CN103495161B

CN103495161B - 一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103495161B
Application number: CN201310464075.0A
Authority: CN
Inventors: 李建平
Original assignee: JIANGSU KANGTAI BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: JIANGSU KANGTAI BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2033-10-08
Also published as: CN103495161A

Abstract

本发明公开了一种多元肺炎球菌荚膜多糖‑蛋白质结合物的混合物，包含13种肺炎球菌荚膜多糖‑蛋白质的结合物和增强免疫的佐剂，每一种肺炎球菌荚膜多糖‑蛋白质的结合物由对应的血清型肺炎球菌荚膜多糖通过共价键与同一种蛋白载体的结合，所述13种肺炎球菌荚膜多糖是从肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F细菌通过纯化提取获得，所述蛋白载体是由基因重组大肠杆菌表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链。同时公开了其制备方法。与传统细菌发酵全链白喉毒素突变体CRM197相比易纯化，产量大，成本低，经实验证明本发明所述混合物具有免疫原性，可用于临床接种。

Description

一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种具有免疫原性的13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法。

背景技术：

肺炎球菌性疾病的主要受害者是儿童，尤其在发展中国家，每年有数百万的儿童因患肺炎、脑膜炎死亡。目前，接种疫苗是保护儿童免受肺炎细菌侵袭的有效途径之一。从化学结构上看，肺炎球菌拥有一个细胞表面荚膜多糖层，其功能是帮助病原体感染宿主。荚膜多糖能够屏蔽细菌细胞表面功能成分免于被宿主免疫系统识别，防止补体系统被细菌表面蛋白激活和免疫细胞吞噬，如果细菌被吞噬，荚膜多糖能够防止细菌被杀灭。不同肺炎球菌菌株中具有不同化学结构的荚膜多糖，产生多种不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎或脑膜炎是由已知的90种血清型中的很大一部分菌株感染所导致的。如果用单一血清型肺炎球菌荚膜多糖来制备疫苗以预防肺炎球菌感染，效果有限；因此，要想提高预防效果，疫苗中应该包含有多种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖。临床使用结果证明，用多种肺炎球菌荚膜多糖混合物制作的疫苗预防效果显著。但该类疫苗还存在如下缺陷：第一，具有重复化学结构的多糖是T细胞独立型2类的免疫原，没有T细胞的参与，它们是无法诱导免疫记忆效应，刺激机体产生IgM和IgG2抗体，这些抗体在体内存留时间短，不能有效地保护机体免受细菌的侵袭；第二，这类疫苗不能够诱导年龄小于2岁的婴幼儿产生免疫应答来预防疾病，而这一人群正是免疫系统发育不完善，容易患传染病的高危人群。

目前，人们已开始将多糖抗原与蛋白载体结合制备新型疫苗，以提高多糖的免疫原性。如John Robbins通过将流行性嗜血杆菌b型（Haemophilus influenzae type b，Hib）荚膜多糖（Polyribosylribitolphosphate,PRP）共价键连接到蛋白载体（破伤风类毒素）来制备流行性嗜血杆菌b型多糖PRP-破伤风类毒素结合疫苗（PRP-TT）。当细菌多糖以共价键的形式连接到蛋白载体，由于蛋白质是一种T细胞依赖性抗原，能够将共价键连接的多糖转变成T细胞依赖性抗原，从而刺激机体产生针对于该多糖的特异性IgG抗体，保护机体不受细菌的感染。但由于肺炎球菌导致的肺炎或脑膜炎可由多种不同的血清型或菌株感染所致，并且各血清型或菌株间由于细菌表面多糖的化学结构的不同，其抗体没有交叉免疫反应，所以接种单一的血清型或菌株结合疫苗，无法保护被接种人体免于其它血清型或菌株的感染。因此，多价肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗是今后的重点研究方向，美国辉瑞公司已成功开发出13价肺炎球菌多糖-CRM197结合疫苗，以用于儿童预防肺炎和脑膜炎，但是这种疫苗所用的载体蛋白CRM197是通过发酵培养白喉杆菌变异株野株，从其发酵液中进行纯化获得，这种方法来制备CRM197生产周期长，产量低，生产成本高，造成该疫苗产品成本高昂，无法大批量生产，普通民众无法接受高昂的价格；因此，无法广泛的推广应用。

