂盒，其包含权利要求1–46中任一项的分子或权利要求47的载体和缓冲液。

137.一种固相载体，其包含下述结构的至少两种分子:(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，其中：

-n是1–5，并且i随着每次重复而从1增加到n；

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

138.权利要求137的固相载体，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

139.权利要求137的固相载体，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

140.权利要求137的固相载体，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无P、R、K、D或E残基。

141.权利要求137-140任一项的固相载体，其中所述分子通过接头连接至所述固相载体。

142.权利要求137-140任一项的固相载体，其中所述至少两种分子是至少两种不同分子。

143.一种农业化学组合物，其包含下述结构的至少一种分子和农学上可接受的载体：(X_2i-1-Y_i-X_2i-Z_i)_n，

其中n是1–5的整数，并且i随着每次重复而从1增加到n；并且其中

-每个Z_i是接头，并且Z_n独立地选自接头或无。

144.权利要求143的农业化学组合物，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K、E、D和P的1–4个氨基酸。

145.权利要求143的农业化学组合物，其中每个X_2i-1和X_2i是独立地选自R、K和P的1–4个氨基酸。

146.权利要求143的农业化学组合物，其中每个Y_i独立地选自4–16个连续氨基酸的区段，其中至少50％是疏水性氨基酸，并且其中存在至少一个脂肪族残基或F，并且如果仅存在一个脂肪族残基或F，则至少两个其他残基选自Y、W、A、M和T；并且其中无，P、R、K、D或E残基。