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CN103492586A - 用于检测癌症的方法和化合物 - Google Patents

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CN103492586A
CN103492586A CN201180067637.7A CN201180067637A CN103492586A CN 103492586 A CN103492586 A CN 103492586A CN 201180067637 A CN201180067637 A CN 201180067637A CN 103492586 A CN103492586 A CN 103492586A
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alkyl
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cancer
hydrogen
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I·威克斯
M·加夫法
R·诺克斯
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University College Cardiff Consultants Ltd
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Abstract

本发明涉及使用通式（I）所示的化合物诊断癌症的方法，特别是诊断膀胱癌或前列腺癌的方法：（I）其中R1、R2、R3、R4、R5、X、Y和z如本文所定义。

Description

用于检测癌症的方法和化合物
本申请涉及使用化合物诊断癌症的方法，特别是诊断膀胱癌和前列腺癌的方法，所述化合物用于检测NQO1或NQO2表达细胞。
膀胱癌是全世界第九常见的癌症。它在男性中比在女性中更普遍。全世界每年（2008）预计新发生356,600例膀胱癌，每年约20,000人死亡。已发现的是，工业发达国家的膀胱癌发病率最高，特别是在北美和西欧。
在发达国家，约有90%的膀胱癌是移行细胞癌（TCC，膀胱疣），而剩余10%为鳞状细胞癌和腺癌。除非长期不予治疗，浅表性移行细胞癌倾向于仅在膀胱内扩散。TCC可以沿着膀胱内膜扩散，但不深入膀胱（除非未治疗），并且细胞脱落进入尿液。
浅表性膀胱肿瘤可以通过反复切除而非常有效地管理。肿瘤通过向上穿过尿道的膀胱镜除去（切除）。该类型的治疗是具有高度侵入性的。浅表性膀胱肿瘤倾向于间歇性地复发，可能需要在重复基底上切除。浸润性膀胱癌需要更积极的方式。在早期，肿瘤可以通过部分或完全除去膀胱来手术地切除。这可能需要大手术，所述手术需要建立回肠膀胱术。常规的“膀胱镜检查”用于检测肿瘤的复发，特别是在早期的复发，和在需要时开始的进一步治疗。膀胱镜检查之间的时间间隔最初通常为3-4个月，但如果在随后的检查中膀胱保持没有肿瘤时可以增加。建议进行膀胱镜检查数年以确保肿瘤未复发。大约85%的膀胱癌患者在5年内复发，大多数患者在2年内复发。高复发率在很大程度上可能是由于膀胱中的肿瘤存在于多个部位，在检查时被遗漏或在初始切除时太小而无法被外科医生看到。因此，临床上需要敏感的、特异性的和非侵入性的膀胱癌检测的方法。
由于在手术或化疗干预后的第一个5年内复发的高风险（85%），因此需要对检测早期膀胱癌（浅表性移行细胞癌）的诊断测试是有保证的。除了需要侵入性检查和取样的方法以外，已描述了一些非侵入性测试。这样的方法的最近的综述（Shariat等人，2008）得出的结论是已评述的测试中没有一个满足理想肿瘤标志物的所有标准。因此，需要用于膀胱癌的早期检测的简单、快速、准确和非侵入性的方法，本文公开的发明提供了该问题的解决方案。
已检测到的是，与浸润性移行细胞癌相比，浅表性膀胱癌中的NAD(P)H:醌还原酶-1（NQO1，E.C.1.6.99.2）和其它相关的氧化还原酶水平升高（Li等人，2001,J.Urol.,166,2500-2505;Choudry等人,2001,Br.J.Cancer,85,1137-1146）。通过使用NQO1-特异性试剂，该显著差异已经被用来治疗早期膀胱癌。已开发出苯醌-药物共轭系统来特异性靶向富NQO1肿瘤细胞。
相对于正常细胞，NQO1也在各种其它类型的癌症中过表达，所述癌症包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌。
相关的酶NQO2也在癌症细胞中过表达，所述癌症包括以上阐述的那些。
本发明利用NQO1和NQO2在癌细胞中相对于正常细胞的过表达，并涉及被NQO1和NQO2活化的酶底物，在癌细胞的存在下产生可检测的信号。相反地，在癌细胞不存在时（从而大大降低NQO1和/或NQO2的量）观察到最小的信号。
发明陈述
在本发明的第一个方面中，提供了一种测定在来自患者的生物样品中过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞存在或不存在的方法，所述方法包括：
i.将生物样品或其处理过的衍生物与通式（I）所示的化合物接触
Figure BDA0000366971890000021
（I）
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
其中所述生物样品含有或疑似含有过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞；
ii.任选地，在癌细胞过表达或疑似过表达NQO2的情况下，向样品中加入NQO2辅底物；和
iii.测定下式所示化合物：
z-XH；
或下式所示离子：
z-X-；
的存在或不存在；
其中z和X如通式（I）中所定义，其中化合物或离子的存在表明在癌样品中存在过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞。
在本发明的第二个方面中，提供了一种测定在来自患者的生物样品中过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞存在或不存在的方法，所述方法包括：
i.将生物样品或其处理过的衍生物与通式（Ia）（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物或任意其盐接触；其中所述生物样品含有或疑似含有过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞；
ii.任选地，在癌细胞过表达或疑似过表达NQO2的情况下，向样品中加入NQO2辅底物；和
iii.测定下式所示化合物：
z-XH；
或下式所示离子：
z-X-；
的存在或不存在；
其中z和X如通式（I）中所定义，其中化合物或离子的存在表明在样品中存在过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞；
其中：
通式（Ia）为：
Figure BDA0000366971890000041
（Ia）
其中R1、R2、R3、R4、R5、X、Y和z如通式（I）所定义；
R1’、R2’、R3’、R4’和R5’各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1’和R2’与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
X’为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y’为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
通式（Ib）为：
Figure BDA0000366971890000042
其中R1、R2、R4、X和z如通式（I）所定义，Rx为H或C1-C3烷基；
通式（Ic）为：
Figure BDA0000366971890000043
其中R4、R5、X、Y和z如通式（I）所定义；和
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
通式（Id）为：
Figure BDA0000366971890000051
其中X和z如通式（I）所定义；和
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
通式（Ie）为：
其中X、Y和z如通式（I）所定义；和
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
通式（If）为：
Figure BDA0000366971890000061
其中z如通式（I）所定义；
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
R14为氢或C1-C6烷基。
通式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物容易被还原以产生式z-XH所示的产物或式z-X-所示的阴离子和还原的残基。如将在下面更详细地讨论，部分z是可检测的标记，并且分子的剩余部分被选择，使得当部分z形成通式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物的部分时，基团z发射的可检测信号与化合物z-XH或离子z-X-发射的信号相比被改良。
式（I）和（Ia）所示的醌或苯醌化合物、式（Ib）所示的吲哚类化合物、通式（Ic）、（Id）和（Ie）所示的硝基类化合物和通式（If）所述的化合物在本领域均为已知的。例如，Huang等人,Org.Letters,8(2),2665-268(2006)教导了通式（Ia）所示的化合物，Blanche等人,Tetrahedron,65(25),4892-4903(2009)中讨论了通式（I）、（Ib）、（Ic）、（Id）和（Ie）所示的化合物。