白喉毒素突变体CRM197和白喉毒素结构相似，含有A链和B链。由于CRM197的A链的第52氨基酸发生的突变，由甘氨酸变成了谷氨酸，而变成了无毒毒素。因此，白喉毒素突变体CRM197被辉瑞公司用于开发多糖-蛋白结合疫苗的蛋白载体，从药物的角度来看，其优点是安全，无毒；和其它蛋白载体，如破伤风类毒素、白喉类毒素相比较，CRM197作为蛋白载体的优点是该蛋白的表面具有稳定数量的氨基，而氨基是还原胺法合成结合物时，蛋白载体和多糖结合的位点。而类毒素由于经过甲醛去毒处理，分子表面的氨基数量变异较大。建立稳定的多糖和蛋白质结合的合成条件需要载体蛋白具有稳定的氨基数量。

白喉毒素突变体CRM197是通过发酵白喉毒素变异株，该变异株在合适的条件下能够分泌CRM197至培养上清液，而纯化出合适于合成结合疫苗蛋白载体的纯度蛋白是一个极大的挑战。另外，要获得大量的CRM197蛋白，需要进行大容量的细菌发酵，其生产成本高。为此，通过其它生产途径来获得CRM197蛋白是人们努力的方向，通过基因工程技术用大肠杆菌表达系统来生产CRM197蛋白是现有的生物技术的首选。然而许多研究结果表明，由于CRM197蛋白的分子量达到68kDa，用大肠杆菌表达出来的CRM197分子大多数是不可溶性的包涵体，可溶性的含量少，而可溶性的CRM197蛋白是用作合成多糖-蛋白结合物的载体蛋白的必要条件。如果要将包涵体变成可溶性的蛋白，需要采用变性、复性的方法来获得，但通过该工艺获得的可溶性CRM197蛋白产量仍然很低，无法降低生产疫苗的成本，实现廉价的大批量生产。

发明内容：

鉴于现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的是提出一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物及其制备方法。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，包含13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物和增强免疫的佐剂，每一种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物由对应的血清型肺炎球菌荚膜多糖通过共价键与同一种蛋白载体的结合，所述13种肺炎球菌荚膜多糖是从肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F细菌通过纯化提取获得，所述蛋白载体是由基因重组大肠杆菌表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链。

进一步，所述基因重组白喉毒素突变体CRM197的A链的核苷酸序列为：

1 GGCGCTGACG ATGTTGTTGA CTCCTCGAAA TCCTTTGTTA TGGAAAACTT CTCCTCCTAC

61 CACGGCACGA AACCGGGCTA TGTTGACTCT ATTCAGAAAG GCATCCAAAA ACCGAAGAGT

121 GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACTCCACGGA CAATAAGTAT

181 GATGCGGCCG GCTACTCGGT CGACAACGAA AATCCGCTGA GCGGTAAAGC AGGCGGTGTG

241 GTTAAGGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA

301 ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCACTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG

361 GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCCCGCG TCGTGCTGTC ACTGCCGTTT

421 GCTGAAGGCA GCTCTAGTGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGAGC

481 GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA

541 TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGT GTGCGTCGCT AA。

进一步，所述佐剂为磷酸铝或氢氧化铝；

所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备方法如下：

第一，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

步骤1，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白基因片段的构建

用PCR方法合成CRM197的A链核苷酸序列，包含有NcoI酶切识别位点CCATGG的限制性内切酶识别序列和含有BamHI酶切识别位点GGATCC的限制性内切酶识别序列，上述两个限制性内切酶的识别序列分别与白喉毒素突变体CRM197的A链基因序列的5’端和3’端连接，得到白喉毒素突变体CRM197的A链的重组基因片段；

步骤2，表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒构建

用Nco I/Bam H限制性内切酶消化PCR方法合成CRM197的A链核苷酸基因片段，纯化后，将消化获得的基因片段克隆至一个表达载体中，获得表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒；

步骤3，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

将步骤2获得的表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒转入大肠杆菌表达宿主BL21中，获得表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌表达菌，通过对白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌进行培养、诱导后，从菌体中分离、纯化得到白喉毒素突变体CRM197的A链的蛋白。