可检测的部分的性质，即它是式z-XH所示的化合物还是式z-X-所示的阴离子，将取决于可检测的标记z的性质、所使用的检测方法和进行检测方法的环境。因此，在下文中，对式z-XH所示的化合物的引用也应包括式z-X-所示的阴离子。因此，用于检测和/或定量化合物z-XH的方法也包括用于检测和/或定量阴离子z-X-的方法。
此外，对生物样品的处理过的衍生物的引用包括对被处理后的生物样品的引用，所述处理通常是为了制备用于本发明的方法的样品或在进行所述方法之前保存样品的目的，并且涉及本领域技术人员熟知的获取、制备或保存生物样品的传统技术的使用。
在本说明书中，“C1-C6烷基”是指具有一到六个碳原子的直链或支链饱和烃链。实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正己基。
术语“C1-C3烷基”是指具有一到三个碳原子的烷基。
在本说明书的上下文中，术语“芳族”是指具有5或6个环碳原子的具有芳族特征的环系统。芳族基团可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基和氰基。苯基是特别适合的芳基。
在本说明书的上下文中，术语“杂芳族”是指具有5或6个环原子的具有芳族特征的环系统，所述环原子的至少一个为选自N、O和S的杂原子。杂芳基的实例包括吡啶、嘧啶、呋喃、噻吩、噁唑、二唑和三唑。杂芳基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基和氰基。
在本说明书的上下文中，术语“碳环”是指具有5或6个环碳原子的非芳族环系统。环可以含有一个或多个碳-碳双键，因此该术语包括环烷基和环烯基。碳环基的实例包括环己基、环戊基和环己烯基。碳环基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基和氰基。
在本说明书的上下文中，术语“杂环”是指具有5或6个环原子的非芳族环系统，所述环原子的至少一个为选自N、O和S的杂原子。环可以含有一个或多个双键。杂环基的实例包括哌啶基、哌嗪基、吗啉基和四氢呋喃基。杂环基可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基和氰基。
术语“卤素”是指氟基、氯基、溴基或碘基。
如本文所使用的术语“活性取代基”是指能够与固体基质如膜、纳米颗粒或聚合物表面的侧基或蛋白或多肽上的侧基反应的取代基。有许多可以将式（I）所示的化合物连接到固体基质的反应，当然，活性取代基将取决于侧基的性质和所选择的反应。合适的活性取代基包括卤素、羟基、巯基、氨基、羰基、羧基、氰基、叠氮基、C2-C6烯基和C2-C6炔基，特别适合的活性取代基为卤素、羟基、巯基、氨基、羰基和羧基。
生物样品可以是活检样品，或其处理过的衍生物，所述样品取自患有或疑似患有乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌的患者。供选择地，所述生物样品可以是活检样品的处理过的衍生物，例如通过例如离心从活检样品中获得的细胞，所述细胞在必要时重悬于供选择的介质中。
由于细胞脱落进入尿液中从而可以用作生物样品，因此该方法特别适合用于诊断前列腺癌或膀胱癌，尤其是浅表性膀胱肿瘤。供选择地，尿液样品的处理过的衍生物可以用作生物样品。这样的处理过的衍生物的实例为从尿液样品中获得的细胞，所述细胞在必要时重悬于供选择的介质中。
在本发明的一个优选的方法中，也对所述样品中的细胞数量或其测试量进行测定，以使NQO1/NQO2活性可以表示为每细胞。所述细胞可以存在于原始样品中或可以从原始样品中富集、分离或纯化。这可以通过离心、过滤或其它公开于科学文献中的方法来完成。理想地，使用配体结合方法进行富集或纯化，所述方法例如但不限于，为了感兴趣的所选的细胞表面标志物，使用包覆抗体、受体或其它结合伴侣的顺磁性颗粒。
在本发明的一个优选的方法中，对z-XH或z-X-的存在或不存在进行测定，其量由样品的z-XH或z-X-浓度与阴性试验对照的z-XH或z-X-浓度的比值来表示，所述阴性试验对照不含有细胞、不含有NQO1和/或NQO2表达的细胞，或由于正常细胞自然表达非常低水平的酶而含有正常细胞。理想地，该比值的不同量与已知的癌细胞分期技术有关，以使简单的体外试验不仅可以用于确切地告知临床医生癌症的存在，还用于确切地告知临床医生癌症可能的进展。在本发明的又一个优选的方法中，在那些来自患有晚期肿瘤的患者的样品中发现更高的NQO1活性。
在本发明的又一个优选的方法中，试验方案涉及对含有被认为过表达NQO1和/或NQO2的细胞的样品进行离心，除去上清液，将细胞重悬于选择的缓冲液中，与通式（I）所示的化合物进行孵育，并如上所述测定z-XH或z-X-。理想地，孵育进行大约3min。这样就可以相对直接地进行本发明的试验并进行较短的时间，有利于即时（point-of-care）应用。
如以下更详细地描述，标记z可以是发色团或发光团（例如，荧光、磷光、生物发光或化学发光标记）；或荧光、磷光、化学发光或生物发光分子或离子的发光调节剂；或用于化学发光或生物发光反应的辅因子。供选择地，所述标记可以是可检测的微粒或纳米颗粒，例如但不限于，有色或磁性颗粒。测定化合物z-XH或z-X-存在或不存在的方法将根据可检测的标记z的性质而变化。例如，使用荧光计可以监测到荧光强度或波长的变化，使用光度计检测化学发光的类似的变化。如果需要，可以在检测和/或定量之前例如通过液相色谱法分离酶反应的产物。
供选择地，裂解的化合物z-XH或z-X-可以通过其与捕获部分结合的能力被检测到，并且z-XH或z-X-和捕获部分的结合对可以包括，例如，抗生物素蛋白或链霉亲和素和生物素或抗体/抗原结合对，如荧光素/抗荧光素。
如以下更详细地描述，供选择地，裂解的化合物z-XH或z-X-可以通过其与捕获部分结合的能力被检测到，并且z-XH或z-X-和捕获部分的结合对可以包括，例如，抗生物素蛋白或链亲和素和生物素或抗体/抗原结合对，如荧光素/抗荧光素。
通式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物是NQO1和NQO2的底物，并且被这些酶还原。还原导致标记部分z的裂解，该裂解随后可以检测到。裂解如以下图式1所示进行，所述图式1示出了通式（I）所示的化合物的反应机理。通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物的还原以类似的方式进行。
图式1
由于醌部分是在癌细胞中过表达的酶NQO1和NQO2的底物，因此本发明的化合物在癌症的检测中是特别有用的。由于前列腺癌和浅表性膀胱癌的细胞脱落进入尿液并且因此可以对尿液样品或尿液样品的处理过的衍生物（如从样品中获得的细胞）进行诊断测试而无需侵入性过程，所以化合物对于检测前列腺癌和浅表性膀胱癌是特别有用的。在癌细胞过表达NQO2的情况下，可能需要向样品或处理过的衍生物中加入NQO2辅底物如N-核糖基二氢烟酰胺（NRH）或1-甲基-3-甲酰胺基碘化吡啶，尤其是当还原成1,4-二氢吡啶衍生物或1-氨甲酰基甲基-3-氨基甲酰基-1,4-二氢吡啶时，所有上述化合物均充当NQO2的辅底物。其它NQO2辅底物是可用的并且为本领域技术人员所知，如在Knox等人cancer res.60pp4179-4186,2000中描述的那些。在检测NQO1过表达的情况下，由于NQO1的辅底物NAD(P)H存在于细胞中，因此通常不需要加入辅底物。然而，后者的辅底物或其等同物可以用于以下情况中：在测量活性之前NQO1已从生物样品中分离，或待研究的细胞被裂解。
以下的讨论涉及化合物z-XH或离子z-X-的检测。在该讨论中，对式（I）所示化合物的引用也适用于通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物。
特别地，适合的可检测的化合物z-XH或离子z-X-包括，发色团和发光团，例如荧光、磷光、化学发光或生物发光分子或离子；或荧光、磷光、化学发光或生物发光分子或离子的发光调节剂；或用于化学发光或生物发光反应的辅因子。特别地，部分z可以被选择，以使当所述部分z从通式（I）所示的化合物的剩余部分裂解以形成化合物z-XH或离子z-X-时，其光学性质变化。
光学性质的变化可以是，例如，发射光波长的可检测变化，由通式（I）的醌部分施加的淬灭效应的去除，或在辅因子的情况下，对其活性的调节。
最常见地，当部分z为发光团或发色团时，当所述部分z从通式（I）所示的化合物的剩余部分裂解后，其光学性质的变化基于两个潜在的机理。第一个是由于活性信号部分的“吸电子”连接（通过C-O-X键），另一个是由于通过（伪）π堆叠现象来实现淬灭。这些机理使用香豆素作为实例在图式2A和2B中示出。
图式2
Figure BDA0000366971890000101
在图式2A中，香豆素阴离子经历了共振互变异构，导致荧光输出。如果基团X如通式（I）所示连接到吸电子的醌部分，则荧光关闭。
图式2B显示了醌和芳族香豆素部分之间的伪π堆叠荧光淬灭。
在供选择的实施方案中，部分z可以包括可检测的标签，例如可检测的颗粒，特别是可检测的微粒或纳米颗粒，例如但不限于，有色乳胶微粒、金纳米颗粒或磁性颗粒，以及多种可检测的分子，所有上述物质均为本领域技术人员所熟知。测定化合物z-XH或离子z-X-存在或不存在的方法将根据可检测的部分z的性质而变化。例如，使用荧光计可以监测到荧光强度或波长的变化，使用光度计监测化学发光的类似的变化。如果需要，可以在检测和/或定量之前例如通过液相色谱法分离酶反应的产物。
供选择地，裂解化合物z-XH或离子z-X-可以通过其与捕获部分结合的能力而被检测到。在这种情况下，部分z可以简单地包括选择性地与捕获部分结合的结合部分，并且捕获部分可以包括用于部分z和可检测的标签的结合伴侣，可检测的标签例如上述可检测的颗粒。
当z包括如上所述的可检测的标签时，它可以进一步包括结合部分，所述结合部分选择性地与捕获部分结合。
可以用于该类型的实施方案的适合的结合对的实例是已知的，例如生物素和抗生物素蛋白或链亲和素和抗原/抗体结合对。
因此，在某些情况下，z和捕获部分的一个可以包括生物素或生物素衍生物，另一个可以包括抗生物素蛋白或链亲和素或其衍生物。供选择地，z和捕获部分的一个可以包括抗原，另一个可以包括对该抗原特异性的抗体，例如，荧光素/抗荧光素。适合的结合对的其它实例在本领域是众所周知的。
检测这样的标记的一种方式是将由标记z和捕获部分形成的复合物固定在固体基质上，并检测在所述固体基质上的标记。因此，在一个实施方案中，捕获部分将被固定在固体基质如珠、纤维或膜上，部分z将包括可检测的标签。
如果NQO1存在于样品中，部分z将从通式（I）所示的化合物裂解，并且游离的z-XH或z-X-将结合到固定化的捕获部分，所述捕获部分允许标签被检测。
供选择地，可以使用结合试验格式，当部分z仅包括用于捕获部分的结合伴侣时，这将是特别适合的。在该情况下，使用合适标记的第二结合试剂以监测捕获部分的占位（occupancy）。
在某些情况下，式（I）所示的化合物可以例如通过共价连接被固定在固体基质的第一位置，捕获分子被固定在第二位置，所述共价连接涉及任意的R1至R5基团或其适合的衍生物。用于常规地将分子固定到固相载体的适合的衍生物和方法为本领域技术人员所熟知。如果NQO1或NQO2存在于样品中，式（I）所示的化合物将会被还原，部分z会从通式（I）所示的化合物的残基裂解，并自由地移动到第二位置，在所述第二位置可以被捕获和检测到。
上述的检测方法可以是定性或定量的。化合物z-XH或z-X-的定量检测使其可以测定癌症的严重程度并监测任意治疗的有效性。
在本发明的又一个方面中，提供了一种用于诊断过表达NQO1和/或NQO2的癌症的试剂盒，所述试剂盒包括组合物，所述组合物包含在适合的容器中的通式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物；使用试剂盒的说明书，和任选地在适合的容器中的包含NQO2辅底物的组合物。
标记部分z的具体实例包括荧光素、2-氧代-2H-1-苯并吡喃基和4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基。
在特别合适的实施方案中，生物样品与通式（I）所示的化合物接触。
在适合的如通式（I）所示的化合物中，独立地或任意组合地：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为氢、甲基或乙基；
X为O或NH；和
Y为O。
在更适合的化合物中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为氢或甲基，更适合地：
R1和R2均为甲基；
R3为氢或甲基；和
R4和R5相同并且可以是氢或甲基。
特别适合的如通式（I）所示的化合物包括：
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me）；
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-3-甲基丁酸酯（R1=R2=R4=R5=Me；R3=H）；
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丙酸丙酯（R1=R2=R3=Me；R4=R5=H）；和
4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me）。
在单独的供选择的实施方案中，样品与通式（Ia）所示的化合物、通式（Ib）所示的化合物、通式（Ic）所示的化合物、通式（Id）所示的化合物、通式（Ie）所示的化合物或通式（If）所示的化合物接触。
在通式（Ia）所示的化合物中，用于R1、R2、R3、R4、R5、X、Y和z的特别适合的值如通式（I）所定义，而用于R1’、R2’、R3’、R4’和R5’，X’和Y’的特别适合的值如通式（I）的R1、R2、R3、R4、R5、X和Y所定义。
在通式（Ib）所示的化合物中，R1、R2、R3、R4、R5、X、Y和z的特别适合的值如通式（I）所定义。
在通式（Ic）所示的化合物中，R4、R5、X、Y和z的特别适合的值如通式（I）所定义。
在通式（Id）所示的化合物中，X和z的特别适合的值如通式（I）所定义。
在通式（Ie）所示的化合物中，X、Y和z的特别适合的值如通式（I）所定义。
在通式（If）所示的化合物中，X和z的特别适合的值如通式（I）所定义，并且R10适合地为H或甲基。
在更适合的通式（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物中，R10、R11、R12和R13的每个独立地代表H或C1-C6烷基，特别是H或甲基，最适合的是H。
通式（I）所示的化合物可以由通式（II）所示的化合物制备：
Figure BDA0000366971890000131
（II）
其中R1、R2、R3、R4和R5和Y如通式（I）所定义；
通过与式（III）所示的化合物反应：
z-XH或z-X-   （III）
其中X和z如以上通式（I）所定义。
通常地，该反应在偶联试剂如二环己基碳二亚胺（DCC）和碱如4-二甲基氨基吡啶（DMAP）的存在下进行。反应可以在约15-30℃的温度下进行，通常在室温下进行。当X为NR8时，反应可以在DCC和N-羟基琥珀酰亚胺的存在下进行，并以与常规肽偶联反应相似的方式进行。
通式（II）所示的化合物可以由通式（IV）所示的化合物制备：
Figure BDA0000366971890000141
（IV）
其中R1、R2、R3、R4和R5和Y如通式（I）所定义；
通过在乙腈中与N-溴代琥珀酰亚胺反应，随后加入水。反应可以在约15-30℃的温度下进行，通常在室温下进行。
通式（IV）所示的化合物可以通过将通式（VI）所示的化合物：
Figure BDA0000366971890000142
（VI）
其中R1、R2和R3如通式（I）所定义；
与通式（VII）所示的化合物反应来制备：
Figure BDA0000366971890000143
（VII）
其中Y、R4和R5如通式（I）所定义。
该反应可以在酸性条件下，例如在甲磺酸的存在下，在约60-100℃，更通常地70-90℃的温度下进行。
通式（VI）和（VII）所示的化合物容易得到，或可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。
如上面已经提到的，Huang等人的Org.Letters,8(2),2665-268(2006)教导了通式（Ia）所示的化合物并且Blanche等人的Tetrahedron,65(25),4892-4903(2009)中讨论了通式（Ib）、（Ic）、（Id）和（Ie）所示的化合物。用于制备这些化合物的方法在这些参考文献中有直接地教导或在那些文献引用的参考文献中有所描述。
通式（I）和通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物在用于诊断癌症的方法中使用，因此在本发明的又一个方面中，提供了如上所述的通式（I）和通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物，所述化合物用于诊断癌症。
还提供了通式（I）所示的化合物或通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物在制备用于诊断癌症的试剂中的应用。
通式（I）和通式（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）和（If）所示的化合物可用于诊断的癌症的实例包括乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌。然而，所述方法特别适用于检测肿瘤细胞可能存在于尿液中的泌尿系统恶性肿瘤。因此，更适合地，所述癌症为前列腺癌，或和更适合地，膀胱癌，特别是浅表性膀胱肿瘤。
现在将参照以下实施例和附图更加详细地描述本发明，其中：
图1显示了一个试验格式的实施例，其中NQO1的活性可以通过它将固定化的可检测的颗粒从固相连接物上裂解的能力来检测或定量，所述测定在颗粒的初始位置、最终位置或两者。
图2是显示在37℃下，在磷酸盐缓冲液（10mM）存在下，由UPLC分光光度计检测的MTL8-252（0.1M）监测75min的UV吸光度（在265nm处）（●）和荧光信号（λex410nm；λem550nm）（○）的图。图显示MTL8-252在磷酸盐缓冲液中明显稳定至少1小时。
图3是显示在265nm的吸光度下，在265nm、pH7和37℃下监测到的MTL8-252（100μM）随时间消失的UV图。对照（●）表示底物仅在磷酸盐缓冲液中；（○）表示底物在缓冲液和NADH（500μM）中；（△）表示hNQO1（0.10μg/mL）和NADH（500μM）存在下的底物，（
Figure BDA0000366971890000151
）表示hNQO1（0.20μg/mL）和NADH（500μM）存在下的底物。图表表明MTL8-252是hNQO1的很好的底物。
图4是显示使用UPLC试验，在hNQO1存在和不存在下，MTL8-252随时间消失和4MU随时间出现的图。（○）代表MTL8-252（初始浓度100μM）在hNQO1（0.2μg/mL）和NADH（500μM）的存在下消失；（
Figure BDA0000366971890000152
）代表通过荧光检测到的4MU的出现；（●）是对照实验，其中MTL8-252与NADH孵育。化合物的消失速率计算为13.51μM/min，4MU的出现速率计算为8.41μM/min。
图5是图6所示数据的重制图，但其中使用UV（在210nm下）而不是荧光测量随时间推移的浓度。（□）代表仅有MTL8-252；（●）代表在NADH存在下的MTL8-252；（○）代表在hNQO1和NADH存在下MTL8-252的消失；（△）代表4MU的出现（由活化过程–MTL8-252+NADH+hNQO1释放4MU）；（
Figure BDA0000366971890000163
）代表内酯副产物的出现（由活化过程形成内酯）。MTL8-252消失的速率计算为8.41μg/min。4MU出现的速率计算为11.48μg/min，内酯出现的速率测量为9.84μg/min。
图6是当4MU（100μM）和内酯（100μM）与hNQO1（0.2mg/μL）和NADH（500mM）孵育时，随时间推移的稳定图。（●）代表通过UV在210nm下测量的4MU；（○）代表通过荧光测量的4MU（FL Plus数据）；（
Figure BDA0000366971890000164