第二，13种血清型肺炎球菌荚膜多糖的制备

通过对13种血清型肺炎球菌分别进行发酵，菌液分离后，取离心上清液，进行荚膜多糖的纯化，获得相应的血清型肺炎球菌荚膜多糖；

第三，13个血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的合成

将第二获得的13种纯化的肺炎球菌荚膜多糖分别与第一步骤获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白共价键连接，得到13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物；

第四，13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备

将第三获得的13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物和增强结合物免疫性的佐剂进行均匀混合即得目标物。

本发明的突出效果为：

（1）本发明混合物中13种不同血清型肺炎球菌荚膜多糖涵盖了全球大部分导致人类疾病的肺炎球菌，免疫原性好；

（2）实验证明，以白喉毒素突变体CRM197的A链作为蛋白载体制备的多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物具有免疫原性，可用于临床接种；

（3）通过在基因重组大肠杆菌中表达的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白，与传统细菌野株发酵获得的相应CRM197蛋白相比，不仅产量高，容易纯化，而且制备成本低廉。

为了进一步说明本发明的具体实施方式，下面举例说明本发明的实施方式。

附图说明：

图1为用Nco I和Bam HI限制性内切酶消化后的表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白质粒电泳图；

图中，1泳道为质粒，2泳道为用Nco I和Bam HI限制性内切酶消化后的表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白质粒电泳图，3泳道分子量Marker，4标示位置为5000bp，5标示位置为500bp；

图2为白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白表达菌培养产物与对照大肠杆菌培养产物的SDS-PAGE胶图谱，图中，6泳道为不含白喉毒素突变体CRM197的A链质粒的大肠杆菌培养液；7泳道为含有白喉毒素突变体CRM197的A链质粒大肠杆菌表达菌的细菌培养液；8泳道为含有白喉毒素突变体CRM197的A链质粒大肠杆菌表达菌的细菌培养液破菌离心后获得的上清液；9泳道为含有白喉毒素突变体CRM197的A链质粒大肠杆菌表达菌的细菌培养液破菌离心沉淀物；10是指白喉毒素变异体CRM197的A链；

图3为与图2相对应的Western blot检定电泳图，图中，15是指对应白喉毒素变异体CRM197的A链经Western blot的杂交信号；

图4为表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白包涵体复性后，进行的SDS-PAGE电泳图；图中，SDS-PAGE部分中的16泳道为含有白喉毒素突变体CRM197的A链质粒大肠杆菌表达菌的细菌培养液破菌离心后获得的包涵体，经复性后离心获得的上清液；SDS-PAGE部分中的17泳道为含有白喉毒素突变体CRM197的A链质粒大肠杆菌表达菌的细菌培养液破菌离心后获得的包涵体，经复性后离心获得的沉淀物；PVDF部分中的18泳道和19泳道是SDS-PAGE部分相对应的Western blot分析图谱；20是指白喉毒素变异体CRM197的A链，21是白喉毒素变异体CRM197的A链在硝酸纤维素上的杂交信号；

图5为表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白包涵体，经复性后获得的离心上清液，进行的双向免疫扩散图；其中，22孔为抗CRM197蛋白血清，23孔为表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白。

具体实施方式：

下面举例说明对本发明的具体实施方式，所举的实施例仅是对本发明产品及其方法作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明的保护范围。在实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，包含13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物和磷酸铝佐剂，每一种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物是由对应的血清型肺炎球菌荚膜多糖通过共价键与同一种蛋白载体的结合，所述13种肺炎球菌荚膜多糖是从肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F细菌培养液中通过纯化提取获得，所述蛋白载体是由基因重组大肠杆菌表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白，所述基因重组白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的核苷酸序列为：

1 GGCGCTGACG ATGTTGTTGA CTCCTCGAAA TCCTTTGTTA TGGAAAACTT CTCCTCCTAC

61 CACGGCACGA AACCGGGCTA TGTTGACTCT ATTCAGAAAG GCATCCAAAA ACCGAAGAGT

121 GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACTCCACGGA CAATAAGTAT

181 GATGCGGCCG GCTACTCGGT CGACAACGAA AATCCGCTGA GCGGTAAAGC AGGCGGTGTG

241 GTTAAGGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA

301 ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCACTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG

361 GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCCCGCG TCGTGCTGTC ACTGCCGTTT

421 GCTGAAGGCA GCTCTAGTGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGAGC

481 GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA

541 TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGT GTGCGTCGCT AA。

实施例2：将实施例1中的佐剂改为氢氧化铝。

实施例1中所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备方法如下：

第一，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

1、白喉毒素突变体CRM197蛋白A链氨基酸序列确认

基因重组表达的白喉毒素突变体CRM197蛋白A链是由白喉毒素氨基酸序列中的1至193部分的氨基酸多肽组成，从GenBank获取CRM197完整的基因序列（HW71379），其氨基酸序列如下：

1 GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY

61 DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT

121 EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE

181 YMAQACAGNR VRR

该蛋白核酸序列中的第52位氨基酸编码原始的甘氨酸（G），变为谷氨酸（E）；

2、基因优化设计

为了提高大肠杆菌表达系统对这些蛋白的表达，需要对其核酸序列进行优化，白喉毒素G52E片段优化后核酸序列如下：

1 GGCGCTGACG ATGTTGTTGA CTCCTCGAAA TCCTTTGTTA TGGAAAACTT CTCCTCCTAC

61 CACGGCACGA AACCGGGCTA TGTTGACTCT ATTCAGAAAG GCATCCAAAA ACCGAAGAGT

121 GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACTCCACGGA CAATAAGTAT

181 GATGCGGCCG GCTACTCGGT CGACAACGAA AATCCGCTGA GCGGTAAAGC AGGCGGTGTG

241 GTTAAGGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA

301 ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCACTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG

361 GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCCCGCG TCGTGCTGTC ACTGCCGTTT

421 GCTGAAGGCA GCTCTAGTGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGAGC

481 GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA

541 TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGT GTGCGTCGCT AA

限制性内切酶识别序列与基因连接确认：Nco I酶切识别位点CCATGG，BamHI酶切识别位点GGATCC，（经过对G52E基因序列进行分析，在序列内，无Nco I及BamHI酶切位点），G52E基因合成全序列如下：

1 GGCGCTGACG ATGTTGTTGA CTCCTCGAAA TCCTTTGTTA TGGAAAACTT CTCCTCCTAC

61 CACGGCACGA AACCGGGCTA TGTTGACTCT ATTCAGAAAG GCATCCAAAA ACCGAAGAGT

121 GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACTCCACGGA CAATAAGTAT

181 GATGCGGCCG GCTACTCGGT CGACAACGAA AATCCGCTGA GCGGTAAAGC AGGCGGTGTG

241 GTTAAGGTTA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA

301 ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCACTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG

361 GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCCCGCG TCGTGCTGTC ACTGCCGTTT

421 GCTGAAGGCA GCTCTAGTGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGAGC

481 GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA

541 TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGT GTGCGTCGCT AA

3、宿主及载体选择

大肠杆菌BL21表达系统的载体是通过改造获得，大肠杆菌BL21为目前通用的大肠杆菌受体菌，是一种能高效表达的溶源性细菌，含有T7聚合酶基因，T7RNA聚合酶受IPTG诱导的Lac UV5启动子控制；因此，重组G52E蛋白需以IPTG为诱导剂。载体中的多克隆位点含有Nco I，BamHI，而目的基因中不含有这两个限制性内切酶的切点，所以在该目的基因5′端3′加入相应的限制性内切酶识别序列，从而克隆到载体中形成重组质粒；

4、基因合成

白喉毒素变异体CRM197蛋白A链的基因是由DNA合成仪合成，并用以下检测方法进行基因确认，酶切鉴定：取复苏的白喉毒素变异体CRM197蛋白A链表达菌种，接种至含有50mg/ml卡那霉素的LB基本培养基平皿上，37℃培养过夜后挑取单菌落，碱裂解法提取质粒DNA，通过Nco I和Bam HI双酶切重组质粒，如图1所示，电泳显示得到约5396bp及593bp两条带，其中，Lane1为表达质粒，Lane2为用Nco I和Bam HI消化后的表达质粒，Lane M为ladder，与预期目的DNA片段大小相符合；