）代表通过UV在210nm下测量的内酯。数据表明4MU和内酯在hNQO1的存在下是稳定的（即，不被hNQO1影响/活化）。
图7是显示当MTL8-252（100mM）与hNQO1表达细胞系（hDT7；2.5x105个细胞/Ml）和hNQO1无表达细胞系（F170；2.5x105个细胞/mL）孵育时，4MU的形成速率随时间推移的发光光度图。（●）代表化合物仅在尿液中；（
Figure BDA0000366971890000162
）代表化合物与hDT7NQO1表达细胞系；（○）代表MTL8-252与F179–NQO1无表达/零表达的细胞系。4MU仅在尿液中和在F179细胞中的形成速率分别为0.32nmol/min和0.18nmol/mL。4MU在hDT7细胞中的形成速率为0.83nmol/mL。
图8是使用设置（λex=360nm；λem=450nm）-检测释放的4MU的荧光的FL-Plus检测器重复图9的分光光度图。对照实验由（○）表示，为MTL8-252（10μM）仅在PBS中；（
Figure BDA0000366971890000161
）代表MTL8-252（10μM）在PBS中与hDT7NQO1表达细胞系（5x105个细胞/mL）孵育；（●）代表MTL8-252（10μM）在PBS中与零表达细胞系F179（5x105个细胞/mL）孵育。4MU在hDT7和F179细胞中的初始释放速率分别计算为6.1μM/min和0.068μM/min。对照实验的4MU的释放速率为0.002μM/min。
图9是显示MTL8-252在PBS中（○）、在具有10%胎牛血清（FBS）的培养基中（●）和在不含FBS的培养基中（□）的稳定性的分光光度图。MTL8-252在PBS和不含FBS的培养基中非常稳定。
图10和11是显示实施例试验的精确度的图。试验在将产生NQO1的HDT7细胞加入培养基（DMEM）（图10）或尿液（图11）的重复样品上进行。图10显示了对加入培养基的标明的1x105或5x105个细胞三次重复测定的精确度。图11显示了对加入尿液中的HDT7106个细胞两次重复测量的精确度。误差条为+1SEM，并且实验表明可以在培养基或尿液中测量细胞而对精确度没有任何不利影响。
图12和13是显示实施例试验的图，所述试验可以用于测定许多不同类型的细胞的NQO1活性，即HDT7和F179（分别为NQO1产生和零产生的工程细胞系）、人膀胱癌细胞系EJ138和RT112和人前列腺癌细胞系PC3。每个实验中使用相似数量的细胞以允许比较。NC代表无细胞阴性对照。
图14显示实施例试验可以区分NQO1和NQO2之间的活性。前列腺癌细胞（例如PC3细胞）表达NQO1和NQO2活性。然而，后者仅在辅底物（EP-0152R，1-氨基甲酰基甲基-3-氨基甲酰基-1,4-二氢烟酰胺）存在下活化，所述辅底物不是天然存在于细胞中的。已知EP-152R不存在时，hNQO2是无活性的。图14显示了通过加入hNQO2选择性辅底物，4-MU的形成增加1.2倍。该额外的4-MU释放表明当补充hNQO2辅底物时，另外地或供选择地，试验可以用于检测表达hNQO2酶的肿瘤细胞。在前者的情况下，补充试验可以用于提供更强的试验信号，在后者的情况下，仅可以用于检测hNQO2表达的癌症。
图15和16显示实施例试验的定量性质。对2.5×105、1.25×105、0.625×105、0.3125×105个RT112细胞进行测定（图15）。同时，也使用已建立的方案将细胞暴露到4',6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI），以允许通过在相同荧光计中测量细胞DAPI荧光强度而对总细胞数进行定量（图16）。因此，对图15和16中的数据的评估可以确定每个细胞的信号量和产生所述信号的样品中的细胞数。当期望在“每个细胞”的基础上测定NQO1或NQO2活性时，这是特别有利的。
图17和18显示了试验的改良版本的结果，其中试验的灵敏度和/或特异性通过在试验前对细胞进行富集/分离/纯化而得到改善。图17显示了具有这种程序的本发明的兼容性。在这里，使用可磁化的（顺磁性）颗粒分离含有携带Ber-EP4上皮抗原的癌细胞的样品，所述颗粒包被有针对该抗原的抗体（Invitrogen,Dynal AS,Oslo,Norway）。获得颗粒/细胞复合物的混悬液，并在图10-16所报告的实施例试验方案中进行处理。图17显示相对于在一系列颗粒密度下（通过制造商的珠储备溶液（4x106个颗粒/ml）的体积示出）存在的细胞总数的活性（100%，在图中由0珠的条表示），在RT112膀胱癌细胞中的NQO1活性的恢复为约60–70%。图18显示针对HDT7细胞的相当的结果，所述HDT7细胞表达NQO1但不表达人Ber-EP4抗原。数据表明特异性富集上皮细胞群的能力。
图19显示了当试验用于从临床环境获得的样品时所获得的结果。结果表达为样品的4-MU浓度与阴性试验对照的4-MU浓度的比值，并且与最终的临床诊断相关（是否移行细胞癌）。空心三角形代表含有大量碎片的样品，表明参照图17使用如本文所述的免疫提取对增加特异性是有益的。空心圆形代表来自患者的样品，随后诊断出所述患者患有非常早期的Ta膀胱癌，并且很可能没有足够的细胞用于可靠地分析该样品。
表2显示了已诊断出患有膀胱癌但未治疗的患者的试验结果。结果表达为样品的4-MU浓度与阴性试验对照的4-MU浓度的比值。该系列中样品89由于存在肉眼血尿，不能被测定。
表3显示了已诊断出患有前列腺癌的患者的NQO1试验结果。在直肠指检之后收集这些样品。
图1示出了一种类型的试验格式。图的上半部分（12）代表在适合的膜（10）上的第一限定的位置，通过NQO1活性底物部分（14，“氧化还原敏感部分”）将可检测的生物素化的微粒（16；“z”部分）连接到该位置。因此（14）和（16）一起组成了式（I）所示的化合物。在人NQO1（hNQO1）不存在时，当在第二限定的位置（18）的方向上引入流体流穿过膜时，可检测的颗粒（16）保持固定在第一限定的位置（12）。因此没有生物素化的微粒被固定在第二位置（18）的抗生物素蛋白（20）捕获。相反地，图的下半部分示出了氧化还原敏感部分（14）被施加到第一位置（12）的样品中的hNQO1的反应先裂解的影响。在该情况下，之后引入穿过膜的流体流会导致可检测的生物素化的微粒（16）迁移，并随后被固定于第二位置（18）的抗生物素蛋白部分（20）捕获。因此，在相对于各自的另一个位置，对第一（12）或第二（18）限定的位置的微粒的检测和/或定量是引入流体流之前施加到第一位置（12）的样品中的hNQO1的存在或不存在，或其量的指标。
现在将参照实施例更加详细地描述本发明。
通式（I）所示的化合物的合成的一般图式
Figure BDA0000366971890000191
试剂和条件：（i）适合的丙烯酸酯，MeSO3H，70-90℃，2-5h；（ii）NBS，MeCN:H2O，1.5-3h，RT；（iii）DCC，DMAP，Z-XH，DCM，16-24h，RT
实验
化学品和试剂获得自Aldrich Chemical Co.,Dorset UK、LancasterSynthesis Ltd,Lancashire,UK和VWR International,Leicestershire,UK。氘代溶剂和四甲基硅烷（TMS）获得自Cambridge Isotope Laboratories Inc.,Andover USA。NQO1由Morvus Technology Ltd表达和纯化。使用薄层色谱（TLC）在预包被的60-F254硅胶铝背板上监测反应，使用UV GL-58矿物灯通过紫外（UV）辐射在254nm和325nm下显色，或通过用高锰酸钾（KMnO4）溶液染色来显色。使用来自VWR international的100-125目硅胶进行柱色谱。在Bruker Avance300MHz或Varian400MHz NMR光谱仪上记录1H和13C核磁共振（NMR）光谱。对于在氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）中运行的样品，化学位移报告为TMS低场区的δ百万分比（ppm）。在无畸变极化转移增益实验（DEPT实验）的帮助下归属13C光谱。使用以下缩写：s（单峰），d（双峰），dd（双二重峰），t（三重峰）和m（多重峰）。J值以Hz度量。在Micromass Trio2000光谱仪上记录电子电离（EI）和正负化学电离（CI）。使用Micromass Tof Spec2e电离光谱仪记录正负电喷雾电离（ESI）。在Thermo Finnigan MAT95XP光谱仪上记录高分辨光谱（HRMS）。运行光谱管理（spectra manager），使用Jasco FT/IR-4100记录红外光谱。所有峰报告为波长cm-1。在GallenKamp MPD.350.BM2.5仪器上的开放的玻璃毛细管中测定熔点（MP）并保持未校正。运行Cary Win UV软件，使用1cm光程石英比色皿（2个相对的磨砂面）在Cary100UV光谱仪上记录紫外（UV）光谱。使用1cm光程的4面石英恒温比色皿，在Cary Eclipse荧光计上记录酶反应的荧光光谱。根据生成强度使用2.5、5和10的狭缝值，使用自动快门功能使光漂白最小化。在4面石英恒温比色皿中，使用ShimadzuRF-5301PC荧光分光光度计记录化学还原的荧光发射和激发光谱。通过150w的氙气灯泡提供光源。使用Shimadzu Rf-5301PC软件处理数据。使用C18反相柱（尺寸：50x2.1mm；粒径：1.9微米）在ThermoFisher Accela U-HPLC（超高压液相色谱）系统上实现分离。使用PDA（光电二极管阵列）系统分析数据并使用ChromQuest软件（4.2版）处理。所有溶剂不经进一步纯化直接使用。在反应中，使用MgSO4干燥溶液。在减压下蒸发溶剂。
包被有抗-Ber-EP4抗体的可磁化的颗粒获得自（Invitrogen Dynal AS,Oslo,Norway.）。
缩写：DCC是二环己基碳二亚胺；DMAP是4-二甲基氨基吡啶；DCM是二氯甲烷；DCE是二氯乙烷；DMSO是二甲基亚砜；PBS是磷酸盐缓冲液。
实施例1–通式（IV）所示的内酯，Y为O
A.6-羟基-4,4,5,7,8-五甲基-1-苯并吡喃-2-酮（R1=R2=R3=R4=R5=Me）
将2,3,5-三甲基-1,4-氢醌（5.0g，32.9mmol）和3,3-二甲基丙烯酸甲酯（4.31g，4.94ml，37.8mmol）加到甲磺酸中（50ml）。将混合物在70℃下搅拌3小时，然后用H2O（200ml）淬灭，并用乙酸乙酯萃取（3×100mL）。然后用H2O（100mL）、饱和NaHCO3水溶液（100mL）和饱和盐水（100mL）洗涤有机层。然后用MgSO4干燥有机层并在真空中浓缩得到固体。用己烷-氯仿（3:1）重结晶残留物得到内酯（5.4g，70.2%），为无色晶体。MP:182-184℃,文献186-187℃（Borchardt和Cohen，1972b）。1H NMR(CDCl3):δ4.73(1H,s,OH),2.55(2H,s,CH 2),2.36(3H,s,ArCH 3),2.22(3H,s,ArCH 3),2.19(3H,s,ArCH 3),1.45(6H,s,2×偕-CH 3).13C NMR(CDCl3):δ169.3(C=O),148.7,142.3,127.6,123.4,120.9,119.5(6×ArC),45.7(CH2),34.6(C(CH3)2),27.5(2×偕-CH3),14.6,12.4,12.1(3×ArCH3).MS:CI235,(M+1)+33%;EI234,(M)+100%。
B.6-羟基-4,4,7,8-四甲基-1-苯并吡喃-2-酮（R1=R2=R4=R5=Me；R3=H）
将2,3-二甲基-1,4-氢醌（5.03g，36.2mmol）和3-3-二甲基丙烯酸甲酯（5.68mL，4.96g，43.5mmol）加到甲磺酸（50ml）中。将混合物在90℃下搅拌5小时然后用H2O（200mL）淬灭，并萃取到乙酸乙酯中（3×200mL）。然后用水（100mL）、饱和NaHCO3（100mL）和饱和盐水（100mL）洗涤有机层。然后用MgSO4干燥有机层并在真空中浓缩。用己烷-氯仿（3:1）重结晶残留物得到内酯，为无色晶体（3.40g，42.7%）。MP:145-147℃,文献：146-148℃（Yenes和Messeguer，1999）。1H NMR(CDCl3):δ6.63(1H,s,ArH),5.21(1H,s,OH),2.58(2H,s,CH 2),2.23(3H,s,CH 3),2.16(3H,s,CH 3),1.30(6H,s,2×偕-CH 3);13C NMR(CDCl3):δ169.4(C=O),150.3,142.6,126.5,126.3,122.7,107.8(6×ArC),43.6(CH2),33.1(C(CH3)2),27.6(2×偕-CH3),12.3,12.0(2×ArCH3);MS:CI221,(M+1)+44.7%;EI220,(M)+100%。
C.6-羟基-5,7,8-三甲基-1-苯并吡喃-2-酮（R1=R2=R3=Me;R4=R5=H）
将2,3,6,-三甲基氢醌（5g，32.9mmol）和3-3-二甲基丙烯酸甲酯（3.39g，3.55mL，39.5mmol）加到甲磺酸（50ml）中。将混合物在90℃下搅拌2小时然后用H2O（200mL）淬灭，并用乙酸乙酯（3×200mL）萃取。然后用H2O（100mL）、饱和NaHCO3（100mL）和饱和水盐水（100mL）洗涤有机层。然后用MgSO4干燥有机层并在真空中浓缩。用己烷-氯仿（3:1）重结晶残留物得到内酯（4.21g，62.1%），为无色晶体。MP:169-171℃。1H NMR(CDCl3):δ4.65(1H,s,OH),2.91(2H,t,CH 2J=7.2),2.71(2H,t,CH 2J=7.4),2.21(3H,s,CH 3),2.19(3H,s,CH 3),2.18(3H,s,CH 3);13C NMR(CDCl3):δ169.5(C=O),148.2,144.2,122.9,121.8,119.3,118.0,(6×CAr),29.1(3CH2),21.3(4CH2),12.2,12.1,11.8(3×ArCH3);CI207,(M+1)+25%;EI206,(M)+100%。
实施例2-通式（II）所示的醌酸，Y为O
A.3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（R1=R2=R3=R4=R5=Me）
将6-羟基-4,4,5,7,8-五甲基-1-苯并吡喃-2-酮（3.7g，15.8mmol）悬浮于乙腈中（aq.，15%v/v，200ml）。将NBS（3.8g，21.3mmol）的乙腈（aq.,40%v/v,60ml）溶液在1小时内滴加到悬液中。将混合物进一步搅拌30分钟，然后用H2O（330mL）稀释，用乙醚（3×75mL）萃取。用H2O（2×100mL）和盐水（100mL）洗涤合并的有机相，用MgSO4干燥，然后用泵浓缩得到固体。用乙酸乙酯重结晶固体得到醌酸，为黄色晶体（1.9g，48.1%）。MP:97-99℃,文献：101-103℃（Borchardt和Cohen，1973c）。1H NMR(CDCl3):δ11.04(1H,brs,OH),3.06(2H,s,CH 2),2.10,(3H,s,ArCH 3),1.95(6H,s,2×CH 3),1.43(6H,s,2×偕-CH 3);13C NMR(CDCl3):δ190.9,187.4(2×醌C=O),178.9(COOH),152.0,143.0,139.0,138.4(4×环C),47.3(CH2),37.9(C(CH3)2),28.8(2×偕-CH3),14.3,12.5,12.1(3×ArCH3);MS:CI251,(M+1)+100%;EI250,(M)+5%.
B.3-(3’,6’-二氧代-4’,5’-二甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（R1=R2=R4=R5=Me；R3=H）
将6-羟基-4,4,7,8-四甲基-1-苯并吡喃-2-酮（2.0g，9.1mmol）悬浮在乙腈中（aq.,15%，110mL）。将NBS（2.18g，12.3mmol）的乙腈（aq.,40%，35mL）溶液在1小时内滴加到搅拌的内酯悬液中。将混合物再搅拌2小时，然后用H2O（180mL）稀释，并萃取到乙醚中（3×45mL）。用H2O（120mL）、饱和盐水（100mL）洗涤合并的有机萃取液，并用MgSO4干燥。将黄色有机溶液蒸发至干燥，并用乙酸乙酯重结晶产生醌酸，为黄色晶体（1.3g，60.5%）。MP:92-94℃。1H NMR(CDCl3):δ10.37(1H,brs,OH),6.53(1H,s,2-H),2.94(2H,s,CH 2),2.00(6H,s,2×CH 3),1.32(6H,s,2×偕-CH 3);13C NMR(CDCl3):δ187.9,187.5(醌C=O),177.3(COOH),152.9,142.4,139.7,132.2(4×环C),44.8(CH2),36.8(C(CH3)2),28.1(2×偕CH3),12.6,11.9(2×Ar-CH3).MS:CI237,(M+1)+22.4%,254(M+NH4)100%;EI237,(M+1)+55.3%。
C.3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)丙酸（R1=R2=R3=Me；R4=R5=H）
将合适的内酯（1.5g，7.3mmol）悬浮在乙腈中（aq.,15%，90mL）。将NBS（1.72g，9.83mmol）在乙腈（aq.,40%，30mL）中的溶液在1小时内滴加到搅拌着的内酯混悬液中。将混合物再搅拌1小时，然后用H2O（220mL)稀释并用乙醚萃取（3×75mL）。用H2O（150mL）洗涤合并的有机萃取液，用MgSO4干燥，在真空中浓缩并用乙酸乙酯重结晶产生醌酸，为黄色化合物（1.19g，73.5%）。MP:113-115℃。1H NMR(CDCl3):δ11.00(1H,br,OH),2.82(2H,t,CH 2J=7.7),2.52(2H,t,CH 2J=7.7),2.11(3H,s,CH 3),2.02(6H,s,2×CH 3);13C NMR(CDCl3):δ187.5,186.9(醌C=O),178.5(COOH),141.8,141.6,140.8,140.6(4×环C),32.6(2CH2),22.1(3CH2),12.4,12.3,12.3(3×Ar-CH3).MS:CI223,(M+1)+100%;EI222,(M)+19.7%
实施例3-通式（I）所示的潜在的荧光底物，Y为O
A.2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me)（化合物A）
将3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（400mg，1.7mmol）、DCC（415mg，2.0mmol）和DMAP（21mg，0.2mmol）的混合物悬浮在干燥的DCM（10ml）中。将混悬液搅拌30分钟。加入7-羟基香豆素（317mg，2.0mmol）并将混合物再搅拌24小时。过滤产生的混悬液并蒸发滤液。过滤形成的混悬液，蒸发并再溶解于乙酸乙酯中并过滤。用柱色谱(1:3，乙酸乙酯-己烷）纯化有机萃取物得到产物：330mg（50.0%）为黄色固体。MP:128-130℃.1H NMR(CDCl3):δ7.68(1H,d,ArH,J=9.6),7.46(1H,d,ArH,J=8.4),7.02(1H,d,ArH,J=2.1),6.94(1H,d,d,ArH,J=2.1)6.39(1H,d,ArH,J=9.6),3.29(2H,s,CH 2),2.19(3H,s,CH 3),1.94(6H,s,2×CH 3),1.53(6H,s,2×偕-CH 3).13C NMR(CDCl3):δ190.8,187.3(2×醌C=O),170.8(C=OO),160.3(C=O香豆素),154.7,152.9,151.4,142.8,142.7,139.5,138.9,128.6,118.3,116.7,116.2,110.4(12×环C),47.7(CH2),39.0(C(CH3)2),29.9(2×偕-CH3),14.5,12.7,12.2(3×CH3).MS:ES+ve417.1(M+Na)100%.