5、重组质粒的转化和表达检定

取质粒干粉瞬时离心后加入40μL双蒸水溶解，溶解后的的质粒浓度为100ng/μL。取一管感受态细胞置于冰上，加入5μL连接产物，混匀，冰上放置20min，42℃热击90s后，迅速置于冰上3min，将上一步处理后的感受态细胞迅速加入到37℃预热的1mL LB液体培养基中，在37℃摇床中振荡培养1h，吸取100～300μL菌液，用涂布棒将菌液均匀涂布于含有卡那霉素的LB培养基平板上，37℃倒置培养过夜。实验结果：37℃倒置培养过夜后，培养皿上出现表面光滑，边缘整齐，中等大小的淡黄色菌落；

6、阳性克隆的筛选检定

挑取LB平板上澄亮圆润的单菌落，接种至5ml无菌且含有卡那霉素的LB培养基中，在37℃下，180rpm摇速培养。转接5ml菌液至500ml含有卡那霉素LB培养基中，在37℃下，180rpm摇速培养，菌液OD₆₀₀至1.0左右时（约4h），加入1.0M的IPTG至终浓度为1.0mmol/L，20℃下，180rpm摇速培养6h。4℃，4000rpm，离心30min，收集菌体。称重菌体质量，作为一个体积，加入5倍菌体体积的PBS重悬。向菌液中加入5ⅹSDS-PAGE loading buffer至工作浓度，煮沸5-8min，1000rpm，离心2min，取上清上样，SDS-PAGE检测表达情况，鉴定为阳性克隆的菌株扩大培养，保存为原始种子；

7、蛋白表达分析

取原始种子接种至含有50mg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀约0.6时，按终浓度1mmol/L加入IPTG，继续培养2h后，离心收集菌体，加入适量PBS，超声破碎，离心分别收集上清，沉淀进行SDS-PAGE。并进行Western blot分析，电泳图结果如图2所示，其中，对照上样量10μL，全菌上样量10μL，上清上样量20μL，沉淀上样量10μL，Western blot检定结果如图3所示，其中，对照上样量5μL，全菌上样量5μL，上清上样量10μL，沉淀上样量5μL；

对上述结果进行分析，经摇瓶培养，收集菌体后超声破碎，分别收集沉淀与上清，电泳结果显示目的蛋白大部分以包涵体形式存在，少量以可溶性蛋白形式存在，Westernblot显示可溶性蛋白与包涵体均由杂交信号；

8、包涵体复性

8.1菌体洗涤

称重40g湿菌体于500ml离心管中，加入400ml1xPBS重悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌悬浮（约10min），在4℃下，9000rpm，离心15min，弃上清，收集菌体，重复以上步骤两次；

8.2菌体破碎

小批量的菌体中加入400ml1xPBS至菌体离心管，菌体/缓冲液（w/v）=1:10，在超声仪上进行破碎，超声条件：冰水浴，超声5秒，间隙5秒，破碎总时间30-40min；在4℃下，9000rpm，离心30min；弃上清液，收集沉淀，加入400ml洗涤缓冲液A，室温下在磁力搅拌器上搅拌悬浮（约30min），在4℃下，9000rpm，离心30min，弃上清液，收集沉淀（即包涵体），重复以上步骤，依次更换洗涤缓冲液B，C，D，储备缓冲液；

8.3包涵体复性

加入240ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体（按照包涵体重量/变性缓冲液体积（w/v）=1:30），室温下在磁力搅拌器上搅拌溶解完全（约30min），在25℃下，12000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀，将离心上清液转移至6-8KD透析袋中，封闭透析袋，置透析袋于2L复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜，次日将透析袋转入2L复性缓冲液2中，室温搅拌透析8-10h，将透析袋转入2L复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜，次日将透析袋转入2L复性缓冲液4中，室温搅拌透析8-10h，将透析袋转入2L复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜。次日将透析袋转入2L储备缓冲液中，室温搅拌透析8-10h，更换储备缓冲液二次，室温透析过夜，取1ml透析液，室温12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度，实验结果如图4左侧的SDS-PAGE电泳检测所示，取适量透析液，室温12000rpm离心10min，收集上清，上样检测。进行Western blot杂交实验，结果如图4右侧所示；

进行双向免疫扩散实验：取上步骤离心上清液，送检测组进行双向免疫扩散实验，如图5所示，检测结果显示出现明显的免疫沉淀线，其中，1号孔为复性后的白喉毒素变异体CRM197蛋白A链，2号孔为白喉类毒素抗血清。

9、CRM197蛋白A链表达大肠杆菌发酵

从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中，取出一工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀=1.0左右；将菌液无菌接种至1升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀=1.0左右；接种种子液至50-升发酵罐中的20升培养基中，在37℃下，180rpm条件下进行发酵，当OD₆₀₀至7-8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用；

10、CRM197蛋白A链纯化

称重3g湿菌体于50ml离心管中，加入30ml1xPBS重悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌3min；在4℃下，4000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入30ml1xPBS至菌体离心管，在超声仪上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心10min；收集沉淀，弃上清液；加入30ml1xPBS缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌3min；在4℃下，4000rpm，离心10min；弃上清液，收集包涵体，加入90ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6-8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于2L复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2L复性缓冲液2中，室温搅拌透析8-10h；将透析袋转入2L复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2L复性缓冲液4中，室温搅拌透析8-10h；将透析袋转入2L复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2L储备缓冲液中，室温搅拌透析8-10h；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP琼脂糖凝胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用；

第二，13种血清型肺炎球菌荚膜多糖的制备

第三，13种血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的合成

1）肺炎球菌血清型1荚膜多糖-CRM197蛋白A链蛋白结合物合成

称取5mg的Pn1降解多糖于反应瓶中，量取0.5ml的1mol/L NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。记录多糖溶液的初始pH，分别量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中，室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min，用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5，过3min后立即向反应瓶中加入5mg的CRM197蛋白A链，在室温下（25℃）搅拌反应1h，量取37.5μl2mol/L赖氨酸加入反应瓶中，用0.1N HCl调节溶液pH至9.0。室温下搅拌反应30min，将反应瓶转移到4℃下反应过夜，将反应混合物转移至透析袋（MWCO6-8000）中，在4℃下，对0.85%NaCl溶液透析3次，6L/次，透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

2）肺炎球菌血清型3荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5mg的Pn3降解多糖于反应瓶中，量取0.68ml1mol/L NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解，记录多糖溶液的初始pH，分别量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中，室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min，用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5，过3min后立即向加入3mgCRM197蛋白A链，在室温下（25℃）搅拌反应1h，量取37.5μl2mol/L赖氨酸加入反应瓶中，用0.1mol/L HCl调节溶液pH至9.0，室温下搅拌反应30min，将反应瓶转移到4℃下反应过夜，将反应混合物转移至透析袋（MWCO6-8000）中，在4℃下，对0.85%NaCl溶液透析3次，6L/次，透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

3）肺炎球菌血清型4荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5mg活化多糖至反应瓶中，量取100μl的0.5M磷酸钠缓冲液，加入反应瓶中，量取5mg的CRM197蛋白A链至反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌混匀；称取5.0mg的NaBH₃（CN），加入反应瓶中，将反应体系置于30℃的干浴器中反应12h，反应结束后，量取1.5ml的0.15MNaCl溶液加入反应瓶中，称取2.5mg的sodiumborohydride，加入反应瓶中，反应体系置于22℃下反应5h；将反应混合物转移至透析袋（MWCO12-14Kd），在4℃下，对0.15M sodium chloride solution透析3次，每次透析液量6L；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

4）肺炎球菌血清型5荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5.0mg活化多糖，加入至反应瓶中，向反应瓶中加入100μl的0.5M磷酸钠缓冲液；称取4.0mg的CRM197蛋白A链，加入反应瓶中，量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使反应物溶解，测定反应体系的pH；称取5.0mgNaBH3（CN），加入反应瓶中；将反应体系置于室温下反应48小时；称取2.5mg的NaBH，溶解于10μl纯水中，用移液枪混匀溶解完全后，加入反应瓶中；将反应体系置于23℃下搅拌反应5小时；将反应混合物转移至透析袋（MWCO6-8Kd）中，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，每5小时换液一次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

5）肺炎球菌血清型6A荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取6.0mg活化Pn6A多糖，溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入4mg的CRM197蛋白A链，搅拌混匀；称取5.0mg的NaBH₃（CN），加入上述反应瓶中，在室温反应18小时；反应结束后取样送检；称取2.7mg的NaBH，加入上述反应瓶中，在室温反应5小时；反应结束后取样送检；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析5次，6L/次，透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