B.2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-3-甲基-丁酸酯（R1=R2=R4=R5=Me；R3=H)（化合物B）
将DCC（4.18mg，2.0mmol）和DMAP（21mg，0.2mmol）加到3-(3’,6’-二氧代-4’,5’-二甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（400mg，1.7mmol）在干燥的DCM（10mL）中的混悬液中。将混合物搅拌30分钟然后加入7-羟基香豆素（329mg，2.0mmol）。然后将混合物搅拌16小时。过滤产生的混合物并在真空中浓缩。将产生的固体溶于乙酸乙酯中并过滤。浓缩滤液并再溶于乙酸乙酯中并过滤，再次在真空中浓缩产生的滤液并用柱色谱(1:3乙酸乙酯-己烷）纯化，产生产物为黄色固体285mg（44.4%）。MP:108-110℃。1HNMR(CDCl3):δ7.66,(1H,d,ArH,J=9.6),7.44(1H,d,ArH,J=8.4),7.00(1H,d,ArH,J=1.8),6.93(1H,d,d,ArH,J=2.1,2.1),6.59(1H,s,ArH),6.38(1H,d,ArH,J=9.6),3.22(2H,s,CH 2),2.02(3H,s,CH 3),1.94(3H,s,CH 3),1.42(6H,s,2×偕-CH 3).13C NMR(CDCl3):δ188.0,187.0(2×C=O),170.1(C=OO),160.7(C=O香豆素),154.9,153.2,153.1,143.3,142.7,140.3,132.6,129.0,118.7,117.1,116.4,110.7(12×环C),45.4(CH2),37.7(C(CH3)2),28.6(2×偕-CH3),13.0,12.3(2×CH3).MS:ES+403.1(M+Na)。
C.2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丙酸酯（R1=R2=R3=Me；R4=R5=H)（化合物C）
将3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)丙酸(500mg，2.3mmol）加到在干燥DCM（10ml）中的DCC（557mg，2.7mmol）和DMAP（27mg，0.2mmol）溶液中并将混悬液搅拌30分钟。将7-羟基香豆素（437mg，2.7mmol）加到混合物中并在室温下继续搅拌16小时。过滤产生的混合物并在真空中浓缩。将产生的固体溶解于乙酸乙酯中并过滤。浓缩滤液并再溶于乙酸乙酯中并过滤。再次在真空中浓缩产生的滤液并用柱色谱(用1:3的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生的产物为黄色固体285mg（34.6%产率）。1H NMR(CDCl3):δ7.69(1H,d,ArH J=9.6),7.49(1H,d,ArH J=8.4),7.13(1H,d,ArHJ=2.1),7.06,7.04(1H,d,d,ArH J=2.1),6.40(1H,d,ArH J=9.6),2.94(2H,t,CH2J=7.5),2.76(2H,t,CH 2J=7.5),2.11(3H,s,CH 3),2.03(3H,s,CH 3)。
D.4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me）[MTL8-252]；（化合物D）
将3-(3’,6’-二氧代-2’,4’,5’-三甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（800mg，3.4mmol），DCC（830mg，4.0mmol）和DMAP（42mg，0.4mmol）的混合物混悬于干燥DCE（20ml）中。将混悬液搅拌30分钟。加入4-甲基伞形花内酯（634mg，3.6mmol）并将混合物再搅拌24小时。过滤产生的混悬液并蒸发滤液。将形成的混悬液过滤、蒸发、再溶于乙酸乙酯中并过滤。将有机萃取液蒸发并用乙酸乙酯重结晶得到产物，为黄色晶体(0.96g，69%）。.1H NMR(CDCl3):δ7.58(1H,d,ArH,J=5Hz),7.02(1H,d,ArH,J=3Hz),6.98(1H,d,ArH,J=3Hz),6.96(1H,d,ArH,J=3Hz),3.29(2H,s,CH 2),2.41(3H,s,CH 3),2.18(3H,s,CH 3),1.94(3H,s,CH 3),1.53(6H,s,2×CH 3).13CNMR(CDCl3):δ190.8,187.3(2×醌C=O),170.8(C=OO),160.4(C=O香豆素),154.1,152.8,151.8,151.5,142.7,139.7,138.8,125.4,117.9,117.8,114.6,110.4(12×环C),47.7(CH2),38.4(C(CH3)2),29.0(2×偕-CH3),18.7(CH3),14.4,12.6,12.1(3×CH3)。
以下酰氨基底物作为通式（I）所示的化合物的模型被合成，其中X为NR8。
实施例4–酰氨基底物
A.N-甲基-N-苯基-[3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)-3-甲基]丁酰胺
将在干燥DCM（10ml）中的DCC（371mg，1.8mmol）和DMAP（22mg，0.2mmol）加到合适的醌酸（400mg，1.6mmol）中。将混合物搅拌30分钟，然后加入N-甲基苯胺（192.6mg，1.8mmol）。然后将混合物搅拌16小时。过滤产生的混悬液，用HCl（aq.，0.1M，5ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生的产物为黄色固体390mg（71.9%）。MP:92-94℃.1H NMR(CDCl3):δ7.45(2H,t,间H,J=6.9),7.36(1H,t,对H J=6.8),7.20(2H,d,邻HJ=7.2),3.17(3H,s,NCH 3),2.75(2H,s,CH 2),2.10(3H,s,CH 3),2.01(3H,s,CH 3),1.97(3H,s,CH 3),1.30(6H,s,2×偕-CH 3).13C NMR(CDCl3):δ191.2(醌C=O),187.7(醌C=O),172.1(C=O),154.8,144.0,143.6,137.7,136.2(5×环C),129.8(间C),127.8(对C),127.5(邻C),47.6(CH2),38.0(C(CH3)2),37.1(NCH3),28.4(2×偕-CH3),14.1,12.7,12.1(3×CH3).MS:ES+362.2(M+Na)。
B.N-甲基-N-苯基-[3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)-3-甲基]丁酰胺
将3-(3’,6’-二氧代-4’,5’-二甲基环己-1’,4’-二烯)-3,3-二甲基丙酸（400mg，1.69mmol）加到在干燥10ml DCM中的DCC（371mg，1.80mmol）和DMAP（22mg，0.180mmol）溶液中。将混合物搅拌30分钟，然后加入N-甲基苯胺（181.8mg，1.80mmol）。然后将混合物搅拌16小时。过滤混合物，用HCl（aq.，0.1M，5ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，得到的产物为黄色固体330mg（60.4%）。MP:110-112℃.1HNMR(CDCl3):δ7.44(2H,t,间H J=7.4),7.36(1H,t,对H J=7.2),7.16(2H,d,间H J=7.5),6.49(1H,s,醌ArH),3.16(3H,s,NCH 3),2.02(3H,s,CH 3),1.99(3H,s,CH 3),1.16(6H,s,2×偕-CH 3).13C NMR(CDCl3):δ188.2(醌C=O),188.0(醌C=O),171.3(C=O),155.5,144.1,142.3,139.6,130.4(5×环C),129.8(2×间C),127.8(对C),127.5(2×邻C),44.4(CH2),37.4(C(CH3)2),37.2(NCH3),28.5(2×偕-CH3),12.7,11.9(2×醌CH3).MS:ES+348.1(M+Na)。
C.N–甲基-N–苯基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)-丙酰胺（R1=R2=R3=Me;R4=R5=H）
将在干燥的DCM（10ml）中的DCC（371mg，1.8mmol）和DMAP（22mg，0.2mmol）加到合适的醌酸（64）（400mg，1.8mmol）中并搅拌30分钟。将N-甲基苯胺（192.6mg，1.8mmol）加到搅拌着的混合物中。然后将混合物搅拌16小时。过滤产生的混合物，用HCl（aq.，0.1M，5ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生的产物为黄色固体:285mg（50.9%）。MP:69-71℃.1H NMR(CDCl3):δ7.40(2H,t,间HJ=7.4),7.32(1H,t,对H J=7.2),7.17(2H,d,邻H J=7.5),3.26(3H,s,NCH 3),2.75(2H,t,CH 2J=7.8),2.19(2H,t,CH 2,J=7.8)2.00(3H,s,2×CH 3),1.94(3H,s,CH 3).13C NMR(CDCl3):δ187.6(醌C=O),186.8(醌C=O),171.7(C=O),143.8,142.9,141.0,140.4(5×环C),129.8(2×间C),127.9(对C),127.3(2×邻C),37.4(NCH3),32.8,23.0(2×CH2),12.4,12.3,12.1(3×CH3).MS:ES+334.2(M+Na)。
D.N-苯基[3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)]丁酰胺（R1=R2=R3=R4=R5=Me）
将在干燥的10ml DCM中的DCC（371mg，1.8mmol）和DMAP（22mg，0.2mmol）加到合适的醌酸（400mg，1.6mmol）并搅拌30分钟。将苯胺（148.8mg，1.6mmol）加到搅拌着的混合物中。然后将混合物在室温下搅拌16小时。过滤产生的混合物，用HCl（aq.，0.1M，5ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生的产物为黄色固体：410mg（78.8%）。MP:152-154℃.1H NMR(CDCl3):δ7.40(2H,d,邻H J=8.1),7.28(2H,t,间H J=7.7),7.13(1H,s,NH)7.07(1H,t,对H J=7.4),3.02(2H,s,CH 2),2.15(3H,s,CH 3),1.95(6H,s,2×CH 3),1.50(6H,s,2×偕-CH 3).13CNMR(CDCl3):δ191.6(醌C=O),187.5(醌C=O),170.2(C=O),153.0(醌烯C),143.3(醌烯C),138.3(醌烯C),138.2(苯胺本位C),137.6(醌烯C),129.0(间C),124.3(对C),119.8(邻C),50.5(CH2),38.4(C(CH3)2),29.1(2×偕-CH3),14.2(醌CH3),12.7(醌CH3),12.2(醌CH3).MS:ES+348.1(M+Na)。
E.N-苯基-[3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)-3-甲基]丁酰胺（R1=R2=R4=R5=Me;R3=H）