6）肺炎球菌血清型6B荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5.0mg的Pn6B溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1MNaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入2.5mg的CRM197蛋白A链，搅拌混匀；称取5.0mg的NaBH₃（CN），加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；称取2.5mg的NaBH，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M NaCl溶液透析5次，6L/次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检；

7）肺炎球菌血清型7F荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取10.0mg的Pn7F多糖，溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解；分别滴加0.1MNaOH溶液至多糖溶液中，调节pH至7.0；向反应体系中加入3.5mg的CRM197蛋白A链，搅拌混匀；称取5.0mg的NaBH₃（CN），加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；往反应瓶中加入990μl纯水，搅拌混匀；称取2.5mg的NaBH，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋（MWCO6000-8000），在4℃下，对5mM succinate/0.9%氯化钠缓冲液透析5次，6L/次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。

8）肺炎球菌血清型9V荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取10mg的Pn9V活化多糖，量取125μl的磷酸钠缓冲液，量取125μl纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取15mg的CRM197蛋白A链至加入反应瓶中，搅拌溶解完全；称取10mg的NaBH₃（CN），加入反应瓶中；将反应体系置于22℃下反应48小时；称取2.5mg的NaBH₄，加入反应瓶中，22℃下反应5小时；将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用AKTA系统，Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合峰；

9）肺炎球菌血清型14荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5mg的Pn14活化多糖，量取1ml3.9mg的CRM197蛋白A链，加入反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；加入弱还原剂NaBH₃（CN）5mg后，在22℃下反应48小时；加入强还原剂NaBH₄2.5mg，室温下反应4小时；将反应混合液转移至透析袋（MWCO12-14Kd）中，用2ml的透析液润洗反应瓶；在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，6L/次，每5小时换液一次。透析结束以后收集透析液，10000rpm，离心10min后取上清，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰；

10）肺炎球菌血清型18C荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5mg的Pn18C降解多糖，用1mL1M氯化钠溶液溶解；溶解完全后测其初始pH值；加入适量的CDAP溶液，室温下搅拌1.5min，加入0.2M NaOH溶液调节溶液的pH至9.0，之后于室温反应3min；加入10mg的CRM197蛋白A链，于25℃下反应45min；反应结束后，加入37.5μl2M赖氨酸溶液；25℃下反应30min后置于4℃反应过夜；将反应混合液转至透析袋（MWCO6000-8000）中，在4℃下，对0.85%氯化钠溶液透析，换液3次，6L/次，每5小时换液一次，透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL-4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量；

11）肺炎球菌血清型19A荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取10.0mg氧化Pn19A多糖，溶解于0.5mL的缓冲液中，置磁棒于反应瓶中，搅拌至多糖完全溶解；加入10mg的CRM197蛋白A链；搅拌混匀，称取5.0mg的NaBH₃（CN），加入至反应瓶中，在室温下反应20小时；称取2.5mg的NaBH₄，加入反应瓶中，在室温下反应5小时；将反应混合液转至透析袋（MWCO6000-8000）中，在4℃下，对0.85%氯化钠溶液透析，换液3次，6L/次，每5小时换液一次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL-4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量；

12）肺炎球菌血清型19F荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取5.2mg氧化Pn19F多糖，溶解于1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入3.0mg的CRM197蛋白A链；搅拌混匀后，称取4.9mg的NaBH₃（CN），加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在室温18℃下反应24小时；称取2.5mg的NaBH₄，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋（MWCO12-14000），在4℃下，对缓冲液透析5次，每次透析液量6L，每5小时换液一次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL-4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量；

13）肺炎球菌血清型23F荚膜多糖-CRM197蛋白A链结合物合成

称取4.9mg氧化Pn23F多糖，溶解于1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入5.0mg的CRM197蛋白A链；称取5.1mg的NaBH₃（CN），加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在恒温箱18℃下反应17小时；称取2.5mg的NaBH₄，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋（MWCO12-14000），在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析，每次透析液量6L，每5小时换液一次，共5次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL-4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量；

第四，多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备

用Millipore的Labscale超滤系统将1，3，4，5，6A，7F，9V，14，18C，19A，19F和23F血清型结合物溶液浓缩至多糖浓度大约为40mg/ml；6B血清型结合物溶液浓度浓缩至多糖浓度大约为80mg/ml；按照下列表格计算加入相应容量的单价血清型结合物溶液至制剂瓶中：