将在干燥的DCM（10ml）中的DCC（371mg，1.80mmol）和DMAP（22mg，0.180mmol）加到合适的醌酸中（400mg，1.69mmol）并搅拌30分钟。将苯胺（157.2mg，1.69mmol）加到搅拌着的混合物中。然后将混合物在室温下搅拌16小时。过滤产生的混合物，用HCl（aq.，0.1M，2ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生黄色固体（86）390mg（73.9%）。MP:131-133℃.1HNMR(CDCl3):δ7.37(2H,d,邻H J=7.5),7.27(2H,t,间H,J=7.8),7.07(2H,t,对H,J=7.4)7.05(NH,D2O交换),6.60(1H,s,醌H),2.94(2H,s,CH 2),2.02(3H,s,CH 3),2.00(3H,s,CH 3),1.38(6H,s,2×偕CH 3).13C NMR(CDCl3):δ188.4(醌羰基C=O),187.9(醌羰基C=O),169.1(酰胺羰基C=O),153.5(醌C),142.3(醌C),140.0(醌C),137.4(苯胺本位C),132.0(醌C),129.0(间C),124.4(对C),119.8(邻C),48.3(CH2),37.6(C(CH3)2),28.5(2×偕CH3),12.6(醌CH3),11.9(醌CH3).MS:ES+334.1(M+Na)。
F.N-苯基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)-丙酰胺（R1=R2=R3=Me;R4=R5=H）
将在干燥的DCM（10ml）中的DCC（371mg，1.80mmol）和DMAP（22mg，0.180mmol）加到合适的醌酸中（400mg，1.80mmol）并搅拌30分钟。将苯胺（167.4mg，1.80mmol）加到搅拌着的混合物中。然后将混合物在室温下搅拌16小时。过滤产生的混合物，用HCl（aq.，0.1M，2ml）洗涤，在真空中浓缩并用柱色谱（用3:1的乙酸乙酯:己烷洗脱）纯化，产生的产物为黄色固体：360mg（67.2%）。MP:135-137℃.1H NMR(CDCl3):δ8.09(1H,s,NH),7.51(2H,d,邻H J=7.8),7.30(2H,t,间H J=8.0),7.08(1H,t,对H J=7.4),2.89(2H,t,CH 2J=7.7),2.50(2H,t,CH 2,J=7.8),2.08(3H,s,CH 3),2.00(6H,s,2×CH 3).13C NMR(CDCl3):δ187.4,187.4(2×C=O醌),170.0(C=O),142.2,141.7,141.0,140.4,137.8(5×环C),129.0(间C),124.3(对C),119.8(邻C),36.2(CH2),23.0(CH2),12.5,12.3(3×CH3).MS:ES+320.2(M+Na)100%。
实施例5–溶解度和纯度
NMP溶解度:在NMP中配制实施例3D（MTL8-252）的产物溶液并进一步在NMP中稀释至0.1M。通过uplc用1-99%乙腈梯度评价化合物的纯度。使用0.5μl，1μl，2μl，3μl和5μl的进样体积。基于265nm下的uv数据鉴定纯度几乎为100%。FL Plus设定是（高PMT电压，λex410nm和λem550nm，峰值外的）。只检测到一个保留时间大约为4.3min的单峰。MTL8-252同样地非常易溶于DMSO。
NMP和DMSO储备液在pH为10的10mM磷酸钠缓冲液中的水溶液产生轻微浑浊的溶液，其在台式微型离心机中以13000rpm旋转时不成颗粒。然而，来自UV hplc trace的峰面积似乎没有改变（与NMP稀释的样品相比）.用0.2微孔滤膜过滤产生澄清溶液，但是hplc上没有检测到峰，表明材料保留在尼龙滤器上。稀释的DMSO储备液也得到类似的结果。随后的实验使用在pH为7.0的0.1M的10mM磷酸盐缓冲液中稀释的储备液并直接进样到uplc柱上。
实施例6–MTL8-252在NMP和磷酸钠缓冲液中的稳定性
在37℃下在2小时的时间内评价在NMP中的0.1M MTL8-252的稳定性。由uv吸收峰面积保持基本不变的事实证实，化合物表现为稳定。没有观察到4-甲基伞形花内酯的可检测到的释放。用在10mM磷酸钠缓冲液中稀释的DMSO储备液进行类似的实验。结果（见图2）显示MTL8-252在这种溶液中明显稳定至少1hr。
实施例7–用人NQO1评价MTL8-252的活性
对在磷酸缓冲液（10mM，pH7）中的含有MTL8-252（0.1mM），NADH（0.5mM）和0.5μg/ml hNQO1的样品进行初始HPLC，使用1-99%乙腈梯度和1μl进样体积。温度维持在37℃。结果显示在下面的表1中。
表1–数据总结（起始速率）
Figure BDA0000366971890000281
母体化合物的降低是快速的，在第二次进样时大部分已经消失。发现0.2μg/ml hNQO1的酶浓度适合测定MTL8-252降低的起始速率。在只有MTL8-252单独存在或者只有NADH单独存在时，在峰面积上没有观察到显著的降低（见图3）。MTL8-252浓度的降低速率计算为5.9μM/min，当酶浓度减半时速率降低为1.5μM/min。
这个发现证明MTL8-252是hNQO1的底物。在325nm下监测时4-MU的峰面积增加，与底物的减少相吻合。这被4-MU荧光峰的增加证实。NADH的存在不干扰FL光谱。
UV数据的分界点开始设定在220-800nm间，当较短的波长减少至180nm时，尽管有最低的基线噪音干扰，内酯4-MU和MTL8-252相当明显。
通过改变FL Plus检测器的设置（低PMT电压,λex410nm,λem550nm）和通过建立校准曲线图校准4-MU的测量，可以看到有对4-MU的线性应答，达到至少200μM。最终，在孵育实验中使用的最高浓度为100μM。
校准仪器之后，进行用hNQO1活化MTL8-252的重复实验，得到MTL8-252减少的计算速率和4-MU形成的计算速率（见图4）。MTL8-252的减少速率为8.41μM/min，并且这与通过荧光测定的4-MU形成13.51μM/min相对应。
在210nm下重新绘制UV数据，显示4-MU和内酯形成的起始速率分别为11.48μM/min和9.84μM/min（见图5）。
实施例8–具有hNQO1的4-MU和内酯的活性
进行该实验以保证活化产物没有进一步被hNQO1代谢。使用1-99%的乙腈梯度和2μl进样体积，对在磷酸盐缓冲液中的含有4-MU和内酯（0.1mM），NADH（0.5mM）和hNQO1（0.2μg）的样品进行HPLC。温度维持在37℃。结果显示MTL8-252活化之后释放的两个副产物都不是hNQO1的底物（见图6）。
实施例9–MTL8-252与体外培养的细胞孵育
A.荧光光谱测定
在富含非必需氨基酸和10%FBS的Eagle’s MEM培养基中培养人NQO1表达细胞（HDT7）和零表达细胞（F179）。在指数生长期收获细胞，并以5x106个细胞/ml悬浮于冷的PBS中。在37℃下，将100μl细胞悬浮液（5x105个细胞）加到荧光比色皿中的3ml含有10μM MTL8-252的PBS中，并在3分钟内测量荧光强度的增加速率（归因于4-MU的释放）。对照实验在PBS中仅包含底物。
荧光分光光度计设置如下：λex=360nm；λem=45237℃.
图7显示与零表达细胞（F179）相比，使用hNQO1表达细胞（HDT7）孵育后4-MU形成速率显著增加（至少5倍）。这表明有活性的起始爆发，但是由于仪器的低灵敏度，这不能被证实。然而，在连接到uplc的更灵敏的FL-Plus检测器上重复该试验。
B.Uplc分离随后FL-Plus检测
收获处于指数生长期的细胞并以5x106个细胞/ml悬浮于冷的PBS中。在37℃下，将100μl细胞悬浮液（5x105个细胞）加到的1ml含有10μMMTL8-252的PBS中并按如下时间周期孵育：0，5，30和60min。通过在13,000rpm下旋转沉淀细胞30秒来停止反应并将不含细胞的提取物直接进样（2μl）到uplc上。用Whatman Partisil C18柱（S/N no.4SF03177），以1-99%MeCN梯度，1ml/min的流速，在10min内完成代谢物的分离。FL-Plus检测器的设置如下：PMT（低），λex=360nm；λem=450nm。下面的图8显示通过hNQO1表达细胞形成4-MU的速率。起始速率测量值表明，活性相对于零表达的细胞增加约100倍。这也证实了如荧光分光光度计实验中表明的活性的起始爆发。
如下面的图9，用细胞培养基替代PBS表明培养基中的其它组分能减少MTL8-252。可能的来源是来自培养基中加的FBS。
实施例10–MTL8-252与体外培养的细胞孵育的典型方案
采用以下一般方法产生图10-19所示的结果。在DMSO中制备荧光底物的1mM溶液。含有细胞的尿液样品或缓冲液样品（如给出的实验中所指定的，通常为5-20ml）在1200rpm下离心以沉淀细胞。除去上清液并用10ml的PBS或给出实验中规定的培养基洗涤沉淀。将细胞沉淀重悬在期望的缓冲液/介质（1ml）中，然后加入10μl底物溶液并混合。在37℃下孵育所需时间后（通常为3分钟），将混合物通过0.45μM针式过滤器并将滤液置于冰上，直到通过荧光计或（100μl，380nm ex/480nm em）或hplc（uplc）（2μl）分析。NQO1活性表达为所产生的产物（4-MU）浓度。某些介质显示比其它更高的背景荧光。
实施例11–试验精确度
上述标准方法在重复样品上进行，所述样品为在培养基或尿液中加入NQO1产生HDT7细胞的样品。图10显示了对加入培养基中的指定数量的细胞的三次重复测定的精确度。图11显示了对加入尿液中的HDT7细胞（106个细胞）的二次重复测量的精确度。误差条为SEM，并且实验显示细胞可以在培养基或尿液中测量，而对精确度没有任何不利影响。
该方法可以用于测定许多不同类型的细胞的NQO1活性，即HDT7和F179（分别为NQO1产生和零产生的工程细胞系）、人膀胱癌细胞系EJ138和RT112和人前列腺癌细胞系PC3。结果显示在图12和13中。每个实验中使用相似数量的细胞以允许比较。NC代表无细胞阴性对照。
实施例13–NQO1和NQO2活性的区分
前列腺癌细胞（例如PC3细胞）表达NQO1和NQO2活性。然而，后者仅在辅底物（EP-0152R，1-氨基甲酰基甲基-3-氨基甲酰基-1,4-二氢烟酰胺）存在下活化，所述辅底物不是天然存在于细胞中的。如下所示证明了这一点：
向在37℃下预孵育5min的含有5x105个PC-3细胞的440μl的PBS中加入在DMSO中10μM MTL8-252荧光底物（最终DMSO，10μl）并使用PBS将体积调节至500μl。再进一步孵育5min后，如上所述将混合物针式过滤，并通过前述uplc分析2μl的上清液。用相同数量的细胞重复反应，但在孵育过程中包括100μM EP-0152R（50μl）作为辅底物。如上所述过滤并分析反应混合物。已知在EP-152R不存在时，hNQO2是无活性的。图14显示了通过加入hNQO2选择性辅底物，4-MU的形成增加1.2倍。该额外的4-MU释放表明当补充hNQO2辅底物时，另外地或供选择地，试验可以用于检测表达hNQO2酶的肿瘤细胞。在前者的情况下，即表达NQO1和NQO2的情况下，补充试验可以用于提供更强的试验信号，在后者的情况下，即仅表达NQO2的情况下，补充试验仅可以用于检测hNQO2表达癌症。
实施例14–癌细胞数量和试验应答之间的关系
对各种数量的RT112细胞进行上述试验以证明方法的定量能力。这些测试的数据在图15中显示。正如所期望的，在功能性试验中，当NQO1细胞的数量升高时，试验信号的幅度也升高。同时，也使用已建立的方案将细胞暴露于4',6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI），以允许通过测量荧光计中的细胞DAPI荧光强度而对总细胞数进行定量（图16）。因此，对图15和16中的数据的评估可以确定每个细胞的信号量和产生所述信号的样品中的细胞数。当期望在“每个细胞”的基础上测定NQO1或NQO2活性时，这是特别有利的。
实施例15–细胞的富集/分离/纯化
在某些情况下，通过在试验前对细胞进行富集/分离/纯化来改善方法的灵敏度和/或特异性是有利的。该实施例显示了具有这种程序的本发明的能力和兼容性。在这里，使用可磁化的颗粒分离含有携带Ber-EP4上皮抗原的癌细胞的样品，所述颗粒包被有针对该抗原的抗体（Invitrogen）。根据制造商的指示使用颗粒，以获得颗粒/细胞复合物的混悬液，并在上述标准试验方案中进行处理。图17显示相对于在一系列颗粒密度下（通过制造商的珠储备溶液（4x106个颗粒/ml）的体积示出）存在的细胞总数的活性（100%，在图中由0珠的条表示），在RT112膀胱癌细胞中的NQO1活性的恢复为约60–70%。图18显示针对HDT7细胞的相当的结果，所述HDT7细胞表达NQO1但不表达人Ber-EP4抗原。这说明特异性富集上皮细胞群的能力，并且在样品含有大量细胞，不可能都过表达NQO1或NQO2，但程序可以在试验中增强非特异性背景信号的例子中，程序是期望的。