将结合物混合液用0.22μm膜除菌过滤；加入磷酸铝胶，最终浓度为125mg/ml；用缓冲液定容至最终体积；灌装，0.5ml/瓶；

第五，多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物免疫原性实验：

（1）注射小鼠检测13价肺炎球菌多糖-CRM197的A链蛋白结合物混合物制剂：

取5-6周的CM57系小鼠70只，每只小鼠注射制备的多元肺炎球菌多糖-CRM197蛋白A链结合疫苗，注射容量为0.1ml/只小鼠/次，注射小鼠分为三组，一组注射本发明配制的多元肺炎球菌多糖-CRM197蛋白A链疫苗，另一组注射市场上临床使用的PVC13（辉瑞公司）疫苗作为对照，第三组为空白对照，具体注射疫苗和采集免疫血清程序表如下：

采集小鼠血液至离心管，在室温下静止2小时，在10000rpm条件下离心10分钟，用移液枪吸取离心的上清血清，储存于4℃冰箱中，待检；

（2）ELISA法检测小鼠血清中多糖抗体滴度

分别配制13种不同血清型肺炎球菌多糖储备液1mg/ml（1×PBS溶液中），存储于冰箱，稀释待检血清型肺炎球菌多糖存储液到包被缓冲液2-4μg/ml，加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜，用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周；将小鼠注射结合疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体（1:2000稀释），在室温下孵育4小时，用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸-4-硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘；

结果显示，本发明结合疫苗的免疫原性良好，注射三针后的小鼠血清中抗特异性肺炎球菌多糖的IgG抗体滴度显着高于注射一针和二针的血清中IgG抗体滴度；注射三针后的各个血清型抗体滴度高于注射一针的4倍以上，符合WHO对于结合疫苗滴度提高的标准；与市场上临床使用PVC13疫苗相比较，各个血清型抗体的滴度，在注射三针后，小鼠抗血清滴度接近甚至更好。

（3）调理吞噬试验（Opsonophagocytic Assay，OPA）

调理吞噬试验是评价肺炎球菌多糖结合疫苗杀菌效力方法，根据UAB-MOPA的“肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体多型调理吞噬杀菌试验方法”对获得的小鼠免疫血清进行试验；

OPA滴度结果如下表：

血清型	对照组	试验组（注射三针后血清）
			1	16	2048
3	16	1024
			4	32	2048
5	16	2048
			6A	16	1024
6B	8	1024
			7F	32	2048
9V	16	1024
			14	16	4096
18C	8	2048
			19A	8	1024
19F	16	2048

23F

16

2048

试验结果可见，注射三针后的小鼠血清和未注射多元多糖结合疫苗组小鼠血清比较，其抗体的OPA滴度有明显提高。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，其特征是，包含13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物和增强免疫的佐剂，每一种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质的结合物由对应的血清型肺炎球菌荚膜多糖通过共价键与同一种蛋白载体的结合，所述13种肺炎球菌荚膜多糖是从肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F细菌通过纯化提取获得，所述蛋白载体是由基因重组大肠杆菌表达获得的白喉毒素突变体CRM197的A链，所述白喉毒素突变体CRM197的A链基因的核苷酸序列为：

2.根据权利要求1所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物，其特征是，所述佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。

3.权利要求1所述多元肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备方法：

第一，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

步骤1，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白基因片段的构建

用PCR方法合成CRM197的A链核苷酸序列，包含有Nco I酶切识别位点CCATGG的限制性内切酶识别序列和含有Bam H酶切识别位点GGATCC的限制性内切酶识别序列，上述两个限制性内切酶的识别序列分别与白喉毒素突变体CRM197的A链基因序列的5’端和3’端连接，得到白喉毒素突变体CRM197的A链的重组基因片段；

步骤2，表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒构建

步骤3，白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的制备

将步骤2获得的表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的质粒转入大肠杆菌表达宿主BL21中，获得表达白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌表达菌，通过对白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白的大肠杆菌进行培养、诱导后，从菌体中分离、纯化得到白喉毒素突变体CRM197的A链蛋白；

第二，13种血清型肺炎球菌荚膜多糖的制备

第三，13个血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的合成

第四，13价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质结合物的混合物的制备