实施例16–临床样品中的NQO1的检测
从在泌尿科就诊的患者获得尿液样本（20ml），并进行上述试验。结果表达为样品的4-MU浓度（由于NQO1活性而从荧光基质中产生）与阴性试验对照的4-MU浓度的比值，并且与最终的临床诊断相关（是否移行细胞癌）。空心三角形代表含有大量碎片的样品，表明使用如本文所述的免疫提取对增加特异性是有益的。空心圆形代表来自患者的样品，随后诊断出所述患者患有非常早期的Ta膀胱癌，并且很可能没有足够的细胞用于可靠地分析该样品。在需要更高灵敏度的检测的情况下，本文所述的化学发光基质可能是有利的。
表2显示了已诊断出患有膀胱癌但未治疗的患者的相应结果。在该系列中样品89由于存在肉眼血尿不能被测定。
从诊断出患有前列腺癌的患者中收集更多的尿液样品（20ml）。这些样品在直肠指检之后收集。表3显示了这些样品的NQO1试验结果。在这两个试验中，在来自患有更晚期肿瘤的患者的样品中发现更高的NQO1活性。在本发明的方法中，NQO1/NQO2活性随着进展期疾病的定量升高意味着方法不仅可以用于确定癌症，也可以通过将试验的定量性质与疾病的各种阶段相关联来评估疾病的进展。本领域技术人员将会理解由于试验的灵敏度和疾病的病理，这是可能的。
表2
膀胱癌样品
Figure BDA0000366971890000331
NC为阴性试验对照，UNK是未知的。
表3
前列腺癌样品
Figure BDA0000366971890000332
NC为阴性试验对照，UNK是未知的。注：最初认为该批均为DRE后尿液收集。然而，在检查记录时，获得的样品109无DRE。测量的精确度通常<10%CV。

Claims (23)

1.一种用于测定在来自患者的生物样品中过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞存在或不存在的方法，所述方法包括：
i.将生物样品或其处理过的衍生物与通式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物或其任意的可用的盐接触，其中所述生物样品含有或疑似含有过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞；
ii.任选地，在癌细胞过表达或疑似过表达NQO2的情况下，向样品中加入NQO2辅底物；和
iii.测定下式所示化合物：
z-XH；
或下式所示离子：
z-X-；
的存在或不存在；
其中z和X如通式（I）中所定义，其中化合物或离子的存在表明在样品中存在过表达NQO1和/或NQO2的癌细胞；
其中通式（I）为：
Figure FDA0000366971880000011
（I）
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（Ia）为：
Figure FDA0000366971880000021
（Ia）
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
R1’、R2’、R3’、R4’和R5’各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1’和R2’与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
X’为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y’为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（Ib）为：
Figure FDA0000366971880000031
其中R1、R2和R4各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；或
R1和R2与它们所连接的碳原子一起形成任选地取代的五元或六元的芳环系统、杂芳环系统、碳环系统或杂环系统；
Rx为H或C1-C3烷基
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（Ic）为：
Figure FDA0000366971880000032
其中R4、R5、R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（Id）为：
Figure FDA0000366971880000041
其中：
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（Ie）为：
Figure FDA0000366971880000042
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-；
通式（If）为：
Figure FDA0000366971880000051
其中
R10、R11、R12和R13各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个活性取代基取代；
R6和R7各自独立地代表氢或任选地被卤素取代的C1-C6烷基；
R14为氢或C1-C6烷基；和
X为O、S或NR8；
R8为氢或C1-C3烷基；
Y为O、S或NR9；
R9为氢或C1-C3烷基；
z为共价连接到所述分子的剩余部分的部分，当通式（I）所示的化合物被还原时，z从所述分子的剩余部分裂解，以形成可检测的化合物z-XH或离子z-X-。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述癌细胞过表达或疑似过表达NQO1的情况下，向所述样品中加入NQO1辅底物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中z包括发色团或发光团。
4.根据权利要求3所述的方法，其中z包括荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，以使z-XH或z-X-为荧光、磷光、化学发光或生物发光分子或离子；或荧光、磷光、化学发光或生物发光分子或离子的发射的调节剂；或用于化学发光或生物发光反应的辅因子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中当所述部分z从通式（I）所示的化合物的剩余部分裂解以形成化合物z-XH或离子z-X-时，其光学性质变化。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述部分z的光学性质的变化包括发射光波长的可检测变化，由通式（I）的醌部分施加的淬灭效应的去除，或在辅因子的情况下，对其活性的调节。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分z包括可检测的颗粒，例如有色胶乳微粒、金纳米颗粒或磁性颗粒。
8.根据权利要求1或权利要求7所述的方法，其中所述部分z包括选择性结合捕获部分的结合部分，其中所述捕获部分包括所述部分z的结合伴侣。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述部分z和所述捕获部分中的一个为抗原，另一个为抗体；或z和所述捕获部分中的一个为生物素或生物素衍生物，另一个为抗生物素蛋白或链亲和素或其衍生物。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中z包括荧光素、2-氧代-2H-1-苯并吡喃基或4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在通式（I）所示的化合物中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地代表氢、卤素、NR6R7、C(O)NR6R7或C1-C6烷基、-O(C1-C6烷基)或C(O)O(C1-C6烷基)，所述任意基团可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、羟基、巯基、氨基、羰基、羧基、氰基、叠氮基、C2-C6烯基和C2-C6炔基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在通式（I）所示的化合物中，独立地或任意组合地：
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地为氢、甲基或乙基；
X为O或NH；和
Y为O。
13.根据权利要求1所述的方法，其中式（I）所示的化合物选自：
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me）；
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(4,5-二甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-3-甲基丁酸酯（R1=R2=R4=R5=Me；R3=H）；
2-氧代-2H-1-苯并吡喃-7-基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代-环己-1,4-二烯基)-丙酸丙酯（R1=R2=R3=Me；R4=R5=H）；和
4-甲基-2-氧代-2H-色烯-7-基-3-甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己-1,4-二烯基)丁酸酯（R1=R2=R3=R4=R5=Me）。
14.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述生物样品为来自患者的活检样品，所述患者患有或疑似患有乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述患者患有或疑似患有膀胱癌，特别是浅表性膀胱肿瘤，并且所述生物样品为尿液样品或其处理过的衍生物。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述患者患有或疑似患有前列腺癌，并且所述生物样品为尿液样品或其处理过的衍生物。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，包括将所述生物样品与权利要求3至6中任一项所述的化合物接触，其中在步骤（iii）中，测定下式所示的化合物或离子的存在或不存在：
z-XH或z-X-
包括检测发色团或发光团的存在。
18.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，包括将所述生物样品与权利要求7所述的化合物接触，并且其中在步骤（iii）中，测定下式所示的化合物的存在或不存在：
z-XH或z-X-
包括检测有色或磁性颗粒的存在。
19.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，包括将所述生物样品与权利要求8或权利要求9所述的化合物接触，并且其中在步骤（iii）中，测定下式所示的化合物的存在或不存在：
z-XH或z-X-
包括检测结合到所述捕获部分的化合物z-XH或z-X-的存在。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中步骤（iii）包括定量地测定式z-XH或z-X-所示的化合物的存在或测定式z-XH或z-X-所示的化合物的不存在。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物，所述化合物用于医药。
22.根据权利要求1至13中任一项所述的式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物，所述化合物在诊断癌症的方法中使用，所述癌症例如乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌。
23.根据权利要求1至13中任一项所述的式（I）、（Ia）、（Ib）、（Ic）、（Id）、（Ie）或（If）所示的化合物在制备用于诊断癌症的试剂中的应用，所述癌症例如乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结肠癌、宫颈癌、睾丸癌、前列腺癌或膀胱癌。
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